TW208657B - - Google Patents

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Λ 6 15 6 208657 五、發明説明（1 ) 發明範圍 閲 背 .¾ 之 注 意 事 項 填 % 本 本發明是有關間白素一 2 (IL — 2)或類IL — 2 物質，於哺乳動物中促進及加強中樞神經糸中受損神經之 再生。 發明背景 低等脊椎動物之中樞神經糸統（CNS),具有於軸 索受傷後再生之高能力，而哺乳動物中樞神經元之再生能 力很低。此不良的再生力至少有部份可歸於存在有成熟的 寡樹突膠質細胞，已知其對軸索生長具抑制性。 經濟部中央榀準^β工消价合作社印奴 於魚的視神經中，此為自主再生性CNS的一個代表 ，已示出再生乃係與再生相關物質之存在所致，其當應用 至受損之成年兔子視神經上，有助於其再生（Schwartz， Μ· et al·» (1985) Science 228. 601-603； Lavie. V. et al.，（1990) J. Comp. Neurol. 298，293-315;歐洲 專利案第172987 )。對寡樹突膠質細胞具胞毒性的一種 活性，歸於這些製劑内的物質，其推測可使魚的視神經克 服與寡樹突膠質細胞有關之抑制活性（Sivron. T. et al .,(1990) Glia 3, 267-276)。已示出活體外之胞毒性不 僅針對魚寡樹突膠質細胞，也針對大鼠的寡樹突膠質細胞 (Sivron，T. et al.，見上，及 Cohen, A. et al.，（ 1990) Brain Res. 537, 24-32)。這些物質俗直接或間接 地與巨噬細胞或其他由血中衍生之細胞有關。 歐洲專利案第EP 415321中，描述存在於低 81. 2. 20,000 本紙张尺度逍用中8 B家樣準(CNS) T4規怙（210x297公龙） ' -3

五、發明説明（2 ) 等脊椎動物再生性受損神經調適培養基中；寡樹突膠質細 胞胞毒因子，如魚，但於低等脊椎動物完整神經之調適培 養基及哺乳動物受損或完整神經之調適培養基中均不存在 Ο 間白素一 2 (IL — 2)是一種淋巴因子，已知於 IL一1存在下經抗原或有弱分裂原活化之後可為T細胞 所合成及分泌（Smith，K.A.，（1988) Science 240， 1169-1176)。於免疫糸統中，I L-2被視為一種重要的 組織介素，負責許多免疫反應之抑制作用或進行（Uang， S. Μ· e t a 1· . ( 1989) Biochem· Biophys. Res. Commun. 165，1312-1318)。相反的，關於I L _ 2於腦中之角色 則鮮為人知。於神經糸統中，關於I L - 2對寡樹突膠質 細胞作用的某些觀察似乎是矛盾的。近來的研究已歸因於 寡樹突膠質細胞上對組織介素I L 一 2之抑制作用（San-e t o. R.P. e t a 1 . » ( 1986) Proc. Natl. Acad. Sc i · 經濟部Ψ央榀準而只工消作合作社印级 (請先閲讀背而之注意事項洱瑱寫本了) USA 88. 9221-9225； Saneto, R.P.. et al·» (1987) J· Neurosci. Res. 18，147-154)，而其他的研究顯示 I L 一2在寡樹突膠質細胞上之增殖作用（£.1861^611丨5卜 e and J.E· Merril (1986) Nature 321， 610-613)。己 示出哺乳動物中之I L 一 2是淋巴細胞之産物（Sm i th， K . A .見上），且某些報告顯示，魚的淋巴細胞可能具有類 I L — 2 活性（Caspi，R.R. and Avtalion，R.R. (1984 )Dev. Comp - Immunol · 8，51 -60) 〇 I L 一 2及一般的CNS傷害，及特別是腦中之傷害 本紙張尺度边用中a Η家標準（CNS) T4規格（210><297公龙） 81. 2. 20,000 208657 五、發明説明（3 ) ,其間之關偽已被指明（Nieto-Sampedro，M. et al·，（ 1987) Neurochem. Res. 12 723-727; Araujo, D.M·， et a 1 . , (19 8 9 ) B r a i n R e s . 4 9 8 . 2 5 7 - 2 6 6) 0 N i e t o - S a m p-edro等人發現於腦受損後有I L_2活性。類似地Liars et al (上示）發現於腦傷處由MPP* (i—甲基一 4 —苯基嘧啶）産生的I L 一 2。此外，Araujo et a 1觀察 到，於大鼠海馬中由於受損造成I L 一 2結合位置之正面 調控。然而，關於IL — 2及CNS再生間之關僳則尚未 提及。 其他目前的研究也提議，藉著處理由寡樹突膠質細胞 所阻礙之受阻之生長，可能可促進再生，如應用對寡樹突 膠質細胞具胞毒性之因子，如TNF (歐洲專利案 EP 4550 93及 Schwartz， M. et ai. (1991) B-rain Res. 545, 334-338)或應用直接拮抗與寡樹突膠質 細胞相關抑制劑之抗體（Schnell, L. et al., (1990) Nature 343, 269-272) 〇 經濟部屮央標準局cs：工消"合作社印製

Robbins et al.， J· Immunol·， 138， 8, 2593-7 ( 1987)已報告，活體外剌激大鼠星形細胞，可造成功能上 與腫瘤壞死因子相似之胞毒因子。其亦指示，人類重組體 腫瘤壞死因子，具有拮抗大鼠寡樹突膠質細胞之胞毒活性 〇 Selmaj et al.，Ann. Neurol . » 24, 4. 339-46 (1988 )報告重組體人類腫瘤壞死因子（rh TNF)於老鼠脊 链組織之髄磷脂化培養上之作用。他們發現，r h T N F 可誘生延缓一發動之寡樹突膠質痰死作用及髓磷脂脹大作 本紙張尺度边用中國Η家標毕規格（210x29/公;《：) 81. 2. 20,000 66 An 五、發明説明（4 ) 用。 不論全世界實質的研究努力，迄今尚未發展出可於晡 乳動物中，特別是人類，引起CNS再生之安全且有效的 方法。為了舒缓創傷後之截癱或四肢麻痺、視覺缺失、聾 、與外科手術有關之。 發明要點 目前發現依據本發明，間白素一2及類IL—2物質 可促進軸索的再生。又進一步發現，源自魚視神經且對寡 樹突膠質細胞具胞毒性之物質係一種類I L - 2物質。 因此，本發明提出I L — 2及類I L 一 2物質於製備 藥物，以誘導及促進哺乳動物（特別是人類）中CNS軸 索再生之用法。 本發明的一個主題是提供一種藥學組成物，含有單位 劑量之間白素一2或類間白素-2物質、及藥學上可接受 之載體或賦形劑，呈有效劑量，而當投予至受損位置時可 誘導及促進受損軸索之再生。 經濟部中央；^準局只工消费合作社印¾ (請先閲讀背而之注意事項#靖寫本頁) 本發明又一主題是提供一種方法，以於哺乳動物中誘 導及促進受損之中樞神經糸統軸索之再生，此方法包括對 受損位置投予有效劑量之間白素_ 2或類間白素一 2物質 Ο 本發明再一主題是提出呈實質上純化型式、衍生自魚 視神經之寡樹突膠質細胞胞毒因子、一種類間白素一2物 質。 本紙张尺度边用中國國家標準（CNS)肀4規ΪΜ210Χ297公龙） 81. 2. 20,000 Λ 6 1\6 經试部屮央榀準局β工消价合作杜印製 五、發明説明（5 附圔簡要說明 圖1示出抗一 I L 一 2抗體，可於寡樹突膠質細胞調 適培養基中中和魚可溶性物質之胞毒作用。 圖2示出魚梘神經可溶性物質，利用老鼠抗一人類 I L 一 2單株抗體之西方墨點分析。 圔3示出係自魚視神經調適培養基中親和力純化類 I L 一 2因子。 圖4示出於大鼠腦寡樹突膠質細胞培養中，以重組體 老鼠I L — 2減少寡樹突膠質細胞之數目。 圖5示出以重組體老鼠IL一2造成成熟的寡樹突膠 質細胞數目減少（經Ga 1 C —標記）。 圖6示出於轉切之IL—2處理過的神經上新生長之 纖維。 較佳具體實例之詳細說明 於哺乳動物CNS受損處軸突之再生，可藉著將IL -2或類IL-2物質投予至受損區域而予以誘導及促進 。雖然I L 一 2或類I L _ 2物質與接受治療之哺乳動物 較好是同類，但此點並不嚴格要求。 依據本發明的類I L 一 2物質，是一種可與拮抗I L -2之抗體交叉反應之物質。此定義包括突變蛋白（《nut-ein)及經修飾之I L_2分子，其與天然的人類I L-2 比較下有胺基酸之添加、刪除或置換，以及I L _ 2衍生

.......< ,3 (請先間請背而之注意事項#塡窍本I 本紙張尺度逍用中a 8家橒準(CNS) Τ4規格（210x297公埤） 81. 2. 20,000 〇8〇57 五、發明説明（6 ) 物，其中為改進其在藥學組成物使用上之物理特性而加上 部份或其他的肽序列，只要此種突變蛋白及經修飾之蛋白 質具有活性内誘導及促進受損之哺乳動物軸突之再生特性 。此功能可利用對寡樹突膠質細胞選擇性胞毒性之活體外 試驗來測試。 依據本發明，所使用之IL一2包括任何種類之天然 IL — 2,及任何種類之重組體IL 一 2。IL — 2可以 任何合宜的技術獲得，WR.J.R〇bbetal.(1983)Pr-oc. Natl. Acad. Sci. USA 80，5990 中之方法。較好是 以重組體DNA技術獲得，如T. Taniguchi et al.,( 1 9 8 3 ) N a t u r e 3 0 2，3 0 5 - 310 或〇6丫〇3，1?.(1983)1^11〇-leic Acids Research 11，4307-4323 中所述的。重組體 人類I L 一 2 (rh I L — 2)目前也已上市。某些I L 一2突變蛋白，可如美國專利第4, 518， 584中所 述地獲得。 經术部屮央櫺準^工消作合作杜印Μ (請先閲請背而之注意事項洱填窍本 依據本發明，所使用之較佳的類IL一2物質，偽衍 自魚梘神經且呈實質上純型式之寡樹突膠質細胞胞毒因子 。此因子最早掲示於EP 415321,而本案是第一 次完金鑑定且以純化型式獲得。 依據本發明，發現源自魚視神經之寡樹突膠質細胞胞 毒因子，由以下各點可證實傜類IL-2分子：（i)其 由抗一 I L _ 2抗體之親和力層析純化；（ii )拮抗I L - 2之抗體可中和衍自再生魚視神經調適培養基之胞毒活 性；（m )西方墨點分析顯示，於魚調適培養基中存在有 本紙張尺度逍用中a Η家標準(CNS)TM規格(210X297公*) 81. 2. 20,000

-20865'V 五、發明説明《） IL 一 2免疫反應性之28kDa的帶；及（iv)重組體 老鼠I L - 2在寡樹突膠質細胞上而非星形細胞上具有活 體外之選擇性胞毒作用。於魚調適培養基中，類I L 一 2 物質有較重組體老鼠I L - 2還高之外觀強度強烈地顯示 ，活性之特異性係由組織而非種類所決定，即衍自CNS ;魚11^ 一 2可能異於重組體IL — 2,後者是由免疫衍 生的，顯示來自魚視神經之活性分子是衍自免疫之IL一 2之變化。此點可由圖2所示之結果進一步證實，即於魚 血液淋巴細胞中之I L — 2免疫反應性，物質是約1 4 kDa之多肽，而非如神經中之類IL一2物質，為28 k D a之肽。 經沭部屮央標準^β工消作合作杜印製 衍自魚視神經，且呈實質上純型式之寡樹突膠質細胞 胞毒因子，以西方墨點分析知，係分子量約28kDa的 類I L — 2物質。其存在於低等脊椎動物再生性受損神經 之調適培養基中，如魚，而非低等脊椎動物完整神經或哺 乳動物受損或完整神經之調適培養基中。其對寡樹突膠質 細胞糸具選擇性毒性，而非1型星形細胞及纖維母細胞。 此胞毒活性可為拮抗I L 一 2之抗體所中和。 純化的魚寡樹突膠質細胞胞毒因子，可由親和力純化 獲得。將含有由無血清培養基與磨碎之再生性魚視神經共 置生成之因子之調適培養基，填料至含有拮抗IL-2之 抗體管k中，已結合的物質以適當的溶劑溶離，如此可得 含有2 8 kDa因子之流份，此可由其對寡樹突膠質細胞 之胞毒性及西方墨點分析而測知。 81. 2. 20,000 (請先閲請背而之注-事項洱靖寫本釕) 本紙51尺度边用中a國家標準（CNS)甲4規tM2]0x29/公釐） ~ 9 - Λ 6 \\6 0S657 五、發明説明§ ) (請先閲讀背而之注意亊項朴靖寫本頁) 任何抗一IL一2抗體均可用於親和力純化過程中。 較好，使用抗人類IL-2抗體，且特別是拮抗重组體人 類IL — 2之老鼠單株抗體，偶合至適當的樹脂上，如聚 丙烯醯替苯胺瓊脂糖。已結合物質之溶離可利用如甘胺酸 來進行。 IL — 2或類IL — 2物質，以足以促進哺乳動物（ 持別是人類）中CNS軸突再生之量及純度而應用於本發 明。由於已示出經純化之寡樹突膠質細胞胞毒因子強度高 於I L — 2,故可以較I L — 2低之量使用。其以適合帶 至欲再生之受損軸突鄰近的任何方式投予。較好，於藥學 上可接受之液體載體中直接注射至該部位。 此外，攜有IL—2或類IL一2物質之植入物，也 可以手術方式嵌入。此一植入物中可含有任何物質，如硝 化纖維，其可吸收活性物質就如同海棉一般，並缓慢地釋 出至植入位置。其他遞送方法精藝者應明白，且包括在本 發明範圍之内。 投予至任何病人之IL_2或類IL一2物質之量， 經沭部屮央櫺準^工消仲合作社印ft-'4 依據許多因子而定，如欲治療之傷害，欲再生之受損軸突 位置，及病人的狀況。然而一般而言，IL一2或類IL _2物質之投予可呈單一注射，或浸入硝化纖維中，或其 他任何可吸附的載體。精確的劑量可由實驗決定。 IL一2或類IL一2物質之投予，較好在傷害處理 後儘早地投予。因此，較好是用於急性傷害而非慢性傷害 。依據本發明，變性期已存在愈久則愈難以促進再生。 本紙》尺度边用中团Η家標準（CNS)TM規格(210x297公¢) 81. 2. 20,000 -10 - Λ 6 II 6 五、發明説明孕） 雖然單獨投予IL一2或類IL一2物質顯示良好的 結果，此種治療仍可結合任何型式之相伴療法，其可擴大 其效力。例如，以低能量雷射照射受損位置，較好是氫一 仍雷射（5分/天，3 5mW)可延缓創傷後之變性過程 ，因而延缓短痕形成。見Assia et al.，Brain Res.，4 76, 205-212 (1988) 〇 依據本發明可治療之各種傷害無數，且一般精藝者應 容易明白。不予以限制其中可提及的包括：神經創傷、涉 及CNS軸突急性或慢性傷害之疾病，可由壓力或絶血造 成，如青光眼、前房絶血性視神經病變，脊髓傷害，視神 經或聽覺神經之傷害等。於神經手術中對C N S神經元之 傷害及由於腫瘤所造成的，也可利用本發明方法治療。 經"部屮央樑準局CX工消"合作社印^ 基於本發明目的，IL — 2或類IL 一 2物質可與任 何藥學上或獸醫學上可接受之載體或稀釋劑一起調和。其 可呈水性溶液，如無菌之水溶液。含有IL一2或類IL 一2物質之溶液或粉末可利用安定劑安定之。其可調和成 單位劑量可注射型式（溶液劑、懸液劑、乳劑）、較好是 於先天上即無毒且無療效之藥學上可接受之載體介質中。 此種溶媒之實例有：食鹽水、林格氏液、右旋糖溶液、甘 露醇及正常血清白蛋白。非水性溶媒如固定油類及油酸乙 醋等。載體介質可含有少量添加物，如加強等滲性、溶解 度及/或化學穩定性之物質，如缓衝物質、去污劑及保藏 劑。關於I L 一 2的各種調和物，於其他適應症中已知。 此種調和物亦可用於本發明目的，只要因此不致於影繼 81. 2. 20,000 (諳先閲-背而之注意事項#塡寫本頁) 本紙张尺度边用中《Η家標準（CNS)>P4規格（210X297公龙） 11 - Λ 6 Η 6 五、發明説明（10 ) I L 一 2欲求之功能。 (請先閲請背而之注意事項洱塡寫本，u) ___ ί 依據本發明提出免疫化學證據，即類I L 一 2物質存 在於衍自魚視神經之可溶性物質之中，且於受損後水平增 加。此物質如先前所述之寡樹突膠質細胞胞毒因子般鑑定 。直接拮抗哺乳動物IL-2之抗體，會中和其於大鼠腦 寡樹突膠質細胞上之胞毒作用。然而，已示出重組體老鼠 I L 一 2對活體外之成熟大鼠寡樹突膠質細胞具胞毒性， 且可促·進活體内受損之兔子視神經之軸突生長。 以下實例説明本發明。 實例 實驗步驟 a.製備衍自再生性魚視神經之可溶性物質 經术部屮央櫺準而β工消"合作社印奴 令缠魚（Cyprinus carp'io，8 0 ◦ - 1 2 0 0 克， Tnuva, Israel)適應環境1天，再以〇. 05%三卡因（ tricaine)甲院横酸鹽（Sigma, St. Louis, MO, USA) 麻醉，且以鑷子壓碎其視神經（3 ◦秒）。小心只傷害神 經，保持周圍組織完整。於受傷後第8天，切出壓碎的再 生性神經，培育於無血清培養基中（DMEM，Gibco)l . 5 小時（4個神經片段/300微升培養基）、251C下。 生成之培養基定為調適培養基（CM),再收集並以Bradford’s 分析法 決其中 蛋白質含量。 以每份 50 微升或 50 ◦微升貯於一 70 °C下。 81. 2. 20,000 本紙»•尺度边用中困Η家標準（CNS)甲4規怙（210x297公；¢) 12

五、發明説明尽l ) b.製備由魚淋巴細胞調適之培養基 魚以3 —胺基苯甲酸乙酯（S i gma)麻醉。切出眼眶 中之頸動脈，自眶中收集血液至含有肝素硫酸鹽之管中（ 1 0 0單位/毫升；BDH Chemicals)。血液以等體積的硫 酸鹽缓衝食鹽水（PBS)稀釋，令靜置5分鐘再平覆於 Ficoll或PercoH溶液頂。於使用前，將29. 4%泠影 酸鈉之操作溶液（Sigma)與70. 6% Fioll混合，製 成密度1.0 6克/毫升。當使用卩6 1^〇11溶液時，？^〇-〇11(1. 0 6克/毫升）之貯液為混合44. 6毫升Pe- rcoll, (Pharmacia)、1〇 毫升 10 OmM 擇檬酸（M-erck) 、1 ◦毫升5%牛血清白蛋白（BSA; Sigma),及 35. 4毫升PBS。 15毫升溶液置入50毫升無菌的 C〇rex離心管中。3 0毫升之經稀釋血液小心平覆於溶液 頂，以小的吸量管進行。管子加蓋再於旋轉離心管中以 800Xg 離心 30 分，201C 下。 經濟部屮央榀準而只工消"合作社印奴 離心後，可於界面發現白血球，其可以巴斯德吸量管 容易地移出。白血球收集於50毫升管中，再以PBS洗 二次。細胞懸浮於少量含青徽素及鐽徽素（1 〇〇單位/ 毫升）之L一15培養基中，再計數。細胞稀釋成2〇x 1〇7細胞/毫升，且各份1 ◦毫升再置於75公分2燒 瓶中（Falcon)。令燒瓶置2〇υ下1小時，未粘附的細 胞再除去並置入第二個燒瓶中。此重覆，且1小時後未粘 附之細胞置入第三個燒瓶中。第一及第二個燒瓶以1〇〇 毫升PBS劇烈震盪二次。富含巨噬細胞之培養基含第一 81. 2. 20,000 (請先閲請背而之注意事項#项窵木頁) 本紙张尺度边用中a Η家標準（CNS)1?*!規格（210x297公没） -13 Λ 6 Η 6 五、發明説明尽2 ) 燒瓶中，第三個燒瓶為富含淋巴細胞之培養基。加10毫 升培養基，且所有燒瓶置8小時，之後收集上清液，再以 2 0 ◦ X g離心5 — 1 5分。上清液於Centricon或Amic-〇n單位中濃縮25— 1 00倍。之後檢品貯於4t：下。 c.製備大鼠腦寡樹突膠質細胞培養且免疫螢光染色 為製備富含寡樹突膠質細胞之培養物，切出新生大鼠 之腦（2天大）〔2値腦於2毫升1^〗15〇*42培養基中（ L-15 ;Gibc〇〕，且於含ImM乙底酸之DMEM ( 屬Ca 〃及Mg*2).中，以3X104單位/毫升胰蛋白 酶（Sigma)化學解離之。機械解離係於3 7¾下與胰蛋白 酶溶液共置1 0分鐘前進行。細胞再轉移至1 5毫升圓錐 形管中，内含1毫升下列成份之溶液：74單位/毫升 DNase (Sigma)、52 00單位/毫升大豆胰蛋白酶（ 經濟部屮央榀準局：^工消伢合作社印製

Si gma)及3毫克BSA,於室溫下共置1分鐘，加至 1 0毫升培養基，再於DMEM中洗3次。於最後一次洗 滌後，細胞懸浮於1 0毫升含5 — 1 0 %胚牛血清（FBS; Sigma—於56t：下加熱滅活30分）之DMEM中，過 篩，再種於85毫升2燒瓶中（Nunc),其先前已於3 7 它下以2 ◦微克/毫升多一 L_賴胺酸（PLL, MW 100000 ;Sigma)塗覆一夜。於細胞種入後第一個2 4小時時更換 培養基，再種入細胞，之後每2-3天一次。於種入後第 8天，細胞採震盪方式培育4 一 6小時，移出上清液，剩 下的細胞再置10毫升培養基中（DMEM加5—10% 81. 2. 20,000 (請先閲請背而之注意事項#填寫本U) 本紙张尺度边用中SB家楳準(CNS)T4規格(210x297公;¢) -14 - 五、發明説明尽3 ) FBS)數小時，之後震盪一夜。之後以莪盪移出之细胞 加以收集及離心，成團塊之細胞再懸浮於1_2毫升無血 清之培養基中（Bottenstein，J.E. et al.，（1979) Pr-oc. Natl · Acad· Sci. USA 76, 514-517) 〇 經濟部+央標準局β工消费合作社印製 如此獲得之由富含寡樹突膠質細胞培養中回收之細胞 ,種入先前已用PLL (20微克/毫升）塗覆之玻璃載 髏上（13毫米；3X105個細胞/孔洞）。玻片置 2 4孔洞盤上（Nunc)。於種入過程中，最初對各玻片施 以5 0徹升細胞懸液，再令其留置3 71C下3 0分鐘以令 粘附。接下來，細胞以DMEM洗滌，再加500微升明 確之培養基（Bottenstein及Sato的明確培養基經過Raff 處理修飾）。4 8小時後，種入之細胞以調適培養基處理 ，或先前已用兔子抗一人類IL-2抗體（Genzyme. Inc )預共置2小時之調適培養基，或對照組抗體（兔子抗神 經纖維）。成熟寡樹突膠質細胞之數目，即半乳糖腦苷酸 類（GaiC)陽性細胞，由如下之免疫螢光決定：細胞 以漢克氏平衡鹽溶液（HBSS)含2%FBS充份洗滌 ,加熱滅活並於3 7 °C下與5 ◦微升單株抗體（I g G 3 ，稀釋於1 : 5 D Μ E Μ之融合瘤上清液，Serotec)共 置3◦分。於共置末了，細胞洗滌再與50微升經螢光素 共軛之小辛抗老鼠IgG3 (1:50於DMEM中）共 置，之後洗滌並固定於甲醇中，一 20*C下1 ◦分鐘。於 最後一次洗滌，細胞塗以含有22mΜ 1， 4_重氮基 二環（2, 2，2)八卡因（Octaine)之甘油。至於對 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 本紙尺度返用中S國家標準(CHS)T4規怙（210x297公龙） -15 - κ -· ο 2 66 ΛΠ 五、發明説明在4 ) 照組，使用以相同染色步驟進行之波片，除了省略第一次 的抗體。玻片置載玻片上，以指甲油封片再貯於41〇下。 計數整個玻片上之細胞。 墨點分析 凝膠吸漬至硝化纖 在3 7t：下與含有 B S洗滌。 3 7它下共置2小 .0 5% Tween — 5 I〕標記之山羊 3 7 °C下共置2小 B S洗三次，乾燥 (請先閲讀背而之注意事項洱屬荇木頁) d. IL — 2免疫反應性蛋白質之西方 V 樣品於Sl^s - PAGE上電泳。 維上，200mA 2小時。硝化纖維 5%乳汁之PBS共置2小時，再以P 吸漬物與兔子抗一IL一2抗體在 時，之後洗三次，各5分鐘，於含有0 20之PBS中。最後，吸漬物與〔〃 抗兔子抗體（10s c pm/毫升）在 時，以含◦. 05% Tween_20之 P 再放射自顯之。 實例1.由再生性魚視神經調適之培養基，其對寡樹突膠 質細胞之胞毒性可以抗-IL一2抗體中和 經濟部中央標準而Α工消"合作社印奴 魚再生性視神經之調適培養基，以拮抗IL—2之抗 體處理以檢査其是否可造成胞毒活性之喪失。頃發現，拮 抗I L 一 2之抗體可中和調適培養基之胞毒作用。 / 評估魚可溶性物_對寡樹突膠質細胞上之胞毒性，為 frfj 一直接拮抗重組體人^頁I L 一 2抗體之兔子多株抗體之中 和作用。結果示於圖1。4 8小時之調適培養基或與拮抗 重組體人類IL一2之兔子多株抗體預共置後，加至寡樹 81. 2. 20,000 本紙张尺度逍用中a Η家標準(CNS)肀4規怙（2丨0父297公龙） 16 - V .'•ί 66 ΛΗ 五、發明説明（15 ) (請先閲讀背而之注意事項外项寫木頁) 突膠質細胞培養物中，再繼缠培養4 8小時。以拮抗神經 纖雒之抗髏充作對照組。寡樹突膠質細胞以免疫螢光鑑定 。衍生再生性魚視神經之最高濃度之可溶性物質（5徹克 蛋白質）可造成約60%胞毒性，且以抗一IL—2抗體 並無中和；0. 5微克的諝適培養基可造成42%胞毒性 ，其中一半可為抗體中和；只有當應用0. 2微克之調適 培養基時，可以相同劑量之抗體獲得完全之中和作用。結 果以胞毒性百分率示出，此係比較只以抗體處理之無胞毒 性對照培養物而得（1 0 0 %存活，無胞毒性）。所有的 實驗均重覆3次，且以0. 1微克的抗—IL 一 2抗體（ I gG)進行。實驗結果示於此圖片中；CM表示調適培 養基。於各實驗中，於毎一玻片上計數出之Ga1C陽性 細胞绝對總數範圍，由300至50 ◦之間，此插圖示出 以10倍多之抗一 IL 一 2 (即1微克IgG)進行的實 質上相同的實驗。 由圖中可看出，拮抗重組體老鼠IL一2之抗體，可 中和調適培養基之胞毒活性。當抗體量保持固定（◦. 1 經濟部t央梂準工消赀合作社印3i 微克I g G流份；1微克中和1單位的I L 一 2 )、則所 達到之中和作用為所應用之調適培養基濃度之函數關係， 於最低受試濃度時可予以完全地中和，即0. 2微克/毫 升總蛋白質。10倍高之抗體量（1微克IgG流份）可 造成調適培養基更高濃度之中和作用（即◦. 5及5微克 /毫升）（圖1,插圖）。依據這些結果，且依據用於本 分析中IL-2抗體之效力，據估計1微克的調適培養基 81. 2. 20,000 本紙张尺度逍用中a S家楳準(CNS) T4規格(2丨0x297公龙） 17 五、發明説明咎6 ) 含有0. 5—2單位之生物活性的類IL一2分子。 實例2.自魚調適培養基中鑑定類IL一2分子 為了決定類IL—2分子之大小，含有可溶性物質之 魚視神經調適培養基接受西方墨點分析，使用直接拮抗人 類I L 一 2之單株抗體。魚視神經調適培養基（CM, 400徹克）、由血液淋巴細胞（LMP, 16微克）

P /調適之培養基，及老鼠IL 一 2 (75毫微克）於S&S 一PAGE上電泳。1列含有與抗一IL—2抗體共置之 調適培養基（CM)。2列為對照列，含有只與第二抗體 反應之調適培養基。第3列為魚淋巴細胞（LMP)與抗 -I L- 2抗體共置所調適之培養基。於各列左側之箭號 (除了第2列）指出各列之I L 一 2免疫反應性帶。分子 量標記於同一凝膠上電泳，則標在凝膠上。 經濟部屮央榀準局EX工消作合作杜印$i 圖2示出在28kDa分子量處存在有單一的I L 一 2免疫反應性帶。由於已知淋巴細胞可産生IL—2,在 相同實驗條件下比較相同抗體與魚淋巴細胞之交互作用。 如圖2所示，可觀察到約i4kDa之單一 IL 一 2免疫 反應性帶。這些結果推測，I L 一 2,或可與I L — 2抗 體交叉反應之分子量，可能負貴寡樹突膠質細胞上之胞毒 作用。 _ 實例3.自魚調適培養基中親和力純化寡樹突膠質細胞胞 毒因子 81. 2. 20,000 (請先間-ift背而之注意亊項再项寫本頁) I .....-- 本紙張尺度边用中困a家樣準(CNS) T4規格(210x297公;¢) -18 - Λ 6 It 6 五、發明説明) 利用如下之I L- 2親和力管柱，進行胞毒物.質之纯 化。 拮抗重組人類IL-2抗體之老鼠單株抗體，偶合至 聚丙烯醯替苯胺瓊脂糖上（BioMalcor, Israel)。利用 Wilchek 及 Miron 之步驟（Meth. .Enzymol· (1974) 34. 72-76) , 0. 1毫升填磘之樹脂偶合至0. 5毫克抗體 經濟部中央榀準^Ex工消^合作社印^ (請先閱讀背而之注意事項#碼寫本Ί) 。如下進行純化：調適培養基（50徹升）加至與抗體偶 合之填滿樹脂中，此中抗一IL—2抗體已偶合，並於 3 7它下共置2小時。再收集上清液，剩下的樹脂洗3次 ，每次採用1毫升PBS。以5 ◦撤升甘胺酸（0. 2M ,PH2. 7)在室溫下震盪10分鐘進行溶離。溶離出 之物質（ELU)收集在10微升Tr i s缓衝溶液中（ 1M, pH8. 0)。含IL — 2結合物質之流份，測試 於寡樹突膠質細胞上之胞毒作用，使用比色之MTT (溴 化3 — （4, 5 —二甲基瞜唑一2 —基）一 2, 5 —二苯 基四銼）分析法來評估寡樹突膠質細胞之數目，因此是胞 毒性(Mosmann » T. (1983) J. Immunol. Me t h. 65, 55-63) 0 分析進行如下：細胞單獨以調適培養基處理，或加上 溶離自抗一 IL 一 2抗體管柱之結合物質（ELU)。用 於分析中之溶離物質（E L U )最终稀釋液相當於粗製的 調適培養基。經過48小時之共置後，10微升MTT加 入3小時；培養基再移出並加10 ◦微升0. 04N H C /異丙醇。細胞緩和震盪，直到所有晶體溶解為止 本紙張尺度逍用中》困家標準（CNS)甲4規怙（210Χ2ΪΠ公货) ' 81. 2. 20,000 -19 - A 6 Η 6 208糾 五、發明説明（18 ) ，且在55 ◦毫微米波長下計錄吸光度，以600毫微米 波長為參考波長。 由比色MT T分析法評估之寡樹突膠質細胞上之胞毒 活性，回收自再生性魚視神經調適培養基（實驗步驟（a ))，傜溶離出與管柱上的混合之抗一 IL_2抗體結合 之物質。對照組為未處理之培養，或以含有溶離缓衝液之 培養基所處理者，因此排除溶離物中之任何胞毒性俗由溶 離缓衝液所造成的。實驗重覆3次，且進行三次。結果以 I/ 經淨部屮央榀準而κχ工消合作社印則灰 it未培養值^表示，代表1〇〇%存活。由重 — 7 覆偵測分析顯示）溶離出之物質（ELU)其作用顯著異 於（P<〇. 05)二値相當之對照組培養。 如圖3所示，溶離自管柱之IL一2結合物質對寡樹 突膠質細胞具胞毒性。小規模之純化無法估計溶離物之比 活性。然而，基於蛋白質偵測之已知限制，我們可估計溶 離物之比活性至少較調適培養基高1 03倍。發現保有胞 毒活性之溶離物，也接受抗一I L - 2抗體之西方墨點分 析，其顯示存在有原先之28kDa免疫反應性多肽（數 據未示出）。因此這些結果將I L 一 2免疫反應性28 kDa蛋白質與胞毒性結合。 實例4 .重組體老鼠I L - 2對寡樹突膠質細胞具選擇性 毒性 重組體老鼠IL 一 2 ( ◦— 150單位/毫升）施用 至大鼠寡樹突膠質細胞之加豐培養物中（如實驗步驟中所 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項洱辦寫本頁) 本紙张尺度边用中a Η家楳準（CNS)T4規格（210X297公；《：) -20 - A 6 II 6 / 五、發明説明（19 ) 述地製備），係於细y種入後4 8小時進行。使用拮抗 G a又C之抗體評估細胞數目。再以免疫螢光分析決定對 成熟寡樹突膠質細胞數目上之作用，其中以螢光顯微鏡計 數經標記之細胞數目。以未處理細胞充作對照組（無胞毒 性）。由圖1中可看出，IL — 2可造成成熟寡樹突膠質 細胞數目上顯著的減少，可由半乳糖腦苷脂類（Ga 1 C )陽性細胞數目反映出來。於高IL一2濃度下，成熟寡 樹突膠質細胞之數目（由G a 1 C陽性細胞數目反映）可 顯著減少（88. 6±1 5. 3%胞毒性，於150單位 / 毫升；P< 0.0005, AN0VA)(圔 4)。代 表性之顯微照片顯示重組體老鼠IL一2 (20◦箪位/ 毫升）對成熟寡樹突膠質細胞（Ga 1 C_標記）數目之 作用，示於圖(b, d)分別是經處理（b)及未處 理（d)細胞之IL 一 2螢光顯微照片，以抗一 Ga 1C 抗體染色。於（b)及（d)中梘野之値別相顯徹照片示 於（a )及（c ) 〇CiT胞多出1係未處理(圖5 b )而非 - ...一一 經 濟 部 屮 央 4rf： 準 乂’J 工 消 合 杜 印 胞（圖5 d丄。然而，*為顯示對寡樹突膠質細胞 胞毒性所需之重組體老鼠IL-2量，遠高於調適培養基 中估計之量。因此，衍自魚之I L 一 2係免疫衍生I L 一 2之變化，因此較重組體老鼠I七- 2對大鼠寡樹突膠質 細胞，其對大鼠寡樹突膠質細胞有更高之親和力。為排除 所觀察的I L - 2對寡樹突膠質細胞上之作用是由於非待 異胞毒性之可能性，也將IL-2施至星形細胞培養上， 即扁平細胞之大鼠腦單層。如所預期的，觀察不到胞毒性 81. 2. 20,000 本紙张尺度边用中a Η家《毕(CNS)<fM規格（210X297公龙） 21 - 〇8^>^ _ A 6 Π 6 經濟部屮央榀準局β工消作合作社印製 五、發明説明¢0) (表 1 ) 〇 表1. 5000 10,000 ·细胞/?L洞 3〇,〇〇〇 細胞/?li 同 I L一 2 CPM % CPM % CPM % 單新 土 SD 土 SD 士 SD 土SD 土SD 土 SD 0 28030 100±2 4S775 101 ±15 55727 110 土 11 ±518 ±5954 ±5137 0.1 33632 120±7 53040 109 土 13 60345 108 土 8 ±2351 土3639 士 793 1 31084 110±3 55740 115 土 12 58231 105±8 ±984 士 1436 土 86 10 33384 119士16 51745 107 土 14 62328 112 土 9 土 5181 ±5317 ±103 50 31879 113±9 53548 110 土 13 56601 102 土 8 土2957 ±3251 ±658 200 30248 107土 3 50064 103 土 11 57380 103 土 9 土 1052 士 2219 士2771 本紙5fc尺度边用中SH家標準（CHS)肀4規格（210><297公;《：) 81. 2. 20' (請先閲請背而之注意事項洱填寫木T) -22 - C〇B^ _Π6_ 五、發明説明) 實例5.活體内IL—2活性 為了測試，IL-2是否可取代調適培養基用於軸突 生長促進作用之活體内作用，因此施加重組體老鼠IL一 2至受損的成年兔子視神經上。利用二個實驗列進行。一 値實驗涉及切出成年兔子視神經，且I L 一 2浸入硝化纖 維中應用（Lavie，V. et al·，（1990) J. Comp. Neurol ,298，293-315)。第二實驗涉及嚴重地壓碎視神經，且 I L — 2以可溶型式注入神經各處，由受損部(g向列分佈 。接下來生長之評估係利用傳送電子顯微鏡分析，且利用 IX 筠菜過氧化@$順行運送，以注入視神經盤（Lavie et amrr' a 1 .，見上）。所觀察之生長示於圖6。如所見的，於受損 位置末端，經IL — 2處理之受損兔子視神經2處，可觀 察到豐富的無髓鞘軸突及生長的視錐。此先前已述（Lav-ie et al.，見上）為新生長軸突之特色。於未處理動物之 對照傷處不見存活之軸突。 (請先閲請背而之注意事項再碣寫木 經濟部屮央榀準工消"合作社印製 81. 2. 20,000 本紙51c尺度边用中B國家楳準(CNS) Ή規格(210x297公 -23 -

Claims (1)

1. ϊ^- ιΤ·. 82. I 〃本斤 - •δ 么， 告 Α7 一 Β7 -C7 本、 D7 六、申請專利範圍 附件一 a : 第81102862號專利申請案 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 中文申請專利範圍修正本 民國82年4月修正 1. 一種用於誘生及促進受損軸突再生之藥學組成物 ,其係包含有效劑量之間白素一2或類間白素一2物質， 及藥學上可接受之載體或賦形劑，其中該類間白素一2物 質為可與拮抗間白素-2之抗體免疫反應者。 2. 根據申請專利範圍第1項之藥學組成物，含有單 位劑量之間白素一 2。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之藥學組成物，含 有人類間白素_ 2。 4. 根據申請專利範圍第3項之藥學組成物，含有重 組體人類間白素一 2。 5 .根據申請專利範圍第1項之藥學組成物，含有類 間白素一 2物質。 6. 根據申請專利範圍第1或5項之藥學組成物，含 有衍自魚視神經呈實質上純化型式之寡樹突膠質細胞胞毒 絰濟部t央櫺準局員工消費合作社印製 因子。 7. 根據申請專利範圍第1或5項之藥學組成物，含 有間白素一 2之突變蛋白。 8. —種自魚視神經中産生實質上純寡樹突膠質細胞 毒因子之方法，此方法包括： a .將再生性魚視神經之調適培養基接受抗一 I L 一 本紙張尺度適用中國國家揉準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐）-1 _ A7 B7 C7 D7 六、申請專利範圍 2抗體之親和力層析； b .以適當的溶劑溶離經結合之物質， c.於呈現對寡樹突膠質細胞選擇性胞毒活性之溶離 流份中回收分子量約2 8 kD a之經純化因子。 9. 根據申請專利範圍第8項之方法，其中於（a) 步驟中，該抗—I L — 2抗體為抗一人類I L~2抗體。 10. 根據申請專利範圍第8或9項之方法，其中於 (a)步驟中，該抗一 I L 一 2抗體為括抗重組體人類I L — 2之老鼠單株抗髏。 1 1 .根據申請專利範圍第8或9項之方法其中方々 (b )步驟中之該適當溶劑是甘胺酸。 _ 1 _2 .根據申請專利範圍第1 0項之方法，_ ψ % ( b )步驟中之該適當溶劑是甘胺酸。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝. 訂. -線. 烴濟部中央標準局員工消#合作社印製 -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 2町公釐）