JP3310289B2 - 酵素的に産生された２量体ｉｌ−２とその調製のための神経由来のトランスグルタミナーゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野 本発明は、新しい神経由来のトランスグルタミナーゼ
（本発明においては以後TG_Mと名付ける）、及び希突起
膠細胞に対して細胞毒性を示す哺乳類の、酵素的に産生
された２量体インターロイキン−２（IL−２）に関す
る。本発明は、さらに、該酵素TG_Mと希突起膠細胞毒性
活性を有する該２量体IL−２の調製、そして哺乳動物に
おける神経再生を誘発および促進するためのそれらの使
用に関する。

発明の背景 成熟哺乳動物の中枢神経系（CNS）は、軸索の傷害の
後、再生能力が乏しいことを示す。傷害された軸索の自
然発生的成長は起るが、傷害の部位を横切ることなく、
200−300ミクロンの伸張の後、そして末端の切株におい
て延長した後伸張がとまる。神経再生が巧く行かないの
は、星状膠細胞（瘢痕形成細胞）が成長を助けることが
出来ないこと、マクロファージ、及び／またはその産生
物が乏しいこと、及び軸索の成長を阻害する成熟希突起
膠細胞の生成をはじめとする神経を取巻く環境が好まし
くないのが原因であるとされてきた。

最近我々は、例えば成熟魚の視覚神経のような、自然
発生的に再生が行われている系においては、傷害に対す
る応答も、再生の過程とともに、魚とラットの両方にお
いて、希突起膠細胞に対して選択的に細胞毒性を示し、
我々が希突起膠細胞毒性因子（OCF）と名付けた因子
（単数または複数）の存在と関連していることを示した
（公開欧州特許出願EP NO.415321;Cohenら、1990;Sivr
onら、1991）。この魚に由来する因子は、後に、ヒト免
疫IL−２における15kDa、及び魚のリンパ球由来のIL−
２の14kDa（公開欧州出願EP NO.501445;Eitanら、199
2）に比較して、28kDaの分子量を有するIL−２様分子と
して、我々によって同定された。OCFとIL−２の間の分
子量における相違は、この因子の起原について、それが
局所的に修飾されたIL−２、すなわち神経における常住
細胞から由来するのか、それとも炎症細胞から由来する
のか、または免疫性IL−２をコードしている遺伝子から
区別されるが、それと高度の相同性を共有している遺伝
子の産物であるかどうかについての疑問を生じた。

本発明によれば、トランスグルタミナーゼのファミリ
ーの一員として同定され、魚における視覚神経の傷害の
後に濃度上昇が見出されたが、哺乳動物ではそうならな
かったある酵素が、傷害を受けた魚の視覚神経において
観察された高分子量のIL−２様物質を、恐らく２分子の
架橋結合において産生するようにIL−２分子を修飾する
上で役割を演じていることが見出された。本発明におい
て、TG_Mと呼ばれるこの神経由来のトランスグルタミナ
ーゼがIL−２の２量化を起し、それによって希突起膠細
胞に対して細胞毒性となる。

発明の要約 本発明は、希突起膠細胞毒性活性を示す酵素的に産生
され得る２量体IL−２に関する。さらに、本発明は、哺
乳動物のIL−２から直接に酵素によって希突起膠細胞毒
性活性を有するIL−２を産生する手段と方法を提供す
る。

希突起膠細胞毒性因子とIL−２様物質は、傷害を受け
た魚の視覚神経を含むならし培地において早期に検出さ
れたが、無傷の魚の視覚神経を含むならし培地では検出
されなかったので（EP415321とEP501445）、IL−２の局
所的処理と希突起膠細胞毒性活性を有するその２量体へ
の修飾に対する機構が傷害を受けた視覚神経について探
究された。

本発明によれば、トランスグルタミナーゼファミリー
の酵素が、傷害を受けた魚の視神経から得られることが
見出された。この神経由来のトランスグルタミナーゼ
（TG_M）は、哺乳動物のIL−２を希突起膠細胞毒性を有
する２量体IL−２に変換する。

このように、本発明は、さらに、SDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）と銀染色によって解
析されたところによれば水溶性であり、約55kDaの分子
量を有し、傷害を受けていない魚の神経に比べて、傷害
を受けた魚の視神経において、濃度の上昇が検出される
酵素TG_Mに関する。TG_Mは、傷害を受けた魚の視神経を含
むならし培地の、トランスグルタミナーゼの十分保存さ
れた活性部位のエピトープに相当するペプチドに対して
発現された抗体でのアフィニティークロマトグラフィー
によって精製することができる。

本発明は、さらに、ヒトをはじめとする哺乳動物のIL
−２を、本発明の酵素TG_Mとインキュベーションを行う
ことからなる希突起膠細胞毒性活性を有するヒトをはじ
めとする哺乳動物の２量体IL−２の酵素的産生の手順を
提供する。

本発明によって、TG_Mの基質として使用される１量体I
L−２には、いかなる種類の動物でもよいが、好ましく
は哺乳類であり、最も好ましくはヒトのIL−２、そし
て、天然またはRobbら、1983の手順のように、いずれの
便利な技術によっても産生することが出来る組換え体IL
−２が含まれる。好ましくは、例えば、Taniguchiら,19
83、またはDevos,R.,1983によって記述されたように、
組換え体DNAによって得られる。本発明によれば、好ま
しくはネズミおよびヒト組換え体IL−２が使用される。

前に述べたように、最初にEP No.415321において開
示された魚の視神経に由来する希突起膠細胞毒性因子
は、後に、再生魚の視覚細胞を含むならし培地（本発明
においては、再生魚ならし培地と称する）から精製さ
れ、以下によって確認された如く、IL−２様（EP No.5
01445）分子であることが示された。すなわち；（ｉ）I
L−２に対して発現された抗体は、再生魚ならし培地の
希突起膠細胞毒性活性を中和したこと；（ii）ウェスタ
ーンブロット分析によって、再生魚を含むならし培地に
おいて、28kDaの免疫反応性バンドの存在が明らかとな
ったこと；（iii）本因子は、抗−IL−２抗体を使用し
て、再生魚ならし培地からアフィニティークロマトグラ
フィーによって精製されたこと；及び（iv）組換え体マ
ウスIL−２はin vitroで希突起膠細胞に対して選択的活
性効果を有するが、星状膠細胞に対しては有さなかった
こと。希突起膠細胞毒性因子は、本発明の２量体に相当
するかもしれない。

酵素的に産生しうる本発明の２量体のIL−２は、以下
の特性を有する。

（ｉ）それは、水溶性である； （ii）それはIL−２の共有結合による２量体である； （iii）それは希突起膠細胞系に選択的に細胞毒性を示
す。そして、タイプー１星状膠細胞や線維芽細胞のよう
な他の細胞には細胞毒性を示さない； （iv）その希突起膠細胞に対する細胞毒性活性は、IL−
２に対して発現させた抗体によって中和される； （ｖ）それは哺乳動物IL−２を、神経由来のトランスグ
ルタミナーゼと共にインキュベートすることによって得
ることが出来；そして、 （vi）それはウェスターンブロット分析によって決定さ
れたように、基質の哺乳動物のIL−２の約２倍の分子量
を有する。

より好ましい態様においては、本発明による酵素によ
って産生された哺乳動物の２量体IL−２は、約30kDaの
分子量を有するヒトの２量体IL−２である。

本発明の神経由来のトランスグルタミナーゼTG_Mは、
以下の特性を有する； （ｉ）それは、水溶性である； （ii）それは再生中の魚の視覚神経から得ることが出来
る； （iii）それは免疫IL−２を希突起膠細胞毒性活性を有
する２量体IL−２に変換する； （iv）それはSDS−PAGEと銀染色によって決定したとこ
ろ、約55kDaの分子量を有する； （ｖ）それは無傷の魚の視覚神経に比べて、傷害を受け
た魚の視覚神経において、上昇した濃度において検出さ
れる。

（vi）それはトランスグルタミナーゼファミリーを特徴
づけるアッセイにおいて、担体蛋白質へプトレッシンを
組み込む； （vii）それはプトレッシンの組み込みにおいて、pH9と
56℃において最適活性である。

（viii）プトレッシンの組み込みにおけるそのKmは、基
質の関数として計算すると5.5×10^-7である； （ix）それはIL−２量化過程に関してCa²⁺依存性酵素で
ある；そして、 （ｘ）それはトランスグルタミナーゼの２つの部位に相
当するペプチドに対して発現された抗体についてのウェ
スターンブロット分析において免疫反応性バンドを示
す。該ペプチドは、以下の配列のトランスグルタミナー
ゼの活性部位に相当する14個のアミノ酸からなるペプチ
ド 及び次の配列の10個のアミノ酸からなるペプチド から選択される。

本発明による酵素的に産生された２量体IL−２と神経
由来のトランスグルタミナーゼTG_Mは、それらの単独ま
たは組み合せにおいて、ヒトをはじめとする哺乳動物に
おいて、中枢神経系（CNS）の傷害神経の再生を誘発
し、促進するための医薬組成物として使用される。この
ような組成物の調製は、EP No.415321及びEP No.5014
45において記述されている。２量体IL−２、または酵素
TG_M、または両者からなる組成物は、通常、哺乳動物のC
NSにおける再生に対する障害物となる希突起膠細胞をin
vivoで選択的に除去し、それによって、それら自身の
環境において、軸索の生長を促進することにより、傷害
神経を治療することができる。

図の簡単な説明 図１は、再生中の魚の視覚神経のならし培地（CM）
が、IL−２（hIL−２）を２量化することが出来ること
を示している。CMの部分量をhIL−２と一夜インキュベ
ートし、混合物をSDS−PAGE（12％アクリルアミド）に
かけ、続いて、IL−２抗体を使用したウェスターンブロ
ットを行った。免疫反応性バンドの可視化をECL（Amers
ham）によって行った。レーンズ:1,Ca²⁺の存在下でhIL
−２とインキュベートしたCM;2,Ca²⁺の不在下でhIL−２
とインキュベートしたCM;3,Ca²⁺の存在下におけるCMの
み;4,hIL−２のみ。分子量の重量マーカーを同じゲル上
で電気泳動にかけ、それらの位置を示してある。

図２は、ウェスターンブロット分析を示し、再生中の
魚の視覚神経において55kDaのトランスグルタミナーゼ
免疫反応性の蛋白質の存在が明らかとなる。CMと再生視
覚の高速遠心分離の上清（HSS−Ｃ）と正常な非損傷神
経（HSS−Ｎ）の上清を、SDS−PAGE（10％アクリルアミ
ド）上で電気泳動にかけた。ブロットを、トランスグル
タミナーゼ酵素ファミリーに保存された14−アミノ酸配
列に対して調製された抗体とともにインキュベートし
た。可視化はECL（Amersham）によって行われた。レー
ンズ:1,CM;2,HSS−C;3,HSS−Ｎ。

図３には、魚の視覚神経のトランスグルタミナーゼ酵
素（TG_M）の段階的精製を示すSDS−PAGEが描かれてい
る。レーンズ:1,HSS;2,Elu−PLL（PLL−アガロースカラ
ムからの溶出液）;3,Elu−TGAb（抗−トランスグルタミ
ナーゼアフィニティーカラムからの溶出液）。

図4A−Ｃは、酵素TG_Mの生化学的特徴を図解してい
る。パネルＡは、pHの関数としてのTG_Mによって媒介さ
れたカゼインへのプトレッシンの組み込みを示す；パネ
ルＢは、温度の関数としてのTG_Mによって媒介されたカ
ゼインへのプトレッシンの組み込みを示し；パネルＣ
は、スカッチャードプロット分析によるTG_MのKmの定量
を図解している。

図５は、精製されたTG_MがhIL−２を２量化することを
示している。レーンズ:1,hIL−２とともにインキュベー
トした精製TG_M;2,hIL−２のみ;3,TG_Mのみ。実験は、精
製したTG_MをCMの代りに用いたことを除けば、図１に記
載した如く行われた。インキュベーションは、すべて5m
M Ca²⁺の存在において行われた。

図6A−Ｄは、IL−２活性が、TG_Mによって媒介された
２量化の後、希突起膠細胞に対する細胞毒性へとシフト
することを示す。希突起膠細胞の増強された培養物を、
TG_M単独、TG_MとあらかじめプレインキュベートしたhIL
−２、または、hIL−２単独のいずれかを含む諸種の調
製物で処理した。細胞毒性活性（生存細胞の数による）
は、MTT〔３−（4,5−ジメチルチアゾール−２−イル）
−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド〕比色ア
ッセイによって評価した。パネルＡは、MTT染色の後TG_M
の存在下または不存在下において、10または100U/mlのh
IL−２で処理した諸種の培養物の定量的分析（630nmに
おける吸光度に対する540nmにおける吸光度）を示す。
パネルB:hIL−２のみ（100U/ml）で処理した培養物の顕
微鏡図；パネルC:TG_M単独で処理した培養物の顕微鏡写
真；パネルD:hIL−２（100U/ml）とTG_M（酵素的に産生
された２量体hIL−２を含む）の混合物で処理した培養
物の顕微鏡写真。

図7A−Ｃは、TG_Mで処理した傷害神経における機能活
性のオンラインの記録を描いている。この図は、TG_Mで
処理した１匹の代表的動物（ラット）から得られた結果
を提出している。視覚誘発電位（VEP）応答を明細書
（それぞれ、パネルA,BとＣ）に記述されたように、傷
害の前と傷害１週後と６週後に記録した。傷害の６週間
後に回復が小さいピークによって顕現され、すべては無
傷害神経におけるピークに比較してシフトしていたこと
に注意。数値は、各時点における４つの記録から得られ
た平均値（実線）±標準誤差（灰色の線）である。

図8A−Ｃには、対照（バッファー処理）の傷害神経中
のオンラインVEP応答が描かれている。代表的な動物
（ラット）がバッファーで処理され、明細書中に記述さ
れたように（それぞれ、パネルA,B,及びＣ）、傷害前と
傷害後１及び６週間において記録された。価は、平均値
（実線）±標準誤差（灰色の線）である。

図９には、PCRによるヒトIL−2cDNAの産生物のデザイ
ンと構築が描かれている。（Ａ）ヒトIL−2cDNA産物（B
p−posは、ヒトリンパ球由来のIL−2cDNA配列上のプラ
イマーの位置を指す）を構築するのに使用された加えら
れた制限部位（破線のボックス）を含む２組のプライマ
ー。（Ｂ）線型２量体IL−２を構築するのに使用された
２つの異なる単量体IL−2cDNAのコピーを産生するのに
使用された２つのPCRs。

図10には、欠陥性のウイルスベクターアンプリコンプ
ラスミドpCBが描かれている。アンプリコンには、HSV1
開裂／パッケージングシグナル（HSVa）を含むpRB3119
からの断片、DNA複製のHSVの起点（HSV ori）を含む断
片、そして、CMVプロモーター、lac Z遺伝子、及びSV40
のポリアデニル化シグナル〔ポリ（Ａ）＋シグナル〕を
含むpcDNA lacからの断片が含まれる。これらの配列
は、β−ラクタマーゼ遺伝子（Amp^R）を含み、DNA複製
の細菌の起点（Col El ori）を含むアンピシリン−抵抗
性プラスミドpT7−３に挿入された。このアンプリコン
は、適用に使用された欠陥性ウイルスベクターゲノムに
対する基礎として役立った。

図11は、線型IL−２ダイマーのマウス抗ヒトIL−２モ
ノクローナル抗体でのウェスターンブロット分析を示
す。左側のパネルは、感染Vero細胞（レーンズ1,3）か
ら採取された培地の２つの希釈（1:3,レーンズ1,3,5,及
び1:9,レーンズ2,4,6）を示す。感染Vero細胞の抽出物
（レーンズ2,4）と欠陥ウイルスのみによって感染され
た細胞から得られた培地と細胞抽出物（それぞれ、レー
ンズ５と６）をナトリウムドデシルサルフェートポリア
クリルアミド電気泳動（SDS/PAGE）にかけた。矢印は、
各スロットにおける免疫反応性バンドを指し示してい
る。右側のパネルは、市販の単量体IL−２（レーン２）
と神経由来のトランスグルタミナーゼによって合成さ
れ、大きさの対照として使用された２量体IL−２（レー
ン１）を示している。分子量のマーカーを同じゲル上で
電気泳動を行い、それらの位置が示してある。

図12には、線形の２量体IL−２が希突起膠細胞に対し
て細胞毒性がないことを示している。比色MTTアッセイ
によって評価された希突起膠細胞に対する細胞毒性を異
なる希釈（左側のパネル）において、図11に記述された
試料の部分量の適用によって検討した。これらの結果
は、細胞毒性を有するIL−２様因子が、酵素的に合成さ
れたヒト２量体IL−２と同定された再生しつつある視覚
神経（CM）に由来する水溶性物質で処理された平行実験
（右側のパネル）と比較された。これらの処置の両者と
も成熟希突起膠細胞の数の有意な減少を起した（ANOVA
によると２量体IL−2,F＝7.833;CM,F＝104.976;そし
て、Fisherの比較によると、それぞれＰ＝0.02および0.
0001であった。）。３回繰返された実験は、３重に行わ
れた。結果は、100％の生存を示す非処理の培養物の値
と比較した平均±標準偏差として提出されている。

図13には、線形２量体IL−２が、CTLL−２細胞の増殖
を起すことを示している。チミジンの組み込みによって
アッセイされたCTLL−２細胞に対する生物活性は図11
（左のパネル）に記述された試料からの部分量の適用に
よって検査された。結果は、CTLL−２細胞が市販の単量
体ヒトIL−２を対照として処理した平行実験（右側のパ
ネル）のそれらと比較した。実験は同時に３回行われ、
結果はcpmで表わされている。

好ましい態様の記述 本発明によると、トランスグルタミナーゼファミリー
の一員と同定された神経由来の55−kDaの酵素が、再生
視覚神経において上昇濃度において見出され、IL−２の
２量化に関与していることが見出された。２量化は、軸
索の傷害後の再生のために必要とされる、傷害によって
誘発された条件を満足させるように因子の活性を変化さ
せるための機作として、重要な役割を演じているかもし
れない。例えば、希突起膠細胞に対する傷害後の細胞毒
性は、軸索の成長と伸長を阻害することが知られている
成熟した希突起膠細胞を除去するのに重要であると考え
られる。したがって、IL−２の活性を変化させることが
でき、それによって希突起膠細胞に対する毒性を増強す
る傷害によって誘発された酵素の上昇は、本発明におい
て観察された結果を説明する要因の１つであるかもしれ
ない。

組織に広く分布している蛋白質のファミリーであるト
ランスグルタミナーゼは、蛋白質の安定化に関連してい
て、化学的、酵素的、及び物理的分析に対するその抵抗
性を増すことが報告されている。このファミリーの酵素
は、血漿及び細胞外体液において見出され、これらの酵
素によって修飾された蛋白質は、血液凝固のフィブリン
ネットワーク、細胞膜、細胞外マトリックス、及び角質
化の特徴において検出された（Greenbergら,1991）。本
発明のトランスグルタミナーゼ酵素、TG_Mは、神経の障
害の下に見出され、神経系からはじめて精製された。精
製は、よく保存されたエピトープ、すなわち他の組織と
種からの既知のトランスグルタミナーゼの活性部位に対
して、発現された抗体を用いたアフィニティークロマト
グラフィーによって達成された。魚の神経由来のトラン
スグルタミナーゼもこの保存配列を有しているか、少く
とも同族の配列を有し、ヒトに由来の蛋白質、すなわ
ち、hIL−２に対するその活性を説明しているように思
われる。この段階においては、活性部位以外の配列にお
ける変異も除外することができず、神経系に対してユニ
ークであるかもしれない。しかし、他の起源、及び種の
トランスグルタミナーゼも同様に活性である可能性があ
り、本発明の中に包含される。

現在までのところ、希突起膠細胞の阻害活性をまぬか
れるために使用された最も効果的な方法には、阻害剤に
対する特異的抗体の使用が含まれた（SchnellとSchwab,
1990）。TG_Mが利用できることになったので、いずれの
種の組換え体IL−２も、酵素TG_Mとインキュベーション
することによって、すべての種の希突起膠細胞に対する
細胞毒性因子の調製に対して道が開かれた。

哺乳動物がIL−２自体においてではなく、その翻訳後
の修飾のために必要な酵素が欠失していることも可能で
ある。希突起膠細胞毒性因子に相当する酵素的に産生さ
れた２量体IL−２は、傷害後の成熟神経から希突起膠細
胞を除去するために必要とされ、神経の成長を起り易く
する反応性の形であるように思われる。

このように、本発明によれば、活性因子（IL−２）が
異なる型の活性を有する形（酵素学的に産生されたIL−
２ダイマー）に変換される機作のための証拠が与えられ
ている。二量化した蛋白質の構造が、その活性因子への
変換に役割を演じているかどうか、または、２量体のい
かなる立体配置（例えば線形）でもよいであろうかどう
かを調べるために、線形２量化IL−２蛋白質の高濃度を
発現する単純ヘルペスウイルス（HSVI）の欠陥ウイルス
ベクターを構築した。単量体蛋白質が翻訳後の修飾によ
って２量体に変換される酵素的に合成された２量体IL−
２とは対象的に、このように構築された線型２量体IL−
２蛋白質は、転写のレベルにおいてデザインされ、した
がって翻訳の産物であった。欠陥ウイルスそれ自身が細
胞内に留まり、挿入された蛋白質を発現し続けたとして
も、このアプローチを使用して、我々はその合成後培地
中に放出された高レベルの線形IL−２蛋白質を得ること
ができた。

直線状のIL−２ダイマーは酵素的に産生されたIL−２
２量体とは異なる構造を有しており、これを用いて本
蛋白質の細胞毒性の特性は、その構造的立体配座の関数
であることが示された。遺伝子工学的技術によって産生
された線型２量体IL−２は、単量体IL−２の生物活性を
保持していたが、酵素的に２量化されたIL−２によって
発揮された希突起膠細胞毒性活性を示すことができず、
特異的な型の活性を示す２量体へのIL−２の変換は、構
造依存性であることを示した。

その上、TG_Mそれ自身も、哺乳動物のCNSの切断された
神経において、神経それ自体の環境内で再生成長を起
し、機能的回復へと導くことができる。ここに与えられ
た例は、魚の神経由来のトランスグルタミナーゼである
けれども、特に神経由来のすべてのトランスグルタミナ
ーゼが本発明に包含されるように意図されている。

本発明は、今や、以下の例によって説明されるが、そ
れらによって制限されない。

例 例1.傷害を受けた魚の視覚神経のならし培地はIL−２を
その分子量に関して修飾することができる。

希突起膠細胞毒性因子が傷害を受けた視覚神経による
ならし培地中に存在し、希突起膠細胞毒性因子は、その
細胞毒性が抗−IL−２抗体によって中和される約28Kdの
分子量のIL−２様分子であることが見出されたので、次
に魚の障害を受けた神経が、哺乳動物の低分子量のIL−
２をIL−２の高分子量型へ修飾できる物質、恐らく酵素
を有するかどうかを検討した。再生中の魚の視覚神経に
よるならし培地を、外部から加えたIL−２を翻訳後に修
飾する機作の存在について検討した。したがって、ヒト
組み換え体IL−２（hIL−２）を5mMのCa²⁺の存在下及び
不在下に、ならし培地（CM）とともにインキュベート
し、その結果得られた産物をIL−２に対して発現された
抗体の助けをかりてウェスターンブロット分析にかけ
た。

この目的のためには、再生中の魚の視覚神経によるCM
は、前にEitanら,1992によって記述されたように調製さ
れた。手短かに述べれば、鯉を0.05％３−アミノ安息香
酸エチルエステル（シグマ）で麻酔し、ピンセットで右
の視覚神経を（30秒間）破砕し、６−７日後摘出し、血
清を含まない培地中にインキュベートした（1.5時間25
℃、300μの培地中に４本の神経断片）。その結果得
られた培地（CM）を採取し、それらの蛋白質の含量をBr
adford法によって定量した。

６μｇのCMの部分量をhIL−２とともに、5mMのCaCl₂
で静かにしんとうしながら一夜インキュベートした。混
合物を、SDS−PAGE（12％アクリルアミド）にかけた。
ゲルを200mAでニトロセルローズ上へ２時間ブロットし
た。そして、ニトロセルローズを４℃で５％（wt/vol）
ミルクを含むリン酸バッファー食塩水（PBS）とともに
一夜インキュベートし、次にPBS中で洗浄した。ブロッ
トは、IL−２抗体と37℃で２時間インキュベートし、次
に、0.05％Tween−20を含むPBS中で５分ずつ３回洗浄
し、最後に西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）−結合
ヤギ抗ウサギIgGとともに室温で２時間インキュベート
した。免疫反応性バンドの可視化は、ECL（Amersham）
によって達成された。

結果は図１に示されている。図１において：レーン1,
Ca²⁺の存在下でhIL−２とインキュベートしたCM;レーン
2,Ca²⁺の不在下でhIL−２とインキュベートしたCM;レー
ン3,Ca²⁺の存在下でのCMのみ；レーン4,Ca²⁺の不在下hI
L−２のみ。分子量のマーカーは同じゲル上で電気泳動
にかけ、それらの位置を示してある。hIL−２のみを含
むスロットにおいては、１つの15kDaの免疫反応性バン
ドだけが見出された。CMとインキュベートした後、元の
IL−２化合物の２倍の分子量をもつさらなるIL−２免疫
反応バンドを検出することが出来た。これらの結果か
ら、再生中の神経がIL−２を２量化する機構を有してい
る可能性が有力となった。高い分子量のIL−２免疫反応
性混合物は、Ca²⁺をインキュベーション混合物に加えな
かったとき（図1,レーン）は観察されず、２量化の過程
は、Ca²⁺−依存酵素によって媒介されていることが示唆
された。

例2.魚の視神経中のトランスグルタミナーゼの免疫反応
性は傷害後に上昇する これらの知見にかんがみて、IL−２を修飾する原因と
なる作用体は、傷害後、選択的に上昇し、その酵素の効
果は、IL−２分子の２量化を達成することであるという
可能性を考えた。酵素トランスグルタミナーゼは、有力
な候補と考えられた。それは、蛋白質の架橋結合に関与
することが知られており（Greenbergら,1991）；さら
に、再生中の魚の視覚神経において、トランスグルタミ
ナーゼを暗示する活性が上昇していることが提案された
からである（Chakrabartyら,1987）。

抗トランスグルタミナーゼ抗体は、ウシ血清アルブミ
ンに結合した10個と14個のアミノ酸からの合成ペプチド
の各々に対して、ウサギにおいて発現された。配列が、 は、他の種と組織のトランスグルタミナーゼの既知配列
に相当している。アミノ酸14個よりなるペプチドは、ト
ランスグルタミナーゼの活性部位を表している。

ウェスターンブロット分析によって、再生中の魚の視
覚神経に55kDaトランスグルタミナーゼ免疫反応バンド
の存在が確認された。例１に記述したようにゲルをブロ
ットした。CM（20μｇ）と再生視覚神経の高速遠心分離
上清（HSS−C;16μｇ）と正常の非傷害神経の高速遠心
分離上清（HSS−N;20μｇ）を、SDS−PAGE（10％アクリ
ルアミド）上で電気泳動にかけた。ブロットを、上述の
保持された14個のアミノ酸からなるペプチドに対して調
製された抗体と室温で２時間インキュベートした。そし
て、次に0.05％のTween 20を含むPBS中で５分間ずつ３
回洗浄した。最後に、ブロットは、HRP−結合ヤギ−抗
体と37℃で２時間インキュベートした。可視化は、ECL
（Amersham）によって行われた。

結果は図２に示してある。図中：レーンズ:1,CM;2,HS
S−C;3,HSS−Ｎ。55−kDaの免疫反応バンドは、CMとHSS
において観察された。濃度計による分析から55−kDa免
疫反応性バンドは、HSS−ＮにおけるよりもHSS−Ｃにお
いて３倍高いことが明らかになった。

例3.魚の視覚神経グルタミナーゼの精製 このトランスグルタミナーゼ免疫反応性蛋白質が観察
されたIL−２の修飾の原因であることを確かめるため
に、それを以下の如く精製した：コイ（Cyprinuscarpi
o）の視覚神経（ｎ＝60）を破砕傷害した。６−７日後
に摘出し、1.5mM CaCl₂,1mMスペルミジン、25μg/mlア
プロチニン、25μg/mlのロイペプチド，および５μg/ml
ペプスタチンを含む、pH7.4の10mMトリス−HClのバッフ
ァー中でホモジナイズした。ホモジネートに蔗糖を加え
て最後濃度0.25Mを得た。４℃、150,000gにおいて、１
時間遠心分離した後、高速遠心上清（HSS）を集め、そ
の蛋白含量を、Bradford法によって定量した。HSSを次
にアガロースと結合させた、ポリ−Ｌ−リジン（PLL）
のアフィニティーカラムを通して溶出し、得られた溶出
液（溶出液PLL）を、トランスグルタミナーゼの保存さ
れた14個のアミノ酸からなるペプチドに対して上述の如
く調製され、アフィニティで精製したウサギの抗体のさ
らなるアフィニティーカラムにかけた。結合した物質
を、カラムからpH2.7の0.2Mグリシンで溶出し、1Mトリ
スpH8.0で中和し、それらの蛋白含量を定量した（溶出
液TGAb）。精製段階は表１に要約されている。

表 １ 魚の視覚神経のトランスグルタミナーゼの精製 精製段階 収量/mg 精製度 粗ホモジネート 14 1 溶出液PLL 1.8 7.8 溶出液TG Ab 0.004 3500 トランスグルタミナーゼアフィニティーカラムから溶
出された蛋白質を、それらの純度を確かめるために10％
SDS−PAGEにかけた。図３は、魚の視覚神経トランスグ
ルタミナーゼ（TG_M）の段階的精製を示すSDS−PAGEであ
る。各段階の後に得られた調製物をSDS−PAGEにかけ、
分析された蛋白質の可視化のために銀染色を行った。レ
ーンズ;1,HSS;2,Elu−PLL;3,Elu−TG Ab。示されてい
るように、最終精製段階の後に55kDaの単一バンドが得
られた。

酵素TG_Mはまた、再生中の魚の視覚神経のならし培地
から、アガロースに結合させたPLLのアフィニティーカ
ラムに適用することにより、そして、ホモジネートにつ
いて上述したように、溶出液を、抗体によるさらなるア
フィニティーカラムにかけ、溶出することによって精製
することができる。

例4.TG_Mによって媒介されたプトレッシンのカゼインへ
の組み込み 放射活性プトレッシンのある担体蛋白質への組み込み
は、トランスグルタミナーゼファミリーの酵素のアッセ
イの特徴である。カゼインやウシ血清アルブミンのよう
なリジン残基を有する担体蛋白質は、すべて、アッセイ
において使用することが出来る。

本例においては、神経由来のトランスグルタミナーゼ
の活性の特徴は、N,N−ジメチルカゼインへの〔¹⁴C〕プ
トレッシンの組み込みによって測定された（Chakrabart
yら,1987）。例３において、TG−Abアフィニティーカラ
ムからグリシンで溶出された精製TG_M酵素を、N,N−ジメ
チルカゼイン（1mg/ml）の存在下で２時間透析を行って
から反応混合物に加えた。反応は、粗TG_M（0.7−10ng）
の添加によって開始され、続いて37℃で20分間インキュ
ベーションを行い、氷冷したトリクロロ酢酸（TCA;最終
濃度,5％）の添加によって終結させた。TG_Mの比放射能
は、502000±115000（〔¹⁴C〕プトレッシン／μｇ蛋白
質;cpm）（ｎ＝3,2つの精製、３アッセイ）である。

酵素活性は、温度、pH及び基質濃度に関して滴定され
た。図4Aと4Bにそれぞれ示されているように、TG_Mの最
適活性は、pH9附近にあり、56℃に見出された。Kmは、
基質濃度の関数として、活性の滴定を行って計算され、
5.5×10^-7Mであることが見出された。滴定は、TG_Mの存
在下におけるカゼインへの〔¹⁴C〕プトレッシンの組み
込みを測定することによって行われた。

例5.魚の視覚神経の精製されたトランスグルタミナーゼ
はヒトIL−２を２量化する 例３の精製酵素がIL−２を２量化する能力が検討され
た。本実験においては、粗CMではなく、精製されたTG_M
が使用されたことを除けば、ヒト組み換え体IL−２（hI
L−２）を例１において記述されたようにインキュベー
トした。対照として、hIL−２、または精製酵素TG_Mを、
別々に同じバッファー中でインキュベートした。インキ
ュベーションは、すべて、5mMのCa²⁺及び熱で不活性化
した0.3％のウシ胎児血清（FCS）の存在下で行われた。

インキュベーションの後、混合物を、ウェスターンブ
ロット分析に適用した。分離は、SDS−PAGE（12％アク
リルアミド）上で行われ、続いて２時間、200mAにおい
てニトロセルローズ上へブロッティングした。次に、ニ
トロセルローズをPBS中で洗い、最初に５％のミルクを
含むPBS中で４℃で一夜インキュベートし、次にヒトIL
−２に対して発現されたウサギ抗体とともに37℃で、そ
の後、さらに２時間インキュベートし、0.05％Tween−2
0を含むPBS中で３回洗浄した。最後の洗浄の後、西洋ワ
サビペルオキシダーゼと結合させたヤギ抗−ウサギ抗体
（HRP−GaRb）と共に室温でさらに１ 1/2時間インキュ
ベーションを行い、続いて、Tween−20を含むPBSで３回
洗浄し、ウェスターンブロッティングの検出試薬（ECL,
Amersham）中で１分間インキュベートし、風乾し、フィ
ルムに暴露した。結果は図５に示されている。図中：レ
ーンズ;1,精製TG_MプラスhIL−2;2,hIL−２のみ;3,TG_Mの
み。

図５に示されているように、元のIL−２に加えて、30
kDの高分子量のIL−２免疫反応性バンドが得られた。濃
度計による分析からこれらの条件下でIL−２の約25％が
２量化したことが明らかとなった。

例6.酵素的に産生された２量体IL−２は希突起膠細胞に
対して細胞毒性である ２量化の生物学的意義を確かめるために、我々は、結
果として生じた２量体IL−２が、希突起膠細胞に対して
細胞毒性があるかどうかを検討した。hIL−２（100U/m
l、または10U/mlにおける）を精製TG_M酵素とインキュベ
ートし、次に、反応混合物をラットの脳の希突起膠細胞
の増強培養に適用した。対照培養は、無処理希突起膠細
胞、及び100U/mlと10U/mlのhIL−2,及び精製酵素に別々
に暴露された希突起膠細胞からなっていた。

新生ラットの脳に由来した増強された希突起膠細胞
は、BottensteinとSato,1979によって記述されたように
調製され、PLL（２μg/μ）（シグマ）でコートされ
たウェル中に接種された。72時間後に、接種された細胞
をTG_M単独、TG_MとあらかじめインキュベートしたhIL−
２、またはhIL−２単独を含む種々の調製物で処理し
た。２つの異なる濃度、10U/mlと100U/mlにおけるhIL−
２を一定量のTG_Mとインキュベートした。細胞毒性活性
（生存細胞の数による）は、比色MTT（シグマ）アッセ
イによって評価された（T.Mosmann,1983,J.Immunol.Met
h.65:55−63）。諸種の調製物と48時間インキュベーシ
ョンした後、MTT（10μ、5mg/ml）を３時間加え、次
に、培地を除き、100μのイソプロパノール中0.04M
HClを加えた。結晶が全部溶解するまで、細胞を静かに
振盪した。それらの吸光度は、参照としての630nmにお
ける吸光度に対する540nmにおいて記録した。

結果は、図6A−Ｄに示されている。顕微鏡写真は、MT
T染色後の種々に処理した培養物を示す。B,hIL−２のみ
（100U/ml）で処理した培養物;C,TG_Mのみで処理した培
養物;D,hIL−２（100U/ml）と酵素的に産生したhIL−２
を含むTG_Mの混合物で処理した培養物。図６においてみ
られるように、酵素的に産生された２量体のIL−２を含
む反応混合物で処理された希突起膠細胞の培養物のみが
細胞毒性を示した。図５に示された結果から、２量体IL
−２を含む反応混合物においては、IL−２の25％が２量
体であり、残りは単量体であるように思われる。したが
って、100U/mlの単量体が細胞毒性を示さない条件下
で、２量体形の25U/mlのIL−２は細胞毒性を示すので十
分であると思われる。

増強させた希突起膠細胞の調製のためには新生ラット
の脳（生後２日）を摘出し〔2mlのLeibowitz培地中に２
つの脳（Ｌ−15）;Gibco〕そして1mMのエチレンジアミ
ンテトラアセティックアシッド（EDTA）を含むDMEM（Ca
²⁺とMg²⁺を含まない）中に、３×10⁴U/mlのトリプシン
（シグマ）によって化学的に解離させた。機械的解離
は、トリプシン溶液で、37℃で10分間インキュベーショ
ンする前に行った。次に、細胞を1mlの74U/ml DNアー
ゼ（シグマ）、5200U/mlの大豆トリプシン（シグマ）、
及び3mgのBSAを含む15mlのコニカルチューブに移し、室
温で１分間インキュベートし、10mlの培地に加え、続い
てDEME中３回洗浄した。最後の洗浄の後、細胞を５−10
％ウシ胎児血清（FBS;シグマ,56℃で30分間加熱により
不活化した）を含む10mlDMEM中に懸濁させ、メッシュを
通過させ、あらかじめ20μg/mlのポリ−Ｌ−リジン（PL
L,Mw100000;シグマ）で、37℃で一夜コートした85mm²の
フラスコ（Nunc）に接種した。細胞接種後の最初の24時
間で培地を交換し、その後は、２−３日毎に１回培地交
換を行った。接種８日後に細胞を振盪しながら４−６時
間インキュベートし、上清を取除き、残りの細胞を、数
時間10mlの培地（DMEM＋５−10％FBS）中でさらに数時
間インキュベートし、一夜振盪した。振盪によって除去
された細胞を集め、遠心分離し、次にペレットとなった
細胞を１−2mlの血清を含まない培地中に再懸濁した。
このようにして得られた増強された回収希突起膠細胞
を、あらかじめPLL（20μg/ml）でコートされた96−穴
のプレート上に接種した。細胞を100μの限定培地（B
ottensteinとSatoの限定培地に対するRaffによる改変培
地ともに接種した）。48−72時間後に接種した細胞を上
述のように処理した。

例7.TG_M処置により成熟ラットの切断された視神経の機
能回復が起る。

30匹の成熟（12−14週齢）Sprague−Dawley（SPD）ラ
ットにおいて、損傷を与えた前後の視覚経路における変
化をオンラインモニターするために、視覚野皮質中に電
極を埋め込んだ。麻酔ラット（Rampon,Vetalar）を、小
動物用の定位固定装置に固定した。そして露出した頭蓋
骨にドリルで２つの穴をあけた。皮質の損傷を最小限に
止めるために、硬膜は傷つけないようにした。鼻骨の上
まであけた１つの穴は、基準電極部位として使用した。
２つ目の穴は、前頂−8mm側方3mmのOCI領域においてあ
けた。電極は、ねじに接続された金の接触ピン（Wire−
Pro,Inc.）であり、これを穴の中にねじ込み、アクリル
酸セメントで頭蓋に接着した。フィールド電位は、最初
に正常神経において記録をとり、次に、傷害後は、スト
ロボスコープによる刺戟で誘発させ（キセノン閃光管4w
/秒,1−2m秒の持続時間,0.3Hz）、1,000倍に増幅し（AM
システム、マイクロ電極増幅器、Model 1800）、デジタ
ル化した（12ビット、500サンプル／秒）（National In
struments,Board MIO 16−９とLab View 2.2.1 Data
AcquisitionとManagement System）。視覚誘発電位（V
EP）の記録中は、反対側の眼には常に覆いをした。電極
を埋め込んだ１週間後に、左側の視覚神経を神経鞘を開
いて露出した。先端が200μｍで、なめらかに切れ味を
鈍くした刃を有する特別にデザインされたガラスのプロ
ーブにより、神経血管系に損傷を与えることなく、神経
線維を眼球から2mm切除した。神経は、完全に切断し、T
G_Mを含まないか、含む２μのバッファー（それぞれ、
対照とTG_M処理と呼ばれる）溶液を、ガラスのピペット
で傷害部位に注入した。手術と処置と記録については、
２重盲検の手順に従った。使用されたTG_Mは、例３にし
たがったCMから精製したTG_Mであった。

30匹の動物のうち、損傷を与えた１週間後に、恐らく
不完全な切断を反映する残存VEP活性を示す８匹を実験
から除き、10匹のTG_M処置動物、及び12匹の対照動物
を、その後の実験のために残した。損傷を与えた６週間
後に、残った22匹の動物についてVEP応答を再び記録し
た。VEPは、２つのパラメーターによって特徴づけられ
る。すなわち、最初の負のピーク反応の潜伏期と振幅で
ある。このオンライン実験においては、１週間後に応答
がなかったので、追跡検討のために残っていた神経の傷
害を受けたTG_M処理の10匹の動物のうち、７匹が機能回
復を示した（表２）。１週間後に、残された12匹の対照
動物においては、５週間後に回復は認められなかった
（表２）。

TG_M処理の傷害を受けた神経における大抵の場合の活
性のピークは、未傷害の神経のそれらに比べて、振幅と
潜伏期の両方において有意な差をもってシフトが起きて
いるように思われた（表３）。TG_M処理傷害神経におけ
る振幅は、正常神経におけるよりも常に小さいけれど
も、恐らく一次標的（外側膝状核）におけるぬけた部位
への樹状分岐、あるいは誘発反応において関与している
神経伝達物質の性質と量の変化のために、予想よりも高
かった。

図7A−Ｃは、SPDラットのTG_M−処理傷害神経における
機能活性のオンライン記録の典型的な結果を示す。VEP
応答を傷害前（パネルＡ）と傷害の１週間後と、６週間
後（それぞれ、パネルＢとＣ）に記録した。傷害の１週
間後には、VEP応答は検出されなかった。しかし、６週
間後には正のVEP活性が記録された。ピークは、傷害前
の状態に比べてシフトしていて、潜伏期がより長く、振
幅はより小さかった。図8A−Ｃは、典型的な対照動物
（バッファー処理）の記録を示す。図は、傷害前（パネ
ルＡ）、傷害の一週間後、及び６週間後（それぞれ、パ
ネルＢとＣ）に記録されたVEP応答活性を示す。VEP応答
は、傷害の６週間後においては検出できなかった。

この実験は、それら自身の変質した環境内において、
恐らく成長を容易にする処理の後、成熟動物の切断され
たCNS神経における機能の回復を示す（Lavieら,199
0）。他の研究は、これまでのところ、生理学的回復が
起ることなく、それら自身の環境内において、CNSの軸
索の成長を達成した。このようにして、例えば、哺乳動
物のミエリンと関連した阻害剤に対する抗体を産生する
ハイブリドーマの使用が、脊髄内の再成長（SchnellとS
chwab,1990）を促進することが示された。同様に、胎児
の星状膠細胞でコートされたミリポーア移植体が、破壊
された背部のルート軸索の成熟哺乳動物の脊髄の灰白質
への成長を促進した（Rudgeら,1990）。新たに成長する
哺乳類の軸索の生理学的活性が、神経自身の環境内での
成長の結果としてではなく、神経自身の成長を敵視する
環境が、移植した末梢神経のブリッジによって置き換え
られた後示された。この結果、移植体の長さに沿って脳
まで、全道のりにおいて、軸索の成長を生じた。上位シ
ナプス丘が見出されたが、軸索は、標的CNS組織内の限
られた距離しか貫通しなかった（Kirsteadら,1990;Aagu
ayoら,1990aと1990b）。

本実験においては、TG_M酵素の局所的投与の後に、機
能恢復が起り、この酵素は、自然発生的に再生しつつあ
る神経系において、傷害後単離された。再生中の魚の視
覚神経から単離された本酵素は、in vitroでIL−２を２
量化し、希突起膠細胞に対して細胞毒性を有するように
その特性を変える。本実験においては、活性なIL−２の
２量体が、in vivoにおいて形成され、傷害後間もな
く、少くとも傷害の部位のごく近傍において、酵素的に
産生された２量体によって、成熟希突起膠細胞の除去
が、成長を促進するかもしれないという仮定に基いて、
TG_Mをin vivoで適用した。しかし、酵素TG_Mの活性の他
の機作も除外すべきでない。

VEP応答は、網膜から脳皮質に至るまでの視覚的シス
テムの完全性を示唆する客観的生理学的パラメーターで
ある。傷害の１週間後には検出されなかったが、５週間
後には有意な活性が記録されたという我々の知見から見
ると、VEP応答は、軸索の成長と再結合の結果であると
仮定することは理に適っている。その上、TG_Mで処理さ
れた神経の大部分において、潜伏期間が、無傷の神経に
比べて延長され、応答が、標的に再分布する新たに成長
しつつある（髄鞘がない）軸索の結果であるかもしれな
いという概念を、さらに支持している。

例8.線型２量体IL−２の調製 線形２量体IL−２の蛋白質を、ウイルス発現ベクター
を使用することによって構築し、感染細胞の培地中に大
量の線形IL−２の２量体が発現できるようになった。

この実験においては、以下の実験的手順が使用され
た。

8.1 リンパ球とRNAの調製 ヒトリンパ球を単離し、IL−2mRNAの量を最大にする
ように刺戟した。末梢血をヘパリンで処理した60−mlの
注射筒に集め、等量の燐酸バッファー食塩水（RBS）で
希釈した。次に混合物を、1.077g/mlのPercoll溶液（4
9.2％Percoll,150mM NaCl）の上に重層し、400xg、４
℃で25分間遠心分離した。リンパ球に富んだ軟膜を、ガ
ラスのPasteurピペットで集め、PBS中で２回洗浄した。
リンパ球の２×10⁶細胞/mlを平板にまき、RPMI−1640
（Gibco）、２％熱不活性化ウシ胎児血清（IFCS）、100
U/mlペニシリンと0.1mg/mlストレプトマイシン（シグ
マ）、及び５×10^-5Mβ−メルカプトエタノールからな
る完全培地中１μg/mlのピーナッツ赤血球凝集素の存在
下で３日間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、
完全培地中２×10⁶細胞/mlにおいて新しいフラスコ上に
平板にまき、１μg/mlのPHAと10ng/mlホルボール12−ミ
リステート13−アセテート（PMA）で３時間刺戟した。
全細胞RNAを、Biotec Laboratoriesキットの助けをかり
て、RNA zol Ｂ法（ChomczynskiとSacchi,1987）によ
って単離し、260/280nmにおける吸光度で定量した。

8.2 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）と配列分析 PCRsは、Gene Ampキット（Cetus,USA）の助けを借り
て行った。全ヒトリンパ球RNA（１μｇ）を42℃で15分
間、PCRバッファー（最終的に１×）、5mM MgCl₂,1U/
μ RNアーゼ阻害剤、50pmolの特異的下流のプライマ
ー、及び1mMの各dNTPとともに、全反応容量20μで逆
転写酵素反応を行った。逆転写酵素を熱で不活性化した
後、反応混合物に、50pmolの下流のプライマー、100pmo
lの上流のプライマー、PCRバッファー（最終的に１
×）、2mM MgCl₂溶液、そして、2.50taq DNAポリメラ
ーゼを加えることによって100μとした。最初のPCRサ
イクルを45℃で１分間、72℃で１分間、及び94℃で１分
間行った。55℃において30秒、72℃において１分、そし
て94℃において１分間の各30サイクルがこれに続いた。

cDNAsの両端が完全に埋められ、このようにして制限酵
素での適切な消化を促進することを確実にするために
（もし反応が増幅したDNAから出発したならば、30の各
サイクルは、非特異的増幅バンドが除去できるように、
94℃で１分間、そして72℃で1.5分間継続した）、30サ
イクルの終りに、72℃において５分間の余分の処理を加
えた。PCRの産物を、適切に消化されたブルースクリプ
トKS−ベクターに連結した。連結されるべきDNAsの各々
（10ng）は、65℃で５分間加熱され、次に、連結バッフ
ァー（最終的に１×;Stratagene）と5UのT4DNAリガーゼ
（Stratagene）とともに全反応容量が10μで室温で15
分間インキュベートした。連結は、15℃で一夜インキュ
ベーションすることによって起った。組み換え体は（確
かな反応能のある細胞であるEqicurian coliに、Strata
gene）クローニングされ、アンピシリンを含むプレート
上で一夜の成長のため平板にまかれた。陽性のクローン
は、ミニスケールDNA調製のための（Sambrookら,1989）
アルカリ法に続く、制限酵素分析とゲル電気泳動によっ
て明確にした。陽性クローンは、Sequenaseキット（US
B）の助けをかりて、Sangerのチェインターミネーター
法によって配列を決定した。

8.3 細胞のトランスフェクション、ウイルスベクター
の発生と蛋白質抽出 ウサギの皮膚（RS）細胞とアフリカミドリザルの腎臓
（Vero）細胞を、10％IFCS、１％グルタミン、及び１％
ペニシリン−ストレプトマイシンを補添したDulbeccoの
改変イーグル培地（DMEM）中で成育させた。RS細胞を、
カルシウムホスフェート法（Grahamとvan der Eb,197
3）によって、そしてその後、グリセロールショック（P
arkerとStark,1979）をかけて20μｇのpCB−IL−２ダイ
マー（以下に記述された）をトランスフェクトさせた。
10から20％の範囲のトランスフェクションの効率は、10
μｇのpCB−IL−２ダイマーと10μｇのＸ−galプラスミ
ドDNAとともにコトランスフェクトされた細胞中の細菌
のβ−ガラクトシダーゼ（Sanesら,1986）の組織化学的
検出によるプレートあたりの青色細胞数／全細胞数に基
づいて決定された。37℃と５％CO₂の雰囲気下で一夜イ
ンキュベーションを行った後、培地を除去し、細胞を温
度感受性HSV1（Grahamとvan der Eb,1973）tsK株（Davi
sonら,1984）で感染の多重度0.1プラーク形成単位（pf
u）／細胞数で重感染させた。31.5℃で1.5時間インキュ
ベートした後、細胞を１％IFCSを補添したPBSで２回水
洗した。そして、DMEM/1％、IFCS/1％ペニシリン−スト
レプトマイシン/1％グルタミン中において同じ温度でイ
ンキュベートした。

通常、重感染の２日後であるが、細胞のすべてが細胞
変性効果を示したとき、ウイルスのストックを収穫し
た。培地中の集められた細胞を1000gで５分間遠心分離
し、ペレットをウイルスバッファー（150mM NaCl/20mM
トリス、pH7.5）中に再懸濁させた。懸濁物を、−70℃
で急速に凍結し、37℃で解凍し（３回繰返した）、そし
て、次に、欠陥性ウイルスの異なる希釈において、Vero
細胞を感染するのに使用した。37℃において（tsKに対
しては非許容温度）一夜インキュベートした後、放出さ
れた合成蛋白質を含む培地を集め、細胞を10mMトリス、
pH7.5、150mM NaCl、１％Triton、1mM EDTA、1mMスペ
ルミジンとプロテアーゼ阻害剤（25μg/mlリューペプチ
ン、及び５μg/mlのペプスタチン）中で、４℃で２時間
インキュベーションすることによって抽出した。その
後、上清を採取した。その結果得られた産物を、感染細
胞の培地／抽出物中のIL−２の２量体蛋白質の発現を確
認するために、ウェスターンブロット解析（Eitanら,19
92）にかけた。

8.4 ヒトIL−2cDNA産物の構築 ヒトリンパ球から誘導されたIL−2cDNA配列（Taniguc
hiら,1983）をPCRに対する最適プライマーの選択におい
て役立つプライマーデザイナープログラムにかけた。平
行して、本配列をクローンマネージャープログラムにか
け、我々がIL−２遺伝子に存在しない制限酵素部位を検
出することができるようになった制限地図を生じた。こ
れらの部位を、プライマーの両端に加えた。我々は、次
に２つのPCRsを行った：反応Ａは、すべての翻訳された
コドンを含むが、停止コドンがないように、最後の翻訳
コドンの直前で停止した；反応Ｂの産物は、最初の翻訳
コドンで出発したが、停止コドンが含まれるように停止
部位の向う側で終った。２つのプライマーのセットとPC
Rsが、図９において説明されている。反応Ａのための下
流のプライマー、反応Ｂのための上流プライマー上に、
遺伝子組み換えによって導入された制限酵素部位は同じ
であり、したがって、ＡとＢの産物のフレーム内で、そ
して適切な配向における融合による２量体cDNAの構築が
出来るようになった。制限酵素部位が加えられたので、
産物Ａの最後のコドンと産物Ｂの最初のコドンの間に６
個の塩基があり、その結果、接合部位において２個のア
ミノ酸の添加が起った。我々は、２量体におけるIL−２
単量体分子のそれぞれに対して、２つの余分なアミノ酸
の寄与は最小限であろうと期待する。

8.5 PCR産物の配列分析 PCR産物が発現実験において使用されたので、PCR過程
を通じて突然変異が導入されなかったことを確認するこ
とが重要であった。各PCR型の（上の8.2において記述さ
れたように）３つの陽性で適切に消化されたクローンが
選ばれて、配列分析が行われ、各セットのクローンの１
つが、突然変異を起さず、正しい配列を発現しているこ
とが見出された。これら２つのクローンが、線形IL−２
２量体の構築に選ばれた。

8.6 欠陥ウイルスベクターにおける線形ダイマーの構
築 ここに用いられた欠陥ベクターの原型（pCB;図10）
は、HSV1開裂／パッケージングシグナル（HSVa）を含む
pRB3119からの断片、DNA複製（HSV ori）のHSV起点を含
む断片、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、l
acZ遺伝子、及びSV40ポリアデニル化シグナル〔ポリ
（Ａ）^＋シグナル〕を含むpcDNA lacからの断片を含
む。これらの配列が、β−ラクタマーゼ遺伝子（Amp^R）
とDNA複製の細菌の起点（Col El ori）を含むアンピシ
リン抵抗性プラスミドpT7−３に挿入された。最初の段
階としては、lac Z遺伝子をベクターから切出した。こ
れは、Hind IIIでベクターを線形化し、続いてPst Iで
部分消化し、Geneclean IIキット（BIO 101）の助けを
借りて、アガロースゲルから正しいベクターバンドを抽
出することによって行われた。２つのPCR産物を３重連
結において生じたベクターに連結させた（Ａに続くＢと
いう正しい方向は、8.4において上に考察したように、
２つの産物のあらかじめデザインされた相補的制限部位
によって決定された）。その結果得られた構築物である
pCB−IL−２ダイマーは、制限酵素分析の後、多量の規
模のDNA調製（CsCl）（Sambrookら,1989）によって２重
にチェックされ、ウサギの皮膚（RS）細胞にトランスフ
ェクトした。収穫されたウイルスのストックを用いて、
上の8.3において考察されたように、アフリカミドリザ
ルの腎臓（Vero）細胞の感染に使用された。

例9.線形の２量体IL−２の蛋白質産物の分析 IL−２蛋白質は、成長しつつある細胞の培地中に放出
されることが知られているので、上の例8.6において得
られた感染Vero細胞の培地を集め、線形２量体IL−２蛋
白質の原料として使用した。平行的に、感染細胞中に合
成蛋白質が保持されているか否かを決定するために、細
胞抽出物を調製し、同じ条件で検討した。２つの懸濁液
を、ヒトIL−２に向けられたモノクローナル抗体の使用
によるウェスターンブロット分析にかけた（図11、左の
パネル）。細胞の上清（レーンズ1,3）と抽出物（レー
ンズ2,4）の２つの希釈物（1:3,レーンズ1,3,5,および
1:9,レーンズ2,4,6）、及び欠陥ウイルスのみによって
感染された細胞から得られた上清（レーン５）と細胞抽
出物（レーン６）が分析された。IL−２の免疫反応性バ
ンドが検出されなかった欠陥ウイルスのみで感染された
細胞と対照的に（レーンズ5,6）、上清（1,3）か細胞抽
出物（2,4）のいずれかを含む４つのレーンは、すべて
が特異的IL−２モノクローナル抗体と免疫反応した約37
kdのバンドを発現した。市販のヒト単量体のIL−２蛋白
質は、14kdの分子量を有し、本発明において記述された
神経由来のトランスグルタミナーゼによって、市販の単
量体IL−２から合成された２量体蛋白質は、分子量28kd
（図11、それぞれ右のパネルのレーンズ２と１）であっ
た。in vitroでトランスグルアミナーゼと単量体IL−２
によって合成された２量体と対照的に、２つの異なる手
順によって産生された２量体IL−２の間の大きさにおけ
る差は、感染性細胞における線形２量化蛋白質の翻訳後
の修飾によって説明できる可能性がある。上清（レーン
ズ,1,3）は約44kd.の余分なバンドを含んでいた。この
余分なバンドも、蛋白質の培地中への放出を通じて起っ
た可能性があるグリコシル化、またはリン酸化のよう
な、翻訳後の修飾によって説明することができる。

例10.線形の２量体IL−２は希突起膠細胞に対して細胞
毒性を有していない 次に、我々は、in vitro細胞毒性に関して、この線形
ヒトIL−２の２量体が、本発明のトランスグルタミナー
ゼで２量化したヒトIL−２を模倣することができるか否
かを見出そうと試みた。この可能性を検討するために、
例９においてウェスターンブロット分析について使用さ
れたのと同じ試料、上清の同じ希釈物からの部分量を、
ラットの希突起膠細胞に適用した。

新生ラットの脳に由来した、増強された希突起膠細胞
は、記述されたように調製した（BottensteinとSato,19
79）そして、あらかじめポリ−Ｌ−リシン（PLL）でコ
ートされたガラスカバースリット上に接種された（Eita
nら,1992）。48時間後に、細胞を線形２量体蛋白質の部
分量で処理し、細胞毒性の程度を、比色法により評価し
た（Eitanら,1992）生存細胞の数によって決定した。比
色法によってアッセイされた成熟希突起膠細胞の数は、
鎖状２量体のいずれの希釈においても、または対照とし
て使用したtsKにおいても、対照として使用した未処理
細胞（100％）と比較して減少しなかった（図12、左の
パネル）。より高い蛋白質濃度においても（図12、左の
パネル）減少は検出されなかった。他方、IL−２様細胞
毒性因子が同定された魚の再生視覚神経から由来した水
溶性物質は（Eitanら,1992）、in vitroで酵素的に合成
されたヒト２量体IL−２と同様に、成熟希突起膠細胞の
数の有意な減少を起した（図12、右のパネル）。

例11.IL−２依存性Ｔ細胞系を使用した線形２量体のIL
−２生物活性の検出 線形２量体の希突起膠細胞に対する毒性がないこと
が、HSV1ベクターを経た発現の結果としてIL−２蛋白質
の活性の喪失によって起ったという可能性を除外するた
めに、我々は、線形２量体の活性評価を行い、Ｔ細胞系
（CTLL−２）に対するマイトジェンとして、単量体I1−
２を模倣するその能力を評価した。このように、CTLL−
２細胞を多穴培養プレート（２×10³細胞/100μ RPM
I、このRPMIは、10％IFCS、2mMグルタミン、及び0.05mM
β−メルカプトエタノールを含む）に接種した。２−
３時間後に、ウェスターンブロット分析、及び細胞毒性
アッセイのために使用されたのと同じ上清の試料と同じ
希釈（1:9）からの部分量を適用し、37℃で一夜インキ
ュベーションを行った。１μCiの〔³H〕チミジンを各ウ
エルに加え、さらに４時間インキュベートした。インキ
ュベーションの後、細胞を収穫し、チミジンの組み込み
を、cpmによって検出した。対照として使用されたtsKと
対比して、線形２量体の異なる濃度の添加は、用量依存
的に細胞増殖を（図13、左のパネル）起した。観察され
た増殖は、対照として使用された市販の単量体によって
起された増殖よりも高くさえあった（図13、右のパネ
ル）。

本実験は、得られた線形２量体IL−２産物は、翻訳産
物であって、翻訳後のIL−２の修飾である酵素的に生じ
た２量体とは突起膠細胞に対する細胞毒性について異な
っていることを示している。線形２量体は、Ｔ細胞に対
する細胞分裂促進性に関して、単量体IL−２の既知のIL
−２活性を保持しているが、希突起膠細胞に対する細胞
毒性を示さず、線形ダイマーのIL−２に、希突起膠細胞
に対する細胞毒性が欠けていることは、その調製中の生
物活性の喪失によって起るのではないことが示唆される
が、希突起膠細胞に対する細胞毒性のための必要事項を
明らかに満していないその高次構造に関連している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １０５７５２ (32)優先日 平成５年５月19日(1993．5．19) (33)優先権主張国 イスラエル（ＩＬ） (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ，1987年，Ｖｏｌ. 48，ｐ．669−675 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1992年，Ｖｏｌ．89，ｐ. 5442−5446 ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ，1991年 12月，Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．15，ｐ．3071 −3077 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1993年 ７月 ２ 日，Ｖｏｌ．261，ｐ．106−108 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/10 C12N 15/09 A61P 25/00 A61P 27/02 A61K 38/45 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の特徴を有する神経由来のトランスグ
   ルタミナーゼTG_M: （ｉ）それは、水溶性である； （ii）それは、再生中の魚の視覚神経から得られる； （iii）それは、IL−２を、希突起膠細胞に対して細胞
   毒性活性を有する２量体IL−２に変換する； （iv）それは、SDS−PAGEと銀染色によって決定され
   る、約55kDaの分子量を有する； （ｖ）それは、傷害を受けた魚の視覚神経において、傷
   害を受けていない魚の視覚神経と比較して、濃度の上昇
   が検出される； （vi）それは、トランスグルタミナーゼファミリーのア
   ッセイの特徴として、担体蛋白質へのプトレッシンを組
   み込む； （vii）それは、pH9と56℃において、プトレッシンの組
   み込み活性が最適である； （viii）そのプトレッシンの組み込みにおけるKmは、基
   質の関数として計算され、5.5×10^-7である； （ix）それは、IL−２の２量化過程に関しては、Ca²⁺依
   存性酵素である； （ｘ）それは、トランスグルタミナーゼの２つの部位に
   相当するペプチドに対して発現された抗体に関して、ウ
   ェスターンブロット分析において免疫反応性のバンドを
   示し、該ペプチドは、以下の配列のトランスグルタミナ
   ーゼの活性部位に相当する14個のアミノ酸からなるペプ
   チド： と10個のアミノ酸からなる配列： から選ばれる。
2. 【請求項２】請求項１に記載の神経由来のトランスグル
   タミナーゼTG_Mを有効成分として含有する傷害を受けた
   視覚神経の再生を誘発し促進するための医薬組成物。