JPH06511393A

JPH06511393A - 酵素的に産生された２量体ｉｌ−２とその調製のための神経由来のトランスグルタミナーゼ

Info

Publication number: JPH06511393A
Application number: JP6505461A
Authority: JP
Inventors: シュワーツ，ミシャル; エイタン，ショシャナ
Original assignee: イエダ　リサーチ　アンド　デベロップメント　カンパニー　リミテツド
Priority date: 1992-07-30
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2017-08-05
Also published as: AU4795093A; AU667572B2; EP0610475A4; EP0610475A1; ATE214730T1; HU9400900D0; WO1994003059A1; HU218852B; DE69331730T2; FI941451A; FI941451A0; CN1084888A; EP0610475B1; DE69331730D1; JP3310289B2; CA2119873A1; MX9304619A; HUT70302A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】酵素的に産生された２量体ＩＬ−２とその調製のための神経由来のトランスグルタミナーセ本発明の分野本発明は、新しい神経由来のトランスグルタミナーゼ（本発明においては以後ＴＧ、と名付ける）、及び希突起膠細胞に対して細胞毒性を示す哺乳類の、酵素的に産生された２１体インターロイキン−２（ＩＬ−２）に関する。本発明は、さらに、該酵素ＴＧＭと希突起膠細胞毒性活性を有する該２量体ＩＬ−２の調製、そして哺乳動物における神経再生を誘発および促進するためのそれらの使用に関する。

発明の背景成熟哺乳動物の中枢神経系（ＣＮＳ）は、軸索の傷害の後、再生能力が乏しいことを示す。傷害された軸索の自然発生的成長は起るが、傷害の部位を横切ることなく、２００−３００ミクロンの伸張の後、そして末端の切株において延長した後伸張かとまる。神経再生か巧く行かないのは、星状腫細胞（ｉＭ痕影形成細胞か成長を助けることか出来ないこと、マクロファージ、及び／またはその産生物か乏しいこと、及び軸索の成長を阻害する成熟希突起膠細胞の生成をはじめとする神経を取巷く環境か好ましくないのが原因であるとされてきた。

最近状々は、例えば成熟魚の視覚神経のような、自然発生的に再生が行われている系においては、傷害に対する応答も、再生の過程とともに、魚とう・ノドの両方において、希突起膠細胞に対して選択的に細胞毒性を示し、我々が希突起膠細胞毒性因子（ＯＣＦ）と名付けた因子（単数または複数）の存在と関連していることを示した（公開欧州特許出願ＥＰ　Ｎｏ、４１５３２１　；Ｃｏｈｅｎら、＋９９０：８１νｒＯｎら、＋９９１）。この魚に出来する因子は、後に、ヒト免疫ＩＬ−２における１５ｋＤａ、及び魚のリンパ球由来のＩＬ−２の１４ｋＤａ（公開欧州出願ＥＰ　Ｎｏ、５０１４４５；　Ｅｉｔａｎら、ｌ　９９２）に比較して、２８ｋＤａの分子量を有するＩＬ−：１４３分子として、我々によって同定された。ＯＣＦとＩＬ−２の間の分子量における相違は、この因子の超厚について、それが局所的に修飾されたＩＬ−２、すなわち神経における常住細胞から由来するのか、それとも炎症細胞から由来するのか、または免疫性ＩＬ−２をコードしている遺伝子から区別されるが、それと高度の相同性を共存している遺伝子の産物であるかどうかについての疑問を生じた。

本発明によれば、トランスグルタミナーゼのファミリーの一員として同定され、魚における視覚神経の傷害の後に濃度上昇が見出されたが、哺乳動物ではそうならなかったある酵素が、傷害を受けた魚の視覚神経において観察された高分子量のＩＬ−２様物質を、恐らく２分子の架橋結合において産生ずるようにＩＬ−２分子を修飾する上で役割を演じていることが見出された。本発明において、ＴＧ、と呼ばれるこの神経由来のトランスグルタミナーゼがＩＬ−２の２量化を起し、それによって希突起膠細胞に対して細胞毒性となる。

発明の要約本発明は、希突起膠細胞毒性活性を示す酵素的に産生され得る２量体ＩＬ−２に関する。さらに、本発明は、哺乳動物のＩＬ−２から直接に酵素によって希突起膠細胞毒性活性を存するＩＬ−２を産生ずる手段と方法を提供する。

希突起膠細胞毒性因子とＩＬ−２様物質は、傷害を受けた魚の視覚神経を含むならし培地において早期に検出されたが、無傷の魚の視覚神経を含むならし培地では検出されなかったので（ＥＰ４１５３２１とＥＰ５０１４４５）、ＩＬ−２の局所的処理と希突起膠細胞毒性活性を存するその２量体への修飾に対する機構が傷害を受けた視覚神経について探究された。

本発明によれば、トランスグルタミナーゼファミリーの酵素が、傷害を受けた魚の視神経から得られることが見出された。この神経由来のトランスグルタミナーゼ（ＴＧ、　）は、哺乳動物のＩＬ−２を希突起膠細胞毒性を有する２量体ＩＬ −２に変換する。

このように、本発明は、さらに、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と銀染色によって解析されたところによれば水溶性であり、約５５ｋＤａの分子量を存し、傷害を受けていない魚の神経に比べて、傷害を受けた魚の視神経において、濃度の上昇が検出される酵素ＴＧ、に関する。ＴＧ、は、傷害を受けた魚の視神経を含むならし培地の、トランスグルタミナーゼの十分保存された活性部位のエピトープに相当するペプチドに対して発現された抗体でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。

本発明は、さらに、ヒトをはじめとする哺乳動物のＩＬ−２を、本発明の酵素ＴＧ、とインキュベーションを行うことからなる希突起膠細胞毒性活性を有するヒトをはじめとする哺乳動物の２量体ＩＬ−２の酵素的産生の手順を提供する。

本発明によって、ＴＯ，の基質として使用されるｌ量体ＩＬ−２には、いかなる種類の動物でもよいか、好ましくは哺乳類であり、最も好ましくはヒトのＩＬ− ２、そして、天然またはＲｏｂｂら、１９８３の手順のように、いずれの便利な技術によっても産生ずることか出来る組換え体ｒＬ−２が含まれる。好ましくは、例えば、ＴａｎｉｇｕＣｌｌｉ　ら、＋９８３、またはＤｅｖｏｓ、　Ｒ，、Ｉ　９８３によって記述されたように、組換え体ＤＮＡによって得られる。本発明によれば、好ましくはネズミおよびヒト組換え体ＩＬ−２が使用される。

前に述へたように、最初にＥＰ　Ｎｏ、４１５３２１において開示された魚の視神経に出来する希突起膠細胞毒性因子は、後に、再生魚の視覚細胞を含むならし培地（本発明においては、再生魚ならし培地と称する）から精製され、以下によって確認された如く、ＩＬ−２様（ＥＰ　Ｎｏ、５０１４４５）分子であることが示された。すなわち；（ｉ）ＩＬ−２に対して発現された抗体は、再生魚ならし培地の希突起膠細胞毒性活性を中和したこと；　（ｉｉ）ウェスターンプロット分析によって、再生魚を含むならし培地において、２８ｋＤａの免疫反応性バンドの存在が明らかとなったこと；　（ｉｉｉ）本因子は、抗−ＩＬ−２抗体を使用して、再生魚ならし培地からアフィニティークロマトグラフィーによって精製されたこと：及び（ｉｖ）組換え体マウスＩＬ−２はｉｎ　ｖｉｔｒｏで希突起膠細胞に対して選択的活性効果を存するが、星状膠細胞に対しては有さなかったこと。希突起膠細胞毒性因子は、本発明の２量体に相当するかもしれない。

酵素的に産生しつる本発明の２量体のＩＬ−２は、以下の特性を有する。

（１）　それは水溶性である：（１１）それはＩＬ−２の共有結合による２量体である；（ｉｉｉ）それは希突起膠細胞系に選択的に細胞毒性を示す。そして、タイプ−１星状膠細胞や線維芽細胞のような他の細胞には細胞毒性を示さない；（ｉｖ）　その希突起膠細胞に対する細胞毒性活性は、ＩＬ−２に対して発現させた抗体によって中和される：（Ｖ）　それは哺乳動物ＩＬ−２を、神経由来のトランスグルタミナーゼと共にインキュベートすることによって得ることが出来；そして、（ｖｉ）　それはウェスターンプロット分析によって決定されたように、基質の哺乳動物のＩＬ−２の約２倍の分子量を有する。

より好ましい態様においては、本発明による酵素によって産生されだ哺乳動物の２量体ＩＬ−２は、約３０ｋＤａの分子量を有するヒトの２量体ＩＬ−２である。

本発明の神経由来のトランスグルタミナーゼＴＧ、は、以下の特性を有する；（１）　それは水溶性である；（ｉｉ）　それは再生中の魚の視覚神経がら得ることが出来る；（山）それは免疫ＩＬ−２を希突起膠細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する：（ｉｖ）　それは５ＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって決定したところ、約５５ｋＤａの分子量を有する：（Ｖ）　それは無傷の魚の視覚神経に比べて、傷害を受けた魚の視覚神経において、上昇した濃度において検出される。

（νｌ）それはトランスグルタミナーゼファミリーを特徴づけるアッセイにおいて、担体蛋白質へプトレッシンを組み込む：（ｖｉｉ）それはプトレッシンの組み込みにおいて、ｐＨ９と５６℃において最適活性である。

（ｖｉｉｉ）プトレッシンの組み込みにおけるその−は、基質の関数として計算すると５．５ＸｌＯ−７である；（ｉｘ）　それはＩＬ−２Ｊｌ化過程に関してＣａ”依存性酵素である：そして、（Ｘ）　それはトランスグルタミナーゼの２つの部位に相当するペプチドに対して発現された抗体に？いてのウェスターンプロット分析において免疫反応性バンドを示す。該ペプチドは、以下の配列のトランスグルタミナーゼの活性部位に相当する１４個のアミノ酸からなるペプチドＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ− Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ −Ｖａｔ及び次の配列の１０個のアミノ酸からなるペプチドＡｓｎ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓから選択される。

本発明による酵素的に産生された２量体ＩＬ−２と神経由来のトランスグルタミナーゼＴＧ、は、それらの単独または組み合せにおいて、ヒトをはじめとする哺乳動物において、中枢神経系（ＣＮＳ）の傷害神経の再生を誘発し、促進するための医薬組成物として使用される。このような組成物の調製は、ＥＰ　Ｎｏ、４１５３２１及びＥＰ　Ｎｏ、５０１４４５において記述されている。２量体ＩＬ −２、または酵素ＴＧＭ、または両者からなる組成物は、通常、哺乳動物のＣＮＳにおける再生に対する障害物となる希突起膠細胞をｉｎ　ｖｉｖｏで選択的に除去し、それによって、それら自身の環境において、軸索の生長を促進することにより、傷害神経を治療することができる。

図の簡単な説明図１は、再生中の魚の視覚神経のならし培地（ＣＭ）が、ＩＬ−２（ｈ　ＩＬ− ２）を２量化することが出来ることを示している。ＣＭの部分量をｈｌＬ−２と一夜インキユベートし、混合物を５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％アクリルアミド）にかけ、続いて、ｌ−２抗体を使用したウェスターンプロットを行った。免疫反応性バンドの可視化をＥ　ＣＬ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって行った。レーンズ：　ＩＩ　Ｃａ”の存在下てｈｌＬ−２とインキュベートしたＣＭ；　２．Ｃａ”の不在下でｈ［、−２とインキュベートしたＣＭ　；　３．　Ｃａ２＋の存在下におけるＣＭのみ、４．ｈｌＬ−２のみ。分子量の重量マーカーを同じゲル上で電気泳動にかけ、それらの位置を示しである。

図２は、ウェスターンプロット分析を示し、再生中の魚の視覚神経において５５ｋＤａのトランスグルタミナーゼ免疫反応性の蛋白質の存在が明らかとなる。ＣＭと再生視覚の高速遠心分離の上清（ＨＳＳ−Ｃ）と正常な非損傷神経（ＨＳＳ −Ｎ）の上清を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％アクリルアミド）上で電気泳動にかけた。プロットを、トランスグルタミナーセ酵素ファミリーに保存された１４ −アミノ酸配列に対して調製された抗体とともにインキュベートした。可視化はＥＣＬ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって行われた。レーンズ＋　ｌ、ＣＭ；　２．ＨＳＳ−Ｃ；　３゜５Ｓ−Ｎｏ図３には、魚の視覚神経のトランスグルタミナーゼ酵素（ＴＧ、）の段階的精製を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥが描カレテイル。レーンズ：　１．　ＨＳＳ　；　２．　Ｅｌｕ　−ＰＬＬ　（ＰＬＬ−アガロースカラムからの溶出液）　；　３．　Ｅｌｕ−ＴＧＡｂ　（抗−トランスグルタミナーゼアフィニティーカラムからの溶出液）。

図４Ａ−Ｃは、酵素ＴＧＭの生化学的特徴を図解している。パネルＡは、ｐＨの関数としてのＴＧ、によって媒介されたカゼインへのプトレッシンの組み込みをるＴＯ，のＭの定量を図解している。

図５は、精製されたＴＧＭがｈｌＬ−２を２量化することを示している。レーンズ　Ｉ、ｈｌＬ−２とともにインキュベートした精製ＴＧＭ　；　２．ｈ　ＩＬ −２のみ；３．ＴＧ、のみ。実験は、精製したＴＧ、をＣＭの代りに用いたことを除けば、図１に記載した如く行われた。インキュベーションは、すべて５蘭　Ｃａ”の存在において行われた。

図６Ａ−Ｄは、ＩＬ−２活性か、ＴＧ、によって媒介された２量化の後、希突起膠細胞に対する細胞毒性へとシフトすることを示す。希突起膠細胞の増強された培養物を、ＴＧ、単独、ＴＧ、とあらかじめブレインキュベートしたｈｌＬ−２、または、ｈｌＬ−２単独のいずれかを含む諸種の調製物で処理した。細胞毒性活性（生存細胞の数による）は、ＭＴＴ　ｌ：３−　（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕比色アッセイによって評価した。パネルＡは、ＭＴＴ染色の後ＴＧ、の存在下または不存在下において、１０またはｌ　ＯＯＵ／ｍｌのｈｌＬ−２て処理した諸種の培養物の定量的分析（６３０ｎｍにおける吸光度に対する５４０ｎｍにおける吸光度）を示す。パネルＢ：ｈｌＬ−２のみ（１００Ｕ／ｍｌ）で処理した培養物の顕微鏡図；パネルＣ：ＴＧ、！独で処理した培養物の顕微鏡写真；パネルＤ：ｈＴＬ −２（ｔｏ。

Ｕ／ｍｌ）とＴＧ、（酵素的に産生された２量体ｈｌＬ−２を含む）の混合物で処理した培養物の顕微鏡写真。

図７Ａ−Ｃは、ＴＧ、て処理した傷害神経における機能活性のオンラインの記録を描いている。この図は、ＴＯ，て処理した１匹の代表的動物（ラット）から得られた結果を提出している。視覚誘発電位（ＶＥＰ）応答を明細書（それぞれ、パネルＡ、ＢとＣ）に記述されたように、傷害の前と傷害１週後と６週後に記録した。傷害の６週間後に回復か小さいピークによって顕現され、すへては無傷害神経におけるピークに比較してシフトしていたことに注意。数値は、各時点における４つの記録から得られた平均値（実ＭＡ）士標準誤差（灰色の線）である。

図８Ａ−Ｃには、対照（バッファー処理）の傷害神経中のオンラインＶＥＰ応答か描かれている。代表的な動物（ラノｔ・）かバッファーで処理され、明細書中に記述されたように（それぞれ、パネルＡ、Ｂ、及びＣ）、傷害前と傷害後１及び６週間において記録された。価は、平均値（実線）士標準誤差（灰色の線）である。

図９には、Ｐ　ＣＲによるヒトＩＬ〜２ｃＤＮＡの産生物のデザインと構築か描かれている。（Ａ）ヒトＩＬ−２ｃＤＮＡ産物（Ｂｐ−ｐｏｓは、ヒトリンパ球由来のＩＬ−２ｃＤＮＡ配列上のプライマーの位置を指す）を構築するのに使用された加えられた制限部位（破線のホックス）を含む２組のプライマー。（Ｂ）線型２量体ＩＬ−２を構築するのに使用された２つの異なる単量体ＩＬ−２ｃＤＮＡのコピーを産生するのに使用された２つのＰ　ＣＲｓ　ａ図」０には、欠陥性のウィルスベクターアンブリコンプラスミドｐＣＢか描かれている。アンブリコンには、Ｈ３Ｖｌ開裂／パッケージングシグナル（Ｈ３Ｖａ）を含むｐＲＢ３１１９からの断片、ＤＮＡ複製のＨ３Ｖの起点（Ｈ３Ｖｏｒｉ）を含む断片、そして、Ｃ〜ＩＶプロモーター、ｊａｃ　Ｚ遺伝子、及びＳＶ４０のポリアデニル化シグナル〔ポリ（Ａ）＋ングナノりを含むｐｃＤＮＡ　ｌａｃからの断片か含まれる。これらの配列は、β−ラクタマーセ遺伝子（Ａｍｐ″）を含み、ＤＮＡ複製の細菌の起点（Ｃｏｌ　Ｅｌ　ｏｒｉ）を含むアンピンリン−抵抗性プラスミドｐＴ７−３に挿入された。このアンブリコンは、適用に使用された欠陥性ウィルスベクターゲノムに対する基礎として役立った。

図１１は、線型ＩＬ−２ダイマーのマウス抗ヒトＩＬ−２モノクローナル抗体てのウエスターンブロソｌ□分析を示す。左側のパネルは、感染Ｖｅｒｏ細胞（レーンズｌ、３）から採取された培地の２つの希釈（１：３．　レーンズｌ、３．　５．及び１：９．レーンズ２．　４．　６）を示す。感染Ｖｅｒｏ細胞の抽出物（レーンズ２゜４）と欠陥ウィルスのみによって感染された細胞から得られた培地と細胞抽出物（それぞれ、レーンズ５と６）をナトリウムドデシルサルフェートポリアクリルアミト電気泳動（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ）にかけた。矢印は、各スロットにおける免疫反応性ハントを指し示している。右側のパネルは、市販の単量体ＩＬ−２（レーン２）と神経由来のトランスグルタミナーゼによって合成され、大きさの対照として使用された２量体ＩＬ−２（レーンｌ）を示している。

分子量のマーカーを同じゲル上で電気泳動を行い、それらの位置が示しである。

図１２には、線形の２量体ＩＬ−２が希突起膠細胞に対して細胞毒性がないことを示している。比色ＭＴＴアッセイによって評価された希突起膠細胞に対する細胞毒性を異なる希釈（左側のパネル）において、図１１に記述された試料の部分量の適用によって検討した。これらの結果は、細胞毒性を存するＩＬ−２様因子が、酵素的に合成されたヒト２１体ＩＬ−２と同定された再生しつつある視覚神経（ＣＭ）に由来する水溶性物質で処理された平行実験（右側のパネル）と比較された。これらの処置の両者とも成熟希突起膠細胞の数の存意な減少を起した（ＡＮＯＶＡによると２量体ＩＬ−２．Ｆ＝７．８３３；ＣＭ、Ｆ＝Ｉ０４．９７６；そして、Ｆｉｓｈｅｒの比較によると、それぞれＰ＝０．０２およびｏ、ｏｏ。

１てあった。）。３回繰返された実験は、３重に行われた。結果は、１００％の生存を示す非処理の培養物の値と比較した平均上標準偏差として提出されている。

図１３には、線形２量体ＩＬ−２が、ＣＴＬＬ−２細胞の増殖を起すことを示している。チミジンの組み込みによってアッセイされたＣＴＬＬ−２細胞に対する生物活性は図Ｉｔ（左のパネル）に記述された試料からの部分量の適用によって検査された。結果は、ＣＴＬＬ−２細胞か市販の単量体ヒトＩＬ−２を対照として処理した平行実験（右側のパネル）のそれらと比較した。実験は同時に３回行われ、結果はｃｐｍで表わされている。

好ましい態様の記述本発明によると、トランスグルタミナーセファミリーの一員と同定された神経由来の５５−ｋＤａの酵素が、１■ｆ生視覚神経において上昇濃度において見出され、ＩＬ−２の２量化に関与していることが見出された。２量化は、軸索の傷害後の再生のために必要とされる、傷害によって誘発された条件を満足させるように因ｒの活性を変化させるための機作として、重要な役割を演じているかもしれない。

例えば、希突起膠細胞に対する傷害後の細胞毒性は、軸索の成長と伸長を阻害することか知られている成熟した希突起膠細胞を除去するのに重要であると考えられる。したがって、ＩＬ−２の活性を変化させることができ、それによって希突起膠細胞に対する毒性を増強する傷害によって誘発された酵素の上昇は、本発明において観察された結果を説明する要因の１っであるかもしれない。

組織に広く分（Ｈｉシている蛋白質のファミリーであるトランスグルタミナーゼは、蛋白質の安定化に関連していて、化学的、酵素的、及び物理的分析に対するその抵抗性を増すことか報告されている。このファミリーの酵素は、血漿及び細胞外体液において見出され、これらの酵素によって修飾された蛋白質は、血液凝固のフィブリンネットワーク、細胞膜、細胞外マトリックス、及び角質化の特徴において検出された（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、１９９１）。本発明のトランスグルタミナーゼ酵素、ＴＧ、は、神経の障害の下に見出され、神経系からはじめて精製された。

精製は、よく保存されたエピトープ、すなわち他の組織と種からの既知のトランスグルタミナーゼの活性部位に対して、発現された抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーによって達成された。魚の神経由来のトランスグルタミナーゼもこの保１７配列を有しているか、少くとも同族の配列を存し、ヒトに由来の蛋白質、すなわち、ｈｌＬ−２に対するその活性を説明しているように思われる。

この段階においては、活性部位以外の配列における変異も除外することができず、神経系に対してユニークであるかもしれない。しかし、他の起源、及び種のトランスグルタミナーゼも同様に活性である可能性があり、本発明の中に包含される。

現在までのところ、希突起膠細胞の阻害活性をまぬかれるために使用された最も効果的な方法には、阻害剤に対する特異的抗体の使用が含まれた（Ｓｃｈｎｅｌ　Ｉ　とＳｃｈｗａｂ、Ｉ　９９０）。ＴＧ、か利用できることになったので、いずれの種の組換え体ＩＬ−２も、酵素ＴＧＭとインキュベーションすることによって、すへての撞の希突起膠細胞に対する細胞毒性因子の調製に対して道か開かれた。

哺乳動物がＩＬ〜２自体においててはなく、その翻訳後の修飾のために必要な酵素力次失していることも可能である。希突起膠細胞毒性因子に相当する酵素的に産生された２量体ＩＬ−２は、傷害後の成熟神経から希突起膠細胞を除去するために必要とされ、神経の成長を起り易くする反応性の形であるように思われる。

このように、本発明によれば、活性因子（ＩＬ−２）が異なる型の活性を存する形（酵素学的に産生されたＩＬ−２ダイマー）に変換される機作のための証拠が与えられている。二重化した蛋白質の構造が、その活性因子への変換に役割を演しているかどうか、または、２量体のいかなる立体配置（例えば線形）でもよいであろうかどうかを調べるために、線形２量化ＩＬ−２蛋白質の高濃度を発現する単純ヘルペスウィルス（Ｈ３ＶＩ）の欠陥ウィルスベクターを構築した。単量体蛋白質か翻訳後の修飾によって２量体に変換される酵素的に合成された２量体ＩＬ−２とは対象的に、このように構築された線型２量体ＩＬ−２蛋白質は、転写のレヘルにおいてデザインされ、したがって翻訳の産物であった。欠陥ウィルスそれ自身が細胞内に留まり、挿入された蛋白質を発現し続けたとしても、このアプローチを使用して、我々はその合成後培地中に放出された高レベルの線形ＩＬ−２蛋白質を得ることができた。

直線状のＩＬ−２ダイマーは酵素的に産生されたＩＬ−２２量体とは異なる構造を有しており、これを用いて本蛋白質の細胞毒性の特性は、その構造的立体配座の関数であることか示された。遺伝子工学的技術によって産生された線型２量体ＩＬ−２は、単量体ＩＬ−２の生物活性を保持していたが、酵素的に２量化されたＩＬ−２によって発揮された希突起膠細胞毒性活性を示すことができず、特異的な型の活性を示す２量体へのＩＬ−２の変換は、構造依存性であることを示した。

その上、ＴＧ、それ自身も、哺乳動物のＣＮＳの切断された神経において、神経それ自体の環境内で再生成長を起し、機能的回復へと導くことができる。ここに与えられた例は、魚の神経由来のトランスグルタミナーゼであるけれども、特に神経由来のすへてのトランスグルタミナーゼが本発明に包含されるように意図されている。

本発明は、今や、以下の例によって説明されるが、それらによって制限されな例希突起膠細胞毒性因子が傷害を受けた視覚神経によるならし培地中に存在し、希突起膠細胞毒性因子は、その細胞毒性が抗−ＩＬ−２抗体によって中和される約２８Ｋｄの分子量のＩＬ−２様分子であることが見出されたので、次に魚の障害を受けた神経が、哺乳動物の低分子量のＩＬ−２をＩＬ−２の高分子量型へ修飾できる物質、恐らく酵素を有するかどうかを検討した。再生中の魚の視覚神経によるならし培地を、外部からカーえたＩＬ−２を翻訳後に修飾する機作の存在について検討した。したがって、ヒト組み換え体ＩＬ−２（ｈＩＬ−２）を５μＭのＣａ”“の存在下及び不在下に、ならし培地（ＣＭ）とともにインキュベートし、その結果得られた産物をＩＬ−２に対して発現された抗体の助けをかりてウェスターンプロット分析にかけた。

この目的のためには、再生中の魚の視覚神経によるＣＭは、前にＥｉｔａｎら、１９９２によって記述されたように調製された。手短かに述へれば、鯉を０．０５％３−アミノ安息香酸エチルエステル（シグマ）で麻酔し、ピンセットで右の視覚神経を（３０秒間）破砕し、６−７日後摘出し、血清を含まない培地中にインキュベートしたく１．５時間２５°Ｃ１３００μｌの培地中に４本の神経断片）。

その結果得られた培地（ＣＭ）を採取し、それらの蛋白質の含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法によって定量した。

６μｇのＣＭの部分量をｈｌＬ−２とともに、５酬のＣａＣｌ２て静かにしんとうしながら一夜インキュベートした。混合物を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％アクリルアミド）にかけた。ゲルを２００ｍＡでニトロセルローズ上へ２時間プロットした。そして、ニトロセルローズを４°Ｃで５％（ｗｔ／ｖａｔ）ミルクを含むリン酸バッファー食塩水（ＰＢＳ）とともに−夜インキユベートし、次にＰＢＳ中で洗浄した。プロットは、ＩＬ−２抗体と３７°Ｃて２時間インキュベートし、次に、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０を含むＰＢＳ中で５分ずつ３回洗浄し、最後に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−結合ヤギ抗ウサギＩｇＧとともに室温で２時間インキュベートした。免疫反応性バンドの可視化は、Ｅ　ＣＬ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって達成された。

結果は図１に示されている。図１において、レーンｌ、　Ｃａ”の存在下でｈｌＬ−２とインキュベートしたＣＭ；レーン２．　ｃａ”″の不在下でｈＩＬ−２とインキュベートしたＣＭ：レーン３．　Ｃａ”＋の存在下でのＣＭのみ；レーン４．　Ｃａ”の不在下ｈｌＬ−２のみ。分子量のマーカーは同じゲル上で電気泳動にかけ、それらの位置を示しである。ｈＩＬ−２のみを含むスロットにおいては、１つの１５ｋＤａの免疫反応性バンドだけが見出された。ＣＭとインキュベートした後、元のＴＬ−２化合物の２倍の分子量をもつさらなるＩＬ−２免疫反応バンドを検出することが出来た。これらの結果から、再生中の神経がＩＬ− ２を２量化する機構を存している可能性が有力となった。高い分子量のＩＬ−２免疫反応性混合物は、Ｃａ”をインキュベーション混合物に加えなかったとき（図１．レーン２）は観察されず、２量化の過程は、Ｃａ”−依存酵素によって媒介されていることが示唆された。

例２．魚の視神経中のトランスグルタミナーゼの免疫反応性は傷害後に上昇するこれらの知見にかんがみて、ＩＬ−２を修飾する原因となる作用体は、傷害後、選択的に上昇し、その酵素の効果は、ＩＬ−２分子の２量化を達成することであるという可能性を考えた。酵素トランスグルタミナーゼは、有力な候補と考えられた。それは、蛋白質の架橋結合に関与することが知られており（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら。

１９９１）；さらに、再生中の魚の視覚神経において、トランスグルタミナーゼを暗示する活性が上昇していることが提案されたからである（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら。

１９８７）。

抗トランスグルタミナーゼ抗体は、ウシ血清アルブミンに結合した１０個と１４個のアミノ酸からの合成ペプチドの各々に対して、ウサギにおいて発現された。

配列が、Ａｓｎ　−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓのペプチド、または、Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ｇｌｎ　−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ　−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌは、他の種と組織のトランスグルタミナーゼの既知配列に相当している。アミノ酸１４個よりなるペプチドは、トランスグルタミナーゼの活性部位を表している。

ウェスターンプロット分析によって、再生中の魚の視覚神経に５５ｋＤａｌ−ランスグルタミナーゼ免疫反応バンドの存在が確認された。例１に記述したようにゲルをプロットした。ＣＭ（２０Ｍｇ）と再生視覚神経の高速遠心分離上清（ＨＳＳ−Ｃ、１６μｇ）と正常の非傷害神経の高速遠心分離上清（ＨＳＳ−Ｎ、２０Ｍｇ）を、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０％アクリルアミド）上で電気泳動にかけた。

プロットを、上述の保持された１４個のアミノ酸からなるペプチドに対して調製された抗体と室温で２時間インキュベートした。そして、次に０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０を含むＰＢＳ中で５分間ずつ３回洗浄した。最後に、プロットは、ＨＲＰ−結合ヤギ−抗体と３７°Ｃで２時間インキュベートした。可視化は、ＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によって行われた。

結果は図２に示しである。図中：レーンズ：　Ｉ、ＣＭ；　２．ＨＳＳ−Ｃ；　３゜ＨＳＳ−Ｎ０５５−ｋＤａの免疫反応バンドは、ＣＭとＨＳＳにおいて観察された。

濃度計による分析から５５−ｋＤａ免疫反応性バンドは、ＨＳＳ−ＮにおけるよりもＨＳＳ−Ｃにおいて３倍高いことか明らかになった。

例３．魚の視覚神経グルタミナーゼの精製このトランスグルタミナーセ免疫反応性蛋白質か観察されたＩＬ−２の修飾の原因であることを確かめるために、それを以下の如く精製した：コイ（ＣＹｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）の視覚神経（ｎ＝６０）を破砕傷害した。６−７日後に摘出し、１．　５ｍＭ　ＣａＣｌ　２．　Ｉ　ｍＭスペルミジン、２５　ｔｔ　ｇ／ｍｌアプロチニン、２５　μｇ／ｍｌのロイペプチド、および５μｇ／ｍｌペプスタチンを含む、ｐＨ７，４の１０蘭トリス−ＨＣｌのバッファー中でホモジナイズした。ホモジネートに蔗糖を加えて最終濃度０．２５Ｍを得た。４°Ｃ１１５０，０００ｇにおいて、１時間遠心分離した後、高速遠心上清（ＨＳＳ）を集め、その蛋白含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法によって定量した。

ＨＳＳを次にアガロースと結合させた、ポリーＬ−リジン（ＰＬＬ）のアフィニティーカラムを通して溶出し、得られた溶出液（溶出液ＰＬＬ）を、トランスグルタミナーゼの保存された１４個のアミノ酸からなるペプチドに対して上述の如く調製され、アフィニティで精製したウサギの抗体のさらなるアフィニティーカラムにかけた。結合した物質を、カラムがらｐＨ２，７の０．２Ｍグリシンで溶出し、ＩＭＩ−リスｐｏｓ、０で中和し、それらの蛋白含量を定量した（溶出液ＴＧＡｂ）。精製段階は表１に要約されている。

点−よ魚の視覚神経のトランスグルタミナーゼの精製溶出液ＰＬＬ　１．　８　７．　８溶出液ＴＧ　Ａｂ　Ｏ，００４３５００トランスグルタミナーゼアフイニテイーカラムから溶出された蛋白質を、それらの純度を確かめるために１０％５ＤＳ− ＰＡＧＥにかけた。図３は、魚の視覚神経トランスグルタミナーゼ（ＴＯ，）の段階的精製を示す５ＤＳ−ＰＡＧＥである。各段階の後に得られた調製物を５ＤＳ−ＰＡＧＥにがけ、分析された蛋白質の可視化のために銀染色を行った。レーンズ：　１．　ＨＳＳ　；　２．　Ｅｌｕ−ＰＬＬ；３．Ｅｌｕ−ＴＧ　Ａｂ、示されているように、最終精製段階の後に５５ｋＤａの単一バンドか得られた。

酵素ＴＧ、はまた、再生中の魚の視覚神経のならし培地から、アガロースに結合させたＰＬＬのアフィニティーカラムに適用することにより、そして、ホモジネートについて上述したように、溶出液を、抗体によるさらなるアフィニティーカラムにかけ、溶出することによって精製することができる。

例４．ＴＯ，によって媒介されたプトレッシンのカゼインへの組み込み放射活性プトレッシンのある担体蛋白質への組み込みは、トランスグルタミナーゼファミリーの酵素のアッセイの特徴である。カゼインやウシ血清アルブミンのようなりジン残基を存する担体蛋白質は、すべて、アッセイにおいて使用することが出来る。

本例においては、神経由来のトランスグルタミナーゼの活性の特徴は、Ｎ、Ｎ− ジメチルカゼインへの（”Ｃ）プトレッシンの組み込みによって測定された（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、１９８７）、例３において、ＴＯ−Δｂアフィニティーカラムからグリノンで溶出された精製ＴＧＭ酵素を、Ｎ、　Ｎ−ジメチルカセイン（１ｍｇ／ｍｌ）の存在下で２時間透析を行ってから反応８合物に加えた。

反応は、粗ＴＧ、（０，７−７−１Ｏ０の添加によって開始され、続いて３７° Ｃで２０分間インキュベーションを行い、水冷したトリクロロ酢酸（ＴＣＡ；最終濃度、５％）の添加によって終結させた。ＴＧＭの比放射能は、５０２０００ ±１１５０００（（”Ｃ）ブ１−レッジン／ｕｇ蛋白質；ｃｐｍ）　（ｎ＝３．　２ツの精製、３アツセイ）である。

酵素活性は、温度、ｐＨ及び基質濃度に関して滴定された。図４Ａど４Ｂにそれぞれ示されているように、ＴＧ、の最適活性は、ｐＨ９附近にあり、５６°Ｃに見出された。陽は、基質濃度の関数として、活性の滴定を行って計算され、５．５×１０−７Ｍであることが見出された。滴定は、ＴＧ、の存在下におけるカゼインへの（”Ｃ）プトレッシンの組み込みを測定することによって行われた。

例３の精製酵素がＩ　Ｌ　−２を２量化する能力か検討された。本実験においては、ｆｉｔ　ＣＭではなく、精製されたＴＧＭか使用されたことを除けば、ヒト組み換え体ＩＬ−２（１１１Ｌ−２）を例１において記述されたようにインキュベートシた。

対照として、ｈＩＬ２、または精製酵素ＴＧＭを、別々に同しバッファー中でインキュへ−１−した。インキユベーシヨンは、すへて、５閘のＣａ　２４及び熱て不活性化した０　３％のウソ胎児血清（Ｆｅ２）の存在下で行われた。

インキユベーシヨンのＬ混合物を、ウェスターンプロット分析に適用した。

分離は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１２％アクリルアミド）」二で行われ、続いて２時間、２００ｍＡにおいてニトロセルローズＦへブロッティングした。次に、ニトロセルローズをＦＢＳ中で洗い、最初に５９６のミルクを含むＦＢＳ中で４° Ｃで一夜インギュへ−１・し、次にヒ１−ＩＬ−２に対して発現されたウサギ抗体とともに３７°Ｃて、そのｉ！、さらに２時間インキュベートし、０．０５％Ｔｗｅｅロー２０を含むＦＢＳ中で３回洗浄した。最１＆の洗浄の１＆、西洋ワサヒペルオキシダーセと結合させたヤギ抗−ウサギ抗体（ＨＲＰ−ＧａＲｂ）と共に室温でさらに】　１量２時間インキュヘーンヨンを行い、続いて、Ｔｗｅｅｎ　−２０を含むＰＢＳで３回洗浄し、ウェスターンブロッティングの検出試薬（ＥＣＬ、　Ａｎｘｒｓｈａｍ）　中で１分間インキュベートし、風乾し、フィルムに暴露した。結果は図５に示されている。図中：レーンズ；Ｉ、ｔｆ４製ＴＧ、プラスｈＩＬ−２，２，ｈＩＬ−２のみ、３．ＴＧ。

のみ。

図５に示されているように、元のＩＬ−２に加えて、３０ｋＤの高分子量のＩＬ −２免疫反応性バンドが得られた。濃度計による分析からこれらの条件下でＩＬ −２の約２５％が２量化したことが明らかとなった。

２量化の生物学的意義を確かめるために、我々は、結果として生じた２量体ＩＬ −２が、希突起膠細胞に対して細胞毒性があるかどうかを検討した。ｈｌＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ、または１０　Ｕ／ｍｌにおける）を精製ＴＧ、酵素とインキュベートし、次に、反応混合物をラットの脳の希突起膠細胞の増強培養に適用した。

対照培養は、無処理希突起膠細胞、及びＸｏ　ｏ　Ｕ／ｍｌと１０　Ｕ／ｍｌのｈｌＬ−２゜及び精製酵素に別々に暴露された希突起膠細胞からなっていた。

新生ラットの脳に由来した増強された希突起膠細胞は、Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎと５ａｔｏ。

１９７９によって記述されたように調製され、ＰＬＬ（２０μｇ／μｍ）（シグマ）でコートされたウェル中に接種された。７２時間後に、接種された細胞をＴＧ、単独、ＴＧＭとあらかしめインキュベートしたｈＩＬ−２、またはｈｌＬ− ２単独を含む種々の調製物で処理した。２つの異なる濃度、ｌ　ＯＵ／ｍｌｌ！：１００　Ｕ／ｍｌにおけるｈｌＬ−２を一定量のＴＧ、とインキュベートした。細胞毒性活性（生存細胞の数による）は、比色ＭＴＴ　（シグマ）アッセイによって評価された（Ｔ、　Ｍｏｓｍａｎｎ、！　９８３．　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈ、６５　：５５−６３）ｏ諸種の調製物と４８時間インキュベーションした後、ＭＴＴ（１０μｆ、５■／ｍｌ）を３時間加え、次に、培地を除き、１００μｌのイソプロパツール中０．０４ＭＨＣｌを加えた。結晶が全部溶解するまで、細胞を静かに振盪した。それらの吸光度は、参照としての６３０ｎｍにおける吸光度に対する５４０ｎｍにおいて記録した。

結果は、図６Ａ−Ｄに示されている。顕微鏡写真は、ＭＴＴ染色後の種々に処理した培養物を示す。Ｂ、ｈｌＬ−２のみ（１００１量ｍｌ）で処理した培養物；Ｃ，ＴＧ、のみて処理した培養物；Ｄ、ｈｌＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）と酵素的に産生じたｈｌＬ−２を含むＴＧＭの混合物で処理した培養物。図６においてみられるように、酵素的に産生された２量体のＨ，−２を含む反応混合物で処理された希突起膠細胞の培養物のみか細胞毒性を示した。図５に示された結果から、２量体ＩＬ−２を含む反応混合物においては、ＩＬ−２の２５％が２量体であり、残りは単量体であるように思われる。したがって、１００　Ｕ／ｍｌの単量体が細胞毒性を示さない条件下で、２量体形の２５０量ｍｌのＩＬ−２は細胞毒性を示すのに十分であると思われる。

増強させた希突起膠細胞の調製のためには新生ラットの脳（生後２日）を摘出しく２ｍｌのＬｅｉｂｏｗｉ　ｔＺ培地中に２つの脳（Ｌ−１５）　；Ｇｉｂｃｏ　）そして１ｍＭのエチレンジアミンテトラアセティツクアシッド（ＥＤＴＡ）を含むＤＭＥＭ　（Ｃａ”とＭｇ　！　＋を含まない）中に、３　ｘ　ｌ　Ｏ’ 　Ｕ／ｍｌのトリプシン（シグマ）によって化学的に解離させた。機械的解離は、トリプシン溶液で、３７°Ｃで１０分間インキュベーションする前に行った。

次に、細胞を１ｍｌの７４　Ｕ／ｍｌ　ＤＮアーゼ（シグマ）、５２００　Ｕ／ｍｌの大豆トリプシン（シグマ）、及び３ｍｇのＢＳＡを含む１５ｍ１のコニカルチューブに移し、室温で１分間インキュベートし、１０ｍ１の培地に加え、続いてＤＥＭＥ中３回洗浄した。最後の洗浄の後、細胞を５−１０％ウソ胎児血清（ＦＢＳ；シグマ、５６°Ｃで３０分間加熱により不活化した）を含むｌ　ＯｍｌＤＭＥＭ中に懸濁させ、メツシュを通過させ、あらかじめ２０μｇ　／ｍｌのポリーＬ−リジン（ＰＬＬ、Ｍｗｌ　ｏｏｏｏｏ　、シグマ）で、３７°Ｃで一夜コートした８５庇２のフラスコ（Ｎｕｎｃ）に接種した。細胞接種後の最初の２４時間で培地を交換し、その後は、２−３日毎に１回培地交換を行った。接種８日後に細胞を振盪しなから４−６時間インキュベートし、上溝を取除き、残りの細胞を、数時間１０ｍ１の培地（ＤＭＥＭ＋５−１０％ＦＢＳ）中でさらに数時間インキュベートし、−夜振盪した。振盪によって除去された細胞を集め、遠心分離し、次にペレットとなった細胞をｌ−２ｍ１の血清を含まない培地中に再懸濁した。このようにして得られた増強された回収希突起膠細胞を、あらかじめＰＬＬ（２０μｇ／ｍｌ）でコートされた９６−穴のプレート上に接種した。細胞を１００μｌの限定培地（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎと５ａｔｏの限定培地に対するＲａｆｆによる改変培地ともに接種した）。４８−７２時間後に接種した細胞を上述のように処理した。

３０匹の成熟（１２−１４週１ｆｒｔ＋）　Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ　（Ｓ　Ｐ　Ｄ）ラットにおいて、損傷を与えた前１麦の視覚経路における変化をオンラインモニターするために、視覚野皮質中に電極を埋め込んだ。麻酔ラット（Ｒａｍｐｏｎ、　Ｖｅｔａｌａｒ　）を、小動物用の定位固定装置に固定した。

そして露出した頭蓋骨にドリルで２つの穴をあけた。

皮質の損傷を最小限に止めるために、硬膜は傷っけないようにした。鼻骨の上まであけた１つの穴は、基準電極部位として使用した。２つ目の穴は、前項−８ｎｗｎ側方３ｎｗｎのＯＣＩ領域においてあけた。電極は、ねじに接続された金の接触ピン（Ｗｉｒｅ−Ｐｒｏ、　Ｉｎｃ、）であり、これを穴の中にねじ込み、アクリル酸セメントで頭蓋に接着した。フィールド電位は、最初に正常神経において記録をとり、次に、傷害後は、ストロボスコープによる刺戟で誘発させ（キセノン閃光管４ｗ／秒。

■−２ｍ秒の持続時間、０．　３Ｈｚ）、１，０００倍に増幅しくＡＭシステム、マイクロ電極増幅器、Ｍｏｄｅｌ　ｌ　８００）　、デジタル化した（１２ビツト、５００サンプル／秒）　（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｂｏａｒｄ　ＭＩＯｌ　６−９とＬａｂ　Ｖｉｅｗ２．２．　Ｉ　Ｄａｔａ　Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ　とＭａｎａｇｅｍｅｎｔ　Ｓｙｓｔｅｍ）　ｏ視覚誘発電位（ＶＥＰ）の記録中は、反対側の眼には常に覆いをした。電極を埋め込んだ１週間後に、左側の視覚神経を神経鞘を開いて露出した。先端が２００μｍで、なめらかに切れ味を鈍くした刃を存する特別にデザインされたガラスのプローブにより、神経全に切断し、ＴＧＭを含まないか、含む２μｌのバッファー（それぞれ、対照とＴＧ、処理と呼ばれる）溶液を、ガラスのピペットで傷害部位に注入した。手術と処置と記録については、２重盲検の手順に従った。使用されたＴＧＭは、例３にしたがったＣＭから精製したＴＧｘであった。

３０匹の動物のうち、損傷を与えた１週間後に、恐らく不完全な切断を反映する残存ＶＥＰ活性を示す８匹を実験から除き、１０匹のＴＧ、処置動物、及び１２匹の対照動物を、その後の実験のために残した。損傷を与えた６週間後に、残った２２匹の動物についてＶＥＰ応答を再び記録した。ＶＥＰは、２つのパラメーターによって特徴づけられる。すなわち、最初の負のピーク反応の潜伏期と振輻である。このオンライン実験においては、１週間後に応答がなかったので、追跡検討のために残っていた神経の傷害を受けたＴＧ、処理の１０匹の動物のうち、７匹が機能回復を示した（表２）。１週間後に、残された１２匹の対照動物においては、５週間後に回復は認められなかった（表２）。

ＴＧ、処理の傷害を受けた神経における大抵の場合の活性のピークは、未傷害の神経のそれらに比へて、振幅と潜伏期の両方において有意な差をもってシフトが起きているように思われた（表３）。ＴＧ、処理傷害神経における振幅は、正常神経におけるよりも常に小さいけれども、恐らく一次標的（外側膝状核）におけるぬけた部位への樹状分岐、あるいは誘発反応において関与している神経伝達物質の性質と量の変化のために、予想よりも高かった。

図７Ａ−Ｃは、ＳＰＤラットのＴＧ、−処理傷害神経における機能活性のオンライン記録の典型的な結果を示す。ＶＥＰ応答を傷害前（パネルＡ）と傷害の１週間後と、６週間後（それぞれ、パネルＢとＣ）に記録した。傷害の１週間後には、ＶＥＰＬ？答は検出されなかった。しかし、６週間後には正のＶＥＰ活性が記録された。ピークは、傷害前の状懸に比べてシフトしていて、潜伏期がより長く、振幅はより小さかった。図８Ａ−Ｃは、典型的な対照動物（バッファー処理）の記録を示す。図は、傷害前（パネルＡ）、傷害の一週間後、及び６週間後（それぞれ、パネルＢとＣ）に記録されたＶＥＰ応答活性を示す。ＶＥＰ応答は、傷害の６週間後においては検出できなかった。

表２個々のＴＧ、４処理の傷害及び対照動物のＶＥＰ応答。各動物のＶＥＰ応答を、傷害６週間後に記録した。最初の負のピーク応答の潜伏期間と振幅が示されている。これらの動物は、すへて、傷害の１週間後にＶＥＰ活性の完全な不在を示した。

処　理　潜伏期間（ｍ　５ｅｅ）　振幅（μＶ）対照（ｎ＝１２）　０　０表３ＴＧ、−処理傷害及び無傷の神経におけるＶＥＰ応答の特徴。平均の潜伏期間と活性の最初の負のピークの振幅変が提出されている。ＡＮＯＶＡ、１因子分析は、＠ＤＦ＝ｌ、Ｆ＝３４．０１８．ｐ＝Ｑ、ｏｏｏ　１．”ＤＦ＝１゜Ｆ＝９３．１０１．ｐ＝Ｑ、ｏｏｏｔを生じた。Ｆｉｓｈｅｒによる比較により、９５％における有意差が明らかとなった。

無傷の神経　３９．７±１．４　１３１．８±８．７　１３この実験は、それら自身の変質した環境内において、恐らく成長を容易にする処理の後、成熟動物の切断されたＣＮＳ神経における機能の回復を示す（Ｌａｖｉｅら、＋９９０）。

他の研究は、これまでのところ、生理学的回復が起ることなく、それら自身の環境内において、ＣＮ５Ｏ軸索の成長を達成した。このようにして、例えば、唾乳動物のミニリンと関連した阻害剤に対する抗体を産生ずるバイブリド−マノ使用か、を髄内の再成長（Ｓｃｈｎｅｌ　ｌとＳｃｈｗａｂ　、ｌ　９９０）を促進することか示された。同様に、胎児の星状膠細胞でコートされたミリボーア移植体が、破壊された背部のルート軸索の成熟咄乳動物のを髄の灰白質への成長を促進した（Ｒｕｄｇｅら、＋９９０）。新たに成長する哺乳類の軸索の生理学的活性が、神経自身の環境内での成長の結果としてではなく、神経自身の成長を敵視する環境が、移植した末梢神経のブリッジによって置き換えられた後示された。

この結果、移植体の長さに沿って脳まで、全通のりにおいて、軸索の成長を生した。上位シナプス丘が見出されたか、軸索は、標的ＣＮＳ組織内の限られた距離しか貫通しなかった（Ｋｉｒｓｔｅａｄら、ｌ　９９０　：　Ａａｇｕａｙｏ　ら、１９９０ａと１９９０ｂ）。

本実験においては、ＴＧ、酵素の局所的投与の後に、機能恢復が起り、この酵素は、自然発生的に再生しつつある神経系において、傷害後単離された。再生中の魚の視覚神経から単離された本酵素は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでＩＬ−２を２量化し、希突起膠細胞に対して細胞毒性を存するようにその特性を変える。本実験においては、活性なＩＬ−２の２量体が、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて形成され、傷害後間もなく、少くとも傷害の部位のごく近傍において、酵素的に産生された２量体によって、成熟希突起膠細胞の除去が、成長を促進するかもしれないという仮定に基いて、ＴＧ、をｉｎ　ｖｉｖｏて適用した。しかし、酵素ＴＧ、の活性の他の機作も除外すべきでない。

ＶＥＰ応答は、網膜から脳皮質に至るまでの視覚的システムの完全性を示唆する客観的生理学的パラメーターである。傷害の１週間後には検出されなかったが、５週間後には存意な活性が記録されたという我々の知見がら見ると、ＶＥＰ応答は、軸索の成長と再結合の結果であると仮定することは理に適っている。その上、ＴＧＭで処理された神経の大部分において、潜伏期間が、無傷の神経に比べて延長され、応答が、標的に再分布する新たに成長しつつある（髄鞘がない）軸索の結果であるかもしれないという概念を、さらに支持している。

例８．線型２量体ＴＬ−２の調製線形２量体ＩＬ−２の蛋白質を、ウィルス発現ベクターを使用することによって構築し、感染細胞の培地中に大量の線形ＩＬ−２の２量体が発現できるようになった。

この実験においては、以下の実験的手順か使用された。

８．１　リンパ球とＲＮＡの調製ヒトリンパ球を単離し、ＩＬ−２ｍＲＮＡの量を最大にするように刺戟した。

末梢血をヘパリンで処理した６０−ｍｌの注射筒に集め、等量の燐酸バッファー食塩水（ＲＢＳ）で希釈した。次に混合物を、１．０７７ｇ／ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（４９，２％　Ｐｅｒｃｏｌｌ　、Ｉ　５０ｍＭ　ＮａＣ１）の上に重層し、４００ｘｇ、４°Ｃで２５分間遠心分離した。リンパ球に富んだ軟膜を、ガラスのＰａ５ｔｅＵｒピペツトで集め、ＰＢＳ中で２回洗浄した。リンパ球の２Ｘ１０’細胞／ｍｌを平板にまき、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）、２％熱不活性化ウつ胎児血清（ＩＦＣ３）、１００　Ｕ／ｍｌペニシリンとＯ、Ｉ　ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン（シグマ）、及び５×１０−’Ｍβ−メルカプトエタノールからなる完全培地中ｌμｇ／ｍｌのビーナツツ赤血球凝集素の存在下で３日間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、完全培地中２ＸＩＯ’細胞／ｍｌにおいて新しいフラスコ上に平板にまき、ｌμｇ／ｍｌのＰＨＡと１０量ｇ／ｍｌホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で３時間刺戟した。全細胞ＲＮＡを、Ｂｉｏｔｅｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓキットの助けをかりて、ＲＮＡ　ｚｏｌ　Ｂ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ　と５ａｃｃｈｉ　、１９８７）によって単離し、２６０／２８０量ｍにおける吸光度で定量した。

８．２　ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と配列分析ＰＣＲｓは、Ｇｅｎｅ　Ａｍｐキット（Ｃｅｔｕｓ、ＵＳＡ）の助けを借りて行った。全ヒトリンパ球ＲＮＡ（ｌμｇ）を４２°Ｃで１５分間、ＰＣＲバッファー（最終的にＩＸ）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２．ＩＵ／ｕｌ　ＲＮアーゼ阻害剤、５０μｍｏｌの特異的下流のプライマー、及びＩｎ＋ＩＪの各ｄＮＴＰとともに、全反応容量２０μｌで逆転写酵素反応を行った。逆転写酵素を熱で不活性化した後、反応混合物に、５０μ ｍｏｌの下流のプライマー、１００１００ｐの上流のプライマー、ＰＣＲバッファー（最終的にＩＸ）、２ｍ！ｉｌ　ＭｇＣ１ｔ溶液、そして、２．　５０ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを加えることによって１００μｌとした。最初のＰＣＲサイクルを４５℃で１分間、７２℃で１分間、及び９４°Ｃで１分間行った。５５°Ｃにおいて３０秒、７２℃において１分、そして９４°Ｃにおいて１分間の各３０サイクルがこれに続いた。

ｃＤＮＡｓの両端が完全に埋められ、このようにして制限酵素での適切な消化を促進することを確実にするために（もし反応が増幅したＤＮＡから出発したならば、３０の各サイクルは、非特異的増幅バンドが除去できるように、９４°Ｃで１分間、そして７２°Ｃで１．　５分間継続した）、３０サイクルの終りに、７２℃において５分間の余分の処理を加えた。ＰＣＲの産物を、適切に消化されたブルースクリブｔ−ＫＳ−ベクターに連結した。連結されるべきＤＮＡ５の各々（１０量ｇ）は、６５℃で５分間加熱され、次に、連結バッファー（最終的にｌ ×。

Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）とともに全反応容量が１０μｌで室温で１５分間インキュベートした。連結は、１５°Ｃで一夜インキユベーションすることによって起った。組み換え体は（確かな反応能のある細胞であるＥｐｉｃｕｒｉａｎ　ｃｏｌｉに、Ｓ　ｔ　ｒａ　ｔａｇｅｎｅ）クローニングされ、アンピシリンを含むプレート上で一夜の成長のため平板にまかれた。陽性のクローンは、ミニスケールＤＮＡ調製のための（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）アルカリ法に続く、制限酵素分析とゲル電気泳動によって明確にした。陽性クローンは、５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（ＵＳＢ）の助けをかりて、Ｓａｎｇｅｒのチェインターミネータ−法によって配列を決定した。

８．３　細胞のトランスフェクション、ウィルスベクターの発生と蛋白質抽出ウサギの皮膚（Ｒ３）細胞とアフリカミドリザルの腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞を、１０％ＩＦＣ３，１％グルタミン、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補添したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で成育させた。Ｒ３細胞を、カルシウムホスフェート法（Ｇｒａｈａｍとｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、１９７３）によって、そしてその後、グリセロールショック（Ｐａｒｋｅｒと５ｔａｒｋ　、１９７９）をがけて２０μｇのｐＣＢ−ＩＬ−２ダイマー（以下に記述された）をトランスフェクトさせた。

１０から２０％の範囲のトランスフェクションの効率は、１０μｇのｐＣＢ−ＩＬ−２ダイマーと１０μｇのＸ−ｇａｌプラスミドＤＮＡとともにコトランスフェクトされた細胞中の細菌のβ−ガラクトシダーゼ（Ｓａｎｅｓら、１９８６）の組織化学的検出によるプレートあたりの青色細胞数／全細胞数に基づいて決定された。

３７°Ｃと５％ＣＯ□の雰囲気下で一夜インキュベーションを行った後、培地を除去し、細胞を温度感受性Ｉ（ＳＶＩ　（Ｇｒａｈａｍとｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、１９７３）　ｔ　ｓＫ株（Ｄａｖｉｓｏｎら、１９８４）で感染の多重度０．　１プラ一ク形成単位（ｐｆｕ）／細胞数で重感染させた。３１．５°Ｃて１．　５時間インキュベートした後、細胞を１％ＩＦＣ８を補添したＰＢＳて２回水洗シタ。ソシテ、ＤＭＥＭ／１９６、ＩＦＣ３／１％ペニシリン−ストレプトマイシン／１％グルタミン中において同じ温度でインキュベートした。

通常、重感染の２日後であるが、細胞のすへてか細胞変性効果を示したとき、ウィルスのストックを収穫した。培地中の集められた細胞をｌｏｏｏｇで５分間遠心分離し、ペレットをウィルスバッファー（１５０量ＭＮａＣ１／２０ｍＭ）リス、ｐＨ７，５）中に再懸濁させた。懸濁物を、−７０″Ｃて急速に凍結し、３７°Ｃで解凍しく３回繰返した）、そして、次に、欠陥性ウィルスの異なる希釈において、Ｖｅｒｏ細胞を感染するのに使用した。３７°Ｃにおいて（ｔｓＫに対しては非許容温度）−夜インキユベートした後、放出された合成蛋白質を含む培地を集め、細胞を１０ｒｒＭトリス、ｐＨ７，５，１５０ｍＭ　ＮａＣ１、１％Ｔｒｉｔｏｎ、１ｍＭＥＤＴＡ、１−　スペルミジンとプロテアーゼ阻害剤（２５μｇ／ｍｌリューベブチン、及び５μｇ／ｍｌのペプスタチン）中で、４℃ で２時間インキュベーションすることによって抽出した。その後、上清を採取した。その結果得られた産物を、感染細胞の培地／抽出物中のＴＬ−２の２量体蛋白質の発現を確認するために、ウェスターンプロット解析（Ｅｉｔａｎら、＋９９２）にかけた。

８．４　ヒ１ｉＬ−２ｃＤＮＡ産物の構築ヒトリンパ球から誘導されたＩＬ−２ｃＤＮＡ配列（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ　ら、１９８３）をＰＣＲに対する最適プライマーの選択において役立つプライマーデザイナ−プログラムにかけた。平行して、本配列をクローンマネージャープログラムにかけ、我々がＩＬ−２遺伝子に存在しない制限酵素部位を検出することができるようになった制限地図を生じた。これらの部位を、プライマーの両端に加えた。

我々は、次に２つのＰＣＲｓを行った：反応Ａは、すべての翻訳されたコドンを含むが、停止コドンがないように、最後の翻訳コドンの直前で停止した：反応Ｂの産物は、最初の翻訳コドンて出発したが、停止コドンが含まれるように停止部位の向う側で終った。２つのプライマーのセットとＰＣＲｓが、図９において説明されている。反応へのための下流のプライマー、反応Ｂのための上流プライマー上に、遺伝子組み換えによって導入された制限酵素部位は同じであり、したがって、ＡとＢの産物のフレーム内で、そして適切な配向における融合による２量体ｃＤＮＡの構築か出来るようになった。制限酵素部位が加えられたので、産物への最後のコドンと産物Ｂの最初のコドンの間に６個の塩基があり、その結果、接合部位において２個のアミノ酸の添加が起った。我々は、２量体におけるＩＬ −２単量体分子のそれぞれに対して、２つの余分なアミノ酸の寄与は最小限であろうと期待する。

８．５　ＰＣＲ産物の配列分析ＰＣＲ産物か発現実験において使用されたので、ＰＣＲ過程を通じて突然変異が導入されなかったことを確認することが重要であった。各ＰＣＲ型の（上の８．２において記述されたように）３つの陽性で適切に消化されたクローンが選ばれて、配列分析が行われ、各セットのクローンの１つが、突然変異を起さず、正しい配列を発現していることが見出された。これら２つのクローンが、線形ＩＬ− ２２量体の構築に選ばれた。

８．６　欠陥ウィルスベクターにおける線形ダイマーの構築ここに用いられた欠陥ベクターの原型（ｐＣＢ；図１０）は、Ｈ３Ｖ１開裂／パッケージングシグナル（Ｈ３Ｖａ）を含むｐＲＢ３１１９がらの断片、ＤＮＡ１１１１　（Ｈ３Ｖ　ｏ口）のＨＳＶ起点を含む断片、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター、１ａｃＺ遺伝子、及びＳＶ４０ポリアデニル化シグナル〔ポリ（Ａ）′″シグナル〕含むｐｃＤＮＡ　ｌａｃからの断片を含む。これらの配列が、β−ラクタマーゼ遺伝子（Ａｍｐ”　）とＤＮＡ複製の細菌の起点（Ｃｏｌ　Ｅｌ　ｏｒｉ）を含むアンピシリン抵抗性プラスミドｐＴ７−３に挿入された。最初の段階としては、Ｉａｃ　Ｚ遺伝子をベクターから切出した。これは、Ｈｉｎｄ　［［［でベクターを線形化し、続いてＰＳｔ　ｒで部分消化し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　ＩＩキット（ＢＩＯ１０１）の助けを借りて、アガロースゲルから正しいベクターバンドを抽出することによって行われた。２つのＰＣＲ産物を３重連結において生じたベクターに連結させた（Ａに続くＢという正しい方向は、８．４において上に考察したように、２つの産物のあらかじめデザインされた相補的制限部位によって決定された）。その結果得られた構築物であるｐＣＢ−ＩＬ−２ダイマーは、制限酵素分析の後、多量の規模のＤＮＡ調製（Ｃｓ　ＣＩ　）　（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって２重にチェックされ、ウサギの皮膚（ＲＳ）細胞にトランスフェクトした。収穫されたウィルスのストックを用いて、上の８．３において考察されたように、アフリカミドリザルの腎１ａｌ　（Ｖｅｒｏ）細胞の感染に使用された。

例９．線形の２量体ＴＬ−２の蛋白質産物の分析ＩＬ−２蛋白質は、成長しつつある細胞の培地中に放出されることが知られているので、上の例８６６において得られた感染Ｖｅｒｏ細胞の培地を集め、線形２量体ＩＬ−２蛋白質の原料として使用した。平行的に、感染細胞中に合成蛋白質が保持されているか否かを決定するために、細胞抽出物を調製し、同じ条件で検討した。２つの懸濁液を、ヒトＩＬ−２に向けられたモノクローナル抗体の使用によるウェスターンプロット分析にかけた（図１１、左のパネル）。細胞の上清（レーンズｌ、３）と抽出物（レーンズ２，４）の２つの希釈物（１：３．　レーンズ１．　３．　５．およびｌ：９．レーンズ２．　４．　６）、及び欠陥ウィルスのみによって感染された細胞から得られた上清（レーン５）と細胞抽出物（レーン６）が分析された。ＩＬ−２の免疫反応性バンドが検出されなかった欠陥ウィルスのみで感染された細胞と対照的に（レーンズ５．　６）、上清（１，３）か細胞抽出物（２，４）のいずれかを含む４つのレーンは、すべてが特異的ＩＬ−２モノクローナル抗体と免疫反応した約３７ｋｄのバンドを発現した。市販のヒト単量体のＩＬ−２蛋白質は、＋４ｋｄの分子量を存し、本発明において記述された′神経由来のトランスグルタミナーゼによって、市販の単量体ＩＬ−２から合成された２量体蛋白質は、分子量２８ｋｄ（図１１．それぞれ右のパネルのレーンズ２と１）であった。１０ｖｉｔｒｏてトランスグルアミナーゼと単量体ＩＬ−２によって合成された２量体と対照的に、２つの異なる手順によって産生された２量体ＩＬ−２の間の大きさにおける差は、感染性細胞における線形２量化蛋白質の翻訳後の修飾によって説明できる可能性がある。上清（レーンズ、１．　３）は約４４ｋｄ。

の余分なバンドを含んでいた。この余分なバンドも、蛋白質の培地中への放出を通じて起った可能性があるグリコジル化、またはリン酸化のような、翻訳後の修飾によって説明することができる。

例１０．線形の２量体ＩＬ−２は希突起膠細胞に対して細胞毒性を有していない次に、我々は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏｌＨ胞毒性に関して、この線形ヒトＩＬ−２の２量体が、本発明のトランスグルタミナーゼで２量化したヒトＩＬ−２を模倣することができるか否かを見出そうと試みた。この可能性を検討するために、例９においてウェスターンプロット分析について使用されたのと同じ試料、上清の同じ希釈物からの部分量を、ラットの希突起膠細胞に適用した。

新生ラットの脳に由来した、増強された希突起膠細胞は、記述されたように調製した（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎと５ａｔｏ、１９７９）そして、あらかじめポリーＩ、−リジン（ＰＬＬ）でコートされたガラスカバースリット上に接種された（Ｅｉｔａｎら。

１９９２）。４８時間後に、細胞を線形２ｉ体蛋白質の部分量で処理し、細胞毒性の程度を、比色法により評価した（Ｅｉｔａｎら、＋９９２）生存細胞の数によって決定した。比色法によってアッセイされた成熟希突起膠細胞の数は、鎖状２量体のいずれの希釈においても、または対照として使用したｔｓＫにおいても、対照として使用した未処理細胞（１００％）と比較して減少しなかった（図１２、左のパネル）。より高い蛋白質濃度においても（図１２、左のパネル）減少は検出されなかった。他方、ＩＬ−２様細胞毒性因子が同定された魚の再生視覚神経から由来した水溶性物質は（Ｅｉ　ｔａｎら、１９９２）、１ｎｖｉｔｒｏて酵素的に合成されたヒト２量体ＩＬ−２と同様に、成熟希突起膠細胞の数の有意な減少を起した（図１２、右のパネル）。

側圧　ＩＬ−２依存性Ｔ細胞系を使用した線形２量体のＩＬ−２生物活性の検出線形２量体の希突起膠細胞に対する毒性がないことが、Ｈ３Ｖ１ベクターを経た発現の結果としてＩＬ−２蛋白質の活性の喪失によって起ったという可能性を除外するために、我々は、線形２量体の活性評価を行い、Ｔ細胞系（ＣＴＬＬ−２）に対するマイトジェンとして、単量体１１−２を模倣するその能力を評価した。このように、ＣＴＬＬ−２細胞を多穴培養プレート（２Ｘ１０”細胞／１００ μｉ’　ＲＰＭＩ、このＲＰＭＩは、１０％ＩＦＣ３，２蘭グルタミス及び０．０５ｄ　β−メルカプトエタノールを含む）に接種した。２−３時間後に、ウェスターンプロット分析、及び細胞毒性アッセイのために使用されたのと同じ上清の試料と同じ希釈（１：９）からの部分量を適用し、３７°Ｃで一夜インキュベーションを行った。ｌμＣｉの〔３Ｈ〕チミジンを各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキュベーションの後、細胞を収穫し、チミジンの組み込みを、ｃｐｍによって検出した。対照として使用されたｔｓＫと対比して、線形２量体の異なる濃度の添加は、用量依存的に細胞増殖を（図１３、左のパネル）起した。観察された増殖は、対照として使用された市販の単量体によって起された増殖よりも高くさえあった（図１３、右のパネル）。

本実験は、得られた線形２量体ＩＬ−２産物は、翻訳産物であって、翻訳後のＩＬ−２の修飾である酵素的に生じた２量体とは突起膠細胞に対する細胞毒性について異なっていることを示している。線形２量体は、Ｔ細胞に対する細胞分裂促進性に関して、単量体ＩＬ−２の既知のＩＬ−２活性を保持しているが、希突起膠細胞に対する細胞毒性を示さず、線形ダイマーのＩＬ−２に、希突起膠細胞に対する細胞毒性が欠けていることは、その調製中の生物活性の喪失によって起るのではないことが示唆されるか、希突起膠細胞に対する細胞毒性のための必要事項を明らかに満していないその高次構造に関連している。

参考文献 −Ａｇｕａｙｏ、　Ａ、Ｊ、、　Ｇ−Ｍ、　Ｂｒａｙ、　Ｍ−Ｒａ−Ｊにｙ、　 ’！”、　Ｚｗｉｍｐｆｓｒ、　Ｃ１，Ａ。

Ｃａｒｔａｒ　ａｎｄ　ｌｉ−Ｖｉムｌ１−５ａｎ　（１９９０ａ）　Ｊ、　Ｆ、ｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　」１ｔ１９９゜−Ａｇｕａｙｏ、Ａ、Ｊ、、Ｇ、Ｍ、　Ｂｒａｙ、Ｄ、λ、　Ｃａｒｔｅｒ、ａ、Ｐ、　Ｖｉｌｌｅｇａｓ−Ｐｅｒｅｇ、Ｍ、Ｖｉｄａｌ−５ａｎｇ　ａｎｄ　Ｍ、Ｒａｓｍｎａ）ｃｙ　（１９９Ｑｂ）　入Ｃｔ＆！ｉ＠ｕｒｏｂｉｏ１．　Ｎｘｐ、　、５ｊｌ＋３８１゜−Ｂｏｔｔｅｎｓｔａｉｎ、　、Ｔ、に、　ａｎｄ　Ｇ、Ｈ，５ａｔｏ　（１９７９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、λｃａｄ。

ｇｅｌ　ｔ７ａｉ’ｋ　７１！５１４−５１７゜−Ｃｈａ）ｃｒａｂａｒｔｙ、Ｇ、ａｔ　ａｌ、（１９８））　Ｊ、Ｍｅｕｘｏｃｈｅｒｎ、、４Ｊｌ：６６９゜−Ｃｂｏｍｃｚｙｎｔｘｋｉ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｎ、５ａｃｅｈｉ　（１５１８７）　λｎａ１．　Ｂｉｏｃｈａｍ。

−二：１５６Ｊ５９゜ −Ｃｏｈｅｎ、　入、、’Ｉ’、５ｉｖｒｏｎ、Ｒ，Ｄｕｖｄａｖａｎｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｓｃｈｗａｒｔｚ（１９９０）　Ｂｒａｉｎ　Ｒａｍ、　５ｎ＝２４− ３２゜−Ｄａｖｉｓｏｎ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｖ、Ｇ、　Ｐｒ５ａｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄ、Ｊ、　ＭｃＧ＊ｏｃｈ　（１９８４）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　、７１）＋８５９−８６３゜−Ω＠’ｌ０Ｉｙ　Ｒ−（１９８３）　Ｎｕｃｌ＠ｉｃ　Ａｃｉｄｇ　１ａｓｅａｒｃｈ　］］５４３０７−４３２３−　冨１ｔａｎ、Ｓ、、Ｒ，！ｉａｌｉｎｇ、λ、　Ｃｏｈｅｎ、Ｍ、　Ｂａ１ｋｉｎ、Ｄ、Ｌ。

Ｈｉｒｓｃｈｂａｒｇ、、　Ｉｔ　−ｔａｎ　ＪＬ！ｌｄ　Ｍ−ＳＣＣａ１Ｚ　（１９９２）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

ｘｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｔＦＩＡ　ｊｌｌ：５４４２−５４４６−−　Ｇｒａｈａｍ、Ｆ、Ｌ、ａｎｔｉ　λ、Ｊ、ｖａｎ　ｄ＊ｚ　Ｉ！ｂ　（１り７３）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　３ｉ：４５６−４６７゜ −Ｇｒｅａｎｂａｒｇ、Ｃ，Ｓ、、　Ｐ、Ｊ、　ＢＬｒｃｋｂｉｃｈｌ＊ｒ　ａｎｄ　ＲＪｌ、　Ｒｌｃｅ　（１９９１）ＰＡＳＥＢ　、７．　シミ富３０７１゜−Ｘ１ａｒｓｔ＠ａｄ、Ｓ、入−Ｉ　Ｍ−＊ａＢＸＩＩｄＪＬｍｋ’ｌＩ　Ｊ、ｈ出■込ｇ　Ｄ−Ａ−Ｃ１ｒｔｅｒｔ入、Ｊ、Ａｇｕａｙｏ　ａｎｄ　Ｍ、Ｖｉｄａｌ−５ａｎｇ　（１９９０）ＳａＬａｎｃａユｌ：２５５゜−Ｌａｖｉ＠、Ｖ、、Ｌ　Ｈｕｒｒａｙ、＾、　Ｓａｌａｍｏｎ、５．　Ｂａｎ−Ｂａ５ａａｔ、Ｓ。

Ｒｕｍ１ｔ、Ｍ、　Ｂｏｄｋｉｎ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｃｈｗａｚｔｚ　（１９９０）　Ｊ、　Ｃａｍｐ。

Ｍ＊ｔｚｏＬ　、３ｊＪｌｓ２９３−３１４゜−Ｐａｒｋｅｒ、　Ｂ、λ、　ａｎｄ　Ｇ、Ｒ，５ｕｃｋ　（１９７９）　Ｊ、　Ｖｆｏｌ、　、１ｉｔ３６０− ３６９゜−Ｒｏｂｂ、Ｒ，Ｊ、ａｔ　ａｌ、　（１９８３）、ｉ’ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、λａａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵａＡ旦１１＊５９９０゜ −Ｒｕｄｇｅ、Ｊ、Ｓ、ａｎｄ　Ｊ、５ｉｌｖｅｒ　（１９９０）Ｊ、）ｉｅｕｒｏａｃｉ、、ｌ＠３５９４゜−シｕｘａｇ、　Ｊ、Ｒ，、Ｊ、！、、Ｒ，Ｒｕｂｅｎａｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｆ、　Ｎ１ｃｏｌａｓ　（１９８６）！＋）［ＢＯＪ、　、）ｔ３１３３−３１４２−　Ｔ、５ｉｖｒｏｎ、　ａｔ　ａｌ、（１９９１）　Ｇ１１ａ　ｉ！５９１−６０１゜−５ａｈｎａｌｌ、　Ｌ、　ａｍ　Ｍ、Ｅ、　ｓｃｋｒｗａｂ　（１９うＯｌ　Ｎａｔｕｒｅ　１ｕｓ２６９゜− ＴａｎｉｇｕｃＭ、’ｌ’、、ｆｉ、Ｍａｔａｕｉ、Ｔ、Ｆｕｊｉｔ、ａ、Ｃ， ’ｌ’ａｋａｏｋａ、　Ｎ。

Ｋａｓｈｉｍ、Ｒ，τｏａｈＬｍｏｔｏ　ａｎｄ　Ｊ、　！！ａｍｕｒｏ　（１９８３）　Ｎａｔｕｒｅ１ａｔ３０５−３１０゜１　２　′ｓ＋３６Ｑ　屯ａｔ　ａ、ｃ葛　６．１２　６．Ｉｇ　ａｊ１’ｌｉ閉（七υ 図　７図８ λ　２０尺７シイ７−碑テ″す゛イ／ＩＩ　ネｌ覧遁４１りＡ・・図　９図　１１ｒ５Ａ１２図　１コ

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対し、細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する傷害を受けた魚の視覚神経から得られる神経由来のトランスグルタミナーゼ酵素。
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって決定される約５５ｋＤａの分子量を有する請求項１に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
３．傷害後の魚の神経において、傷害を受けていない魚の視覚神経と比較して、上昇濃度が検出される請求項１または２に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
４．ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項１から３のいずれかに記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
５．哺乳動物のＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項４に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
６．ネズミ組み換え体ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項５に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
７．ヒト組み換え体ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項５に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
８．以下の特徴を有する神経由来のトランスグルタミナーゼＴＧＭ：（ｉ）それは、水溶性である；（ｉｉ）それは、再生中の魚の視覚神経から得られる；（ｉｉｉ）それは、免疫由来のＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する；（ｉｖ）それは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと銀染色によって決定されるように、約５５ｋＤａの分子量を有する；（ｖ）それは、傷害を受けた魚の視覚神経において、傷害を受けていない魚の視覚神経と比較して、濃度の上昇が検出される；（ｖｉ）それは、トランスグルタミナーゼファミリーのアッセイの特徴として、担体蛋白質へのプトレッシンを組み込む；（ｖｉｉ）それは、ｐＨ９と５６℃において、プトレッシンの組み込み活性が最適である：（ｖｉｉｉ）そのプトレッシンの組み込みにおけるＫｍは、基質の関数として計算され、５．５×１０−７である；（ｉｘ）それは、ＩＬ−２の２量化過程に関しては、Ｃａ２＋依存性酵素である；（ｘ）それは、トランスグルタミナーゼの２つの部位に相当するペプチドに対して発現された抗体に関して、ウェスターンプロット分析において免疫反応性のバンドを示す。該ペプチドは、以下の配列のトランスグルタミナーゼの活性部位に相当する１４個のアミノ酸からなるペプチド：【配列があります】と１０個のアミノ酸からなる配列：【配列があります】から選ばれる。
９．哺乳動物のＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項８に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
１０．ネズミの組み換え体ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項８に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
１１．ヒト組み換え体ＩＬ−２を、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２に変換する請求項８に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼ。
１２．ＩＬ−２を、トランスグルタミナーゼ酵素とともにインキュベートすることからなる希突起膠細胞に対して、細胞毒性活性を有する２量体ＩＬ−２の産生のための酵素的方法。
１３．ＩＬ−２を、請求項１から１２のいずれかに記載のトランスグルタミナーゼとインキュベートすることからなる希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する２量体の産生のための酵素的方法。
１４．ＩＬ−２が、哺乳動物のＩＬ−２である請求項１３に記載の方法。
１５．ＩＬ−２が、組み換え体ＩＬ−２である請求項１３、または１４に記載の方法。
１６．ＩＬ−２が、ヒト組み換え体ＩＬ−２である請求項１３、または１４に記載の方法。
１７．希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する請求項１２から１６のいずれかに記載の方法によって得ることができる２量体ＩＬ−２。
１８．希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する請求項１２から１６のいずれかに記載の方法によって得ることができる哺乳動物の２量体ＩＬ−２。
１９．希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する請求項１２から１６のいずれかに記載の方法によっても得ることができるヒト２量体ＩＬ−２。
２０．組み換え体ヒトＩＬ−２をトランスグルタミナーゼ酵素とインキュベートすることによって産生される、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する、ヒト２量体ＩＬ−２。
２１．組み換え体ヒトＩＬ−２を、請求項８に記載の神経由来のトランスグルタミナーゼとインキュベートすることによって産生される、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する、ヒト２量体ＩＬ−２。
２２．以下の特徴を有し、希突起膠細胞に対し、細胞毒性活性を有する哺乳動物の２量体ＩＬ−２：（ｉ）それは、水溶性である；（ｉｉ）それは、ＩＬ−２の共有結合２量体である；（ｉｉｉ）それは、希突起膠細胞系に対して選択的に毒性であるが、１型星状膠細胞や線維芽細胞のような他の細胞に対しては毒性がない；（ｉｖ）その希突起膠細胞に対する細胞毒性活性は、ＩＬ−２に対して発現された抗体によって中和される；（ｖ）それは、トランスグルタミナーゼ酵素とインキュベートすることによって、哺乳動物のＩＬ−２から得られる；そして、（ｖｉ）それは、ウェスターンプロット分析によって決定される基質ＩＬ−２の約２倍の分子量を有する。
２３．以下の特徴を有し、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する哺乳動物の２量体ＩＬ−２：（ｉ）それは、水溶性である；（ｉｉ）それは、ＩＬ−２の共有結合２量体である；（ｉｉｉ）それは、希突起膠細胞系に対して選択的に毒性であるが、１型星状膠細胞や線維芽細胞には毒性がない；（ｉｖ）その希突起膠細胞に対する細胞毒性活性は、ＩＬ−２に対して発現された抗体によって中和される；（ｖ）それは、神経由来のトランスグルタミナーゼとインキュベートすることによって哺乳動物から得ることができ；そして、（ｖｉ）それは、ウェスターンプロット分析によって決定される基質のＩＬ−２の約２倍の分子量を有する。
２４．請求項１から８のいずれかの記載において請求されているトランスグルタミナーゼ酵素、または、神経由来のトランスグルタミナーゼと哺乳動物のＩＬ− ２をインキュベートすることによって得られる請求項２２または２３に記載の哺乳動物２量体ＩＬ−２。
２５．以下の特徴を有し、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有するヒト２量体ＩＬ−２：（ｉ）それは、水溶性である；（ｉｉ）それは、ＩＬ−２の共有結合による２量体である；（ｉｉｉ）それは、希突起膠細胞系に対して選択的に毒性であるが、１型星状膠細胞や線維芽細胞には毒性がない；（ｉｖ）その希突起膠細胞に対する細胞毒性活性は、ＩＬ−２に対して発現された抗体によって中和される；（ｖ）それは、トランスグルタミナーゼ酵素とインキュベートすることによって、ヒトＩＬ−２から得ることができる；そして、（ｖｉ）それは、ウエスターンプロット分析によって決定されるように、約３０ｋＤａの分子量を存する。
２６．以下の特徴を有し、希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有するヒト２量体ＩＬ−２：（ｉ）それは、水溶性である；（ｉｉ）それは、ＩＬ−２の共有結合のダイマーである；（ｉｉｉ）それは、希突起膠細胞系に対して選択的に毒性であるが、１型星状膠細胞と線維芽細胞のような他の細胞には毒性がない；（ｉｖ）希突起膠細胞に対するその細胞毒性活性は、ＩＬ−２に対して発現された抗体によって中和される；（ｖ）それは、神経由来のトランスグルタミナーゼとインキュベートすることによってヒトＩＬ−２から得られ；そして、（ｖｉ）それは、ウェスターンプロット分析によって定量されるように、約３０ｋＤａの分子量を有する。
２７．組み換え体ヒトＩＬ−２を、請求項１から８のいずれかの記載において請求されているトランスグルタミナーゼ酵素、または神経由来トランスグルタミナーゼとインキュベートすることによって得られた請求項２５または２６に記載のヒトの２量体ＩＬ−２。
２８．哺乳動物の中枢神経系の傷害神経の再生を誘発し、促進するための請求項１７から２７のいずれかに記載の２量体ダイマーの使用。
２９．哺乳動物の傷害された中枢神経系の再生を誘発し、促進するためのトランスグルタミナーゼ酵素の使用。
３０．哺乳動物の中枢神経系の傷害を受けた神経の再生を誘発し、促進するための、請求項１から１１のいずれかに記載の、神経由来のトランスグルタミナーゼ酵素の使用。
３１．哺乳動物の中枢神経の傷害を受けた神経の再生を誘発し促進するための希突起膠細胞に対して細胞毒性活性を有する酵素的に産生される２量体ＩＬ−２を活性成分として含む医薬組成物。
３２．請求項２３または２４に記載の哺乳動物の２量体ＩＬ−２からなる請求項３１に記載の医薬組成物。
３３．請求項２５または２６に記載のヒト２量体ＩＬ−２からなる請求項３１に記載の医薬組成物。
３４．哺乳動物の中枢神経系の傷害細胞の再生を誘発し、促進する医薬組成物の調製における請求項１７から２７のいずれかに記載の２量体ＩＬ−２の使用。
３５．哺乳動物中の中枢神経系の傷害神経の再生を誘発し、促進する薬物組成物の調製物のための、請求項２５または２６に記載のヒト２量体ＩＬ−２の使用。
３６．哺乳動物における中枢神経の傷害神経の再生を誘発し、促進するための医薬組成物の調製のための請求項２５または２６に記載のヒト２量体のＩＬ−２の使用。
３７．哺乳動物における中枢神経系の傷害神経の再生を誘発し、促進する活性成分として、トランスグルタミナーゼを含む医薬組成物。
３８．哺乳動物における中枢神経系の傷害神経の再生を誘発し、促進する活性成分として、神経由来のトランスグルタミナーゼを含む医薬組成物。
３９．請求項１から１１のいずれかに記載の神経由来のトランスグルタミナーゼからなる請求項３７、または３８に記載の医薬組成物。