JPH04505330A - 血栓の検出に使用する合成ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 血　の　出に　する合成ペプチド類 この発明は、ヒトおよび動物の両者における、基本的には勿論、ヒトの疾病にお ける血栓の検出のための合成ペプチド類の開発および用途に関する。この発明に 使用した方法および合成ペプチド類は、生体内の標的とする他の部位、例えばＲ ＧＤ結合部位を含む細胞接着分子（ＣＡＭｓ）および腫瘍にも有効である。

１９８７年、ビエルシュバッヘル（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ）およびルオス ラチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ　）は、フィブロネクチンの細胞接触活性が合成ペプ チドの小さい断片によって模倣的に生ずる証拠を示した（Ｎａｔｕｒｔａ、３０ ９．３Ｏ−３３）、この活性能力のあるアミノ酸配列順序は、アルキニン−グリ シン−アスパラギン酸−セリン（ＲＧＤＳ）であることが示され、この配列順序 を含む合成ペプチド類は、フィブロネクチンで被覆された基質へのＮＨＫ細胞（ 神経芽腫細胞系からの細胞）の接触を阻害し得ることが証明された。ＲＧＤＳを 含むペプチド類で得られる阻害は、用量依存性があることが示されているが、Ｒ ＧＤＳ配列順序を含まないペプチド類は細胞接触を阻害することができなかった 。テトラペプチドのセリン基は、生物学的活性を保持するための通常の置換体で あるけれども必須なものでない二とが知られている。

ＲＧＤＳ配列順序はフィブリノゲン、フィブロネクチンおよびフォンウイルブラ ンド（ｖｏｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子中に存在することが知られている。

これらの蛋白の受容器は、血小板の活性化によって血小板の膜表面に現われる。

これらの細胞接着蛋白による血小板の架橋は、血栓中の血小板−血小板の相互作 用の原因となる。ＲＧＤＳを含む合成ペプチド類が、生体外で血小板凝集を阻害 し得ることも立証されている。これは、血小板膜表面に存在し、フイブリノゲン 結合領域を含むＧＰＩｒｂ／ｌ１ｌａ（Ｗ蛋白賀フィブリノゲン受容器）複合体 との特異な相互作用を示唆している。カルボン酸およびアミン末端に一個のアミ ノ酸基が結合することによるＲＧＤＳ配列順序の延長は、その生物学的活性にお いて１０倍の減少を起こすが、さらに延長しても結合能力がさらに減少すること はない、セリン基をフェニルアラニン基で置換すると、ＲＧＤＳよりも４ないし ５倍強力な抗凝集蛋白になる。ＲＧＤＳ配列順序においてセリンに相当する基は 、異なるＲＧＤＳ受容器に対して、ある程度の認識特異性を伝達することができ るという示唆がなされている。これは、ＲＧＤ配列順序の周辺を置換することに よって、特異性および親和性の両者を変化させ得る可能性を示している。ＲＧＤ 結合部位が、細胞接着分子（ＣＡＭｓ）および幾つかの腫瘍にあることも知られ ている。

本発明は、生体内における血栓の検出への新しい研究方法であり、患者（この用 語は、本文中で特に断らない限り、ヒトおよび動物の両者を意味する）への、血 小板ＧＰＩ［ｂ／ＩＩ［ａ複合体に対して特異な親和性を有し、ＲＧＤ　（Ａｒ ｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列順序、好適にはＲＧＤＳ　（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ −３ｅｒ）またはＲＧＤＦ　（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ）配列順序を含 む放射性で標識した合成ペプチドの静脈注射、および、存在する場合には、血栓 上での結合標識の存在を検出するものである。標識した抗体を用いる血栓検出の この方法は、系内における抗体の拡散速度が遅いため数時間を要する；本発明の 標識したペプチドを使用すると血栓の検出がおよそ数分で可能なことが期待され 、診断および治療がごく早期の段階で極めて容易になる。

生体における血栓検出のための用途として、本発明はＲＧＤ、好適にはＲＧＤＳ またはＲＧＤＦ配列順序を含み、放射性で標識された合成ペプチドを提供するも のである。

上記のような放射性で標識されたペプチド類を製造するために用いられる好まし い放射性標識の例としては、Ｔ　ｃ　Ｑ　９　″、工１２３および１、、ＩＩ＋ が挙げられ、既知の方法、例えば合成ペプチドのシスティン基により合成ペプチ ドに取り入れられる。その他の適当な方法は、Ｓｃｉ　ｅｎｃｅ、２２０，６１ ３−６１５　；　Ｉｎｔ、Ｊ、Ｎｕｃｌ。

Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、、１２．３−８；Ｊ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、、２７．６８５− ６９３およびＪ、Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、、２６，２９３−２９９に記載されている 。

非経口投与および有効性、即ちＧＰＩＩｂ／ｎ１ａｌ１合体への高い親和性およ び特異性を妥当性の条件とすると、組成および長さの点で、正確なアミノ酸配列 順序は特に重要ではないが、実際上の理由、例えば経済的および合成の容易さの ために、比較的短い鎖、例えば３ないし１０のペプチド単位よりなるペプチドが 好ましい。

ＲＧＤ１好適にはＲＧＤＳまたはＲＧＤＦ配列順序を含む好ましいペプチド類は 、異なる各種の原料から入手できる、若しくは通常のペプチド合成法、特に通常 のペプチド合成装置を用いて極めて容易に製造することができる。

非経口的に投与できるＲＧＤ配列順序を含む放射性で標識されたペプチド溶液お よび非経口的に投与できる担体よりなる生体内での血栓検出の診断薬、および血 栓の血小板上でのＲＧＤ結合部位に結合することができるＲＧＤ配列順序を含む 放射能で標識されたペプチドを静脈注射し、蓄積した結合性ペプチドをＸ線写真 で検出することよりなる生体内で血栓を検出する方法が、この発明の範囲に含こ の発明は、生体内でＣＡＭｓのＲＧＤ結合部位に局在化した放射性で標識したペ プチドの用途にも関する。

この発明の詳細な記述を行なう前に、誤解を避けるため、ここに記載するアミノ 酸配列順序は、次のように、三文字の短縮形または一文字の略号の何れかによっ て表現する：アルギニン　＝　ａｒｇ、またはＲ。

アスパラギン酸　＝　ａｓｐ、またはり。

グリシン　”　ｇｌ、Ｙ、またはＧ。

セリン　＝　ｓｅｒ、またはＳ。

チロシン　＝　ｔｙｒ、またはＹ。

フェニルアラニン　−ｐｈｅ、またはＦ。

システィン　＝　ｃｙｓ、またはＣ９ 添付の図は、この発明の放射性で標識したペプチドの静脈注射したウサギの放射 線写真であり、左耳において人工的に誘発した血栓中のペプチドの局在化を示す 。

この発明をより詳細に説明するため、血栓造影剤としての有効性を評価するため の四種のペプチド（ＲＧＤＳＹ、ＲＧＤＦＹ％ＲＧＤＳＹＣおよびＲＧ　Ｄ　Ｓ 　ＣＲＧ　Ｄ　Ｓ　Ｙ　）を用いて研究を行なった。

ＡＤＰが誘発した血小板凝集に対するこれらのペプチドの効果を測定し、血小板 凝集を阻害することが知られているＲＧＤＳペプチドと比較した。この結果（表 １）は、試験した四種のペプチドすべてが高濃度で血小板凝集を阻害し得ること 、およびＲＧＤＳと殆ど同程度の効力を有することを示した。これは、これらの ペプチド配列順序への放射性で標識したアミノ酸の導入が、血小板と結合する能 力を破壊しないことを示している（血栓造影処理のための前提条件）。

次の試験では、ＲＧＤＳＹｌＲＧＤＦＹ、ＲＧＤＳＹＣおよびＲＧＤＳＣＲＧＤ ＳＹの放射性ヨウ素化、次いで全血液中の活性化された血小板に対する結合能の 解析を行なった。その結果（表２）は、四種類のペプチドすべてが、ＡＤＰで刺 激された血液中の血小板と結合すること、および凝固した血液中への取込みが高 いことを示している。

試験の一つは、ヨウ素−１２３の放射性同位体で標識したＲＧＤＳＹを用い、耳 の微小血管系に血栓を予め形成したウサギに注射して行なった。添付の図に示し た画像の研究は、この血栓に速やかに（２分以内）取込まれ、試験の期間中（２ ０分）残存していることを示した。

これらのデータは、試験した四種類のペプチドが血小板と結合し得ること、ガン マ線を放出する同位体で放射性の標識がなされ得ること、および刺激された血液 および凝固した血液中の凝集血小板に取込まれることを示している。これは、上 記のペプチドの一つを用いた実験動物モデルで確認された生体内での血栓の検出 および診断用に、これらのペプチドが有効であることを示している。

Ｊ　ＲＧＤＳ、ＲＧＤＳＹ、ＲＧＤＦＹ、ＲＧＤＳＹＣおよ７ＪＲＧＤＳＣＲＧ ＤＳＹベブチＦにょ６ＡＤＰ　（１ｘｌ　０−’Ｍ）　が誘発した血小板凝集の 阻害。

（ペプチド）　阻害百分率 ユヱ　顔部　匹ｙ江　四辺ゴ　顔部ぢ　ＲＧＤＳＣＲＧＤＳＹＯ，］、　４０／ ３７　５／１３　３２　２５　１７０．２　７０／６５　１０／２１　５５　５ ７０．４　８６／８０　４３／６８　８０　７９考２　放射性テ標１ｍされたＲ ＧＤｓＹ、ＲＧＤＦＹ、ＲＧＤＳＹＣおよびＲＣｉＤＳＣＲＧＤＳＹペプチドの 、ＡＤＰで刺激された血液および凝固した血液への結合。

（ペプチド）　（結合したペプチド）ｎｇｎ　ｇ　ＲＧＤＳＹ　ＲＧＤＦＹ　Ｒ ＧＤＳＹＣＲＧＤＳＣＲＧＤＳＹＡＤＰで刺激された血液 １０．０５　０．０１　０．０３　０．０１３０　０．６４　１．００　０．９ ４　０．８５１００　９．８０　４．４６　９．８５　９．０７凝固した血液 １　０．２７　０．４１　０．１８　０．２８１０　０．８５　２．１４　２． ２６　２．６４１００　１７．２７　１８．１２　２７．０８　２９．３３上記 の結果は、ＲＧＤ配列順序を含む大きさの異なる一連の合成ペプチドのすべてに 対して、この発明の適用の可能性を証拠立てている。ペプチドの実際の長さは重 要でないが、実際上の目的には、鎖の長さは３ないし１０、好適には４ないし１ ０のペプチド単位の範囲であり、前述のごとく、何れもＲＧＤＳまたはＲＧＤＦ 配列順序よりなり、若しくは含有する。多くのかかる合成ペプチドは、既知の製 品として既に市販されている。市販されていない場合には、既知のペプチド合成 および／または既知のペプチド合成装置を用いて容易に合成される。同様に、該 合成ペプチドは既知の方法、例えばこのペプチドに組込まれた末端のチロシン（ Ｙ）を工Ｉ２３でヨウ素化することによって、放射能で標識することができる。

この発明の放射性で標識されたペプチドの詳細な製法は、以下の実施例によって 例示される。

Ｘ嵐１ 性で　識された（Ｉ”’　ＲＧＤＳＹ、ＲＧＤＦＹ、ＲＧＤＳＹＣおよびＲＧＤ ＳＣＲＤＳＹの製法 ヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ’）管を、ヨードゲン（１，３，４，６−テトラク ロロ−３α、６α−ジフエニルグリコールウリル）をグロロホルムに１■・１ｎ Ｉｌ−１の濃度で溶解することにより製した。その５０ｕｆ（ヨードゲン５０ｕ りをポリプロピレン凍結管に分配し、グロロホルムを乾固した０次いでこれらの 管を用量まで一２０℃で乾燥、貯蔵した５ 放射性標識前に、ペプチドをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に５０μｇ・ＴｎＩｌ−１ の濃度に溶解した。最初にＲＧＤＳＹＣおよびＲＧＤＳＣＲＧＤＳＹを、ＰＢＳ 中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の最終濃度が１％ｖ　／　ｖになるよう に小量のＤＭＳＯに溶解した。

ヨードゲン管を室温に平衡させ、ペプチド溶液２００ｊｆおよび１１１（水溶液 ）１〜３．Ｏｉｔを添加した０次いで、反応混合物を１５分間室温に放置し、時 々振盪した。定温放置後、反応混合物を取り出し、ＰＢＳで平衡させたセファデ ックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ　１０カラムを通した。放射性で標識したペプチ ドを遊離のヨウ素から分離するため、カラムをＰＢＳで溶出し、２−づつの留分 を集めた。留分中の放射能を測定し、カラムから溶出した最初の放射能ビーブを 示すペプチドを集め、用量まで４℃で貯蔵した。

生体内での血栓検出における放射能で標識したペプチドの用途を、以下の試験例 によって例示する。

区監男 性で標識した（Ｔ’２３ＲＧＤＳＹの血　症ウサギへの　脈内投王 雄のニューシーラントホワイトウサギ（３ｋｇ）を、ヒブノルム（Ｈｙｐｎｏｒ ｍ）　（０、４ｄ　−ｋｇ　−’　）の筋肉内注射で鎮静させ、次いでミダゾラ ム（Ｍｉｄａｚｏｌａｍ）　（２ｍｇ　・ｋｇ−’）を静脈注射シ”Ｃ麻酔シｆ ：。

二個の円盤状永久磁石を頚静脈領域の外側に配置し、次いでウサギの左耳動脈に 対照溶媒［オムニバク（昨ｎ１ｐａｑｕｅ）］の１艷に懸濁した鉄カルボニルミ クロスフェア０．２ｇを注射した。この方法は耳の毛細管に微小な血栓を形成す る。他方、耳を通過した鉄粒子は磁場によって捕捉され頚静脈内で血栓の形成を 促す。鉄注射の６０分後、反対側の耳に”’Ｉ−ＲＧＤＳＹを静脈注射した。ガ ンマカメラによる動的な画儂は、両耳、頭及び頚部を視野に入れるため、前方に 配置したカメラで２０分間フレーム速度１分で撮影した。

標識したペプチドの静脈注射を行った後、ウサギのＸ線写真を撮影し、得られた Ｘｌ！写真を添付した図に示した。Ｘ線写真で判るように、頚静脈内の血栓（矢 印１）及び左耳内の多数の小さな血栓によるペプチドの速やかな吸収が見られた 。特に、後者は生体内における小さな血栓の検出、及び早期の診断と治療の可能 性での、この発明の有効性を示している。

国際調査報告 一惰一’−ＩＡｍ”−’ｍＭ、ＰＣＴ／ＧＢ　９０１００９３３国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．生体内でＲＧＤ結合部位に結合することができる３乃至１０のペプチド単位 よりなり、該３乃至１０のペプチド単位中に、アルギニン−グリシン−アスパラ ギン酸−フェニルアラニン（ＲＧＤ）の配列順序を含む放射性で標識したペプチ ド。
2. ２．アルギニン−グリシン−アスパラギン酸−セリン（ＲＧＤＳ）配列順序また はアルギニン−グリシン−アスパラギン酸−フェニルアラニン（ＲＧＤＦ）配列 順序よりなり、またはそれらを含む請求項１記載の放射性で標識したペプチド。
3. ３．特に、ペプチドがＲＧＤＳＹ、ＲＧＤＦＹ、ＲＧＤＳＹＣ及びＲＧＤＳＣＲ ＧＤＳＹである請求項１記載の放射性で標識したペプチド。
4. ４．放射性標識がＴｃ９９ｍ、Ｉ１２３またはＩｎ１１１である請求項１乃至３ の何れか一つに記載の放射性で標識したペプチド。
5. ５．非経口的に投与し得る放射性で標識したＲＧＤ配列順序を含むペプチド及び 非経口的に投与し得る担体よりなる、ＲＧＤ結合部位における生体内での局在性 診断薬。
6. ６．該ＲＧＤ結合部位が血小板の結合部位である請求項５記載の診断薬。
7. ７．該ＲＧＤ結合部位が血栓である請求項６記載の診断薬。
8. ８．該ＲＧＤ結合部位が細胞接着分子である請求項５の診断薬。
9. ９．該ＲＧＤ結合部位が種瘍である請求項５記載の診断薬。
10. １０．放射性標識したペプチドが請求項１乃至４の何れかの化合物である請求項 ５乃至９の何れかに記載の診断薬。
11. １１．血栓の血小板上のＲＧＤ結合部位に結合することができるＲＧＤ配列順序 を有する放射性で標識したペプチドを静脈注射し、Ｘ線撮影法により蓄積した結 合ペプチドを検出する生体内での血栓の検出法。