HUT60437A - Process for producing pharmaceutical compositions - Google Patents

Description

A találmány interleukin-2 (IL-2) vagy IL-2-szerű anyagok alkalmazásával foglalkozik a központi idegrendszer sérült idegei regenerálásának megkönnyítésére és fokozására emlősökben.

Az alacsonyabbrendű gerincesek központi idegrendszerének (CNS) erős képessége van arra, hogy axonális sérülések után regenerálódjék, míg· az emlősök központi neuronjainak csekély a regenerálódási képessége. Ez a csekély regenerálódási képesség, legalábbis részben, az érett oligodendrociták jelenlétének tulajdonítható, amelyekről kimutatták, hogy gátló hatásuk van az axonális növekedésre.

A halak látóidegeiben - amely jó képviselője a spontán regenerálódó CNS-nek - a regenerálódásról kimutatták, hogy regenerálódást kísérő anyagok jelenlétével társul, amelyek, amikor sérült felnőtt nyúl látóidegekre alkalmazzák, megkönnyíti azok regenerálódását /Schwartz M. és munkatársai: Science 228, 601-603 (1985), Lavie V. és munkatársai: J.Comp.Neurol. 298, 293-315 (1990), 172 987 lajstromszámú európai szabadalmi leírás/. Az oligodendrocitákra citotoxikus aktivitás ezen készítményekben olyan anyagoknak tulajdonítható, amelyek a halideget valószínűleg képessé teszi arra, hogy leküzdje az oligodendrocitákkal társult gátló aktivitást /Sivron T. és munkatársai Glia 267-276 (1990)/. Az in vitro citotoxicitást nem csupán a hal oligodendrocitáknál mutatták ki, hanem a patkány oligodendrocitáknál is /Sivron T. és munkatársai: fentebb idézett munka, Cohen A. és munkatársai: Brain Rés. 537, 24-32 (1990)/. Ezek az anyagok - közvetve vagy közvetle··· nül - makrofágokhoz vagy más véreredetű sejtekhez társulnak.

Az EP 415321 számú európai szabadalmi bejelentés leír egy olyan oligodendrocita citotoxikus faktort, amely jelen van a 1acsonyabbrendű gerincesek, pl. halak regenerálódó sérült idegeinek kondicionált tápközegében, de nincs jelen sem az alacsonyabbrendű gerincesek ép idegeinek kondicionált tápközegében, sem az emlősök sérült vagy ép idegeinek kondicionált tápközegében.

Az interleukin-2 (IL-2) olyan limfokin, amelyről ismert, hogy a T sejtekben szintetizálódik és azokból választódik ki antigénnel vagy mitogénnel történő aktiválás után IL-1 jelenlétében /Smith K.A.: Science 240, 1169-1176 (1988)/. Az IL-2 az immunrendszerben fontos citokinnak tekinthető, amely felelős több immunválasz gátlásáért vagy előreviteléért /Liang S.M. és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun. 165, 1312-1318 (1989)/. Ezzel ellentétben nagyon keveset tudunk az IL-2 sze repéről az agyban. Az idegrendszerben az IL-2 oligodendrocitákra való mondásosnak hatásaira vonatkozó megfigyelések néhánya ellenttűnik. Az elmúlt évek néhány tanulmánya az IL-2 citokinnek gátló hatást tulajdonít ol igodendrocitákra /Saneto

R.P. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9221 -9225 (1986), Saneto R.P. és munkatársai: J.Neurosci. Rés. 18, 147-154 (1987)/, míg más tanulmányok az IL-2 burjánzást elősegítő hatását mutatják be oligodendrocitákra /Benveniste

E.N. és Merril J.E: Natúré 321, 610-613 (1986)/. Az IL-2-ről emlősökben kimutatták, hogy limfociták termékei (lásd: Smith K.A. fentebb idézett munkáját), és bizonyos beszámolók azt

t jelzik, hogy a hal limfocitáknák IL-2-szerű aktivitásuk van /Caspi R.R. és Avtalion R.R.: Dev. Comp. Immunoi. 8, 51-60 (1984)/.

Hangúlyozták többen a kapcsolatot az IL-2 és a CNS-ben történő sérülések között általában, de különösen az agyban /Nieto-Sampedro M. és munkatársai: Neurochem. Rés. J_2, 723-727 (1987), Araujo D.M. és munkatársai. Brain Rés. 498, 257-266 (1989)/. Nieto-Sampedro és munkatársai IL-2 aktivitást találtak agysérülés után. Hasonlóképpen Liang és munkatársai (fentebb idézett munkájukban) is találtak IL-2-t MPP⁺-_vel (1-meti1-4-feni1-pirimidin) kialakított agysérülésekben. Ezen kívül Araujo és munkatársai IL-2 kötőhelyek felülszabályozását figyelték meg patkány agyve 1őkampóban a sérülés eredményeképpen. Az IL-2 és a CNS regenerálódás között azonban kapcsolatot eddig még nem tételeztek fel.

További, nem régi tanulmányok azt sugallják, hogy a regenerálódás elősegíthető olyan kezeléssel, amely megakadályozza az oligodendrociták által előidézett növekedésgátló hatást, ilyen pl. valamely oligodendrocitákra citotoxikus faktor, pl. a TNF alkalmazása /455093 számú európai szabadalmi bejelentés, Schwartz M. és munkatársai: Brain Rés. 545, 334-338 (1991)/, vagy olyan antitestek alkalmazása, amelyek az oligodendrocitákkal társult inhibitorok ellen irányulnak /Schnell L. és munkatársai: Natúré 343, 269-272 (1990)/.

Robbins és munkatársai /J. Immunoi. 8, 2593-7 (1987)/ beszá·« ···♦ t

• · ··· • ·· • · moltak arról, hogy a patkány asztrociták in vitro szimulálása olyan citotoxikus faktort eredményez, amely működését tekintve hasonló a tumor nekrózis faktorhoz. Arról is beszámoltak, hogy a humán rekombináns tumor nekrózis faktornak citotoxikus aktivitása van, amely patkány oligodendrociták ellen irányul. Selmaj és munkatársai /Ann. Neurol. 24 (4) 339-46 (1988)/ beszámoltak a rekombináns humán tumor nekrózis faktor (rhTNF) átvizsgálásáról egér gerincvelő szövet mielínezett tenyészeteire való hatásával kapcsolatban. Arra a megállapításra jutottak, hogy az rhTNF késleltetett beindulású ol igodendrocita nekrózist és bizonyos típusú mielin tágulást indukál.

A világszerte jelentős kutatás ellenére eddig még nem fejlesztettek ki biztos és hatékony eszközt, hogy a CNS regenerálását előidézzék emlősökben, és különösen emberekben. Egy ilyen eszközre, különösen egy gyógyászati kompozícióra, amelyet be lehetne injektálni a regenerálás kívánt helyére, nagy mértékben szükség lenne abból a célból, hogy csökkentsük a balesetek utáni kétoldali vagy négyoldali bénulás, vakság, siketség, sebészeti beavatkozással társult axotómia, stb. kialakulásának esélyeit.

Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmányt.

A találmány szerint arra jöttünk rá, hogy az interleukin-2 és az interleukin-2-szerű anyagok elősegítik az axonális regenerálódást. Arra is rájöttünk továbbá, hogy az az anyag, amely a hal szemidegeiből ered és citotoxikus az oligodendrocitákra,

»♦· egy IL-2-szerű anyag.

A találmány tehát IL-2 és IL-2-szerű anyagok alkalmazásával foglalkozik olyan gyógyszerek előállításához, amelyek indukálják és elősegítik a CNS axonok regenerálódását emlősökben, elsősorban emberekben.

A találmány egyik tárgya ennek megfelelően, hogy gyógyászati kompozíciót nyújtsunk, amely interleukin-2 vagy valamely interleukin-2-szerű anyag egységdózisát tartalmazza valamely gyógyászati hordozóval és hígítóval együtt, ahol a hatóanyag olyan mennyiségben van jelen, hogy hatékonyan indukálja és segítse elő a sérült axonok regenerálódását, amikor a sérülés helyére juttatjuk.

A találmány további tárgya, hogy eljárást nyújtsunk sérült központi idegrendszeri axonok regenerálódásának indukálására és elősegítésére; az eljárás abból áll, hogy a sérülés helyére interleukin-2 vagy interleukin-2-szerií anyag hatékony mennyiségét juttatjuk.

A találmány még további tárgya, hogy hal látóidegből származó ol igodendrocita citotoxikus faktort, egy interleukin-2-szerQ anyagot, biztosítsunk lényegében tiszta formában.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a bejelentést kísérő ábrákat .

Az 1. ábra bemutatja, hogy az anti-IL-2 antitestek közömbösí-

t t tik a kondicionált tápközegben (CM) található oldható, hal-eredetű anyagok citotoxikus hatását oligodendrocitákra.

A 2. ábra a hal látóideg oldható anyagok Western-folt elemzését mutatja be egér anti-humán IL-2 monoklonális antitestek a 1 kalmazásáva1.

A 3. ábra az IL-2-szerű, hal látóideg kondicionált tápközegből származó faktor affinitásos tisztítását mutatja be.

A 4. ábra az oligodendrocita szám csökkenését mutatja be patkány agy oligodendrocita tenyészetekben rekombináns egér IL-2-ve 1.

Az 5. ábra az érett (Gal-C-vel jelzett) oligodendrociták számának csökkenését mutatja be, amelyet a rekombináns egér IL-2 idéz elő.

A 6. ábra az újonnan kinövő rostokat mutatja be az átvágott, majd IL-2-vel kezelt idegekben.

Az alábbiakban részletesen leírjuk a találmány előnyös kiviteli módjait.

Az axonok regenerálását emlősökben a CNS sérülésének helyén indukáljuk és elősegítjük IL-2 vagy valamely IL-2-szerű anyag bejuttatásával a sérülés helyére. Bár előnyös, ha az IL-2 vagy IL-2-szerű anyag azonos fajból való, mint a kezelendő állat,

t ez nem kritikus tényező.

A találmány szerinti IL-2-szerű anyag olyan anyag, amely kereszt-reaktív az IL-2 elleni antitestekkel. Ez a definíció magában foglalja azokat a muteineket és módosított IL-2 molekulákat, amelyekhez aminosav-gyökök vannak hozzátéve, amelyekből aminosav-gyökök vannak kiiktatva, vagy amelyekben aminosav-gyökök vannak helyettesítve a natív humán IL-2-höz viszonyítva, valamint azokat az IL-2 származékokat, amelyekhez további részek vagy más peptid-szekvenciák varnak csatlakoztatva, hogy a gyógyászati kompozíciókhoz való felhasználáshoz szükséges fizikai tulajdonságok javuljanak,’ mindezek a módosítások a muteinekben és módosított fehérjékben olyan mértékűek lehetnek, hogy megmaradjon a sérült emlős axonok in vivő regenerálódását indukáló és elősegítő tulajdonságuk. Ezt a működést vizsgálhatjuk nem túl bonyolult kísérleti útcn, az oligodendrocitákra való szelektív citotoxicitásra vonatkozó in vitro vizsgálat segítségével.

A találmány szerint alkalmazott IL-2 fogalma magában foglalja bármely faj natív IL-2-jét vagy bármely faj rekombináns IL-2-jét. Az IL-2-t előállíthatjuk bármely kényelmes, alkalmas technikával, pl. Robt R.J. eljárásával /Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 5990 (1983)/. Ezt előnyösen előállíthatjuk rekombináns DNS technikákkal is, pl. azzal amelyeket Taniguchi T. és munkatársai /Natúré 302, 305-10 (1983)/, illetve Devos R. és munkatársai /Nucleic Acid Research J_1_, 4307-4323 ( 1983)/ írnak le. A rekombináns humán IL-2 (rhIL-2) jelenleg már kereske9 delmí forgalomban van. Bizonyos IL-2 miteineket előállíthatunk a 4,515,584 1 ajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás alapján.

A találmány szerint, alkalmazott előnyös IL-2-szerú anyag a hal látóidegekből származó ol igodendrocita citotoxikus faktor lényegében tiszta formában. A faktort, amelyet eredetileg a 415321 számú európai bejelentés ír le₍elsőként jellemezzük és tisztított formában elsőként kapjuk meg.

A hal látóidegekből származó oligodendrocita citotoxikus faktorról úgy találjuk a találmány szerint, hogy egy IL-2-szerű molekula, amelyet az alábbiak igazolnak: (i) affinitás-kromatográfiával tisztíthatók arti-IL-2 antitestekkel, (ii) az IL-2 elleni antitestek semlegesítik a regenerálódó hal látóidegekből való kondicionált tápközeg citotoxikus aktivitását, immunreaktív tápközegben, (iii) a Western folt elemzés egy 28 kDa-as, IL-2 csík jelenlétét tárja fel a hal kondicionált és (iv) a rekombináns egér IL-2-r.ek szelektív citotoxikus hatása van in vitro az cl igodendrocitákra, de nincs hatásuk az asztrocitákra. Az IL-2-szerű anyagok látszó lag nagyobb potenciálja a kondicionált tápkczegben, mint a rekombináns IL-2 potenciálja erősen sugallja azt, hogy az aktivitás faj1agosságát inkább a szövet, és nem a faj szabja meg, vagyis a CNS-εredetti hal IL-2 valószínűleg eltér a rekombináns IL-2-től, amely immun-eredetű, ez azt jelzi, hogy a hal látóidegekből való aktív molekula az imnr.un-eredetű IL-2 módosított formája. Erre a 2. ábrákon bemutatott eredmények további igazolást adnak, amernyiben a hal vér 1imfocitákban

I ·

levő IL-2 immunreaktiv anyag mintegy 14 kDa mérető polipeptid, és nem 28 kDa méretű polipeptid, mint az IL-2-szerű anyag az idegben.

A hal látóidegekből származó oligodendrocita citotoxikus faktor lényegében tiszta formában egy IL-2-szeru anyag mintegy 28 kDa molekulatömeggel, amint ezt Western folt elemzéssel meghatározzuk. Ez alacsonyabbrendu gerincesek, pl. halak regenerálódó, sérült idegeinek kondicionált tápközegében van jelen, de nincsen jelen az alacsonyabbrendű gerincesek ép idegeinek kondicionált tápközegében vagy az emlősök sérült vagy ép idegeinek kondicionált tápközegében. Ez szelektíven toxikus az oligodendrocita vonalakra, de nem toxikus az 1. típusú asztr ocitákra és fibroblaszt sejtekre. A citotoxikus aktivitást semlegesítik az IL-2 ellen irányuló antitestek.

A tisztított hal oligodendrocita citotoxikus faktort affinitásos tisztítással kapjuk meg. A faktort tartalmazó kondicionált tápközeget úgy készítjük el, hogy szérummentes tápközeget inkubálunk összezúzott regenenálódó hal látóidegekkel, és ezt a tápközeget visszük fel olyan oszlopra, amely IL-2 ellen irányuló antitesteket tartalmaz, a megkötött anyagokat megfelelő oldószerrel eluáljuk és így kapjuk meg a 28 kDal tonos faktort tartalmazó frakciókat, amint ezt az cligodendrociták elleni citotoxicitással és Western folt elemzéssel megvizsgáljuk.

Az affinitásos tisztítási munkamenethez bármilyen anti-IL-2

antitestet teket, és noklonális alkalmazhatunk. Előnyösen anti-humán IL-2 antites elsősorban rekombináns humán IL-2 elleni egér mo antitesteket alkalmazunk, amelyek megfelelő gyan tához, pl. poliakrilhidrazid agarózhoz vannak kötve. A kötött anyagok eluálását pl. glicinnel végezhetjük.

Az IL-2-t vagy IL-2-szerC anyagokat a találmányban olyan mennyiségben és tisztaságban alkalmazzuk, amely elegendő ahhoz, hogy a CNS axonok regenerálódását megkönnyítse emlősökben, elsősorban emberekben. Mivel a tisztított ol igodendrocita faktorról kimutattuk, hogy hatásosabb, mint az IL-2, ezt kisebb mennyiségben kell alkalmazni, mint az IL-2-t. Ezeket bármely olyan módon be lehet vinni, amely alkalmas arra, hogy az anyagot a regenerálandó axon közelébe vigye. Előnyösen ezeket - gyógyászati lag elfogadható folyékony hordozóban közvetlenül injektáljuk az adott helyre.

Egy másik eljárás szerint sebészi úton IL-2-t vagy IL-2-szerű anyagot hordozó implantátumot vezethetünk be.

Egy ilyen implantátum állhat bármely olyan anyagból, pl. nitrocellulózból, amely az aktív anyagot szivacsként abszorbeálja és lassan kibocsátja a beültetés helyén. Az anyag bejuttatásának további módjai nyilvánvalóak azok számára, akik a szakterületen járatosak, és ezeket is úgy tekintjük, mint a találmány oltalmi körén belül levőket.

Egy adott betegnek beviendő IL-2 vagy IL-2-szerű anyag » ♦

mennyisége sokféle tényezőtől függ, pl. a kezelendő sérülés természetétől, a regenerálni kívánt sérült axonok helyétől és a beteg

IL-2-szerű cel lulózba állapotától. Tipikusan azonban az IL-2-t vagy anyagot egyedi injekció formájában, illetve nitro vagy más adszorbeáló hordozóba felitatva vezetjük be. A pcntos adagolást tapasztalati úton határozzuk meg.

Az IL-2-t vagy IL-2-'szerü anyagot előnyösen lehetőleg azonnal a kezelendő sérülés után vezetjük be. így az eljárás előnyösen inkább akut sérülések, mint krónikus sérülések kezelésére alkalmas. Nehezebb elősegíteni a találmány szerint a regenerálódást az esetben, ha a degenerálódás már hosszabb idő óta fennáll·.

Bár az IL-2 vagy IL-2-szerű anyag bevezetése önmagában is jó eredményeket mutat, az ilyen kezelés kombinálható bármilyen típusú kísérő terápiával, amely ezek hatásainak fokozására irányul. így pl. a sérülési hely besugárzása kis energiájú lézerrel, előnyösen He-Ne lézerrel (5 perc/nap, 35 mW), megakadályozhatja a degenerálódás baleset utáni folyamatát és ezáltal megakadályozhatja a sebhelyképződést /Assia és munkatársai: Brain Rés. 476, 205-212 (1988)/.

A találmány szerinti eljárással kezelhető különböző sérülések száma nagyon nagy, ez nyilvánvaló azok számára, akik a szakterületen jártasak. A korlátozás igénye nélkül felsorolunk ezek közül néhányat: idegi trauma, a CNS axonok magas vérnyomás vagy iszkémia által előidézett akut vagy szubakut károsodásával kapcsolatos betegségek, pl. glaukóma, elülső iszkémiás optikai neuropátia, gerincvelősérülések, a szemidegek vagy a ·· fülidegek sérülései, stb. A találmány szerinti eljárással kezelhetők a CNS neuronok idegsebészi beavatkozás során keletkező vagy tumorok által előidézett sérülései is.

A találmány céljaira az IL-2-t vagy IL-2-szerű anyagot kiszerelhetjük bármilyen gyógyászati1ag vagy ál latorvosilag elfogadható hordozóval vagy hígítóval. Ezeket kiszerelhetjük vizes oldatokban, pl. steril vizes oldatokban. Az IL-2-t vagy IL-2-szerű anyagot tartalmazó oldatot vagy port stabilizálhatjuk valamely stabilizálószer segítségével. Ezek kiszerelhetők injektálható egységdózis formájában (oldat, szuszpenzió, emulzió), előnyösen gyógyászatilag elfogadható hordozó közegben, amely önmagában nem toxikus és nem gyógyhatású. Az ilyen hordozókra példák lehetnek a fiziológiás konyhasóoldat, a Ringer-féle oldat, a glükóz oldat, a mannit, és a normál szérum albumin. Alkalmazhatunk nem vizes hordozókat is, pl. állandó olajokat és eti1-ο 1eátot. A hordozó közeg tartalmazhat kisebb mennyiségű adalékanyagot, pl. olyan anyagokat, amelyek fokozzák az izotóniás jelleget, az oldhatóságot és/vagy a kémiai stabilitást, ilyenek pl. a pufferek, detergensek és tartósítószerek. A más indikációknál az IL-2 különböző kiszerelési formái már ismeretesek. Az ilyen kiszereléseket a találmány céljaira olyan mértékig alkalmazhatjuk, hogy ezekne legyenek káros hatással az IL-2 kívánt működésére.

A találmány szerint immunkémiai bizonyítékot nyújtunk arra, hogy van valamely IL-2-szerű anyag a hal látóidegeiből származó oldott anyagok között, és ennek szintje sérülés után ne• ·· ·«·· #« ·· • · · · · · ·· · • ·«· «· · · · • · · · · · · «·· «· · * · · · vekszik. Ezt az anyagot jellemezzük és azonosnak találjuk a korábban leírt oligodendrocita citotoxikus faktorral. Az emlős IL-2 ellen irányuló antitestek semlegesítik ennek citotoxikus hatását patkányagy oligodendrocitekra. Ezen kívül a rekombináns IL-2-ről kimutatjuk, hogy citotoxikus az érett patkány oligodendrocitákra in vitro és elősegíti a sérült nyűi látóidegek axonális növekedését in vivő.

Az alábbi példákkal bemutatjuk és alátámasztjuk a találmányt.

KIVITELI PÉLDÁK

Kísérleti munkamenetek

a) Regenerálódó hal látóidegekből származó oldható anyagok előállítása. Pontyot, (Cyprinus carpio, 800-1200 g„ Tnuva, Izrael) amelyet akklimatizálunk 1 napon át, érzéstelenítünk O,O57é trikain-metánszulfonáttal (Sigma, St. Louis, Missouri, Amerikai Egyesült Államok), és látóidegeiket csipesszel összemorzsoljuk (mintegy 30 másodperc alatt). Gondot fordítunk arra, hegy csak az idegeket sértsük meg, és épen hagyjuk az ezeket körülvevő szöveteket. A sérülés után 8 nappal az összemorzsolt regenerálódó idegeket kioperáljuk és szérummentes tápközegben inkubáljuk (DMEM, Gibco) 1,5 órán át 25°C hőmérsékleten (4 idegszegmens/300 Atl tápközeg). Az így létrejövő közeget, amelyet kondicionált tápközegnek (CM) nevezünk, összegyűjtjük és fehérjetartalmát a Bradford-fé1e vizsgálattal meghatározzuk. 50 /U-es és 500ytl-es alikvotokat tárolunk -70°C hőmérsékleten.

• · ♦ · ♦ · · *« ·· ··· · ··>'·· · • · ·· ·· ·· · • · « » · · · ··· ·· · ν· ··

b) Hal 1 imfocitákkal kondicionált tápkczeg előállítása.

Halat érzéstelenítünk 3-amino-benzoesav etilészterrel (Sigma). Miután a szemüregben a nyaki artériát elvágtuk, a szemgödörből vért gyűjtünk heparin szulfátot (100 egység/ml BDH Chemicals) tartalmazó kémcsőbe. A vért egyenlő térfogatú, foszfáttal pufferolt kcnyhasóoldatt.al (PBS) hígítjuk és 5 percig állni hagyjuk, majd Ficoll vagy Percol 1 .oldatok tetejére rétegezzük. Közvetlenül felhasználás előtt 29,4%-cs nátrium-diatrizoát törzsoldat munkaoldatát (Sigma) összekeverjük 70,6% Ficoll törzsoldattal, hogy a sűrűség 1,06 g/ml legyen. Amikor Percoll oldatot alkclmazunk, a Percoll (1,06 g/ml) törzsoldatát készítjük el olyan módon, hogy 44,6 ml Percoll-t (Pharmacia), 10 ml, 100 mmól/l-es citromsavoldatot (Merek), 10 ml 5%-os szarvasmarha szérum albumint (BSA, Sigma), és 35,4 ml PBS-t összekeverünk. Az oldatból 15 ml-t 50 ml-es sterilezett Corex (Corning) centrifuga csőbe helyezünk. 30 milliliter hígított vért óvatoson rárétegezünk az oldat tetejére kis pipetta segítségével. A csöveket kupakkal lezárjuk és lengő serlegekben centrifugálunk 800 xg-nél 30 percen át 20°C hőmérsékleten.

A centrifugálás után a fehér vérsejteket a köztes fázisban találjuk meg, ahonnan azok könnyen eltávolíthatók Pasteur pipetta segítségével. A fehér vérsejteket 50 ml-es csőbe gyűjtjük és kétszer mossuk PBS-sel. A sejteket kis térfogatú olyan L-15 tápközegben szuszpendá1juk, amely tartalmaz penicillint és streptomicint is (100 egység/ml), majd megszámláljuk. A sejteket 20.10⁷ sejt/ ml-re hígítjuk és 10 ·· ·♦·· ·· ·· • · * · · · · ··· · · · · · • · · · · · ml-es alikvotokat helyezünk 75 cm -es palackokba (Falcon).

A palackokat 1 órán át 20°C hőmérsékleten tartjuk, és a nem tapadó sejteket eltávolítjuk és egy második palackba visszük át. Ezt a műveletet megismételjük, és 1 óra múlva a nem tapadó sejteket átvisszük egy harmadik palackba. Az első és második palackot kétszer mossuk 100-100 ml PBS-sel élénk rázatás mellett. Az első palack tartalmazza a makrofágban dús tenyészetet, és a harmadik palack tartalmazza a limfocitában dús tenyészetet. Az összes palackba 10 milliliter tápkczeget adunk és az összes palackot 8 órán át inkubáljuk, amely idő után a felülúszókat összegyűjtjük és 2000 xg-nél centrifugáljuk 5-15 percen át. A felülúszókat ezután 25-100-szorosára koncentráljuk Centricon vagy Amicon egységben (Amicon Corp.). mintákat azután 4°C hőmérsékleten tároljuk.

c) Patkányagy ol igodendrocita tenyészetek előállítása és imrrunf luoreszcens festés. A dúsított ol igodendrocita tenyészetek előállításához újszülött (2 napos) patkányok agyát kimetsszük /2 agy 2 ml Leibowitz tápközegben (L-15) , Gibco/ és kémiailag disszcciáljuk 3.10⁴ egység/ml tripszinnel (Sigma) DMEM-ben (Ca^⁺ és Mg^⁺-mentes), amely 1 mmól/1 etiléndiamin-tetraecetsavat (EDTA) is tartalmaz. Mechanikus disszociálást végzünk a tripszin oldattal 37°C hőmérsékleten, 10 percig végzett inkubálás előtt. A sejteket azután átvisszük 15 ml-es kúpos csövekbe, amelyek 1 ml oldatot tartalmaznak /ahol az oldat összetétele: 74 egység/ml DN-áz (Sigma), 5200 egység/rrl szója tripszin (Sig17

ma), és 3 mg BSA/, inkubáljuk 1 órán át szobahőmérsékleten, hozzáadjuk 10 ml tápközeghez, majd háromszor mossuk DMEM-ben. Az utolsó mosás után a sejteket szuszpendáljuk

5-10% borjuszérumot (FBS, Sigma, hővel aktiválva 56°C hőmérsékleten 30 percen át) is tartalmazó DN.EM-ben, szűrőn 2 engedjük át és inokuláljuk 85 mm -es palackokba (Nunc), amelyeket előzőleg egy éjszakán át beburkoltunk 37°C hőmérsékleten 20 ja g/ml pol i-L-1 ízinnel (PLL, molekulatömeg 100000, Sigma). A tápközeget először a sejt inokulálás után 24 órával cseréljük, majd ezután minden 2-3 napon. Az inokulálás utáni 8. napon a sejteket rázatással inkubáljuk 4-6 órán át, a felülúszót eltávolítjuk, és a megmaradó sejteket tovább inkubáljuk 10 ml tápközegben (DMEM+5-10% FBS) több órán át, amelyet rázatás követ egy éjszakán át.. A sejteket, amelyek a rázatással felszabadultak, összegyűjtjük és centrifugáljuk, és a leülepedett sejteket újra szuszpendáljuk 1-2 ml szérum-mentes tápközegben /Ecttenstein ΰ. E. és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 514-517 (1979)/.

Az így kapott dúsított oligodendrocita tenyészetek kinyert sejtjeit olyan üveg fedőlemezre inokuláljuk (13 mm, 3.10^ sejt/ üreg), amelyet előzőleg PLL-lel (20ytg/ml) burkoltunk be. Az üveg fedőlemezeket egy 24 üreges lemezen (Nunc) helyezzük el. Az inokulálás során először 50/xl sejtszuszpenziót alkalmazunk mindegyik feöő’emezre, majd 30 percig állni hagyjuk 37°C hőmérsékleten, hogy lehetővé tegyük a megkötést. Ezután a sejteket DMEM-mel mossuk, majd 500 yx.1 **· ·· ·· ·« • · · ·· • · · ·· • · · ·· • *« · · meghatározott tápközeget (Raff által módosított Bottenstein-Sato meghatározott tápközeg) adunk hozzá. 48 óra múlva az inokulált sejteket a kondicionált tápközeggel kezeljük, vagy 2 órán át nyúl-anti-humán-IL-2 antitestekkel (Genzyme, Inc.), vagy kontroll antitestekkel (nyúl anti-idegvégzőcés) előinkubált kondicionált tápközeggel kezeljük. Az érett oligodendrociták, vagyis a galaktocerebrozid (GalC) pozitív sejtek, számát immunfluoreszcenciával határozzuk meg az alábbi módon. Sejteket mosunk alaposan Hank féle kiegyensúlyozott sóoldattal (HBSS), amely 2% FBS-t is tartalmaz, hővel inaktiváljuk, és 30 percen át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten 5G jtl anti-GalC monoklonál is antitesttel (IgG3, hibridóma felülúszó 1:5 arányban hígítva DMEM-ben, Serotec). Az inkubálás végén a sejteket mossuk és tovább inkubáljuk 50 74Λ fluoreszceinnel konjugált kecske-anti-egér IgG3-mal (1:50 DMEM-ben), majd mossuk és metanollal fixáljuk 10 percig -20°C hőmérsékleten. Az utolsó mosás után a sejteket 22 mmól 1,4-diazabiciklo /2,2,27 oktaint tartalmazó glicerinnel befedjük. Kontrollként olyan fedőlemezeket alkalmazunk, amelyeket azonos festési munkamenetnek vetünk alá azzal a kivétellel, hogy a primer antitesteket nem alkalmazzuk. A fedő 1 emezeket üveglemezekre helyezzük, körömlakkal leforrasztjuk és 4°C hőmérsékleten tároljuk. A sejteket a teljes fedőlemezen megszámoljuk.

d) Az IL-2 immunreaktív fehérjék Western folt elemzése. Mintákat SDS-PAGE elektroforézisnek vetünk alá. A géleket átvisszük nitrocellulózra 2 óra alatt 200 mA-nél. A nitrocellulózt 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten 5% tejet ·* ·· · · • ··· • · *· · >· ·· ·· • · · ·· • « « ·· • · · ·· • · · · · tartalmazó PBS-sel, majd PBS-ben mossuk.

A foltot nyúl anti-IL-2 antiestekkel inkubáljuk 2 órán át 37°C hőmérsékleten, majd háromszor mossuk 5-5 percig 0,05% Tween 20-at is tartalmazó PBS-ben. Végül a foltot inkubáljuk 2 órán át 37°C hőmérsékleten /¹²⁵I/-vel jelzett kecsc ke-anti-nyúl antitestekkel /10 cpm (beütés/perc)/ml/, háromszor mossuk 0,05% Tween-20-at is tartalmazó PBS-sel, szárítjuk, és autoradiográfiának vetjük alá.

1. példa. A regenerálódó hal látóidegekkel kondicionált tápközeg citotoxicitását oligodendrocitákra közömbösíteni lehet ant.i-IL-2 antitestekkel.

Regenerálódó hal látóidegekkel kondicionált tápközeget kezelünk IL-2 elleni antitestekkel, hogy megvizsgáljuk:vajon vezet-e ez a citotoxikus aktivitás elvesztéséhez. Arra az eredményre jutunk, hogy az IL-2 ellen irányuló antitestek semlegesítik a kondicionált tápközeg citotoxikus hatását.

Felbecsüljük a hal oldható anyagai oligodendrocitákra való citotoxikus hatásának semlegesítését rekombináns humán IL-2 antitestek ellen irányuló nyúl poliklonális antitestekkel. Az eredményeket az 1. ábrában mutatjuk be. 48 óra múlva kondicionált tápközeget - önmagában vagy rekombináns humán IL-2 elleni nyúl poliklonális antitestekkel előinkubálva - hozzáadunk az oligcdendrocita tenyészetekhez és további 48 órán át inkubáljuk. Az idegvégzőcések ellen irányuló anti• 4 ·♦ ·*44 ···* • · · · 4 ·· * »4« » 4 ··· • · · 4 4 44 •4* ·♦ 4 444· testeket alkalmazzuk kontrollként. Az oligodendrocitákat immunfluoreszcenciával azonosítjuk. A regenerálódó hal látóidegekből származó oldott anyagok legnagyobb koncentrációja (5/tg fehérje) mintegy 60%-os citotoxicitást eredményez és nincs semlegesítés anti-IL-2 antitestekkel; 0,5/(g kondicionált tápközeg 42% citotoxicitást eredményez, amelynek fele semlegesíthető az antitestekkel; ugyanolyan mennyiségű antitesttel teljes semlegesítést kaphatunk, amikor csak 0,2 g kondicionált tápközeget alkalmazunk. Az eredmények százalék citotoxicitásban vannak megadva a csak antitestekkel kezelt, citotoxicitás-mentes kontroll tenyészetekhez (100% túlélés, nincs citotoxicitás) viszonyítva. Az összes kísérletet háromszor ismételjük és 0,1 xg antí-IL-2 antitest (IgG) alkalmazásával hajtjuk végre. Ebben az ábrában egy kísérlet eredményeit adjuk meg, a CM kondicionált tápközeget jelent. Az egyes fedőlemezeken megszámolt GalC pozitív sejtek abszolút összszáma a 300 és 500 közötti tartományban van a különböző kísérletekben. A betét lényegében ugyanezt a kísérletet mutatja tízszer több anti-IL-2-vel, vagyis 1 xg IgG-nel kivitelezve.

Amint az ábrából látható, a rekombináns egér IL-2 elleni antitestek semlegesítik a citotoxikus aktivitást a kondicionált tápközegben. Amikor az anti-testek mennyiségét állandó értéken tartjuk (0,1 xg IgG frakció; 1/<g semlegesít 1 egység IL-2-t), az elért, semlegesítés az alkalmazott kondicionált tápközeg koncentrációjának függvénye, legkisebbjy izsgált koncentrációnál teljes semlegesítéssel a , vagyis 0,2 xg/ml • · » ·

teljes fehérjénél. Tízszeres mennyiségű antitest (1y4.g IgG frakció) a kondicionált tápközeg nagyobb koncentrációinak semlegesítését eredményezi (pl. 0,5 és 5 g/ml) (lásd az 1. ábra betétjét). Ezen eredmények szerint, valamint a jelen vizsgálatban a semlegesítéshez alkalmazott IL-2 antitestek képességeire alapozva úgy becsüljük, hogy 1 /Ag kondicionált tápközeg 0,5-2 egység biológiailag aktív, IL-2-szerű molekulát tartalmaz .

2. példa. A hal kondicionált tápközegből való IL-2-szerű molekula jellemzése.

Abból a célból, hogy meghatározzuk az IL-2-szerű molekula méretét, az olcható anyagokat tartalmazó hal látóideg kondicionált tápkczeget Western folt elemzésnek vetjük alá, humán IL-2 ellen irányuló monoklonális antitesteket alkalmazva. Látóideg kondicionált tápközeget (CM, 400 //.g), halvér 1imfocitákka1 kondicionált tápközeget (L.MP, 16y<g), és egér IL-2-t (75 ng) elektroforézisnek vetünk alá SDS-PAGE-n. Az 1. vonal tartalmazza az anti-IL-2 antitestekkel inkubált kondicionált tápközeget (CM). A 2. vonal a csak második antitestekkel reagáltatott kondicionált tápközeget (CM) tartalmazó kontroll folt. A

3. vonal az anti-IL-2 antitestekkel inkubált, hal limfocitákkal (LMP) kondicionált tápközeget tartalmazó folt. Az egyes vonalak (kivéve a 2. vonalat) baloldalán található nyilak jelölik az IL-2 immunreaktív csíkokat az egyes foltokban. Ugyanezen a gélen molekulatömeg markereket is alávetünk elektroforézisnek, ezeket a gélen jelöljük. A 2. ábra egy egyedi IL-2 immunreaktív csík jelenlétét mutatja 28 kDa molekulatömegnél. Mivel a 1imfccitákról ismeretes, hegy termelnek IL-2-t, azonos • ·« ♦»*< »4·· ··· « · · · · · • »·» * · · · · * · 5 · « ·· ··· «· « 4··· antitestek kölcsönhatását hasonlítjuk össze a hal limfocitákkal, azonos kísérleti körülmények között. Amint, a 2. ábrából látható, egy egyedi, mintegy 14 kDa-os IL-2 immunreaktív csík figyelhető meg. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy az IL-2, vagy egy olyan molekula, amely IL-2-vel keresztreaktív, lehet c. felelős az ol igodendrocitákra való citotoxikus hatásért.

3. példa. Az oligodendrocita citotoxikus faktor affinitásos tisztítása hal kondicionált tápközegből.

A citotoxikus anyagok tisztítását. IL-2 affinitás oszlop alkalmazásával a következőképpen hajtjuk végre.

Rekombináns humán IL-2 antitestek elleni egér monoklonális antitesteket összekapcsolunk pol iakri lhidrazid agarózzal BioMakor, Izrael). Wilchek és Miron munkamenetét alkalmazva /Meth. Enzymol. 34, 72-76 (1974)/ 0,1 ml csomagolt gyantát 0,5 mg antitesttel kötünk össze. A tisztítást a következőképpen végezzük. Kondicionált tápközeget (50 Ml) adunk uz antitesttel összekapcsolt csomagolt gyantához, amelyhez enti-IL-2 antitestek kapcsolódnak, és 2 órán át inkubáljuk 37°C hőmérsékleten. A fe 1 ü! úszót, azután összegyűjtjük és a megmaradó gyantát, háromszor mossuk, mindegyik alkalommal 1 ml PBS-sel.

Az eluálást 50 glicinnel (0,2 mól/1, pH 2,7’ végezzük 10 percen át szobahőmérsékleten rázatva. Az eluált anyagot (ELU) 10 Ml trisz-pufferbe (1 mól/1, pH 8,0) gyűjtjük. Az IL-2 kö23 ·« * « ··· • ··· V «· · • · · ·* e < · ·· * · « ·« * · ·· · tött anyagokat tartalmazó frakciókat megvizsgáljuk citotoxikus aktivitásukra oligodendrocitákra, kolorimetriás MTT /3 -(4,5-dimeti 1-tiazcl-2-i 1 )-2,5-dif eni 1-tetrazól ium-bromí.tí/ (Sigma) vizsgálattal, felbecsülve az ol igodendrociták számát és ezáltal a citotoxicitást /Mosmanri T: J. Immunoi. Meth. 65, 55-63 (1983)/.

A vizsgálatokat a következőképpen végezzük. A sejteket kezeljük vagy egyedül a kondicionált tápközeggel, vagy az anti-IL-2 antitestek oszlopáról eluált kötött anyagokkal (ELU). Az eluált anyagoknak (ELU) a vizsgálatban alkalmazott végső hígítása megfelel a nyers kondicionált tápközeg hígításának. 48 órás inkubálás után 10J4.1 MTT-t adunk hozzá 3 órára, ezután a tápközeget eltávolítjuk és 100 /4.1 0,04 n HCl-t (izopropanolban) adunk hozzá. A sejteket gyengéden rázatjuk, amíg minden kristály feloldódik, és abszorbanciájukat 550 nm-nél rögzítjük 600 nm-rel, mint referencia hullámhosszán szemben.

A kolorimetriás MTT méréssel megbecsült, oligodendrocitákra citotoxikus aktivitású anyagot a regenerálódó hal látóidegekkel kondicionált tápközegből kinyerjük /(a) kísérleti munkamenet/ az előzőleg az c.sz’cphc.2. kapcsolt anti-IL-2 antitestekhez kötött anyagok el Hálásával. A kontrollok nem kezelt tenyészetek vagy olyan tenyészetek, amelyek az eluciós puffért (Pufféi) tartalmazó tápközeggel vannak kezelve, így ki van zárva az a lehetőség, hogy az eluátuirban található bármely citotoxicitás a kötött anyagnak az oszlopról való leoldásához használt puffer hatásának eredménye. A kísérletet, amelyet • ·· '‘«l ·« ·· ·· · Λ · « · ♦ · * ··· « « · < · • · · · « · « ·*« · · · * · «« háromszor ismétlőnk meg, három párhuzamosban végezzük, és az eredményeket úgy adjuk meg, mint átlagot + a nem kezelt tenyészet értékek, amelyek 100%-os túlélést képviselnek, SD értékét. Az ismételt mérési eljárással végzett elemzés feltárja, hogy az eluált anyagok (ELU) hatásai szignifikánsan (p<0,05) különböznek a két megfelelő kontroll tenyészet hatásaitól.

Amint a 3. ábrában bemutatjuk, az oszlopról eluált, IL-2-kötött anyagok az oligodendrocitákra citotoxikusak. A tisztítás kis léptéke nem teszi lehetővé az eluátum fajlagos aktivitásának kiszámítását. A fehérje-kimutatás ismert korlátáit figyelembevéve felbecsülhetjük, hogy az eluátum fajlagos aktivitása legalább ezerszeresen nagyobb, mint a kondicionált tápközegé. Az eluátumot, amelyről megállapítjuk, hogy megőrizte citotoxikus aktivitását, szintén alávetjük Western folt elemzésnek anti-IL-2 antitesteket alkalmazva, amely vizsgálat feltorja, az eredeti 28 kDa-os immunreaktív polipeptid jelenlétét, (adatot nem mutatunk be). Ezek az eredmények így összekapcsolják az IL-2 immunreaktív 28 kDa-os fehérjét és a citotoxikus aktivitást.

4. példa. A rekombináns egér IL-2 szelektíven toxikus az öli— godendroc itákra.

Rekombináns egér IL-2-t (0-150 egység/ml) alkalmazunk patkány, oligcdendrociták feldúsított tenyészeteihez (amelyeknek előállítását a kísérleti munkameneteknél írtuk le) 48 órával a sejtek inokulálása után. A sejtek számát. a GalC elleni antitestek alkalmazásával becsüljük meg. Az ezt követő hatást az ·· ·♦» «· • · ··· ·· ·♦·· ·· • · · ♦4 » · · 4« • « « ·· • ♦·«4 érett oligodendrociták számára immunfluoreszcens vizsgálattal határozzuk meg, ahol a jelzett sejtek számát fluoreszcens mikroszkóp alkalmazásával számoljuk meg. Kontrollként a nem kezelt sejteket alkalmazzuk (nincs citotoxicitás). A nagy IL-2 koncentrációknál az érett oligodendrociták száma, amint ez a GalC pozitív sejtek számából tükröződik, szignifikánsan csökken (88,6 t 15,3% citotoxicitás 150 egység/ml-nél, p<0,0005 ANOVA-val) (4. ábra). A reprezentatív mikroszkópos képek , amelyek bemutatják a rekombináns egér IL-2 (200 egység/ml) hatásait az érett (GalC-vel jelzett) oligodendrociták számára, az 5. ábra b. és d. részében láthatók. Az IL-2-vel kezelt (b), illetve nem kezelt (d) sejtek fluoreszcens mikroszkópos képei anti-GalC antitestekkel vannak megfestve. A (b)-ben és (d)-ben bemutatott mezők megfelelő fázis-mikroszkópos képei az (a)-ban, illetve a (c)-ben láthatók. Azok a sejtek, amelyek megmaradtak, nyúlvány nélküliek (5 b. ábra), ellentétben a nyúlványokat hordozó sejtekkel (5 d. ábra). Az ο 1igodendrocitákra való kimutatható citotoxikus hatáshoz szükséges rekombináns egér IL-2 mennyisége azonban sokkal nagyobb, mint amely a becsült mennyiség a kondicionált tápközegben. Ennél fogva lehetséges, hogy a halból származó IL-2 az immun-eredetű IL-2 módosult formája és így nagyobb affinitása van a patkány oligodendrocitákhoz, mint a rekombináns egér IL-2 affinitása a patkány oligodendrocitákhoz. Abból a célból, hogy kizárjuk azt a lehetőséget, hogy az IL-2 oligodendrocitákra megfigyelt hatása nem fajlagos citotoxicitás következménye, IL-2-t alkalmazunk asztrociták, vagyis lapos sejtek patkányagy-egyrétegei • «· ·♦·· ·· *· »· · · ««··· * »·· ▼ · · · · • · · · « » · ••F ·· · *· tenyészeteihez. Amint várható, citotoxicitás nem figyelhető meg.

1. TÁBLÁZAT

5000 sejt/üreg 10.000 sejt/üreg 30.000 sejt/üreg

IL-2	CPM	%	CPM	%	CPM	%
egység/ml	ÍS D	ÍS D	ÍS D	±S D	ÍS D	±S D
0	28030	100±2	48776	101Í15	55727	100±11
	Í518		-5954		±5137
0.1	'33632	120±7	53040	109+13	60345	108±8
	±2351		±3639		±793
1	31084	110±3	55740	115±12	58231	105±8
	±984		±1436		±86
10	33384	119-16	51745	107±14	62328	112±9
	-5181		±5317		±103
50	31879	113±9	53548	110±13	56601	102±8
	Í2957		±3251		±658
200	30248	107±3	50064	103±11	57380	103±9
	±1052		±2219		±2771
5. példa.	IL-2 aktivitás in	vivő.
Abból a	célból,	hogy megvizsgáljuk,	vajon	az IL-2	helyette-

sítheti-e a kondicionált tápközeget az axonális növekedés elősegítésére való in vivő hatásnál, rekombináns egér IL-2-t alkalmazunk sérült felnőtt nyúl látóidegekhez. Az alkalmazást • 4

444 • 4

44·4 4w·# • 4 4 44

4 4 44

4 4*4 • 4444 két kísérleti paradigma alkalmazásával hajtjuk végre. Az egyik kísérleti paradigma magában foglalja az átvágott felnőtt nyúl látóidegeket és a nitrocellulózban felitatott IL-2 alkalmazását /Lavie V. és munkatársai: d. Comp. Neurol. 298, 293-315 (1990)/. A második paradigma magában foglalja a látóidegek súlyos összemorzsolását és IL-2 injektálását oldott formában több helyen az idegek mentén, a sérülések helyétől disztálisan. Az ezt követő növekedés becslése magában foglalja az elemzést transzmissziós elektronmikroszkópiával és a látókorongba injektált torma peroxidáz (HRP) anterograd szállításának elemzésével (Lavie és munkatársai: fentebb idézett munka). A megfigyelt növekedést a 6. ábrában mutatjuk be. Amint látható, az IL-2-vel kezelt, sérült nyúl látóidegekben a sérülés helyétől disztálisan bőséges mennyiségű, nem mielinezett axon és növekedési kúp figyelhető meg. Ezeket korábban úgy írták le (Lavie és munkatársai, fentebb idézett munka), mint az újonnan növekvő axonok jellemzőit. A kontroll sérült, de nem kezelt állatokban életképes axonok nem figyelhetők meg.

Claims (33)

1. Gyógyászati kompozíció axonok regenerálására azzal jellemezve, hogy interleukin 2-t vagy interleukin-2-szerű anyagot, valamint gyógyászati1ag elfogadható hordozót vagy hígítót tartalmaz sérült axonok regenerálódásának indukciójához és elősegítéséhez hatásos mennyiségben, amikor a sérülés helyére juttatjuk.

2. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati konpozíció azzal jellemezve, hogy interleukin-2 egységdózisát tartalmazza.

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció azzal jellemezve, hogy humán interleukin 2-t tartalmaz.

4. A 3. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció azzal jellemezve, hogy rekombináns humán interleukiη-2-t tartalmaz.

5. Az 1. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció azzal jellemezve, hogy interleukin-2-szerű anyagot tartalmaz.

6. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció azzal jellemezve, hogy hal látóidegekből származó oligodendrocita citotoxikus faktort tartalmaz lényegében tisztított formában.

7. Az 1. vagy 5. igénypont szerinti gyógyászati kompozíció azzal jellemezve, hogy az interleukin-2 valamely muteinjét tartalmazza.

8. Eljárás sérült központi idegrendszeri axonok regenerálásának indukálására és elősegítésére emlősökben azzal jellemezve, hogy a sérülés helyére interleukin-2 vagy interleukin-2-szerű anyag hatékony mennyiségét vezetjük be.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlősként embereken alkalmazzuk.

10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy interleukin-2-t vezetük be.

11. A 8-10. igénypontok bámelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy humán interleukin-2-t vezetünk be.

12. A 8-11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy rekombináns humán interleukin-2-t vezetünk be.

13. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy interleukin-2-szerű anyagot vezetünk be.

14. A 8., 9., vagy 13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy hal látóidegeiből származó oligodendrocita citotoxikus faktort vezetünk be lényegében tisztított formában.

15. A 8., 9. vagy 13., igénypontok szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az interleukin-2 valamely muteinjét adjuk be.

16. A 8.-15. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az inter1eukiη-2-t, vagy interleukin-2-szerű anyagot közvetlen injekcióval vezetjük be a sérülés helyére.

17. A 8.-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy sérült központi idegrendszeri axonokként gerincvelő axonokat kezelünk.

18. A 8.-16. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy sérült központi idegrendszeri axonokként látóideg axonokat kezelünk.

19. Interleukin-2 vagy interleukin-2-szerű anyag alkalmazása azzal jellemezve, hogy a nevezett anyagokat a központi idegrendszer sérült axonjai regenerálásának indukciójára és elősegítésére alkalmas gyógyászati készítmények előállításához alkalmazzuk.

20. A 19. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy interleukiη-2-t alkalmazunk.

21. A 19. vagy 20. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy humán interleukin-2-t alkalmazunk.

22. A 19-21. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás azzal ·· • · · • · · jellemezve, hogy humán interleukin-2-t alkalmazunk.

23. A 19. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy interleukin-2-szerű anyagot alkalmazunk.

24. A 19. vagy 23. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy az interleukin-2 valamely muteinjét alkalmazzuk.

25. A 19. vagy 23. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy hal látóidegekből származó oligodendrocita citotoxikus faktort alkalmazunk lényegében tiszta formában .

26. 01igodendrocita citotoxikus faktor azzal jellemezve, hogy hal látóidegből származik, és lényegében tisztított formában az alábbi jellemzőkkel bír:

1., vízoldható,

11., jelen van az a 1acsonyabbrendű gerincesek regenerálódó sérült idegeinek kondicionált tápközegében, de nincsen jelen sem az alacsonyabbrendű gerincesek ép idegeinek kondicionált tápközegeiben, sem az emlősök sérült vagy ép idegeinek kondicionált tápközegeiben,

111., interleukin-2-jellegű anyag, iv., szelektíven toxikus az oligodendrocita vonalakra, de nem toxikus más sejtekre, pl. 1. típusú asztrocitákra k · * A és fibroblaszt sejtekre, vii., molekulatömege mintegy 28 kDa Western folt elemzéssel meghatározva.

27. Eljárás hal látóidegekből származó, lényegében tisztított oligodendrocita citotoxikus faktor előállítására azzal jellemezve, hogy

a) a regenerálódó hal látóidegen kondicionált tápközeget anti-IL-2 antitestekkel végzett affinitás kromatográfiának vetjük alá,

b) a kötött anyagokat megfelelő oldószerrel eluáljuk, és

c) a mintegy 28 kDa molekulatömegű tisztított faktort kinyerjük az oligodendrocitákra szelektív citotoxikus aktivitást mutató eluált frakciókból.

28. A 27. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben említett anti-IL-2 antitestekként anti-humán-IL-2 antitesteket alkalmazunk.

29. A 27. vagy 28. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben említett anti-IL-2 antitestekként rekombináns humán IL-2 elleni egér monoklonális antitesteket alkalmazunk.

30. A 27.-29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a (b) lépésben eluáló oldószerként glicint alkalmazunk.

31. Lényegében tisztított oligodendrocita citotoxikus faktor azzal jellemezve, hogy hal látóidegből származik és anti-IL-2 antitestekkel végzett affinitáskromatográfiás tisztítással van készítve.

32. Lényegében tisztított oligodendrocita citotoxikus faktor azzal jellemezve, hogy hal látóidegből származik és anti-humán-IL-2 antitestekkel végzett .affinitáskromatográfiás tisztítással van készítve.

33. Lényegében tisztított oligodendrocita citotoxikus faktor azzal jellemezve, hogy hal látóidegből származik és rekombináns humán IL-2 elleni egér monoklonális antitestekkel végzett affinitáskromatográfiás tisztítással van készítve.