CN118252953A - 一种用于神经退行性疾病治疗的基因序列构建体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因治疗领域，具体涉及一种用于神经退行性疾病治疗的基因序列构建体及其应用。本发明提供的基因序列构建体包括芳香族L‑氨基酸类脱羧基酶AADC核苷酸序列、胶质细胞源性神经营养因子GDNF核苷酸序列和自加工单元APU；所述芳香族L‑氨基酸类脱羧基酶AADC核苷酸序列和胶质细胞源性神经营养因子GDNF核苷酸序列之间通过自加工单元APU连接，通过体外途径和体内途径介导该基因序列构建体导入到靶细胞或组织，可以实现功能性的芳香族L‑氨基酸类脱羧基酶和胶质细胞源性神经营养因子的共表达，用于帕金森病的预防与治疗，具有提高脑部多巴胺水平和保护多巴胺能神经元的双重作用，具有广阔的应用前景。

Description

一种用于神经退行性疾病治疗的基因序列构建体及其应用
技术领域
本发明属于基因治疗领域，具体涉及一种用于神经退行性疾病治疗的基因序列构建体及其应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种常见的神经退行性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，引起纹状体多巴胺生成显著性减少，无法维持调节神经系统的正常功能。临床上表现为静止性震颤、肌肉僵硬、运动迟缓、姿势平衡障碍、嗅觉减退和睡眠障碍等。PD多见于老年人，平均发病年龄为60岁左右，随着人口的老龄化，PD的发病率呈逐年上升趋势。迄今为止，PD的发病机制仍不清楚，PD的防治成为国内外研究的热点，目前的研究显示，PD倾向于与老龄化、遗传因素、氧化应激和环境因素等有关。目前治疗PD的传统药物，主要是基于提高脑补DA水平或者减少DA的降解，如复方左旋多巴(L-Dopa)、多巴胺受体激动剂、抗胆碱药和儿茶酚-O-甲基转移酶抑制剂等。临床上控制运动症状的金标准是用左旋多巴替代丢失的多巴胺，来改善患者运动症状。然而，疾病的进展会导致左旋多巴的有效性加速消减，患者可能在两次服药之间经历“关闭”期，并导致运动症状出现，一般在应用三到五年之后突然失效，而且往往伴随着患者健康状态的急剧下降。目前传统的多巴胺替代疗法无法根治PD，无法逆转疾病的进展，且伴随明显的副作用，而基因治疗成为PD一种新的潜在手段。
而芳香族L-氨基酸类脱羧基酶(AADC)是一种同二聚体吡哆醛磷酸依耐性酶，它所编码的蛋白质负责多巴胺和血清素的合成，可以催化左旋多巴(L-Dopa)脱羧生成多巴胺，L-5-羟色氨酸脱羧成血清素，L-色氨酸脱羧成色胺。AADC是多巴胺合成的关键酶，通过提高左旋多巴向多巴胺的转化效率来进行多巴胺的替代治疗。基因治疗可以通过病毒或非病毒载体引入AADC，调节神经递质DA的产生，让残存的神经元分泌DA，恢复神经元信号而治疗PD。使用基因疗法的潜在效果包括，减少抗帕金森药物的使用和依赖，改善左旋多巴的应答。
针对PD的治疗另外一种常用策略，阻止或减缓PD介导的神经细胞死亡和诱导残存的神经元再生。神经胶质细胞神经源性神经营养因子(GDNF)是一种有神经修复和神经保护作用的蛋白，研究发现GDNF可以保护多巴胺能神经元，阻止或减缓多巴胺能神经元的变性死亡，提高其存活率，让一些退化的神经元再生，在多种神经系统疾病中具有潜在的治疗价值。有报道，轻度认知功能障碍(MCI)患者及阿尔兹海默病(Alzheimer’s Disease,AD)患者外周血清GDNF浓度下降。体内及体外研究发现，GDNF可能参与围术期神经认知障碍的发生过程。
近期针对PD的基因治疗进展迅速，主要向脑内导入并过表达基因：(1)神经营养因子：如神经生长因子和胶质细胞源神经营养因子GDNF，能预防多巴胺能神经元的变性坏死，恢复多巴胺能神经元的结构和功能。(2)神经递质合成酶：如负责DA合成的关键酶AADC。导入AADC可以恢复多巴胺的合成而缓解临床症状，但不能阻止多巴胺能神经元的持续变性坏死，无法阻止病情的持续恶化；而导入GDNF，虽然有助于保护残存的多巴胺能神经元，阻止病情进一步恶化，但无法改善和恢复已经存在的症状。因此，选择合适的目的基因导入至靶细胞，合适的蛋白间的连接方式，使目的基因在靶细胞中持续并稳定的表达，是基因治疗成败的关键，是帕金森、阿尔兹海默症等神经退行性疾病的防治中急需解决的问题。
发明内容
本发明旨在提供一种用于神经退行性疾病治疗的基因序列构建体及其应用，本发明所提供的基因序列构建体，可以同时表达芳香族L-氨基酸类脱羧基酶(AADC)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)，核苷酸序列之间通过自加工单元(auto-processing unit，APU)连接，可以通过体外途径和体内途径介导该基因序列构建体导入到靶细胞或组织，实现功能性的芳香族L-氨基酸类脱羧基酶(AADC)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的共表达，用于帕金森病的预防与治疗。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的第一个目的是提供一种用于神经退行性疾病治疗的药物，所述的药物为一种核苷酸序列构建体，所述构建体为通过自加工单元APU连接的两个或多个治疗神经退行性疾病相关的核苷酸序列。
优选的，所述治疗神经退行性疾病相关的核苷酸序列，包含选自于芳香族L-氨基酸类脱羧基酶AADC、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、GDNF家族和神经营养因子NT家族的核苷酸序列中的两种或两种以上；所述的核苷酸序列之间，至少有两个是通过自加工单元APU连接。
优选的，所述GDNF家族包含GDNF天然类似物、神经秩蛋白NRTN、神经鞘胚素ARTN和Persephin PSPN；所述神经营养因子NT家族包含神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF、睫状神经营养因子CNTF、神经营养因子3NT-3、神经营养因子4/5NT-4/5和神经营养因子6NT-6。
优选的，所述自加工单元APU包含但不限于内部核糖体进入位点序列IRES、2A肽或类2A肽、Intein、B型细菌提Intein样结构域BIL和Furin序列及其衍生物。
优选的，所述的IRES元件来源于脑心肌炎病毒EMCV；所述的2A肽或类2A肽，包含但不限于源于手足口病毒的F2A、源于马甲型鼻炎病毒的E2A、源于猪捷申病毒的P2A和源于明脉扁刺蛾病毒的T2A。
所述的IRES元件来源于脑心肌炎病毒(EMCV)，作为额外的核糖体募集位点起作用，允许翻译起始发生在除了翻译起始位点之外的mRNA内部区域；所述的2A肽是来源于病毒的短肽(平均长度为18-22个氨基酸)，它们通常被称为“自我剪切”肽，能使一条转录产物产生多种蛋白；目前有四种常用的2A肽，分别是P2A，T2A，E2A和F2A，来源于四种不同的病毒，而2A肽元件的共有序列是D(V/I)ExNPGP，其中，x是任意氨基酸，而切割的位点，就在最后两个氨基酸G和P之间。
优选的，所述自加工单元APU为P2A；所述P2A来源于猪捷申病毒(Porcineteschovirus)，氨基酸序列为(GSG)ATNFSLLKQAGDVEENPGP，序列前加一个GSG(Gly-Ser-Gly)接头序列，可以显著提高切割效率，还可以将前一个蛋白和切割后剩余的部分2A肽段分隔开，防止引起前一个蛋白的构象和功能异常。
优选的，所述的药物为通过自加工单元APU连接芳香族L-氨基酸类脱羧基酶AADC和胶质细胞源性神经营养因子GDNF的核苷酸序列构建体。
优选的，所述的核苷酸序列构建体可以通过体内途径和体外途径给药，实现目的基因在目标细胞和组织中的表达。
优选的，所述体外途径包括将目的基因在体外导入人体自身细胞、异体细胞或异种细胞，经体外细胞扩增后，再回输到体内。
优选的，所述体内途径包括将权利要求1-6所述的核苷酸序列构建体装配到特定的载体中，直接导入体内；所述载体包括病毒载体、非病毒载体或裸DNA；所述非病毒载体包括纳米载体和高分子载体；所述纳米载体包括纳米颗粒载体；所述高分子载体包括阳离子多聚物载体和脂质体载体。
优选的，所述体内途径中病毒载体、非病毒载体或裸DNA的给药途径包含但不限于静脉注射全身给药、颅内或鞘内注射给药。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的用于治疗帕金森病治疗的基因序列构建体，不仅能够持续地表达AADC，改善多巴胺的合成而缓解临床症状，同时可以表达GDNF，保护残存的神经元，改善脑内微环境，阻止多巴胺能神经元的进一步坏死，阻止病情的持续恶化，具有提高脑部多巴胺水平和减少多巴胺降解治疗帕金森病的双重作用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF中目的基因AADC-P2A-GDNF序列示意图；
图2为腺相关病毒载体pAAV-EGFP转染HEK293细胞荧光显微镜检测到EGFP的表达结果图；
图3为腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF转染HEK293细胞Western Blot检测实验结果图；
图4为腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF转染HEK293细胞后，上清(Supernatant，SP)超滤浓缩后的Western Blot检测实验结果图；
图5为腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF转染HEK293细胞，细胞培养上清中GDNF ELISA的标准曲线图；
图6为2型腺相关病毒AAV-EGFP感染HEK293细胞荧光显微镜检测到EGFP的表达结果图；
图7为重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞，细胞裂解物(Wholecell lysate，WCL)的Western Blot检测实验结果图；
图8为重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞，细胞培养上清中GDNFELISA的标准曲线图；
图9为2型腺相关病毒AAV-EGFP感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y荧光显微镜检测到EGFP的表达结果图；
图10为重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，细胞裂解物Western Blot检测实验结果图；
图11为重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，细胞培养上清中GDNF ELISA的标准曲线图；
图12为LC-MS检测多巴胺的标准曲线图；
图13为LC-MS检测3h和6h两个时间点细胞裂解液中多巴胺浓度结果图；
图14为转染pAAV-AADC-P2A-GDNF质粒的细胞裂解物Western Blot检测AADC的表达实验结果图；
图15为LC-MS检测多巴胺的标准曲线图；
图16为LC-MS检测1h、3h、5h和8h 4个时间点细胞裂解液中多巴胺浓度结果图；
图17为转染pAAV-AADC-P2A-GDNF质粒的细胞裂解物Western Blot检测实验结果图；
图18为CTG检测细胞活力结果图；
图19为CTG检测细胞活力结果图；
图20为CTG检测细胞活力结果图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例。
实施例1AAV病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF的构建
委托广州派真生物技术有限公司进行腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF的构建，主要的构建思路为：通过P2A连接AADC基因和GDNF基因，构建的腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF中目的基因AADC-P2A-GDNF序列示意图如图1所示。其中，所述AADC的氨基酸序列信息如下SEQ ID NO.1所示，编码所述AADC的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述GDNF的氨基酸序列信息如下SEQ ID NO.3所示，编码所述GDNF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述P2A的氨基酸序列信息如下SEQ ID NO.5所示，编码所述P2A的核苷酸序列信息如SEQ ID NO.6所示。
MNASEFRRRGKEMVDYMANYMEGIEGRQVYPDVEPGYLRPLIPAAAPQEPDTFEDIINDVEKIIMPGVTHWHSPYFFAYFPTASSYPAMLADMLCGAIGCIGFSWAASPACTELETVMMDWLGKMLELPKAFLNEKAGEGGGVIQGSASEATLVALLAARTKVIHRLQAASPELTQAAIMEKLVAYSSDQAHSSVERAGLIGGVKLKAIPSDGNFAMRASALQEALERDKAAGLIPFFMVATLGTTTCCSFDNLLEVGPICNKEDIWLHVDAAYAGSAFICPEFRHLLNGVEFADSFNFNPHKWLLVNFDCSAMWVKKRTDLTGAFRLDPTYLKHSHQDSGLITDYRHWQIPLGRRFRSLKMWFVFRMYGVKGLQAYIRKHVQLSHEFESLVRQDPRFEICVEVILGLVCFRLKGSNKVNEALLQRINSAKKIHLVPCHLRDKFVLRFAICSRTVESAHVQRAWEHIKELAADVLRAERE(SEQ IDNO.1)；
ATGAACGCAAGTGAATTCCGAAGGAGAGGGAAGGAGATGGTGGATTACATGGCCAACTACATGGAAGGCATTGAGGGACGCCAGGTCTACCCTGACGTGGAGCCCGGGTACCTGCGGCCGCTGATCCCTGCCGCTGCCCCTCAGGAGCCAGACACGTTTGAGGACATCATCAACGACGTTGAGAAGATAATCATGCCTGGGGTGACGCACTGGCACAGCCCCTACTTCTTCGCCTACTTCCCCACTGCCAGCTCGTACCCGGCCATGCTTGCGGACATGCTGTGCGGGGCCATTGGCTGCATCGGCTTCTCCTGGGCGGCAAGCCCAGCATGCACAGAGCTGGAGACTGTGATGATGGACTGGCTCGGGAAGATGCTGGAACTACCAAAGGCATTTTTGAATGAGAAAGCTGGAGAAGGGGGAGGAGTGATCCAGGGAAGTGCCAGTGAAGCCACCCTGGTGGCCCTGCTGGCCGCTCGGACCAAAGTGATCCATCGGCTGCAGGCAGCGTCCCCAGAGCTCACACAGGCCGCTATCATGGAGAAGCTGGTGGCTTACTCATCCGATCAGGCACACTCCTCAGTGGAAAGAGCTGGGTTAATTGGTGGAGTGAAATTAAAAGCCATCCCCTCAGATGGCAACTTCGCCATGCGTGCGTCTGCCCTGCAGGAAGCCCTGGAGAGAGACAAAGCGGCTGGCCTGATTCCTTTCTTTATGGTTGCCACCCTGGGGACCACAACATGCTGCTCCTTTGACAATCTCTTAGAAGTCGGTCCTATCTGCAACAAGGAAGACATATGGCTGCACGTTGATGCAGCCTACGCAGGCAGTGCATTCATCTGCCCTGAGTTCCGGCACCTTCTGAATGGAGTGGAGTTTGCAGATTCATTCAACTTTAATCCCCACAAATGGCTATTGGTGAATTTTGACTGTTCTGCCATGTGGGTGAAAAAGAGAACAGACTTAACGGGAGCCTTTAGACTGGACCCCACTTACCTGAAGCACAGCCATCAGGATTCAGGGCTTATCACTGACTACCGGCATTGGCAGATACCACTGGGCAGAAGATTTCGCTCTTTGAAAATGTGGTTTGTATTTAGGATGTATGGAGTCAAAGGACTGCAGGCTTATATCCGCAAGCATGTCCAGCTGTCCCATGAGTTTGAGTCACTGGTGCGCCAGGATCCCCGCTTTGAAATCTGTGTGGAAGTCATTCTGGGGCTTGTCTGCTTTCGGCTAAAGGGTTCCAACAAAGTGAATGAAGCTCTTCTGCAAAGAATAAACAGTGCCAAAAAAATCCACTTGGTTCCATGTCACCTCAGGGACAAGTTTGTCCTGCGCTTTGCCATCTGTTCTCGCACGGTGGAATCTGCCCATGTGCAGCGGGCCTGGGAACACATCAAAGAGCTGGCGGCCGACGTGCTGCGAGCAGAGAGGGAG(SEQ ID NO.2)；
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ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCCTTCCCGCTGCCCGCCGGTAAGAGGCCTCCCGAGGCGCCCGCCGAAGACCGCTCCCTCGGCCGCCGCCGCGCGCCCTTCGCGCTGAGCAGTGACTCAAATATGCCAGAGGATTATCCTGATCAGTTCGATGATGTCATGGATTTTATTCAAGCCACCATTAAAAGACTGAAAAGGTCACCAGATAAACAAATGGCAGTGCTTCCTAGAAGAGAGCGGAATCGGCAGGCTGCAGCTGCCAACCCAGAGAATTCCAGAGGAAAAGGTCGGAGAGGCCAGAGGGGCAAAAACCGGGGTTGTGTCTTAACTGCAATACATTTAAATGTCACTGACTTGGGTCTGGGCTATGAAACCAAGGAGGAACTGATTTTTAGGTACTGCAGCGGCTCTTGCGATGCAGCTGAGACAACGTACGACAAAATATTGAAAAACTTATCCAGAAATAGAAGGCTGGTGAGTGACAAAGTAGGGCAGGCATGTTGCAGACCCATCGCCTTTGATGATGACCTGTCGTTTTTAGATGATAACCTGGTTTACCATATTCTAAGAAAGCATTCCGCTAAAAGGTGTGGATGTATCTGA(SEQ ID NO.4)；GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQID NO.5)；
GGAAGCGGAGCCACTAACTTCTCCCTGTTGAAACAAGCAGGGGATGTCGAAGAGAATCCCGGGCCA(SEQ ID NO.6)。
广州派真生物技术有限公司包装并纯化含有目的基因AADC-P2A-GDNF的2型重组腺相关病毒，并进一步采用qPCR、SDS-PAGE和凝胶法对2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF滴度、衣壳蛋白纯度和内毒素等进行检验，实验结果如下表1所示。
表1pAAV-AADC-P2A-GDNF载体滴度、衣壳蛋白纯度和内毒素检验结果
检验项目 质量标准 检验结果
滴度 ≥1E+13C/mL 4.49E+13GC/mL
衣壳蛋白纯度 无明显杂带 无明显杂带
内毒素 ＜10Eμ/mL ＜10Eμ/mL
实施例2转染过表达质粒pAAV-AADC-P2A-GDNF验证目的基因在HEK293细胞中的表达
2.1实验目的
转染实施例1的腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF到HEK293细胞中，验证目的基因AADC和GDNF的表达，同时转染腺相关病毒载体pAAV-EGFP作为对照。
2.2实验材料
PEI购于Polyscience，货号23966-100；RIPA细胞裂解液购于生工生物，货号C500007-0100；GDNF和beta-actin一抗购于Abcam，货号分别为ab203573和ab8227；AADC一抗购于Bioss，货号bs-0180R；GFP抗体购于Proteintech，货号66002-1；二抗HRP-conjugated affinipure Goat anti Rabbit IgG(H+L)购于Proteintech，货号SA0001-2；Goat Ab to Ms IgG(HRP)购于Abcam，货号ab205719；GDNF ELISA试剂盒购于Abcam和博士德生物，货号分别为ab212166和EK0362；10kDa MWCO超滤管购于Millipore，货号UFC901008。
2.3实验流程
2.3.1用PEI(Polyscience cat#23966-100)转染腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF到HEK293细胞中，同时转染腺相关病毒载体pAAV-EGFP作为对照，腺相关病毒载体pAAV-EGFP购于广州派真生物技术有限公司。
2.3.2转染48小时后通过荧光显微镜(奥林巴斯IX73)观察对照组EGFP的表达。
2.3.3分别收集细胞和培养物上清(Supernatant，SP)，用未转染的HEK293细胞作为空白对照。
2.3.4RIPA裂解液(生工cat#C500007-0100)裂解细胞，Western Blot检测GDNF(Abcam ab176564)、AADC(Bioss bs-0180R)、GFP(Proteintech 66002-1)和beta-actin(abcam ab8227)的表达，二抗使用HRP-conjugated affinipure Goat anti Rabbit IgG(H+L)(Proteintech，SA0001-2)或者Goat Ab to Ms IgG(HRP)(Abcam，ab205719)。
2.3.5GDNF ELISA(Abcam，ab212166)检测细胞培养上清中GDNF的含量。
2.4实验结果
由图2可知，对照腺相关病毒载体pAAV-EGFP转染HEK293细胞48h后，荧光显微镜检测到EGFP的表达，说明对照腺相关病毒载体pAAV-EGFP可以转染HEK293细胞，并表达EGFP。
由图3可知，HEK293细胞中有内源性的GDNF和AADC的表达，转染腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF 48小时后，发现细胞裂解液(Whole cell lysate，WCL)中GDNF和AADC的量明显增多，说明目的基因GDNF和AADC都有表达。
由图4和图5可知，由于灵敏度较低的原因，Western blot方法在腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF转染上清中并未检测到GDNF的表达。使用10kDa MWCO超滤管(Millipore cat#UFC901008)对细胞培养上清超滤浓缩后，Western blot可以检测到上清中GDNF的存在，如图4所示，说明转染后GDNF表达并成功分泌到胞外。使用GDNF ELISA试剂盒检测细胞培养物上清中GDNF的含量，数据分析采用arigo开发的在线ELISA数据分析工具GainData，发现48h后，转染上清中GDNF的OD450为1.937，根据标准曲线换算浓度为7.496μg/mL，而转染腺相关病毒载体pAAV-EGFP的对照组检测不到GDNF的分泌表达，说明转染后GDNF成功地表达并分泌到细胞外。
由此可知，Western blot可以同时检测到细胞裂解物中的AADC和GDNF，说明腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF可以共表达AADC和GDNF；进一步通过ELISA检测到HEK293转染细胞培养物上清中GDNF的表达，验证了GDNF的分泌表达。
2.5保存腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF和pAAV-EGFP的48h转染上清，用于后面GDNF的生物学活性检测。
实施例3构建重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF并检测其侵染性以及目的基因AADC和GDNF在宿主细胞中的表达
3.1实验目的
用腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF包装2型AAV构建重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞，检测重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF的侵染性以及目的基因AADC和GDNF的表达。
3.2实验材料
2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF由广州派真生物技术有限公司包装纯化，滴度1E+13GC/mL。对照腺相关病毒AAV-EGFP由广州派真生物技术有限公司提供，滴度1E+13GC/mL。
3.3实验流程
3.3.1使用2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞(MOI＝10000)，腺相关病毒AAV-EGFP作为对照，72小时后荧光显微镜检测观察EGFP的表达。
3.3.2分别收集细胞和培养物上清，RIPA裂解液裂解细胞，Western blot检测GDNF和AADC的表达。
3.3.3GDNF ELISA(Abcam，ab212166)检测细胞培养上清中GDNF的分泌表达。
3.4实验结果
由图6可知，2型腺相关病毒AAV-EGFP感染HEK293细胞，MOI＝10000，72h后镜检，观察到EGFP的表达，说明对照病毒AAV-EGFP可以感染HEK293细胞，并表达EGFP。
由图7可知，2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞，感染72h后，Western blot检测细胞中GDNF和AADC的均有表达，说明重组AAV可以感染HEK293细胞，并表达目的基因GDNF和AADC。
由图8可知，GDNF ELISA的标准曲线，重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染HEK293细胞72h后收集细胞培养上清，GDNF ELISA结果检测上清中GDNF的含量，得到OD450为1.331，根据标准曲线换算的浓度为13.53μg/mL，而感染pAAV-EGFP的对照组pAAV-EGFP的上清中检测不到GDNF的信号，说明感染后，GDNF成功表达并分泌到胞外。
由此可知，用腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF包装2型AAV，感染HEK293细胞后，进行Western blot和ELISA实验，确定AADC和GDNF在细胞内均有表达，细胞上清也可以检测到GDNF的分泌表达。
实施例4验证重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF的侵染性和目的基因AADC和GDNF的表达
4.1实验目的
2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，验证重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF的侵染性和目的基因AADC和GDNF的表达。
4.2实验过程
4.2.1 2型重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(MOI＝10000)，2型重组腺相关病毒AAV-EGFP作为对照，72小时后荧光显微镜镜检观察EGFP的表达。
4.2.2分别收集细胞和培养物上清，RIPA裂解液裂解细胞，Western blot检测细胞内GDNF和AADC的表达。
4.2.3GDNF ELISA(博士德生物，EK0362)检测细胞培养上清中GDNF的分泌表达。
4.3实验结果
由图9可知，对照组重组腺相关病毒AAV-EGFP感染人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(MOI＝10000)，72h后荧光显微镜镜检可以观测到EGFP的表达，说明重组腺相关病毒AAV-EGFP可以感染SH-SY5Y细胞，并表达EGFP基因。
由图10可知，重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF感染SH-SY5Y细胞72h后，Western blot结果显示，虽然细胞中有内源性的AADC的表达，但是感染重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF 72h后，细胞中AADC的量明显增多，说明重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF有介导目的基因AADC的表达，并且在细胞中也检测到GDNF的表达，证明重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF成功感染SH-SY5Y细胞，并表达了目的基因GDNF和AADC。
由图11可知，GDNF ELISA的标准曲线，重组AAV感染SH-SY5Y细胞72h后收集细胞培养上清，GDNF ELISA得到上清的OD450为1.057，根据标准曲线计算得到上清中GDNF的浓度为365.0pg/mL，对照组pAAV-EGFP的上清中无法检测到GDNF的信号，说明转染后，重组腺相关病毒AAV-AADC-P2A-GDNF介导GDNF成功表达并分泌到细胞外。
实施例5AADC的活性检测
5.1使用LC-MS检测多巴胺(Dopamine)的浓度，委托博济医药科技股份有限公司完成，分析仪器采用液质联用仪Waters，Xevo TO-S。
5.2实验流程
5.2.1 6孔板铺板HEK293细胞，24h后转染腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF，同时转染腺相关病毒载体pAAV-EGFP作为对照。
5.2.2转染48h后，加入不同浓度的L-Dopa(10μM、100μM和200μM)处理细胞；分别在3h和6h两个时间点收集细胞，每孔加入400μL的RIPA裂解细胞，Western blot检测目的基因AADC的表达；同时应用LC-MS检测细胞裂解液(Whole cell lysate，WCL)中多巴胺的含量。
5.2.3或者在转染48h后，加入200μM L-Dopa处理细胞，而在不同时间点收集细胞(1h、3h、5h和8h)；RIPA裂解液裂解细胞，Western blot确定目的基因AADC的表达，同时LC-MS检测细胞裂解液中多巴胺的含量。
5.3实验结果
由图12-14可知，L-Dopa处理细胞3h和6h两个时间点实验结果显示，转染腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF的细胞裂解液中多巴胺的含量随着L-Dopa的浓度升高而升高，而转染对照质粒pAAV-EGFP的细胞中，即便用L-Dopa处理，也检测不到多巴胺(结果未显示)。Western blot结果显示，转染腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF的细胞中检测到了AADC的表达，并且其表达量高于未转染的空白对照组HEK293中内源性AADC。
由图15-17可知，L-Dopa处理细胞1h、3h、5h和8h实验结果显示，由于AADC介导的L-Dopa转化成多巴胺的反应比较快，第一个时间点1h时细胞裂解物中多巴胺的浓度最高，从1h到8h，4个时间点，细胞裂解液中多巴胺的含量随着时间的推移而降低，而转染对照质粒pAAV-EGFP的细胞中检测不到多巴胺(结果未显示)。Western blot结果显示，转染pAAV-AADC-P2A-GDNF质粒的细胞，均可以检测到AADC的表达，且表达量高于未转染的空白对照组HEK293细胞中内源性的AADC。
因此，由上述实验可知，腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF转染HEK293细胞后，加入L-Dopa，转染pAAV-AADC-P2A-GDNF的细胞，不同时间点可以检测到多巴胺的含量呈时间相关性变化，而阴性对照组(转染pAAV-EGFP)检测不到多巴胺。用不同浓度的L-Dopa处理转染pAAV-AADC-P2A-GDNF的细胞，同一个时间点可以检测到多巴胺的含量呈现剂量依赖效应，高浓度的L-Dopa处理细胞，胞内检测到高浓度的多巴胺，反之低浓度的L-Dopa处理细胞，胞内检测到低浓度的多巴胺，而转染pAAV-EGFP的阴性对照组，用不同浓度的L-Dopa共孵育细胞，胞内均无法检测到多巴胺。由此可以说明本发明腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF表达的AADC是有酶活性的，可以介导L-Dopa转化为多巴胺。
实施例6GDNF活性检测
6.1由于GDNF是一种神经营养因子，对损伤的神经细胞有保护作用，所以在H2O2诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的损伤模型中，GDNF可以起到一定的神经细胞保护作用。
6.2实验流程
6.2.1将SH-SY5Y细胞铺板96孔板，用不同浓度的H2O2(100μM，300μM和600μM)处理细胞，诱导人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y的损伤模型，对照组是含有20％Fetal bovineserum(FBS,Corning)的完全培养基组。
6.2.2处理72h后，使用CellTiter-Glo发光法细胞活力检测试剂盒(CTG,PromegaG7572)检测SH-SY5Y的细胞活力。
6.2.3将SH-SY5Y细胞铺板96孔板，24h后加入350μM H2O2处理细胞24h，对照组是20％FBS培养基组。加入不同浓度的GDNF蛋白溶液(10ng/mL和100ng/mL，义翘神州，货号10561-HNCH)，再处理细胞48h，用CTG检测细胞活力。
6.2.4将SH-SY5Y细胞铺板96孔板，24h后加入350μM H2O2处理细胞24h，对照组是含有20％FBS的完全培养基组。24h后将实验组的培养基换成腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF(GDNF 7.496μg/mL)和pAAV-EGFP在HEK293细胞48h的转染上清(如上文所述，实验结果2.4)，再处理细胞48h，然后用CTG检测细胞活力。
6.3实验结果
由图18可知，用H2O2处理细胞后，SH-SY5Y细胞活力明显降低，并且随着H2O2的浓度增加，SH-SY5Y细胞活力持续降低，呈现剂量相关效应。
由图19可知，20％FBS阳性对照组中，SH-SY5Y细胞活力明显上调，而H2O2可以抑制SH-SY5Y的细胞活力；GDNF蛋白的加入可以明显地提高由于H2O2而受损的细胞活力，在一定程度上保护细胞，并且这种保护作用呈现剂量相关效应。
由图20可知，H2O2可以明显抑制SH-SY5Y的细胞活力，相较于pAAV-EGPF转染上清，本发明含有GDNF蛋白的细胞培养上清(Supernatant，SP)可以保护由于H2O2而受损的SH-SY5Y细胞，显著地提高细胞活力(p<0.05)。
由此，可以说明本发明腺相关病毒载体pAAV-AADC-P2A-GDNF表达的GDNF具有生物学功能，可以保护神经细胞，在一定程度上恢复受损神经细胞的活力。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述的药物为一种核苷酸序列构建体，所述构建体为通过自加工单元APU连接的两个或多个治疗神经退行性疾病相关的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述治疗神经退行性疾病相关的核苷酸序列，包含选自于芳香族L-氨基酸类脱羧基酶AADC、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、GDNF家族和神经营养因子NT家族的核苷酸序列中的两种或两种以上；所述的核苷酸序列之间，至少有两个是通过自加工单元APU连接。
3.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述GDNF家族包含GDNF天然类似物、神经秩蛋白NRTN、神经鞘胚素ARTN和Persephin PSPN；所述神经营养因子NT家族包含神经生长因子NGF、脑源性神经营养因子BDNF、睫状神经营养因子CNTF、神经营养因子3NT-3、神经营养因子4/5NT-4/5和神经营养因子6NT-6。
4.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述自加工单元APU包含但不限于内部核糖体进入位点序列IRES、2A肽或类2A肽、Intein、B型细菌提Intein样结构域BIL和Furin序列及其衍生物。
5.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述的IRES元件来源于脑心肌炎病毒EMCV；所述的2A肽或类2A肽，包含但不限于源于手足口病毒的F2A、源于马甲型鼻炎病毒的E2A、源于猪捷申病毒的P2A和源于明脉扁刺蛾病毒的T2A。
6.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述的药物为通过自加工单元APU连接芳香族L-氨基酸类脱羧基酶AADC和胶质细胞源性神经营养因子GDNF的核苷酸序列构建体。
7.如权利要求1所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述的核苷酸序列构建体可以通过体内途径和体外途径给药，实现目的基因在目标细胞和组织中的表达。
8.如权利要求7所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述体外途径包括将目的基因在体外导入人体自身细胞、异体细胞或异种细胞，经体外细胞扩增后，再回输到体内。
9.如权利要求7所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述体内途径包括将权利要求1-6所述的核苷酸序列构建体装配到特定的载体中，直接导入体内；所述载体包括病毒载体、非病毒载体或裸DNA；所述非病毒载体包括纳米载体和高分子载体；所述纳米载体包括纳米颗粒载体；所述高分子载体包括阳离子多聚物载体和脂质体载体。
10.如权利要求9所述的用于神经退行性疾病治疗的药物，其特征在于，所述体内途径中病毒载体、非病毒载体或裸DNA的给药途径包含但不限于静脉注射全身给药、颅内或鞘内注射给药。
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