MXPA04000967A - Agentes de contraste de objetivo multimerico en base a peptido. - Google Patents

Agentes de contraste de objetivo multimerico en base a peptido.

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Abstract

Se describen los a gentes de contraste multimericos de objetivo de peptido y peptidos, asi como tambien los metodos para elaborar y utilizar los a gentes de contraste.

Description

AGENTES DE CONTRASTE DE OBJETIVO MULTIMÉRICO EN BASE A PÉPTIDO DATOS DE SOLIC ITUD RELACIONADA Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud Provisional de E. U. No. de Serie 60/308,721 , presentada el 30 de Julio del 2001 .
CAMPO TÉCNICO Esta invención se refiere a agentes de contraste para representación por imágenes diagnóstica, y más particularmente a agentes de contraste multiméricos, de objetivo peptido, en donde un peptido funciona como un grupo objetivo y un punto de unión para uno o más quelatos tanto en la terminal carboxi como amino de| peptido.
ANTECEDENTES Las técnicas de representación por imágenes diagnóstica, tales como representación por imágenes de résonancia magnética (MRI), rayos X, representación por imágenes radiofarmacéutica nuclear, representación por imágenes de luz infrarroja visible ultravioleta, y ultrasonido, se harí utilizado en el diagnóstico médico por un número de años. Los medios de contraste adicionalmente se han utilizado para mejorar o aumentar la resolución de la imagen o para proporcionar información del diagnóstico específico. Para ser eficaces, los medios de contraste deben interferir con la longitud de onda de la radicación electromagnética utilizada en la técnica de representación, alterar las propiedades físicas del tejido para producir una señal alterada, o, así como en el caso de radiofarmacéuticos, proporcionar la fuente de radiación por sí mismo. MRI y los métodos ópticos son únicos entre las modalidades de representación por imágenes a medida que producen señales complejas que son sensibles al ambiente químico. Mientras que la señal de rayos X o agentes radionúclidos permanece igual si los agentes se encuentran libres en plasma, unidos a proteínas u otros objetivos, o atrapados dentro del hueso, ciertos agentes de contraste para MRI y representación por imágenes óptica tendrán diferentes características de la señal en diferentes ambientes fisiológicos. Es importante que el agente de contraste sea lo suficientemente sensible y se presente en una concentráción lo suficientemente alta de tal forma que pueden observarse los cambios de señal. Los complejantes entre gadolinio u otros iones paramagnéticos y ligantes orgánicos se utilizan ampliamente para mejorar y reforzar el contraste de MRI. Los complejantes de gadolinio aumentan el contraste al aumentar las velocidades de relajación magnética nuclear de protones encontrados en las moléculas de agua que son accesibles para los agentes de contraste durante MRI (Caravan, P., et al. , R.B. Chem. Rev. 99, 2293 (1999)). La velocidad de relajación de los protones en estas moléculas de agua aumenta en relación a los protones en otras moléculas de agua que no son accesibles para el agente dé contraste. Este cambio en la velocidad de relajación conduce al contraste mejorado de las imágenes. Además, este aumento en la relajación dentro de una población específica de protones de molécula de agua puede dar como resultado la habilidad de colectar más datos de imagen en una cantidad dada de tiempo. Esto, a su vez, da como resultado una señal mejorada para la proporción de ruido. La representación por imágenes también puede realizarse utilizando luz, en cuyo caso se selecciona un tinte óptico para proporcionar la señal. En particular, la luz en el rango de 600-1 300 nm (visible para infrarrojo cercano) pasa relativamente fácilmente a través de los tejidos biológicos y puede utilizarse para propósitos de representación. La luz que se transmite lo suficiente, o se difunde por, se refleja, o se vuelve a emitir (fluorescencia), se detecta y se genera una imagen. Los cambios en las características de absorbencia, reflejo, o fluorescencia de un tinte, incluyendo un aumento o reducción en el número de valores máximos de absorbencia o un cambio en su máximo de longitud de onda, pueden ocurrir en la unión a un objetivo biológico, proporcionando de esta manera contraste de tejido adicional. En algunas situaciones, por ejemplo, pueden utilizarse la diagnosis de la enfermedad cercana a la superficie corporal, UV o luz visible. Persiste la necesidad de agentes de contraste que puedan suministrar suficientes concentraciones de la porción de representación por imágenes al objetivo para mejorar la sensibilidad del proceso de representación por imágenes así como también agentes de contraste que tengan una vida media suficiente in vivo.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se basa en péptidos y agentes de contraste multiméricos de objetivo peptido para representación por imágenes MR, óptica, y radionúclida, en donde un peptido único puede funcionar tanto como un grupo objetivo y un punto de unión para uno o más quelatos tanto en la terminal C como la terminal N, ya sea directamente o por medio de un enlazador de intervención opcional. Sorprendentemente, los agentes de contraste de la invención mantienen la afinidad de unión para objetivos biológicos tales como fibrina y relajación alta. Los agentes de la invención tienen una vida media suficiente siguiendo la administración in vivo de tal forma que pueden realizarse los estudios de representación por imágenes eficaces. En un aspecto, la invención se caracteriza por péptidos purificados que incluyen la secuencia de aminoácidos: P* - Y* - X^* - L* (SEQ ID NO: 1 ), en donde, P* es una prolina o un derivado no natural de la misma; Y* es una tirosina o un derivado nó natural de la misma; Xi * es G o D o un derivado no natural de G o D; L* es una leucina o un derivado no natural de la misma; y en donde al menos uno de P*, Y*, X y L* es un derivado no natural del aminoácido respectivo. Xn* puede ser G o D y L* puede ser leucina. En algunas modalidades, P* es prolina o 4-hidroxiprolina, y Y* es tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituido en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, CI, Br, I y N02. Los compuestos de la invención pueden incluir tales péptidos unidos a un agente trombolítico. En otro aspecto, la invención se caracteriza por péptidos purificados que incluyen la secuencia de aminoácidos Xi - X2 - C - P* - Y* -X3 - L - C- X4 - X5 - X6 (SEQ ID NO:2), en donde: P* es una prolina o un derivado no natural de la misma; Y* es una tirosina p un derivado no natural de la misma; ?? se selecciona del grupo que consiste de W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F (3/4*), y Y(3*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CH3) CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, CI, Br, I, Et, y OMe, y en donde Y(3*) es una tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, CI, Br, I, y N02; X2 se selecciona del grupo que consiste de E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr, y Th; X3 se selecciona del grupo que consiste de G y D; X4 se selecciona del grupo que consiste de H, F, Y, y W; X5 se selecciona del grupo que consiste de I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, TIe, Nval, Phg, Cha, Taz, Fuá, Th, 4-Pal, y F(3/4*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CF3, Et, iPr, y OMe; X6 se selecciona del grupo que consiste de N, Q, I, L y V, o X6 no se presenta; y en donde al menos uno de X·, , X2, X5, P*, y Y* no es un derivado natural de un aminoácido. Por ejemplo, P* puede ser prolina o 4-hidróxiprolina, y Y* puede ser una tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, CI, Br, I, y N02. Los péptidos purificados pueden ser capaces de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras y pueden tener afinidad de unión para fibrina. En algunas modalidades, los péptidos incluyen un enlace de disulfuro. Los compuestos de la invención pueden incluir tales péptidos unidos a un agente trombótico. La invención también se caracteriza por péptidos purificados que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste de W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q- (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-0 (SEQ ID NO: 5), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 6), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 7), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 8), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 9), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 10), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-(-Q (SEQ ID NO: 1 1 ), F(4-O e)-H-C-P-(4-OH)-Y-(3-Cl)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-0 (SEQ ID NO: 13), W-dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 15), y F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 16). Los péptidos pueden ser capaces de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras, y en algunas modalidades, los péptidos incluyen un enlace de disulfuro. Los péptidos pueden tener afinidad de unión específica para fibrina. Los compuestos de la invención pueden incluir tales péptidos unidos a un agente trombolítico. En algunas modalidades, P* es prolina; Y* es tirosina; Xi se selecciona del grupo que consiste de W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, Dopa e2, nTyr, dW, dF, F(3/4*), y Y(3*), en donde F3/4* es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CH3, CF3l NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et y OMe, y en donde Y3* es una tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, y N02; X2 se selecciona del grupo que consiste de dE, H(Bzl), 2-Pal, Dpr, y Th; X3 se selecciona del grupo que consiste de G y D; X4 se selecciona del grupo que consiste de H, F, Y y W; X5 se selecciona del grupo que consiste de I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, nVal, Phg, Cha, Taz, Fuá, Th, 4-Pal, y F(3/4*), en donde F3/4* es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CF3, Et, ¡Pr, y Orne, en donde al menos uno de X1 , X2, o X5 es un derivado de aminoácido no natural; y Xe se selecciona del grupo que consiste de N, Q, I, L, y V, o X6 no se presenta. Tales péptidos pueden ser capaces de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras, y en algunas modalidades, los péptidos incluyen un enlace de disulfuro. Los péptidos pueden tener afinidad de unión específica para fibrina. En otras modalidades, la invención se caracteriza por péptidos purificados que incluyen la secuencia de aminoácidos: C - P* - Y* - - L -C (SEQ ID NO: 3), en donde X, es G o D, P* es prolina o su derivado no natural 4-hidroxiprolina; y Y* es tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I y N02; con la condición de que al menos uno de P* o Y* es un derivado natural del aminoácido respectivo. Los péptidos purificados pueden ser capaces de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras y pueden tener afinidad de unión específica para fibrina. En algunas modalidades, los péptidos incluyen un enlace de disulfuro. Los compuestos de la invención pueden incluir tales péptidos unidos a un agente trombolítico. La invención también se caracteriza por péptidos purificados que incluyen la secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO: 17), en donde Xi0 se selecciona del grupo que consiste de n(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-difluoro), Amh, Hfe, Y(3,5-di-yodo), Pff, 1 Nal, d ! Nal, y MeL, en donde F(4*) es una fenilalanina sustituida en la posición 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de Et, CF3, I, e iPr. Los péptidos purificados pueden incluir la secuencia de aminoácidos C-D-Y-Y-G-T-C-X10-Xn (SEQ ID NO: 18), en donde X,, se selecciona del grupo que consiste de D, dD, ß?, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop, y Cmp. Por ejemplo, un peptido puede tener las siguientes secuencias de aminoácidos: L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(Decil)G-dD (SEQ ID NO: 19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(Decif)G-D (SEQ ID NO: 20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID NO: 21 ), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID NO: 22), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeUnp (SEQ ID NO: 23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID NO: 24), o L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID NO: 25). Los péptidos purificados pueden ser capaces de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductores y pueden tener afinidad de unión específica para fibrina. En algunas modalidades, los péptidos incluyen un enlace de disulfuro. Los compuestos de la invención pueden incluir tales péptidos unidos a un agente trombolítico. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR. El método incluye reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal N con una porción de subunídad de enlazador para formar un péptido modificado que tenga tanto un grupo funcional amina de terminal C como un grupo funcional amina de terminal N; unir covalentemente una porción enlazadofa al grupo funcional amina de terminal C y al grupo funcional amina de terminal N para formar un agente de representación por imágenes MR precursor; y convertir eí agente de representación por imágenes MR precursor ai agente de representación por imágenes MR. La porción de subunidad de enlazador puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es un entero de 1 a 4; m es un entero seleccionado de 1 a 12; y R es un grupo aromático o alifático. La porción enlazadora puede seleccionarse del grupo que consiste de en donde m es un entero de 1 a 4; n es un entero de 0 a 4; LG es un grupo de salida; y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico. La porción enlazadora también puede seleccionarse del grupo que consiste de en donde LG es un grupo de salida; y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico. El LG puede seleccionarse del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido. El éster activado puede seleccionarse del grupo que consiste de pentafluorofenol (Pfp), N-hidroxisuccinimida (NHS), Sal Sódica de N-Hidroxisulfosuccinimida (NHSS), 2-Tioxotiazolidin-1 -il, e hidroxibenzotriazola (OBT). El haluro puede seleccionarse del grupo que consiste de F, Cl, Br, e I. El grupo protector químico puede seleccionarse del grupo que consiste de Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo,. bencilo, y alilo. La conversión del agente de representación por imágenes MR precursor al agente de representación por imágenes MR puede incluir reaccionar el agente de representación por imágenes precursor con una porción de quelato precursor para formar un enlace covalente entre la porción de quelato precursor y la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxüato, los grupos precursores de carboxüato capaces de transformarse en porciones de carboxüato; transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxüato de la porción de quelato precursor unido a una pluralidad de porciones de carboxüato, las porciones de carboxüato capaces de complejar un ión metálico paramagnétíco; y complejar un ión metálico paramagnétíco a la pluralidad de porciones de carboxüato para producir el agente de representación por imágenes MR. La porción de quelato precursor puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde Y es una porción sintética capaz de formar un enlace covalente con la porción enlazadora unida, y en donde cada X, independientemente, es un O" o un precursor de O" de tal forma que X, en la conversión a O", es capaz de formar una porción de carboxilato con su carbonilo adyacente, y R es una porción química sin cargar, un grupo alquilo, alifático, o grupo cicloalquilo, o versiones sustituidas sin cargar de los mismos. La porción sintética puede seleccionarse del grupo que consiste de un ácido carboxílico, éster activado, haluro ácido, anhídrido, haluro de alquilo, ¡socianato, e isotiocianato, y en donde el precursor de O" se selecciona del grupo que consiste de -OH, -OMe, Oet, OtBu, Obencilo, y O-alilo. La porción de quelato precursor también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido, y en donde cada R, independientemente, es un O" o un precursor de O" seleccionado del grupo que consiste de OH, -O-Me, O-Et, O-tBu, O-bencilo, y O-alilo, de tal forma que R, en la conversión a O", es capaz de formar una porción de carboxilato con su carbonilo adyacente. La porción de quelato precursor también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es un entero de 1 a 4; R se selecciona del grupo que consiste de una carga negativa y un precursor de carga negativa capaz de transformarse en una carga negativa; y X es un grupo de salida químico seleccionado del grupo que consiste de -CI, -Br, -I, -MsO, -TsO, y -TfO. La porción de quelato precursor puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde R se selecciona del grupo que consiste de una carga negativa y un precursor de carga negativa capaz de transformarse en una carga negativa; y X es un grupo de salida químico seleccionado del grupo que consiste de -Cl, -Br, -I, - sO, -TsO, y -TfO. El precursor de carga negativa se selecciona del grupo que consiste de -H, -Me, -Et, .-t-Bu, -bencilo, y -alilo. En algunas modalidades, la porción enlazadora puede conjugarse covalentemente a una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. ta conversión dél agente de representación por imágenes MRI precursor al agente de representación por imágenes MR puede incluir transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y complejar un ión metálico paramagnético a la pluralidad de porciones de carboxilato para dar como resultado el agente de representación por imágenes MR. El ión metálico paramagnético puede seleccionarse del grupo que consiste de: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll y IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lil), Eu(ll) y Eu(lll). Gd(ll l) es un ión paramagnético particularmente útil. El conjugado covalente puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es un entero de 1 a 4; LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R1 , R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido de -Me, -Et, o t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. El conjugado covalente también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R1, R2, R3, y R4 se seleccionan del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido de -Me, -Et, o -t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. El conjugado covalente puede seleccionarse del grupo que consiste de: Synthon 1 : Synthon 2: El conjugado covalente también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde: R es un grupo -tBu , LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro y anhídrido. Los métodos de la invención además pueden incluir, antes de unir covalentemente una porción enlazadora a los grupos funcionales amina de terminal N y C, reaccionar una subunidad de eniazador con el grupo funcional amina de terminal N del peptído para producir un grupo funcional amina de terminal N derivada del peptido. La subunidad de eniazador puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde la Base se selecciona del grupo que consiste de adenosina, guanosina, timina, y citosina; LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R es una porción aromática o alifática. La subunidad de enlazador también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es independientemente un entero de 0 a 3; R es un grupo aromático o alifático; y LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de: OH, éster activado, haluro y anhídrido. La subunidad de enlazador también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es independientemente 1 o 2; R es un grupo aromático o alifático; y LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de: OH, éster activado, haluro, y anhídrido. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR. El método incluye unir covalentemente un residuo de aminoácido a una porción de subunidad de enlazador para formar un extremo de terminal C de un peptido, en donde la porción de subunidad de enlazador se une covalentemente a una resina; sintetizar un peptido en la resina del extremo de terminal C covalentemente unido a un residuo de terminal N del peptido, el residuo de terminal N comprendiendo un grupo funcional amina de terminal N; dividir el peptido de la resina para producir un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C; unir covalentemente una porción enlazadora al grupo funcional amina de terminal C del peptido y grupo funcional de amina de terminal N para formar un agente de representación por imágenes MR precursor; y convertir el agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR. El método además puede incluir antes de la división del peptido de la resina, unir covalentemente una porción de subunidad de enlazador al grupo funcional amina de terminal N para producir un grupo funcional amina de terminal N derivada. La porción enlazadora puede conjugarse covalentemente en una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. La conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR puede incluir reaccionar el agente de representación por imágenes MR precursor con una porción de quelato precursor para formar un enlace covalente entre la porción de quelato precursor y la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato; transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unir en una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de las porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. La conversión del agente de representación por imágenes MRI precursor en el agente de representación por imágenes MR también puede incluir transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ¡ón metálico paramagnético; y complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para dar como resultado el agente de representación por imágenes MR. El ión metálico paramagnético puede seleccionarse del grupo que consiste de: Gd(ll l), Fe(l l l), Mn(l l y I I I), Cr(l l l), Cu(l l), Dy(l l l) , Tb(l l l y IV), Ho(l l l), Er(l ll), Pr(l l l), Eu(l l), y Eu(l l l). Gd(lll) es un ión metálico paramagnético particularmente útil. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR que incluye reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional de carboxilato de terminal C con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene tanto un grupo funcional de carboxilato de terminal C como un grupo funcional de carboxilato de terminal N; unir covalentemente una porción enlazadora a ambos grupos funcionales de carboxilato de terminal C y terminal N del peptido modificado para formar un agente de representación por imágenes MR precursor; y convertir el agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR. La porción de subunidad de enlazador puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R es un grupo alifático o aromático. La porción enlazadora también puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde m es un entero de 1 a 4; n es un entero de 0 a 4; R se selecciona independientemente del grupo que consiste de -H, -Me, -Et, -Bz, y -tBu; y R1 y R2 se seleccionan independientemente de un hidrógeno o un grupo protector químico. La porción enlazadora puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico, el grupo protector químico seleccionado del grupo que consiste de: Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo, benciio, y alilo. La conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR también puede incluir reaccionar el agente de representación por imágenes MR precursor con una porción de quelato precursor a fin de formar un enlace covalente entre la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor y la porción de quelato precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato; transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unido en una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. La porción enlazadora puede conjugarse covalentemente a una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. La conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR también puede incluir transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y complejar un ión metálico paramagnético en la pluraljdad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. Un conjugado covalente puede seleccionarse del grupo que consiste de: en donde n es un entero de 1 a 4; y R , R2, R3, R4, y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido de -Me, -Et, o -t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. El conjugado covalente puede ser: La conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR también puede incluir reaccionar el agente dé representación por imágenes precursor con una porción de quelato, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético, para formar un enlace covalente entre la porción de quelato y la porcióh enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor para producir el agente de representación por imágenes MR. Los iones metálicos paramagnéticos adecuados se describen abajo, Todavía en otro aspecto, la invención se caracteriza por un agente de contraste que incluye un complejo de quelato metálico en una terminal NHR y -CO2R de un biopolímero (por ejemplo, un peptido), en donde R se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alifático, y un grupo de salida. El agente de contraste puede incluir dos complejos de quelato metálico en la terminal NHR y C02R del biopolímero. El biopolímero puede tener una afinidad de unión específica para fibrina. El peptido puede ser capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras, y en algunas modalidades, incluye un enlace de disulfuro. Un agente de contraste puede tener la fórmula: en donde el Quelato representa un complejante de quelato metálico; Enlazador representa una porción eniazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; m es independientemente un entero de 1 a 10; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R1 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 es independientemente un hidrógeno o un grupo alifático. Un agente de contraste puede tener una estructura de cualquiera de las estructuras 4-55. En ptro aspecto, la invención se caracteriza por un método para alterar la estabilidad de un peptido, el peptido teniendo un grupo funcional amina de terminal N. El método incluye reaccionar el peptido con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C; y unir covalentemente una porción eniazadora al grupo funcional amina de terminal C del peptido y grupo funcional amina de terminal N para formar un peptido modificado. El método además puede incluir reaccionar el peptido modificado con una porción cubierta para formar un enlace covaiente entre la porción cubierta y la porción enlazadora del peptido modificado. El método también puede incluir reaccionar el peptido modificado con una porción de queiato precursor para formar un enlace covaiente entre la porción de queiato precursor y la porción enlazadora del peptido modificado, la porción de queiato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. Después de transformar una pluralidad de lós grupos precursores de carboxilato de la porción de queiato precursor unido a una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; un ión metálico paramagnético puede complejarse para la pluralidad de las porciones de carboxilato. El método además puede incluir ensayar la estabilidad del peptido modificado o ensayar la estabilidad del peptido sin modificar y comparar la estabilidad de dicho peptido modificado a la estabilidad del peptido sin modificar. La estabilidad del peptido modificado puede mejorarse en relación a la estabilidad del peptido sin modificar (por ejemplo, se mejoró 10 pliegues, 20 pliegues, o 30 pliegues en relación a la estabilidad del peptido sin modificar). La estabilidad puede ensayarse utilizando un ensayo homogenato de hígado de rata. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un peptido modificado que tiene la estructura: en donde el precursor de Quelato representa una porción de precursor de quelato; Enlazador representa una porción enlazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; m es independientemente un entero de 1 a 10; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R1 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 se selecciona del grupo que consiste de H y un grupo alifático. Todavía en otro aspecto, la invención se caracteriza por un peptido modificado que tiene la estructura: de Enlazador) (Enlazador) p en donde Enlazador representa una porción enlazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R1 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 se selecciona del grupo que consiste de H y un grupo alifático. El método para elaborar un agente de representación por imágenes MR también se caracteriza porque incluye reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal N con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene un grupo funcional amina tanto en su terminal C como en su terminal N, o reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional de carboxiiato de terminal C con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene un grupo funcional de carboxiiato tanto en su terminal N como en su terminal C; y convertir el peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR. La conversión del peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR puede incluir unir covalentemente una porción de quelato al peptido modificado, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético, para producir el agente de representación por imágenes MR. La conversión del peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR también puede incluir unir covalentemente una porción enlazadpra a una porción de quelato para formar un conjugado covalente, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético; y reaccionar el conjugado covalente con el peptido modificado para formar el agente de representación por imágenes MR. Los iones paramagnéticos adecuados se describen abajo. En otro aspecto, la invención se caracteriza por un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR que incluye unir covalentemente un residuo de aminoácido a una porción de subunidad de eníazador para formar un extremo de terminal C de un peptido, en donde la porción de subunidad de enlazador se une covalentemente a una resina; sintetizar un peptido en la resina del extremo de terminal C covalentemente unido a un residuo de terminal N del peptido, el residuo de terminal N comprendiendo un grupo funcional amina de terminal N; dividir el peptido de la resina para producir un grupo funcional amina de terminal C del peptido modificado; convertir el peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR. La conversión del peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR puede incluir unir covalentemente una porción de quelato al peptido modificado, en donde la porción de quelato contiene un ion metálico paramagnético, para producir el agente de representación por imágenes MR. La conversión del peptido modificado en agente de representación por imágenes MR también puede incluir unir covalentemente una porción de enlazador a una porción de quelato para formar un conjugado covalente, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético; y reaccionar el conjugado covalente con el peptido modificado para formar el agente de representación por imágenes MR. Los iones paramagnéticos adecuados se describen anteriormente. Al menos que se defina de otra forma, todos los términos científicos y técnicos utilizados en la presente tienen el mismo significado según se entiende comúnmente por un experto en la materia a quien pertenece esta invención. A pesar de que los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales adecuados se describen abajo. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias mencionadas en la presente se incorporan para referencia en su totalidad. En caso de conflicto, la presenté especificación, incluyendo las definiciones, regirá.
Además, los materiales, métodos y ejemplos, son ilustrativos solamente y no se pretende que sean limitantes. Otras características y ventajas de la invención serán aparentes de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La FIG. 1 proporciona las estructuras químicas de los aminoácidos no naturales. La FIG. 2 representa las relajaciones por Gd a 20 MHz, 35°C en salina regulada por Tris (TBS) o 10 mg/ml de fibrina en TBS. La FIG. 3 representa la acumulación de un agente contraste en el trombo. La FIG. 4A es una imagen de un trombo. La FIG. 4B es una imagen de un trombo con sangre negra.
DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones Las abreviaturas químicas comúnmente utitizadas que no se definen explícitamente en esta descripción pueden encontrarse en The American Society Style Guide, Segunda Edición; American Chemical Society, Washington, DC (1997), "2001 Guidelines for Authors" J. Orq. Chem. 66(1), 24A (2001 ), "A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide Science", J. Peptidé. Sci. 5. 465-471 (1999). Para los propósitos de esta solicitud, el término "grupo protector químico" o "grupo protector" significa cualquier porción química temporalmente unida covalentemente a una molécula a lo largo de una o más etapas de química sintética en una secuencia de reacción para prevenir las reacciones indeseables. Las estrategias del grupo protector comunes se describen en "Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera Ed." por P. Wuts y T. Greene, ©1 999 John Wiley & Sons, Inc. Para los propósitos de esta solicitud, el término "grupo de salida" significa cualquier porción química que se desplaza por un nucleófilo en una sustitución nucleofílica o secuencia de reacciones de adición-eliminación. Una molécula que comprende un grupo de salida puede aislarse o puede fórmarse in situ como un intermedio transitorio en una reacción química. Para los propósitos de esta solicitud, el término "alifático" describe cualquier compuesto de carbono acíclico o cíclico, saturado o no saturado, ramificado o no ramificado, excluyendo los compuestos aromáticos. El término "alquilo" incluye grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena recta (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de cadena ramificada (isopropilo, tert-butilo, isobutilo, etc.), grupos (alicíclicos) cicloalquilo (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos alquilo, grupos alquilo sustituidos cicloalquilo. El término alquilo incluye además grupos alquilo, que pueden incluir además átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo reemplazando uno o más carbonos del elemento principal de hidrocarburo. En ciertas modalidades, un alquilo de cadena ramificada o cadena recta tiene 6 o menos átomos de carbono en su elemento principal (por ejemplo, d.Ce para cadena recta, C3-C6 para cadena ramificada), y más preferentemente 4 o menos. De igual forma, los cicloalquilos preferidos tienen de 3-8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferentemente tienen 5 o 6 átomos de carbono en la estructura de anillo. El término C^ -Ce incluye grupos alquilos que contienen 1 a 6 átomos de carbono. Además, el término "alquilo" incluye tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a porciones de alquilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno sobre uno o más carbonos del elemento principal de hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquenilo, alquiniío, halógeno, hidróxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo amino alquilo, dialquilamino, arilamino, diarilamino, y alquilariiamino), acilaminó (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoil y ureido), amidino, imino, sulfihidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoil, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o una porción heteroaromática o aromática. Los cicloalquilos pueden además sustituirse, por ejemplo, con los sustituyentes descritos anteriormente. Una porción de "arilalquilo" es un alquilo sustituido con un arilo (por ejemplo, fenilmetilo (bencilo)). El término "alquilo" también incluye las cadenas laterales de aminoácidos no naturales y naturales. El término "n-alquilo" significa un grupo alquilo no sustituido de cadena recta (es decir, no ramificado) El término "alquenüo" incluye grupos alifáticos que pueden o no pueden sustituirse, según se describe anteriormente para alquilos, conteniendo al menos un enlace doble en al menos dos átomos de carbono. Por ejemplo, el término "alquenilo" incluye grupos alquenilo de cadena recta (por ejemplo, etilenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, heptenilo, octeniio, nonenilo, decenilo, etc.), grupos alquenilo de cadena ramificada, grupos cicioalquenilo (alicíclicos) (ciclopropenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclooctenilo), grupos cicioalquenilo sustituidos de alquilo o alquenilo, y grupos alquenilo sustituidos de cicioalquenilo o cicloalquilo. El término alquilo además incluye grupos alquenilo que incluyen átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo reemplazando uno o más carbonos del elemento principal de hidrocarburo. En ciertas modalidades, un grupo alquenilo de cadena ramificada o cadena recta tiene 6 o menos átomos de carbono en su elemento principal (por ejemplo, G2-C6 para cadena recta, C3-C6 para cadena ramificada). De igual forma, los grupos cicioalquenilo pueden tener de 3-8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferentemente tener 5 o 6 carbonos en la estructura de anillo. El término C2-C6 incluye grupos alquenilo que contienen 2 a 6 átomos de carbono. Además, el término alquenilo incluye tanto "alquenilos no sustituidos" como "alquenilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a porciones de alquenilo que tienen sustituyentes reemplazando un hidrógeno sobre uno o más carbonos el elemento principal de hidrocarburo. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, grupos alquilo, grupos alquinilo, halógenos, hidróxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, aiquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonjlo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo amino alquilo, dialquilamino, arilamino, diarilamino, y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoil, y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoíl, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo, o una porción heteroaromática o aromática. El término "alquinilo" incluye grupos alifáticos no saturados análogos en longitud y posible sustitución para los alquilos anteriormente descritos, pero que contiene al menos un enlace triple y dos átomos de carbono. Por ejemplo, el término "alquinilo" incluye grupos alquinilo de cadena recta (por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo, etc.), grupos alquinilo de cadena ramificada, y grupos alquinilo sustituidos de cicloalquenilo o cicloalquilo. El término alquinilo incluye además grupos alquinilo que incluyen átomos de oxígeno, nitrógeno, azufre o fósforo reemplazando uno o más carbonos del elemento principal de hidrocarburo. En ciertas modalidades, un grupo alquinilo de cadena recta o cadena ramificada tiene 6 o menos átomos de carbono en su elemento principal (por ejemplo, C2-C6 para cadena recta, C3-C6 para cadena ramificada). El término C2-C6 incluye grupos alquinilo que contienen 2 a 6 átomos de carbono. En general, el término "arilo" incluye grupos, incluyendo grupos aromáticos de anillo único de 5 y 6 miembros que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, por ejemplo, benceno, fenilo, pirróla, furano, tiofeno, tiazola, isotiazola, imidazola, triazola, tetrazola, pirazola, oxazola, isoxazola, piridina, pirazina, piridazina, y pirimidina, y lo similar. Además, el término "arilo" incluye grupos arilo multicíclicos, por ejemplo, tricíclicos o bicíclicos, tales como naftaleno, benzoxazola, benzodioxazola, benzotiazola, benzoimidazola, benzotiofeno, metilenodioxifenilo, quinolina, isoquinolina, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, o indoljzina. Aquellos grupos arilo que tienen heteroátomos en la estructura de anillo también pueden referirse como "heterociclos arilo", "heterociclos", "heteroarilos", o "heteroaromáticos". Un grupo arilo puede sustituirse en una o más posiciones de anillo con sustituyentes. Para los propósitos de esta solicitud, "DTPA" se refiere a un compuesto químico que comprenden una estructura compuesta de dietilenotriamina, en donde las dos aminas principales se unen cada una covalentemente a dos grupos acetilo y la amina secundaria tiene un grupo ácetilo covalentemente unido de acuerdo a la siguiente fórmula: en donde X es un grupo donador de electrón heteroátomo capaz de coordinar un catión metálico, preferentemente O", OH, NH2, OP032", o NHR, o OR en donde R es cualquier grupo alifático. Cuando cada grupo X es íerr-butoxi (tBu), la estructura puede referirse como "DTPE" ("E" para éster"). Para los propósitos de esta solicitud, "DOTA" se refiere a un compuesto químico que comprende una subestructura compuesta de 1 ,4,7,1 1 -tetraazaciclododecano, en donde las aminas cada una tiene un grupo acetilo covalentemente unido de acuerdo a la siguiente fórmula: en donde X se define anteriormente. Para los propósitos de esta solicitud, "NOTA" se refiere a un compuesto químico que comprende una subestructura compuesta de 1 ,4,7-tríazaciclononano, en donde las aminas cada una tiene un grupo acetilo covalentemente unido de acuerdo a la siguiente estructura: en donde X se define anteriormente. Para los propósitos de esta solicitud, "D03A" se refiere a un compuesto químico que comprende una subestructura compuesta de 1 ,4,7,1 1 -tetraazaciclododecano, en donde tres de las cuatro aminas cada una tiene un grupo acetilo covaientemente unido y la otra amina tiene un sustituyente que tiene carga neutral de acuerdo a la siguiente fórmula." en donde X se define anteriormente y R es una porción química sin cargar, preferentemente hidrógeno, cualquier alifático, grupo alquilo, o grupo cicloalquilo, y derivados sin cargar de los mismos. El quelato preferido "HP"-D03A tiene R1=-CH2(CHOH)CH3. En cada una de las cuatro estructuras anteriores, los átomos de carbono de los etilenos indicados pueden referirse como carbonos de "elemento principal". La designación "bbDTPA" puede utilizarse para referirse a la locación de un enlace químico a una molécula de DTPA ("bb" para "elemento principal"). Nótese que según se utiliza en la presente, bb(CO)DTPA-Gd significa una porción de C=0 unida a un átomo de carbono de elemento principal de etileno de DTPA. Los términos "ligante quelante", "porción de quelante", y "porción de quelato" puede utilizarse para referirse a cualquier ligante polidentato que es capaz de coordinar un ión metálico, incluyendo molécula DTPA (y DTPE), DOTA, D03A, o NOTA, o cualquier otro ligante quelante de polidentato adecuado según se describe además en la presente, es decir, ya sea coordinando un ión metálico o es capaz de hacerlo, ya sea directamente o después de la remoción de los grupos protectores, o es un reactivo, con o sin grupos protectores adecuados, que se utiliza en la síntesis de un agente de contraste y comprende sustancialmente todos los átomos que por último coordinarán el ión metálico del complejante metálico final. El término "quelato" se refiere a cualquier ligante metálico actual, y se entiende que el ligante de polidentato se coordinará eventualmente a un ión metálico médicamente útil. El término "afinidad de unión específica" según se utiliza en la presente, se refiere a la capacidad de un agente de contraste de tomarse por, retenerse por, o unirse a un componente biológico particular a un mayor grado que los otros componentes. Los agentes de contraste que tienen esta propiedad se dice que son de "objetivo" para el componente "objetivo". Los agentes de contraste que carecen de esta propiedad se dice que son agentes "no objetivos" o "no específicos". La afinidad de unión específica de un grupo de unión para un objetivo se expresa en términos de la constante de disociación de equilibrio "Kd". El término "relajación" según se utiliza en la presente, se refiere al aumento ya sea en las cantidades de MRI 1 /T1 o 1/T2 por concentración milimolar (mM) de ión paramagnético o agente de contraste, cuyas cantidades pueden ser diferentes si el agente de contraste contiene una multiplicidad de iones paramagnéticos, en donde T1 es el retículo de giro o longitudinal, tiempo de relajación, y T2 es el tiempo de relajación de giro-giro o transversal de protones de agua u otros núcleos espectroscópicos o de representación, incluyendo los protones encontrados en las moléculas diferentes al agua. La relajación se expresa en unidades de mM"1s"1. El término "sitio de coordinación abierta" según se utiliza en la presente, se refiere a un sitio sobre un ión metálico que se ocupa generalmente por Una molécula de solvente o agua. Según se utiliza en la presente, el término "purificado" se refiere a un peptido que se ha separado ya sea de moléculas orgánicas que ocurren naturalmente con las cuales se asocia normalmente o, por un peptido químicamente sintetizado, separado de cualquiera de las otras moléculas orgánicas presentes en la síntesis química. Típicamente, el polipéptido se considera "purificado" cuando es al menos 70% (por ejemplo, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99%), por peso seco, libre de cualquiera de las otras proteínas o moléculas orgánicas. Según se utiliza en la presente, el término "peptido" se refiere a una cadena de aminoácidos que es aproximadamente 2 a aproximadamente 75 aminoácidos en longitud (por ejemplo, 3 a 50 aminoácidos). Según se utiliza en la presente, el término "biopolímero" se refiere a una sustancia polimérica que se forma naturalmente en un sistema biológico. Ciertos biopolímeros pueden construirse de un grupo definido de subunidades de construcción y con funcionalidades comunes que enlazan las subunidades, por ejemplo, un peptido se construye usualmente de un grupo de aminoácidos (tanto naturales como no naturales) con enlaces amida que enlazan las subunidades. El término "multímero" para propósitos en la presente se define como un agente de contraste o una subunidad del mismo que comprende al menos dos quelatos covalentemente unidos o precursores sintéticos de los mismos. Según se utiliza en la presente, el término aminoácido "natural" o "que ocurre naturalmente" se refiere a uno de los veinte aminoácidos que ocurren más comunes. Los aminoácidos naturales modificados para proporcionar una etiqueta para propósitos de detección (por ejemplo, etiquetas radioactivas, etiquetas ópticas, o tintes) se considera que son aminoácidos naturales. Los aminoácidos naturales se refieren por sus abreviaturas de tres letras o una estándares. El término "aminoácido no natural" o "no natural" se refiere a cualquier derivado de un aminoácido natural que incluye las formas D, y derivados de aminoácido ß y y. Se señala que ciertos aminoácidos, por ejemplo, hidroxiprolina, que se clasifican como un aminoácido no natural en la presente, pueden encontrarse en naturaleza dentro de un cierto organismo o una proteína particular. El término "estable", según se utiliza en la presente, se refiere a compuestos que poseen estabilidad suficiente para permitir la elaboración y que mantiene la integridad del compuesto por un período suficiente de tiempo para ser útil y seguro para los propósitos descritos en la presente. Típicamente, tales compuestos son estables a una temperatura de 40°C o menos, en la ausencia de humedad u otras condiciones químicamente reactivas, por al menos una semana. Las combinaciones de sustituyentes y variables contempladas por esta invención solamente son aquellas que dan como resultado la formación de compuestos estables. Los términos "unión objetivo" y "unión" para los propósitos en la presente se refieren a interacciones no covalentes de un agente de contraste con un objetivo. Estas interacciones no covalentes son independientes entre sí y pueden ser, entre otras cosas, hidrofóbicos, hidrofílicos, dipolares-dipolares, pi-adherentes, unión de hidrógeno, asociaciones electroestáticas, o interacciones de base de ácido Lewis. El término "porción cubierta" se refiere a un quelato, tinte orgánico, agente de contraste, trombolítico, o porción estabilizadora. Las porciones estabilizadoras adecuadas son biológicamente inertes, es decir, no tienen actividad biológica. Agentes de Contraste En general, la presente invención se refiere a MRI, agentes de contraste radionúclidos, y óptico que incluyen un polímero de objetivo (por ejemplo, peptido) en donde tanto los aminoácidos de terminal C como N se conjugan cada uno, ya sea directamente o por medio de un eniazador o subunidad de eniazador de intervención opcional, a al menos un quelato de un ión metálico radioactivo (para representación por imágenes radionúclida) o paramagnético (para representación por imágenes de resonancia magnética) o un tinte óptico (para representación por imágenes óptica). Según se ejemplifica en ta presente, el eniazador o subunidad de eniazador puede ramificarse y por lo tanto permitirse para los múltiples q uelatos o tintes a unirse en cada extremo del peptido, es decir, un multímero. Los compuestos de esta invención pueden contener uno o más átomos de carbono asimétricos y de esta manera pueden ocurrir como racematos y mezclas racémicas, enantiómeros únicos, mezclas diastereoméricas y diastereomeros individuales. Tales formas isoméricas de estos compuestos se incluyen expresamente en la presente invención. Cada carbono estereogénico puede ser de la configuración R o S al menos que se designe específicamente de otra forma. A pesar de que los compuestos específicos ejemplificados en esta solicitud pueden representarse en una configuración estereoquímica particular, los compuestos que tienen ya sea ia estereoquímica opuesta en cualquier centro quiral dado o mezclas del mismo también se contemplen. Deberá entenderse que los compuestos de esta invención pueden adoptar una variedad de formas iónicas y conformes en solución, en las composiciones farmacéuticas e in vivo. A pesar de qge los dibujos en la presente de los compuestos preferidos específicos de esta invención son de conformaciones particulares y formas iónicas, la descripción de la invención no se limita. Los nuevos multímeros a base dé peptido de la presente invención ofrecen diversas ventajas como agentes de contraste objetivo. 1 . Los compuestos pueden suministrar dos o más porciones cubiertas (por ejemplo, quelatos, tintes orgánicos, o trombolíticos) al objetivo utilizando un peptido de objetivo único de tal forma que la suficiente mejora en el contraste de tejido se observará en parte debido a una concentración significante de la porción de representación por imágenes por imágenes alrededor del objetivo. 2. Los agentes de contraste MRI de esta invención también muestran una alta relajación en la unión al objetivo debido a que el receptor indujo el efecto de mejora magnética (RIME) combinado con la habilidad del peptido para limitar el movimiento local de los quelatos individuales cuando se unen al objetivo. 3. Los compuestos tienen una alta afinidad por uno o más objetivos. 4. Ya que los compuestos son relativamente fáciles de sintetizar de acuerdo a los métodos descritos en la presente y solamente un peptido por molécula se requiere, una multiplicidad de iones metálicos o tintes orgánicas puede suministrarse a un objetivo más económicamente. 5. Los compuestos de la invención pueden tener estabilidad in vivo más alta (es decir, Vidas medias más largas) de metabolismo de enzima disminuida (por ejemplo, división reducida por peptidasas). Estas características favorables de multímeros a base de peptido de acuerdo a la presente invención los hacen agentes de contraste de objetivo útiles. La estructura química de MRI y los agentes de contraste radion úclidos contemplados por la invención pueden ilustrarse por la fórmula: en donde para cada m, independientemente 1 <m<10, el quelato representa un complejante de quelato metálico, p es independientemente un entero de cero a cinco; s es independientemente uno o cero; R1 es cualquier cadena lateral de aminoácido incluyendo cadenas laterales de aminoácidos no naturales; R2 es cualquier grupo alifático o hidrógeno; y n es un entero de 3 a 50 inclusive. Alternativamente, R1 y R2 pueden tomarse juntos para formar una estructura de anillo (incluyendo prolina y versiones sustituidas de la misma). Los enlazadores, si se presentan, pueden ser diferentes. Los iones metálicos preferidos para MRI incluyen aquellos con números atómicos 21 -29, 39-47, o 57-83, y, más preferentemente, una forma paramagnética de un ión metálico con números atómicos 21 -29, 42, 44, o 57-83. Los iones metálicos paramagnéticos particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y I II), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(U I y IV), Ho(lll), Er(III), Pr(lll) y Eu(ll y III). Gd(l l l) es particularmente útil. Nótese qüe, según se utiliza en la presente, el término "Gd" se entiende que conduce la forma iónica del gadolinio metálico; tal como una forma iónica puede escribirse como GD(I II), GD3+, gado, etc. , sin diferencia en la forma iónica contemplada.
Para los agentes de representación por imágenes radionúclidos, los radionúclidos 90Y, 90mTc, 111ln, 7Sc, e7Ga, 5 Cr, 77mSn, 67Cu, 167Tm, 97Ru, 88Re, 177Lu, 99Au, 203Pb, y 41Ce son particularmente útiles. Los complejantes metálicos con propiedades ópticas útiles también se han descrito. Ver, Murru et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1993, 1116-1118. Para la representación por imágenes óptica que utiliza quelatos, los quelatos de lantanido tales como La(lll), Ce(lll), Pr(lll), Nd(lll), Pn(lll), Sm(lll), Eu(lll), Gd(lll), Tb(lll), Dy(lll), Ho(lll), Er(lll), Tm(lll), Yb(lll) y Ln(lll) son adecuados. Eu(lll) y Tb(lll) son particularmente útiles. Los quelatos metálicos no deberán disociarse a cualquier grado significante durante el paso del agente de representación por imágenes a través del cuerpo, incluyéndose mientras se une a un tejido objetivo. La liberación significante de los iones metálicos libres puede dar como resultado la toxicidad, que generalmente podría no ser aceptable. En una modalidad, con referencia a la estructura anterior de un agente de contraste, m es 2, n, s, R1, y R2 se definen según a lo anterior, y la porción enlazadora comprende: El "Quelato" es preferentemente bb(CO)DTPA»Gd. En otra modalidad, con referencia a la estructura anterior de un agente dé contraste, m es 2, n, s, R1, y R2 se definen según a lo anterior, y la porción enlazadora comprende: La porción de "Quelato" puede ser bb(CO)DTPA»Gd. Para los propósitos de ilustración, un agente de contraste contemplado por la presente invención se presenta abajo con las diversas subunidades anotadas: en donde R = cadenas laterales de aminoácido de tal forma que el peptido tiene afinidad por un objetivo biológico, y m = ión metálico (paramagnético para MRI, radioactivo para representación por imágenes radionúclido, y fluorescente, luminiscente, o absorbente para la representación por imágenes óptica). La estructura química de los agentes de contraste contemplados por la invención pueden ilustrarse por la fórmula: en donde 1 <m<10, p es independientemente un entero de cero a cinco, n es 3 a 50 inclusive, R1 es cualquier cadena lateral de aminoácido incluyendo las cadenas laterales de aminoácido no natural, y R2 es cualquier hidrógeno o grupo alifático. Alternativamente, R y R2 tomados juntos forman una estructura de anillo (incluyendo Pro y derivados de los mismos). Los aminoácidos de terminal C y N del peptido pueden conjugarse para el tinte óptico directamente o por medio de un enlazador opcional (por ejemplo, p=0 o 1 ). Las porciones enlazadoras pueden ser diferentes. El tinte óptico puede ser un tinte orgánico o un quelato metálico adecuado. Los tintes orgánicos adecuados para la representación por imágenes óptica se han descrito e incluyen, por ejemplo, ftalocianinas fluorescentes y porfirina fluorescente [ver, por ejemplo, Patente de E.U. No. 5,641 ,878]; materiales particulados [ver, por ejemplo, WO 96/23524], y tintes de polimetina [ver, por ejemplo, WO 97/13490]. Los tintes orgánicos ópticos comúnmente utilizados son fluoresceína, rodamina [ver, por ejemplo, Kojima H, ef al. , Anal. Chem. 73, 1967-1973 (2001 )], tetrametilrodamina [por ejemplo, Anal. Biochem. 223, 39 (1994)], y rojo Texas [por ejemplo, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85,3546 (1 988)]. Los quelatos de lantanida luminiscente y fluoresceína son particularmente útiles. Péptidos de Unión Objetivo y Objetivos La porción de peptido de los agentes de contraste de la presente invención puede mostrar unión específica para un objetivo biológico y funcionar como un punto de unión para uno o más quelatos en cada terminal. En general, los objetivos biológicos se presentan en una concentración baja (por ejemplo, micromolar o menos) y se representan por imágenes ineficazmente utilizando agentes de contraste MRI de complejante gadolinio monomérico existente. Sin embargo, los agentes de contraste MRI multiméricos en base a peptido de acuerdo a la presente invención, proporcionan una concentración mucho más alta del agente para el objetivo así como también alta relajación para elaborar la representación por imágenespor imágenes de estos objetivos posibles. De igual forma, los agentes de contraste radionúclidos multiméricos de base de peptido de la invención pueden suministrar más radionúclidos para objetivos de tal forma que la representación por imágenespor imágenes puede mejorarse más. Mientras que no se sujeta a un mecanismo en particular, se considera que el objetivo crea una concentración aumentada del agente de representación por imágenes en el sitio a representarse por imágenes y aumenta la relajación de los agentes de contraste MRI en el estado unido a través del efecto RIME y también limita el movimiento de quelato local al hacer rígido el peptido unido. Los objetivos para los agentes de contraste pueden ser en cualquier compartimiento corporal, célula, órgano, o tejido o componente del mismo. Los objetivos preferidos son aquellos que son de relevancia terapéutica o diagnóstica, es decir, aquellos que se asocian con estados de enfermedad. Los objetivos particularmente útiles son aquellos en asociación con fluidos corporales, y particularmente aquellos en asociación con sang re, plasma, linfocito y fluidos del sistema nervioso central. Otros objetivos preferidos son las proteínas y ios receptores que existen ya sea en concentración alta o tienen un gran número de sitios de unión para ciertos ligantes. Se incluyen entre tales proteínas objetivo las enzimas y glicoproteínas. La albúmina de suero humano (HSA) y fibrina son objetivos útiles para los agentes de contraste I I. Para la representación por imágenespor imágenes del grupo sanguíneo vascular, la albúmina de suero es un objetivo preferido. Ya que HSA se presenta en concentración alta en suero (aproximadamente 0.6 m ) y une un amplio grupo de moléculas con afinidad razonablemente alta, es una proteína de plasma objetivo preferida para los agentes de contraste de grupo sanguíneo. HSA es un objetivo particularmente preferido para la representación por imágenespor imágenes cardiovascular; ver Solicitud de Patente de E. U. No. 08/875,365, presentada el 24 de Julio de 1997, y WO 96/23526. Para representar por imágenes el trombo, la fibrina es un objetivo preferido debido a que se presenta en coágulos y puede objetivarse sin interferir con el proceso trombolítico normal. Para detalles adicionales concernientes a las porciones de unión objetivo que incluyen péptidos de unión de fibrina, ver Solicitud de Patente PCT WO 01 /09188. Otros objetivos de proteína incluyen, pero no se limitan a, glicoproteína de ácido alfa, fibrinogen, colágeno, receptor de plaqueta GPIlb/llla, receptor de peptido quimitáctico, receptores de somatoestatina, receptor de péptidos intestinales vasoactivos (VIP), receptor de peptido de liberación bombesina/gastrina, y receptores de integrina. Los péptidos adecuados para utilizarse en la invención incluyen aquellos capaces de unirse específicamente a los objetivos identificados anteriormente. Se incluyen entre tales péptidos los péptidos que contienen RGD que tienen como objetivo el receptor GPIlb/llla de plaqueta para la representación por imágenespor imágenes del trombo, péptidos quimiotácticos que tienen como objetivo los leucocitos para la representación por imágenespor imágenes de infección/inflamación, Octreotide y peptido P-829 que tiene como objetivo receptores de somastatina para la representación por imágenespor imágenes del tumor, péptidos intestinales vasoactivos (VIP) que tienen como objetivo el receptor VIP para la representación por imágenespor imágenes del tumor, análogos de bombesina que tienen como objetivo el receptor de peptid de liberación de bombesina/Gastrina para la representación por imágenespor imágenes de tumor, y péptidos que contienen RGD que tienen como objetivo la integrina a?ß3 (receptor de vitronectina) para la representación por imágenes por imágenes de tumor. En principio, cualquier peptido con una afinidad por un objetivo biológico puede utilizarse en un agente de contraste de la invención. El peptido puede ser lineal o cíclico. Ordinariamente, los péptidos lipof ílicos insoiubles se consideran inadecuados para uso farmacológico, pero tales péptidos pueden ser adecuados de acuerdo a la invención debido a que la adición de quelatos metálicos hidrofílicos en las dos terminales del peptido, puede aumentar la solubilidad. Para facilidad de síntesis y consideraciones de costo, se prefiere que los péptidos tengan entre 3 a 50 aminoácidos (por ejemplo, 3 a 30, 3 a 20, 3 a 15, 5 a 30, 5 a 20, 5 a 15, 10 a 12 aminoácidos en longitud). En los péptidos de objetivo de la invención, una gran variedad de aminoácidos puede utilizarse. Los aminoácidos adecuados incluyen aminoácidos no naturales y naturales. Los aminoácidos con varios grupos protectores diferentes adecuados para uso inmediato en la síntesis de fase sólida de péptidos se encuentran comercialmente disponibles. Además de los veinte aminoácidos que ocurren naturalmente más comunes, los siguientes aminoácidos no naturales o derivados de aminoácido pueden ser constituyentes del grupo objetivo peptido de la invención (abreviaturas comunes en paréntesis, ver FIG. 1): ß-Alanina (ß-Ala), Ácido ?-Aminobutírico (GABA), Ácido 2-Aminobutírico (2-Abu), Ácido a,ß-Dehidro-2-aminobutírico (?-Abu), Ácido 1 -Aminociclopropano-1 -carboxíl¡co (ACPC), Ácido Aminoisobutírico (Aib), Ácido 2-Amino-tiazo!ina-4-carboxílico, Ácido 5-Aminovalérico (5-Ava), Ácido 6-Aminohexanoico (6-Ahx), Ácido 8-Aminooctanoico (8-Aoc), Ácido 1 1 -Aminoundecanoico (1 -Aun), Ácido 12-Aminododécanoico (12-Ado), Ácido 12-Aminobenzoico (2-Abz), Ácido 3-Aminobenzoico (3-Abz), Ácido 4-Aminobenzoico (4-Abz), Ácido 4-Amino-3-hirdoxi-6-metilheptanoico (Estatina, Sta), Ácido Aminooxiacético (Aoa), Ácido 2-Aminotetralina-2-carboxílico (Ate), Ácido 4-Amino-5-ciclohexil-3-hidroxipentanoico (ACHPA), para-Aminofenilalanina (4-NH2-Phe), Bifenilalanina (Bip), para-Bromofenilalanina (4-Br-Phe), orto- Clorofenilalanina (2-Cl-Phe), mefa-Clorofenilalanina (3-CI-Phe), para-Clorofenlalanina (4-CI-Phe), /nefa-Clorotirosina (3-CI-Tyr), para-BerizoilfeniJalanina (Bpa), ferf-Butilglicina (Tle), Ciclohexiialanina (Cha), Ciclohexilglicina (Chg), Ácido 2,3-Diaminopropiónico (Dpr), Ácido 2,4-Diaminobutírico (Dbu), 3,4-Diclorofenilalanina (3,4-C|2-Phe), 3,4-Difluorofenilalanina (3,4-F2-Phe), 3,5-Diyodotirosina (3,5-12-Tyr), orto-fluorofenilalanina (2-F-Phe), meia-Fluorofenilalanina (3-F-Phe), para-Fluorofenilalanina (4-F-Phe), mefa-fluorotirosina (3-F-Tyr), Homoserina (Hse), Homofenilalanina (Hfe), Homotirosina (tlR), 5-Hidroxitriptofan (5-OH-Trp), Hidroxiprolina (Hyp), para-Yodofenilalanina (4-l-Phe), 3-Yodotirosina (3-l-Tyr), Ácido indolina-2-carboxílico (Idc), Ácido Isonipecótico (Inp), meía-metiltirosina (3-Me-Tyr), 1 -Naftilalanina (1 -Nal), 2 Naftilalanina (2-NaI), para-Nitrofenilalanina (4-N02-Phe), 3-Nitrotirosina (3-N02-Tyr), Norleucina (Nle), Norvalina (Nva), Ornitina (Orn), orto-Fosfotirosina (H2P03-Tyr), Ácido Octahidroindol-2-carboxílico (Oic), Penicillamina (Pen), Pentafluorofenilalanina (F5-Phe), Fenilglicina (Phg), Ácido Pipecólico (Pip), Propargilglicina (Pra), Ácido Piroglutámico (pGlu), Sarcosina (Sar), Ácido Tetrahidorisoquinolina-3-carboxílico (Tic), y Ácido Tiazolidina-4-carboxílico (Tioprolina, Th). La estereoquímica de aminoácidos puede designarse al preceder el nombre o abreviatura con la designación "D" o "d", o "L" o ?" según sea adecuado. Adicionalmente, los aminoácidos a/V-alquilatados pueden emplearse, así como también los aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amina (tales como Lys y Orn) en donde la amina se ha acilatado o alquilatado. Los péptidos de la invención pueden incluir la fórmula general P*-Y*-X1*-L* (S EQ I D N 0: 1 ) en donde P* es prolin a o un derivado no natural de prolina, Y* es una tirosina o u n derivado no natu ral de la m isma , Xi * es glicina o ácido aspártico, o un derivado no natural de glicina o ácido aspártico, y L* es leucina o u n derivado no natural del mismos. Típicamente , al menos u no de P*, Y*, Xi *, o L* es u n de rivado no natu ral del aminoácido respectivo . Por ejemplo, X-i* puede ser glicina o ácido aspártico, L* puede ser leucina, en al menos uno de P* o Y* puede ser un derivado no natural, tal como hidroxiprolina o una tirosina sustituida en la posición 3 con F, Cl , Br, I o N02. Un peptido de la invención también puede incluir la fórmula general X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6 (SEQ ID NO:2), en donde: P* es una prolina o un derivado no natural de la misma; Y* es una tirosina o un derivado no natural de la misma; Xi es W, Y, F , S , Bip , Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, Dopa e2, nTyr, dW, d F, F(3/4*), o Y(3*). F(3/4*) puede ser una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción tal como CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN , F, Cl, Br, I, Et, o OMe. Y(3*) puede ser una tirosina sustituida en la posición 3 con una porción tal como F, Cl, Br, I, y N02. X2 puede ser E, H , d E, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr, y Th; X3 puede ser G y D; X4 puede ser H , F, Y, o W; X5 puede ser I , L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, NIe, TIe, Nval, Phg, Cha, Taz, Fuá, Th, 4-Pal, o F(3/4*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción tal como CF3 l Et, iPr, y OMe; X6 puede ser N, Q, I, L o V, o no se presenta. Típicamente, al menos uno de Xt , X2, X5, P* y Y* es un derivado no natural de un aminoácido. Por ejemplo, P* puede ser prolina y Y* puede ser un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción tal como F, Cl, Br, I, o N02. Alternativamente, P* puede ser una forma un enlace disulfuro bajo condiciones no reductores. Otro ejemplo de un peptido que puede unir la fibrina incluye la fórmula general C-P*-Y*-X,-L-C (SEQ ID NO: 3), en donde X! es G o D, P* es prolina o su derivado no natural 4-hidroxiprolina; Y* es una tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción tal como F, Cl, Br, I, o N02. Típicamente, al menos uno de P* o Y* es un derivado no natural del aminoácido respectivo. Por ejemplo, el peptido puede tener las siguientes secuencias: W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q^ (SEQ ID NO:4), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-0 (SEQ ID NO: 5), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 6), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO: 7), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 8), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 9), Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 10), W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO: 1 1), F(4-OMe)-H-C-P-(4-OH)-Y-(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-0 (SEQ ID NO: 13), W-dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 15), y F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 16). Tales péptidos pueden formar enlaces de disulfuro bajo condiciones no reducto ras. De acuerdo a los métodos de síntesis estándares tales como aquellos descritos en WO 01 /09188 o en WO 01 /08712, los péptidos que tienen la secuencia establecida en la Tabla 1 se sintetizaron (estructura confirmada por espectrometría de masa), se ciclizaron, y se ensayaron para afinidad para el fragmento DD(E) de fibrina. Cada peptido se encontró que tenía Kd<1 0 µ? ("-" indica la truncacion). TABLA 1 d(n ) vs. Xi X2 C P(4-OH) Y* Xs L C X4 X5 e DD(E) <0.1 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-CI) D L c H 1 L <0.1 F(4-O e) H c Hyp Y(3-C!) D L c H 1 <0.1 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-|) D L c H Bpa <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H Hfe <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H Bpa <0.1 Y(3-CI) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 Y D-E c Hyp Y(3-CI) G L c W 1 Q <0.1 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L c H 1 L <0.1 F(4-OMe) H(Bzl) c Hyp Y(3-CI) D L c H Bpa <0.1 F H c Hyp Y(3-Cl) D L c H 1 <0.1 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 3Pal H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 4Pal H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F(4-F) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 Y(3-1) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 L <0.1 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-CI) D L c H Bpa L <0.1 F(4-O e) H c Hyp Y(3-l) D L c H Bpa L <0.1 F H(BZI) c Hyp Y(3-CI) D L c H 1 L <0.1 1Nal H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 Tyr H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F(4-O e) H(Bzl) c Hyp Y(3-l) D L c H Bpa <0.1 F(4-0Me) H(Bzl) c Hyp Y(3-CI) D L c H 1 <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c 3-Pal 1 <0.1 F(4-l) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F(4-Br) H c Hyp Y(3-I) D L c H 1 0.1 F(4-Me) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F(4-CF3) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 F(4-CN) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 Y(3-N02) H c Hyp Y(3-l) D L c H 1 <0.1 Y(2-F) H C Hyp Y(3-l) D L C H I <0.1 F(4-CH2NH2) H C Hyp Y(3-l) D L C H I <0.1 F-(4-NH2) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F(34-F2) H c Hyp Y(3-l) D L c H l <0.1 DopaMe2 H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F(2-0Me) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F(3-Me) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H F(3-CF3) <0.1 F(3-CF3) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F(3-0Me) H c Hyp Y(3-l) D L c H I 0.1 Hfe H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 nTyr H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 W E c Hyp Y(3-CI) G L c W I Q <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H I L <0.1 F H c Hyp Y(3-CI) D L c H I L <0.1 F(4-O e) H(Bzl) c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H Nle <0.1 F H c Hyp Y(3-I) D L c H Tle 0.1 F H c Hyp Y(3-I) D L c H F(4-CF3) <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H Bip <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H F(4-Et) <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H F(4-0Me) <0.1 F H c Hyp Y(3-l) D L c H F(3-OMe) <0.1 F(F5) H c Hyp Y(3-l) D L c H I <0.1 F H c Hyp Y(3-F) D L c H I L <0.1 W E c Hyp Y(3-CI) G L c W I Q <0.2 T ¦ D-E c Hyp Y(3-CI) G L c W i Q <0.2 F H c P Y(3-CI) D L c H I L <0.2 Y(26-Me) H c Hyp Y(3-D D L c H I <0.2 W E c Hyp Y(3-CI) G L c H I Q <0.2 D-F- D-E c Hyp Y(3-CI) G L c W I Q <0.2 Y E c Hyp Y(3-CI) G L c Y I Q <0.2 W E c Hyp Y(3-CI) G L c F I Q <0.2 H D-E c Hyp Y(3-CI) G L c W I Q <0.2 F H c Hyp Y(3-D D L c H I L <0.2 W E C P Y G L C W 1 Q <0.2 F H C Hyp Y(3-l) D L C ? NVal <0.2 F H C Hyp Y(3-l) D L C ? Phg <0.2 F H C Hyp Y(3-l) D L C ? F(3- e) <0.2 F H C Hyp Y(3-l) D L C 4-Pal I <0.2 S D-E C Hyp Y(3-CI) G L C W 1 Q <0.3 w E C Hyp Y(3-CI) G L C Y 1 Q <0.3 Y E C Hyp Y(3-CI) G L C w 1 Q <0.3 F D-E C Hyp Y(3-CI) G L C w 1 Q <0.3 F H C P Y D L C H 1 L <0.3 F H C Hyp Y(3-l) D L C H 1 L <0.3 F H C Hyp Y D L C H Bpa <0.4 F H C Hyp Y(3-CI) G L C H i L <0.4 S(Bzl) H C P Y D L C H 1 L <0.4 H E C Hyp Y(3-CI) G L C H 1 Q <0.4 F(4-O e) H C Hyp Y D L C H 1 L <0.4 F H C Hyp Y(3-D D L C Bpa 1 <0.4 Ad H C Hyp Y(3-l) D L C H 1 <0.5 F H C Hyp Y(3-CI) F L C H 1 L <0.5 F E C Hyp Y(3-CI) G L C W 1 Q <0.5 F H C Hyp Y(3-CI) 2-Nal L C H 1 L <0.5 F H C Hyp Y D L C H 1 L 0.5 Hfe H c Hyp Y D L C H I L <0.5 Bip H c Hyp Y D L C H 1 L <0.5 W E c P Y G L C W 1 Q <0.5 F(4-OMe) W c Hyp Y(3-l) D L C H 1 <0.5 F H c Hyp Y(3-l) D L C 2Pal 1 <0.5 F H c Hyp Y(3-D D L C Taz Taz <0.5 F H c Hyp ?(3-?) D L G Dht Dht <0.5 Gu H c Hyp ?(3-?) D L C H H Un peptido también puede tener la fórmula general C-D-Y-Y-G-T-C-Xto (SEO. ID NO: 17), en donde X 0 es n(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-difluoro), Amh, Hfe, Y(3,5-di-yodo), Pff, 1 Nal, dI Nal, o MeL, en donde F(4*) es una fenilalanina sustituida en la posición 4 con una porción tal como Et, CF3, I, o ¡Pr. En algunas modalidades, un peptido puede incluir residuos adicionales, ?1t P*, y/o Xn, para proporcionar la fórmula general: C-D-Y-Y-G-T-C-X10-Xn (SEQ ID NO: 18) o X^P^C-D-Y-Y-G-T-C-X^-X (SEQ ID NO:26), en donde X, es cualquier aminoácido no natural o natural, P* es prolina o un derivado no natural del mismo, y Xn es D, dD, ß?, Inp, Nip, Me-D, Cop, o Cmp. Por ejemplo, un peptido puede tener la secuencia de L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(decil)G-dD (SEQ ID NO: 19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(Decil)G-D (SEQ ID NO: 20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID NO: 21), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID NO: 22), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-lnp (SEQ ID NO: 23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C- eL-Cmp (SEQ ID NO: 24), o L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID NO: 25). Los péptidos que tienen la fórmula de SEQ ID NO: 26 se sintetizaron (estructura confirmada por espectrometría de masa) de acuerdo a los métodos de síntesis estándares, tales como aquellos descritos en WO 01/09188 o en WO 01/08712, y se ensayaron para afinidad para el fragmento DD(E) de fibrina. Cada peptido se encontró que tenía un Kd<10 µ? (Tabla 2). TABLA 2 Cha Bip D La habilidad de los péptidos para unir un objetivo tal como HSA o fibrina puede valorarse mediante metodología conocida. Por ejemplo, la afinidad del péptido para fibrina puede valorarse utilizando el fragmento DD(E) de fibrina, que contiene subunidades de 55 kD (Fragmento E) y 190 kD (Fragmento DD). El fragmento DD(E) puede biotinilarse e inmovilizarse por medio de avidina para un sustrato sólido (por ejemplo, una lámina de múltiples cavidades). Los péptidos pueden incubarse con el fragmento inmovilizado DD(E) en un regulador adecuado y la unión se detecta utilizando metodología conocida. Ver, por ejemplo, WO 01 /091 88. Enlazador y subunidades enlazadoras de Terminál C y N Si se presentan, los enlazadores y las subunidades enlazadoras se utilizan para unir covalentemente las porciones cubiertas tales como quelatos, trombolíticos, y otros grupos a los dos extremos de un péptido. Una porción de subunidad de enlazador puede (i) convertir ya sea la funcionalidad del carboxilato de terminal C en un grupo funcional amina o la amina de terminal N en un grupo funcional carboxilato; o (ii) proporcionar una porción separadora o grupo entre la terminal del péptido y el enlazador, si se presenta, un grupo cubierto. En una modalidad, un péptido puede reaccionar con una subunidad de enlazador para formar un péptido modificado que tiene un grupo funcional amina de terminal C y un grupo funcional amina de terminal N. En otra modalidad, un péptido puede reaccionar con una subunidad de enlazador para formar un péptido modificado que tiene un grupo funcional carboxilato de terminal N y un grupo funcional carboxilato de terminal G. En otra modalidad, un péptido puede sintetizarse de una subunidad de enlazador de terminal C que se une a una resina, mediante lo cual en la división del péptido de la resina, un péptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C, se produce. Todavía en otra modalidad, una subunidad de enlazador puede utilizarse como un grupo separador y no para cambiar el grupo funcional terminal. Una subunidad de enlazador puede tener múltiples grupos funcionales para la unión de las porciones enlazadoras o porciones cubiertas. Varios tipos de reacciones pueden utilizarse, incluyendo la acilación, aminación reductiva, reacciones de desplazamiento nucleofílico, formación de urea, formación de tiourea, y ligación quimioselectiva en la conjugación de manera química de la subunidad de enlazador para el péptido, enlazador, y/o porciones cubiertas. Una ventaja de utilizar una subunidad de enlazador es crear grupos funcionales similares en el péptido, facilitando de tal modo la síntesis subsecuente. La porción enlazadora puede utilizarse para unir covalentemente una o más porciones cubiertas a la terminal de péptido. El enlazador puede ramificarse o no ramificarse y puede comprender múltiples grupos funcionales para el quelato precursor y unión de quelato. La estructura química del enlazador puede afectar las propiedades farmacológicas y físicas del agente de contraste, tal como afinidad, estabilidad, duración media de sangre, relajación, y unión de proteína de plasma. Los enlazadores pueden sustituirse con grupos alquilo, arilo, alquenilo o alquinilo. Los enlazadores, si se presentan, en cada terminal, típicamente son relativamente pequeños y rígidos para los agentes de contraste MRI. Por ejemplo, un enlazador puede tener un peso molecular menor a aproximadamente 350 (por ejemplo, menor a aproximadamente 200). Un ejemplo de una porción de subunidad de enlazador de terminal C y una enlazadora de terminal N se ilustra en la siguiente estructura: Enlazador Enlazador El carboxilato de terminal C de un peptido puede convertirse en un grupo funcional amina en cada extremo al cual puede unirse la porción enlazadora restante. Los ejemplos de tales péptidos modificados para tener un grupo funcional amina de terminal C son: Enlazador en donde n= 1 a 4 Varias subunidades enlazadoras de terminal C de diamina pueden derivarse de manera conveniente de una resina de fase sólida: Las siguientes resinas (R) se encuentran cofnercialmente disponibles de Nova Biochem: En algunos casos, las siguientes subunidades enlazadoras pueden emplearse como grupos separadores en el grupo funcional amina de terminal N: en donde la "Base" es una base de pirimidina o purina ("Ad"=adenosina, "Gu^guanosina, Th"=timina, "Cy^citosina) y "LG" es un grupo de salida tal como OH, éster activado, haluro, o anhídrido. Adicionalmente, pueden emplearse aminoácidos aN-alquilatados, así como también aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen aminas (tales como Lys y Orn) en donde la amina se ha acilatado o alquilatado como en los siguientes ejemplos: en donde n es un entero de 0 a 3, R es cualquier grupo aromático o alifático, y LG es un grupo de salida tal como OH, éster activado, haluro y anhídrido. Todavía más subunidades enlazadoras incluyen lo siguiente: en donde n es independientemente 1 o 2, R es cualquier grupo aromático o alifático, y LG es un grupo de salida tal como OH, éster activado, haluro, y anhídrido. Los ejemplos de porciones enlazadoras que son útiles cuando se sigue una estrategia de construcción de enlace amida en donde una molécula de péptido tiene dos grupos amina terminales incluyen lo siguiente: en donde cada m es independientemente un entero de 1 a 4, n es independientemente un entero de 0 a 4 inclusive, LG es un grupo de salida, y R' o R" son independientemente hidrógeno o un grupo protector químico. Una porción enlazadora también puede tener puntos ramificados para la unión de más de dos quelatos. Por ejemplo, cuando se sigue una estrategia de formación de enlace amida, un enlazador que incluye un carbonilo con un grupo de salida LG (por ejemplo, un ácido carboxílico o un éster activado) y tres o más aminas protegidas puede reaccionar con una amina de péptido para crear una molécula con tres o más aminas terminales. Los siguientes reactivos enlazadores de base de carbonilo pueden ser adecuados para introducir tres o más grupos funcionales amina: R T R2 R R2N NR1RZ en donde LG es un grupo de salida (por ejemplo, -OH, éster activado tal como pentafluorofenol (Pfp), N-hidroxisuccinimida (NHS), Sal Sódica de N-hidroxisulfosuccinimida (NHSS), 2-tioxotiazolidin-1 -il, o hirdoxibenzotriazola (HBT) y R1 y R2 preferentemente son independientemente hidrógeno o un grupo protector químico (por ejemplo, Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo, bencilo, o alilo). En otras modalidades, un grupo funcional amina en la terminal N de un péptido puede convertirse en un grupo funcional carboxilato de terminal N mediante la reacción con un anhídrido de ácido cíclico (porción de subunidad de enlazador) produciendo de tal modo un péptido modificado con un grupo funcional carboxilato de terminal N: Nrtz-Pepüdo-OOiH + carboxilatos terminales Los ejemplos de otras subunidades enlazadoras que pueden utilizarse para convertir una amina de terminal N en un grupo funcional carboxilato incluyen: subunidades en donde R es cualquier grupo aromático o alifático.
Por consecuencia, ambos carboxilatos terminales en los ejemplos anteriores pueden reaccionar simultáneamente con un grupo amino sobre una porción enlazadora según se muestra abajo para formar un agente de representación por imágenes MR precursor. En este ejemplo, el agente de representación por imágenes MR precursor es una molécula de péptido derivada con enlazadores en ambos enlaces amida directos terminales: Los ejemplos específicos de porciones enlazadoras adicionales útiles para producir agentes de representación por imágenes MR precursores que terminan con dos carboxilatos son: ? en donde cada m es independientemente 1 a 4 inclusive, n es independientemente 0 a 4 inclusive (por ejemplo, n=1 o 2), y R es hidrógeno o un grupo protector químico adecuado, tal como metilo, etilo, bencilo, o t-butilo. En estos ejemplos, siguiendo la unión de las subunidades enlazadoras, los grupos protectores pueden removerse y las porciones quelantes precursoras o quelantes pueden unirse a través de métodos estándares, por ejemplo, formación de enlace amida. Cuando se sigue una estrategia de construcción de enlace amida en donde una molécula de péptido se termina con dos carboxilatos, los siguientes reactivos enlazadores pueden ser adecuados para introducir tres o más grupos funcionales amina: en donde R y Rz son independientemente hidrógeno o un grupo protector químico tal como OS, Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo, bencilo, o alilo. Las estrategias de enlazador que incluyen la formación de enlaces amida son útiles debido a que típicamente son compatibles con los grupos protectores en el péptido. Según se menciona anteriormente, el péptido, enlazador, y subunidades enlazadoras pueden unirse covalentemente entre sí por formación de otros tipos de enlace (por ejemplo, desplazamiento nucleofílico, aminación reductiva y formación de tiourea). Los enlazadores también pueden tener efectos sobre las propiedades de los agentes de contraste tales como afinidad , propiedades farmacocinéticas, estabilidad ¡n vivo, y relajación. Alternativamente, un conjugado covalente que incluye tanto una porción enlazadora como una porción precursora quelante o quelante puede reaccionar directamente con un péptido con funcionalidad terminal adecuada. Un ejemplo de tal conjugado covalente capaz de reaccionar con los grupos carboxilato terminales sigue: de Quelato en donde n=1 a 4, y R1 , R2, R3, R4, y R5 son independientemente un grupo acetato, grupo aeetamida, o un grupo acetoxi. Otro ejemplo de tal conjugado covalente tiene la siguiente estructura: Enlazador en donde R1, R2, R3, R4, y R5 son independientemente un grupo acetato, grupo acetamida, o un grupo acetoxi. Un ejemplo de un conjugado covalente útil para convertir un péptido modificado con grupos funcionales carboxilato en las dos terminales en un agente de representación por imágenes precursor tiene la siguiente estructura: Los ejemplos de conjugados covalentes capaces de reaccionar con los grupos funcionales amina sobre un péptido modificado son: de Quelato precursor en donde LG es un grupo de salida, n=1 a 4, y R1 , R2, R3, R4, y R5 son independientemente un grupo acetato, grupo acetamida, o un grupo acetoxi, y en donde LG es un grupo de salida, en donde R1, R2, R3, R4, y R5 son independientemente un grupo acetato, grupo acetamida, o un grupo acetoxi. Un conjugado covalente particularmente útil para sintetizar un agente de contraste multímero tiene la siguiente estructura, de aquí en adelante "Synthon #1 ": Otra modalidad de un conjugado covalente útil para sintetizar o tiene la siguiente estructura, de aquí en adelante, "Synthon En el siguiente ejemplo de un agente de contraste MRI de la invención que incluye un péptido según se señala anteriormente, el efecto del enlazador de terminal N sobre la relajación de los agentes de contraste MRI se ¡lustra: Enlazador Enlazador En este ejemplo, "quelato" se refiere a bb-DTPA-Gd(lll). La "subunidad de enlazador" anterior varió con los siguientes resultados (las relajaciones por ión Qd(J I I) se determinaron a 20 MHz y 35°C, las unidades son mM"V1): Afinidad dé Subunidad de Relajación Relajación Fibrina enlazador de PBS Fibrina DD(E) Terminal N (10 mg/mü Estructura 15 1 1 .7 18.7 Ki = 4.0 µ? o Estructura 16 12.6 29.5 K¡ = 3.4 µ? Estructura 32 (enlace directo) 12.5 21 .6 Ki = 4.7 µ Según se muestra anteriormente, las estructuras 15 y 16 son similares a la 32 excepto por las diferentes subunidades enlazadoras de terminal N. Los resultados experimentales muestran que un enlazador puede afectar la relajación, así como también otras características de un agente de contraste de la invención. Porciones Quelantes y Reactivos Las porciones quelantes son ligantes quelantes complejados con iones metálicos. Estas porciones quelantes contienen una porción sintética capaz de formar un punto de unión para el enlazador, subunidad de enlazador, y/o péptido modificado. Una o más porciones quelantes pueden conjugarse covaientemente al grupo funcional en cada terminal del péptido modificado. En una modalidad, el queiato se une a una subunidad de enlazador. En otra modalidad , el quelato se une a una porción enlazadora. En otras modalidades, el quelato puede conjugarse con una porción enlazadora para formar un conjugado covalente antes de unir el conjugado covalente al péptido modificado. Las porciones quelantes precursoras son ligantes quelantes que no se han complejado con iones metálicos. Los ligantes quelantes pueden tener grupos protectores o pueden ser precursores para los ligantes quelantes. Las porciones quelantes precursoras tienen una porción sintética capaz de formar un punto de unión para el enlazador, subunidad de enlazador, y/o péptido modificado. Las porciones quelantes precursoras pueden convertirse en porciones quelantes al complejarse con un ión metálico. Una o más porciones quelantes precursoras pueden conjugarse covalentemente en el grupo funcional en cada terminal del péptido modificado. En una modalidad, el quelato precursor puede unirse a una subunidad de enlazador. En otra modalidad, el quelato precursor se une a una porción enlazadora. En otras modalidades, el quelato precursor puede conjugarse con una porción enlazadora para formar un conjugado covalente antes de unir el conjugado covalente al péptido modificado. Las porciones de quelato precursor y porciones de quelato de acuerdo a fa invención pueden tener cualquiera de las siguientes estructuras: en donde X es un grupo donador de electrón heteroátomo capaz de coordinar un catión metálico, tal como O", OH, NH2, OPO32", NHR, o OR, en donde R es cualquier grupo alifático; R1 es una porción química sin cargar, seleccionada de h idrógeno , cualquier grupo alquilo, alifático, o grupo cicloalquilo, o versiones sustituidas sin cargar de los mismos (por ejemplo, alcoholes); y Y es una porción sintética (por ejemplo, capaz de formar un punto de unión, o de ser el punto de unión, para el grupo funcional del péptido modificado, enlazador, y/o subunidad de enlazador ya sea directamente o con una intervención de carbonilo, metileno, metileno-oxígeno, tiocarbonilo). Las porciones con (porción de quelato) o sin (porción de quelato precursor) un ión metálico coordinado, pueden utilizarse. Una variedad de ligantes quelantes pueden utilizarse en agentes de contraste de la invención. Tales ligantes quelantes incluyen, pero no limitándose a, derivados de DTPA, DOTA, NOTA, y D03A. Para MRI, los quelatos metálicos tales como dietilenotriaminapentaacetato de gadolinio (DTPA»Gd), tetraamina de gadolinio 1 ,4,7, 1 0-tetraazaciclododecano-?/, ?/', ? , ? ''-tetraacetato (DOTA*Gd) y gadolinio 1 ,4,7,10-tetraazaciclododecano-1 ,4,7-triacetato (D03A»Gd) son particularmente útiles. Los quelatos particularmente útiles incluyen bb(CO)DTPA»Gd. Otros metales pueden sustituirse por Gd(lll) en aplicaciones de MRI. Los ejemplos de quelatos funcionalizados que se han sintetizado para el propósito de preparar quelatos multiméricos incluyen pNCS-Bz-DTPA [Martin, V. , et al. Bioconíuaate Chem. 6,616-23, 1995] y Gd(4-NCS-fenil)-amlno-carbonilmetiI-D03A [Ramachandran, R. et al. , Invest. Rad. 1998, 33(1 1 ), 779-797]. Para las propiedades de relajación óptima cuando se unen a un objetivo, es frecuentemente deseable minimizar el movimiento del quelato, y de ahí, un número mínimo de enlaces covalentes que unen el objetivo al ligante quelante, son deseables. El de abajo es un ejemplo de un reactivo que incluye un ligante quelante con un grupo carbonilo de elemento principal para conectarse a un grupo funcional amina o una subunidad de eniazador o eniazador, en donde "LG" es un grupo de salida (por ejemplo, un éster activado) y R representa un grupo que puede dividirse fácilmente para formar O" (-OtBu, por ejemplo, un éster de carboxilato) formando de tal modo un carboxilato con el grupo carbonilo cercano: grupo carbonilo unido al elemento principal del ligante quelante Se ha encontrado que el motivo químico de un carbonilo inmediatamente adyacente al ligante quelante constituye una clase de agentes de contraste MRI de alta relajación. La presente invención también se refiere a intermedios útiles en la síntesis de agentes de contraste para MRI de acuerdo a las siguientes fórmulas: én donde, R1 , R2, R3, R4, y R5 pueden ser cualquier ligante de acetilo sin proteger o protegido adecuado para formar un quelatq de un metal paramagnético con una constante de formación adecuada, incluyendo lo siguiente: en donde P es cualquier grupo protector, incluyendo grupos tert-butilo y benciló. LG es un "grupo de salida" y representa -OH y formas de éster del mismo incluyendo, ésteres HNS, pentafluorofenol, y otros ésteres activados. En una modalidad particularmente útil, LG es -OH, y R1, R2, R3, R4, y R5 son CHzCOzO^u, de aquí en adelante "Synthon #3", y tiene la siguiente estructura: Alternativamente, el siguiente reactivo puede utilizarse en la síntesis de agentes de contraste de la invención: La presente invención también proporciona métodos para elaborar compuestos. En particular, una nueva reacción de oxidación permite la fácil preparación de Synthon #3, una modalidad preferida de un ligante quelante. La síntesis de Synthon #3 puede lograrse a través de dos diferentes vías sintéticas, ambas comenzándose con hidroximetil-dietilenotriamina. Una vía incluye una secuencia de dos etapas sintéticas (alquilación, seguida por oxidación) y la otra incluye un proceso de seis etapas (protección, oxidación, esterificación, desprotección, alquilación e hidrogenolisis). Ambos producen Synthon #3 alto en qu ímica y pureza óptica (vide Ejemplos, abajo). La Patente de E.U. No. 5,637,759 describe una síntesis de Synthon #1 de ácido 2,3-diaminopropiónico y aza-lisina mediante un protocolo de hidrólisis selectiva con tiofenóxido de sodio. El método descrito en la presente evita el uso de este reactivo tóxico. Síntesis de Agentes de Contraste La síntesis de los agentes de contraste a base de péptido puede llevarse a cabo en las siguientes etapas. Primero, un péptido objetivo puede sintetizarse con o sin una subunidad de enlazador de terminal N, típicamente utilizando síntesis de péptido de fase sólida. Para péptidos cíclicos descritos en la presente, un péptido lineal protegido puede ciclizarse en solución o sobre la resina. El péptido sin proteger también puede ciclizarse en solución o sobre la resina. Una subunidad de enlazador de terminal C puede derivarse convenientemente de la resina de síntesis de fase sólida y un enlazador de terminal N o subunidad de enlazador de terminal N pueden acoplarse al péptido durante la síntesis de fase sólida. Típicamente, siguiente a la ciclización, las porciones precursoras de enlazador-subunidad-quelato se acoplaron al péptido. Los grupos protectores se removieron para proporcionar los precursores de ligante, y después se prepararon los quelatos. Los compuestos radionúclidos de esta invención se prepararon de precursores de ligante utilizando radionúclidos comercialmente disponibles (por ejemplo, 99mTc de Nycomed Amersham Boston # cat. RX-290195, 111 ln de NEN Life Science Products # cat. NEZ304, o 153Gd de NEN Life Science Products # cat. NEZ142) por reacción en medio acuoso, típicamente a pH 4-6 por 1 hora. En el caso de agentes de contraste ópticos, un tinte orgánico puede sustituirse por un precursor de quelato. Estructura de los Agentes de Contraste: - 85 - - 86 - ?? - 88 - ?? - 90 - ?? ?? 20 25 20 25 ?? - 96 - ?? - 98 - Propiedades de los Agentes de Contraste Los compuestos de esta invención pueden ser más estables con respecto a la degradación por enzimas endógenas que el peptido principal (es decir, el peptido sin cualquiera de los quelatos unidos), un peptido con uno o más quelatos unidos a la terminal N , o un peptido con uno o más quelatos unidos a la terminal C. Para estimar la estabilidad in vivo, los compuestos de prueba pueden incu barse con homogenatos de h ígado de rata. Después de los intervalos seleccionados, las reacciones pueden enfriarse rápidamente y centrifugarse, y el sobrenadante puede analizarse por espectrometría de masa de cromatografía líquida para cuantificar la cantidad del compuesto restante. Los compuestos de la invención también puede unir un objetivo tal como albúmina de suero humana o fibrina. Por ejemplo, al menos 10% (por ejemplo, al menos 50%, 80%, 90%, 92%, 94%, o 96%) del agente de contraste puede unirse al objetivo deseado en concentraciones fisiológicamente relevantes de fármaco y objetivo. El grado de unión de un agente de contraste a un objetivo, tal como HSA o fibrina, puede valorarse por una variedad de métodos de unión de equilibrio. Por ejemplo, la unión a HSA puede medirse por ultrafiltración. Para medir la unión a la fibrina, un coágulo de fibrina puede formarse en una pared de una lámina de microconcentración y contactarse con el grupo de objetivo. Después de un tiempo de incubación suficiente para establecer el equilibrio, el sobrenadante se remueve por aspiración (la fibrina insoluble permanece unida como un coagulo gelificado en la parte inferior de la cavidad). La concentración de grupo de objetivo sin unir en el sobrenadante se mide así. En ambas metodologías, la concentración del agente de contraste unido se determina como la diferencia entre la concentración de grupo de objetivo total inicialmente presente y la concentración de grupo de objetivo sin unir siguiente al ensayo de unión. La fracción unida es la concentración del grupo de objetivo unido dividido por la concentración de grupo de objetivo total. Los compuestos de la invención pueden mostrar alta relajación como resultado de la unión de objetivo (por ejemplo, a fibrina), lo cual puede conducir a mejor resolución de imagen. El aumento en la relajación en la unión es típicamente 1 .5 pliegues o más (por ejemplo, al menos un aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 pliegues en relajación). Los agentes de contraste de objetivo que tienen 7-8 pliegues, 9-10 pliegues, o aún más de 1 0 pliegues de aumentos en relajación, son particularmente útiles. Típicamente, la relajación se mide utilizando un espectrómetro NMR. La relajación preferida de un agente de contraste MRI a 20 Hz y 37°C es al menos 10 mM-ls-1 por ión metálico paramagnético (por ejemplo, al menos 15, 20, 25, 30, 35, 40, o 60 mM-1s-1 por ión metálico paramagnético. Los agentes de contraste que tienen una relajación mayor a 60 mM-1 s-1 a 20 MHz y 37°C son particularmente útiles. Según se describe en la presente, los agentes de contraste de objetivo pueden mostrar un aumento en la toma de coágulo. La especificidad de la toma de agentes de objetivo de fibrina puede determinarse al comparar la toma del agente por coágulos sanguíneos a la toma por sangre. Ver Ejemplo 11 para más detalles. La especificidad de agentes de contraste de objetivo de fibrina también puede demostrares utilizando MRI y observando mejora de señal de coágulo, Uso de Péptidos y Agentes de Contraste de la Invención Los péptidos de la invención pueden utilizarse para mejorar las terapias para tratar la enfermedad tromboembólica. La terapia trombolítica actual tiene limitaciones, incluyendo un riesgo significante de sangrado, falla para restaurar el flujo sanguíneo, reoclusión trombótica después de una cesación de terapia, y un retardo entre el inicio de la terapia y la lisis del coágulo. Un índice terapéutico mejorado puede lograrse al conjugar un peptido de objetivo de fibrina de la invención en un agente trombolítico (por ejemplo, un trombolítico de proteína tal como activadores de plasminogen de origen bacteriano o humano). Tales conjugados pueden activar el plasminogen localmente o aumentar los niveles endógenos de tPA. Por ejemplo, un peptido de objetivo de fibrina puede conjugarse para activadores de plasminogen humanos incluyendo activador de plasminogen tipo tejido recombinante (tPA), prouroquinasa y uroquinasa (ambas únicas y dos formas de cadena), activador de plasminogen derivado de bacteria que incluye estreptoquinasa, estafiloquinasa, y activadores de plasminogen derivado de animal, incluyendo activador de plasminogen de murciélago. Además, los péptidos de objetivo de fibrina pueden conjugarse para fibrinolíticos tales como fibrolasa de víbora barrilera, que muestra actividad fibrinolítica directa. Tales enzimas y proteínas pueden obtenerse comercialmente, extraerse de fuentes naturales o tejidos, o prepararse recombinantemente. Las composiciones de la invención pueden unirse o fusionarse en maneras conocidas, utilizando el mismo tipo de enlazadores anteriormente discutidos con respecto a la construcción de agentes de contraste RL La conjugación en una proteína puede lograrse mediante técnicas químicas estándares que incluyen la formación de enlaces amida, éster, dísulfuro, y tioéter. Por ejemplo, un peptido de unión de fibrina puede unirse covalentemente, ya sea directamente o a través de un enlazador, a una proteína al formar un enlace amida entre el peptido de unión fibrina o el enlazador y residuos de lisina sobre la superficie de la proteína. Estos residuos de lisina de superficie usualmente se encuentran distantes del sitio catalítico de la enzima. Por lo tanto, las porciones atadas no interfieren con la actividad catalítica de la enzima. La múltiple ligación puede lograrse en una etapa única. La proporción del peptido de objetivo de fibrina al agente fibrinolítico o trombolítico puede controlarse al ajustar la estequiometría de la química de ligación. La múltiple ligación es particularmente útil en el caso de un. ligante de unión de fibrina moderadamente fuerte debido a que la afinidad de unión superior puede realizarse a través del efecto tan llamado "fuerza". En particular, un agente de acoplamiento o un éster activado puede utilizarse para lograr la formación de enlace amida entre la lisina y la porción de unión de fibrina o el enlazador. El esquema de abajo muestra un ejemplo de una molécula híbrida formada mediante ligación química de uroquinasa para péptidos de unión de fibrina múltiples por medio de porciones enlazadoras. El número de los residuos de lisina de superficie y el número de moléculas de unión de fibrina son ilustrativos. Alternativamente, el peptido de objetivo de fibrina puede incorporarse en la molécula híbrida utilizando la tecnología de ADN recombinante.
En algunas modalidades, los péptidos de la invención pueden unirse a un agente trombolítico con un enlazador que comprende un sitio de división enzimática, un sitio de división enzimática normalmente dividido por enzimas en la cascada de coagulación, tal como Factor Xa, trombina, o sitios de división de plasmina, etc. El agente trombolítico no se activa hasta que se divide de las composiciones de unión de coágulo de la invención en el sitio del coágulo, el riesgo de casos de sangrado no deseado en sitios distantes del coágulo, podría minimizarse. Además, las porciones trombolíticas pueden unirse a un agente de contraste multimérico de objetivo de peptido de tal forma que un coágulo puede identificares, representarse por imágenes y disolverse. Los agentes de contraste preparados de acuerdo á las descripciones en la presente pueden utilizarse en la misma manera que los agentes de contraste MRI y son útiles para la diagnosis de la trombosis de vena profunda, embolia pulmonar, trombosis coronaria, trombosis intracraneal y carótida, trombosis ventricular y atrial, trombosis de arco aórtico, y alto riesgo de placa. Cuando se representa por imágenes un trombo, ciertas técnicas MR y secuencias de pulso pueden preferirse para mejorar el contraste del trombo en comparación a la sangre inferior y tejidos. Estas técnicas incluyen , pero no se limitan a, secuencias de angiografía de sangre negra que buscan elaborar oscuridad en la sangre, tal como secuencias eco de giro rápido y secuencias eco de gradiente deteriorado por flujo. Estos métodos también incluyen técnicas independientes de flujo que mejoran la diferencia en contraste debido a la diferencia TI entre el trombo mejorado por contraste y la sangre y el tejido, tal como las secuencias preparadas de inversión-recuperación preparación o preparadas de saturación-recuperación que aumentarán el contraste entre el trombo y los tejidos superficiales. Los métodos de preparación para las técnicas T2 también pueden probarse útiles. Finalmente, las preparaciones para las técnicas de transferencia de magnetización también pueden mejorar el contraste con los agentes de la invención. Las composiciones de la invención, incluyendo las propiedades, péptidos conjugados en trombolfticos, y agentes de contraste multiméricos de objetivo de peptido, pueden formularse como una composición final de acuerdo con los procedimientos rutinarios. Según se utiliza en la presente, los compuestos de la invención pueden incluir derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. "Farmacéuticamente aceptable" significa que el compuesto o la composición puede administrares a un animal sin efectos adversos inaceptables. Un "derivado farmacéuticamente aceptable" significa cualquier sal farmacéuticamente aceptable, éster, sal de un éster, u otro derivado de un compuesto de esta invención que, en la administración a un recipiente, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto de esta invención o un metabolito activo o residuo del mismo. Otros derivados son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los compuestos de esta invención cuando tales compuestos se administran a un mamífero (por ejemplo, al permitir que un compuesto oralmente administrado se absorba más fácilmente en la sangre) o que mejoran el suministro del compuesto principal en un compartimiento biológico (por ejemplo, el cerebro o sistema linfático) aumentando de tal modo la exposición relativa a las especies principales. Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de esta invención incluyen contra iones derivados de ácidos orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables y bases conocidas en la materia. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse por cualquier ruta, incluyendo tanto la administración parenteral como oral. La administración parenteral incluye, pero no se limita a, administración subcutánea, intravenosa, intraarterial, intersticial, intratecal, e intracavidad. Cuando la administración es intravenosa, las composiciones farmacéuticas pueden darse como un bolo, como dos o más dosis separadas en tiempo, o como una infusión de flujo no lineal o constante. De esta manera, las composiciones de la invención pueden formularse por cualquier vía de administración. Típicamente, las composiciones para la administración intravenosa son soluciones en regulador acuoso isotónico estéril. Cuando es necesario, fa composición también puede incluir un agente de soiubilización, un agente estabilizador, y un anestésico local tal como lidocaína para facilitar el dolor en el sitio de la inyección. Generalmente, los ingredientes se suministrarán ya sea por separado, por ejemplo, en un equipo, o se mezclaran juntos en una forma de dosis de unidad, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua. La composición puede almacenarse en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o saquito indicando la cantidad de agente activo en las unidades de actividad. Cuando la composición se administra por infusión, puede distribuirse con una botella de infusión que contiene "agua para inyección" de grado farmacéutico estéril, salina, u otros fluidos intravenosos adecuados. Cuando la administración se administrará por inyección , una ampolleta de agua estéril para inyección o salina puede proporcionarse de tal forma que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden los compuestos de la presente invención y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, con cualquier ingrediente, excipiente, vehículo, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable. Un agente de contraste se administra preferentemente al paciente en la forma de una composición inyectable. El método para administrar un agente de contraste es preferentemente de manera parenteral, significando intravenosamente, intra-arterialmente, intratecalmente, intersticialmente o de manera intracavidad. Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse a mamíferos incluyendo humanos en una manera similar a los otros agentes terapéuticos o de diagnóstico. La dosis a administrarse, y el modo de administración dependerá de la variedad de factores incluyendo edad, peso, sexo, condición del paciente y factores genéticos, y por último se decidirá por el personal médico subsecuente a las determinaciones experimentales de la dosis variante seguida por representación por imágenes según se describe en la presente. En general, la dosis requerida para la sensibilidad diagnóstica o eficacia terapéutica variará de aproximadamente 0.001 a 50,000 g/kg, preferentemente entre 0.01 a 25.0 µg/k de masa corporal huésped. La dosis óptima se determinará empíricamente siguiendo la descripción en la presente. Con respecto al tratamiento de las condiciones trombolíticas, ia cantidad del material administrado dependerá de la seriedad de la condición tromboembólica y posición y el tamaño del coágulo. La dosis precisa a emplearse y el modo de administración puede decidirse de acuerdo a las circunstancias mediante el tratamiento de supervisión del médico. En general, la dosis del conjugado de composición combinada/agente trombolítico seguirá las dosis que son rutinarias para el agente trombolítico solo, a pesar de que la afinidad mejorada para la unión de fibrina/coágulo agregada por las composiciones descritas en la presente pueda permitir una reducción en la dosis trombolítica estándar. Los trombolíticos particulares contemplados para utilizarse en esta terapia (con ejemplos de dosis y método de administración) són como sigue: Estreptoquinasa 1 -3 megaunidades durante 30 minutos a 3 hrs. Anistreplasa 30 unidades; 2-5 minutos de inyección tPA (tipo silvestre) 50-150 mg; infusión hasta por 6 hrs Uroquinasa de dos (40-100 mg); infusión hasta por 6 hrs cadenas Uroquinasa de cadena (scuPA) 3-12 megaunidades (30 única MG; infusión por hasta 5 hrs Derivados y activadores 20-100 mg; inyección o infusión de plasminogen híbrido Muteínas de activadores 10-100 mg; inyección o infusión de plasminogen La invención se describirá además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
EJEMPLOS La síntesis, caracterización, y uso de varias composiciones del agente de contraste de alta relajación de la invención se ilustrarán además en los siguientes ejemplos. Los parámetros específicos incluidos en los siguientes ejemplos se pretende que ilustren la práctica de la invención, y en ninguna manera limiten el alcance de la invención. Aquellos expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de cerciorares de no utilizar más experimentación rutinaria, varios equivalentes para las modalidades específicas y métodos descritos en la presente. Tales experimentos se pretende que se comprendan por el alcance de las reivindicaciones. Ejemplo 1 - Síntesis de los Agentes de Representación por imágenes MR en Base a Peptído: El peptído con porción de subunidad de enlazador unida a la terminal C (P-[porción de subunidad de enlazador]). El peptido sin proteger se preparó utilizando la estrategia Fmoc estándar y una resina de diaminotritilo. El peptido se ciclizó utilizando trifluoroacetato de talio en la resina o en la solución. Después de dividirse de la resina, el peptido no protegido se purificó por RP-H PLC (Columna C-1 8, H20/CH3CN/TFA). Porción de Enlazador: A una solución de Boc-Dpr(Boc)-OH. DCHA (1 eq.) y pentafluorofenol (1 .2 eq.) en diclorometano se agregó PS-carbodiimida (1 .2-1 .5 eq.). La mezcla se agitó por 3-5 h a temperatura ambiente. Después de que los resultados de la masa LC indicaron que la reacción se completó, la resina se removió por filtración y el solvente se evaporó bajo presión reducida para dar la Porción de Enlazador crudo (Boc-Dpr(Boc)-Opft (éster de pentafluorofenilo de ácido ?-a-???-?-ß-Boc-L-dia inopropiónico, 356-128) como una espuma blanca. Agente de Representación por Imágenes MR Precursor: A una solución de P-[porción de subunidad de enlazador] (1 eq.) y la Porción de Enlazador {Boc-Dpr(Boc)-Opft} (2.2 eq.) en DMF se agregó DIPEA (4-6 eq.). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de que los resultados de la masa LC indicaron que la reacción se completó, el solvente se removió bajo presión reducida. El producto crudo se agitó así en una mezcla de TFA, agua y anisóla (90%/5%/5%) a temperatura ambiente por 3 h. Se agregó éter de dietilo y un precipitado blanco se formó, el cual sé purificó por RP-HPLC (columna C-18, H2O/CH3CN/TFA) para dar el Agente de Representación por Imágenes MR Precursor (peptido tetrakisamino-péptido como un sólido blanco). Porción de Quelato Precursor: DOTAGA-Opft. A una solución de DOTAGA-OH (1 eq.) y pentaflurofenol (1 .2 eq .) en diclorometano se agregó PS-carbodiimida (1 .2-1 .5 eq.). La mezcla se agitó por 3-5 h a temperatura ambiente. Después de que los resultados de la masa LC indicaron que la reacción se completó, la resina se removió por filtración y el solvente se evaporó bajo presión red ucida para dar la Porción de Quelato Precursor como una espuma blanca. Agente de Representación por Imágenes MR. A una solución del Agente de Representación por Imágenes MR Precursor (1 eq.) y Porción de Quelato Precursor (4.0 eq.) en DMF es agregó DIPEA (4.0 eq.). La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Después de que los resultados de la masa LC indicaron que la reacción se completó, el solvente se removió bajo presión reducida. El producto crudo se agitó así en una mezcla de TFA, fenol, ácido metanosulfónico, anisóla y diclorometano (90%/2.5%/2.5%/2.5%/2.5%) por 15 min. a temperatura ambiente. El éter de dietilo se agregó y un precipitado blanco se formó y se colecta como el producto crudo. El producto crudo reaccionó con GdCI3. H20 en agua desmineralizada para formar el agente de representación por imágenes MR crudo, que se purificó utilizando RP-HPLC (columna C-18, Etanol/50 mmol de AcONH4). Las fracciones adecuadas se combinaron y el etanol se removió bajo presión reducida, y después, las fracciones combinadas se trataron con acetato de sodio para intercambio de sal. Después de la liofilización, las sales en exceso se removieron utilizando cromatografía de fase inversa en un cartucho Waters Sep-Pak® C-18 con agua y etanol: agua (50:50) eluyentes. Las fracciones adecuadas se combinaron, el etanol se removió bajo presión reducida, y la solución se liofilizó para dar el agente de representación por imágenes MR de peptido deseado como un sólido blanco. Se utilizaron métodos similares para sintetizar otros agentes de representación por imágenes MR. Ejemplo 2 - Métodos para la Síntesis de Una Porción de Precursor de Queiato (Synthon #3) a) B0C¿O, NaOH-Orocano b) aOQ, NaOCt;, TEMPO, regulador de fosfato , ACN c> BnBr, 0¼0¾ PMF d) TFA, CH2Q¿ después 2M ra , E¾0 6) bromoacelalodet-bulilo , D1PEA, DMF f) H2, Pd/C, Ettftc Método A para la Síntesis de Synthon #3 Etapa a - Protección de Aminas Hidroximetil-dietilenotriamina del trihidrocloruro de esteroquímica indicada (25.15 g) (materia prima ópticamente pura: Svn. Comm. 29(14), 2377-2391 (1999), material prima racémica: Coll. Czech. Chem. Comm. 34, 630-634 (1969)) se disolvió en una mezcla de agua desmineralizada/1 ,4-dioxano y el pH de la solución se ajustó a entre 8 y 9 con hidróxido de sodio acuoso. Dicarbonato de di-íerí-butilo (3.5 equiv.) se disolvió en dioxano y se agregó entre 10 y 20°C. La mezcla de reacción se agitó entre 12 y 20 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluyó así con agua, y se extrajo con acetato de etilo. El extracto orgánico se extrajo secuencialmente con agua, bicarbonato de sodio saturado, y soluciones de cloruro de sodio saturado. El extracto orgánico se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró bajo ¡n vacuo para proporcionar un aceite que se purificó por cromatografía de gel de sílice con una mezcla de acetato de etilorhexano. La producción total de producto purificado fue 30.1 1 g. 1H NMR (300 MHz): 5.18 (d, J=7.9 Hz, 1 H), 4.76 (bs, 1 H), 3.8-3.0 (m, 10H), 1.47-1 .42 (2s, 27H). S (m/Z): 456.4 [M+Na]+. Etapa b - Oxidación de Grupo Hidróxilo [en base al procedimiento de oxidación descrito en Zhao et al. , J. Orq. Chem. 64, 2564-2566 (1999)] NaOCI, NaOCI "2- . TEMPO, regulador de fosfato acetonitrilo Triamina protegida de BOC (29.94 g) se disolvió en acetonitrilo. El regulador de fosfato, que consiste de 21.6 g de NaH2P04, 21 .6 g de Na2HP04 y suficiente agua desmineralizada para producir un volumen de 500 mL, se agregó (300 mL), seguido por 2,2,6,6-tetrametilpiperidinil-1 -oxi (TEMPO) (0.07 equiv.). La mezcla se agitó vigorosamente y se calentó a 35°C. El clorito de sodio (2.0 equiv.) se disolvió en agua desmineralizada (100 mg/ml). La solución de clorito de sodio y blanqueador (0.02 equiv., aprox. 0.25% de hipoclorito de sodio acuoso) se agregaron mientras se mantiene a una temperatura constante. Después de la adición de oxidante, I reacción se agitó por 24 horas. El TEMPO adicional (0.07 equiv.) se agregó y la mezcla de reacción se agitó por 24 horas. La reacción se enfrió a temperatura ambiente. El agua se agregó y el pH se ajustó a 8 con 2.0 N de NaOH acuoso. Una solución fría de sulfito de sodio acuoso se agregó (300 mL) mientras se mantiene un pH constante. La solución se extrajo con un pequeño volumen de éter de tert-butilo de metilo y grupo aparte. La capa acuosa se acidificó a pH 3-4 con 2.0N de HCI acuoso y se extrajo con dos pequeños volúmenes de éter de ferf-butiio metilo. El extracto orgánico se combinó con el grupo previamente aparte y se concentró in vacuo. El producto se utilizó sin purificación en la Etapa 3 de abajo. 1H NMR (300 MHz): 5.8 (bs, 1 H), 5.3 (m, 1 H), 4.4 (M, 1 H), 3.6-3.2 (m, 6H), 1.47-1.43 (2s, 27H). MS (m/Z): 470.2 [M+Na]+. Etapa c - Protección de Bencilo del ácido carboxílico La materia prima de ácido carboxílico (178 g) se disolvió en DMF seco. El carbonato de cesio (2.0 equiv.) se agregó, y la solución se agitó por 30 minutos. El bromuro de bencilo (1 .1 eq.) se agregó gota a gota a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó bajo una atmósfera inerte por 18 horas. La mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas orgánicas se combinaron y se lavaron secuencialmente con soluciones de cloruro de sodio y bicarbonato de sodio. La capa orgánica se concentró para un aceite (270 g) que se purificó por cromatografía de gel de sílice utilizando acetato de etilo.hexano. 1H NM (300 MHz): 7.3 (s, 5H), 5.6 y 5.15 (2bs, 1 H), 5.1 (s, 2H), 4.5 (bs, 1 H), 4.0-4.1 (m, 1 H), 3.5-3.2 (m, 6H), 1 .45 y 1 .4 (2s, 27H). MS (m/Z): 560.3 [ +Na]+- Etapas d y e - Desprotección dé Aminas y Alquilación La triamina protegida de BOC (250 g) se agitó en una solución de 1 : 1 acetonitrilo:4 N HCI acuoso y se dejo agitar por aproximadamente 2.0 horas. El acetonitrilo se removió in vacuo y la solución restante se liofilizó para proporcionar un residuo que se disolvió inmediatamente en DMF y diisoprópilamina (una cantidad suficiente para aumentar el pH a 8). Se agregó bromoacetato ferf-Butilo (12.0 equiv.). Después de que la adición se completó, la mezcla de reacción se calentó a 50°C y se agitó por 18 horas. Al completarse la reacción, el volumen de la mezcla de reacción se dobló por la adición de agua, después de lo cual se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron y se lavaron secuencialmente con soluciones de agua, bicarbonato de sodio saturado, y cloruro de sodio saturado. La solución orgánica se concentró in vacuo para un aceite que se purificó mediante cromatografía de gel de sílice utilizando acetato de etilorhexano. La producción total de producto purificado fue 190 g. MS (m/Z): 809.5 [M+Na]+. Etapa f - Desprotección de Carboxilato Un reactor de acero inoxidable se cargó con éster de bencilo (157 g), 10% de paladio en cdrbono (19.8 g) y acetato de etilo y se hidrogenó en 45 psi por 12 horas. La filtración a través de Celite® y concentración in vacuo dio un aceite. El aceite se disolvió en acetato de etilo/hexanos y se purificó por cromatografía de gel de sílice para proporcionar el éster de penta-ferí-butilo de ácido carboxílico DTPA (producción: 82%). ?d (m/Z): 71 9.5 [MH]+. Cuando este reactivo se utiliza en la síntesis de los agentes de contraste que utilizan otros elementos quirales, no se observaron diastereómeros y por lo tanto se concluye que este material es esencialmente ópticamente puro para el límite de detección por NMR de protón ordinario. Método B para la Síntesis de Synthon #3 La materia prima de alcohol (ver Syn. Comm. 29(14), 2377-2391 (1999) para una síntesis de hidroximetil-dietilenotriamina) (105.0 g), acetonitrilo (1 .0 L), regulador de fosfato (1.0 L, preparado al disolver 100 mg de NaH2P04 y 10 mg de Na2HP04 en 1.0 mL de agua y después ajustándose el pH a 4.5 con H3P04) y TEMPO (7.0 g) se combinaron y se calentaron a entre 45 y 50QC. Una solución que consiste de clorito de sodio (29.8 g disueltos en 298 mL de agua) e hipoclorito de sodio (744 µ?) se agregó a la solución mientras que se mantiene una temperatura de 45 a 50°C. La mezcla de reacción se agitó vigorosamente por 4 a 10 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y dos capas se separaron. La capa orgánica se aisló y se combinó con cloruro de sodio acuoso saturado y se ag itó por 1 5 minutos. La capa orgánica se aisló y se concentró ¡n vacuo para dar un aceite (1 71 g) que se purificó por cromatografía de columna utilizando hexanorisopropanol con 0.1 % de trietilamina completamente para proporcionar 81 g de producto enriquecido como un aceite. MS (m/Z): 71 9.5 [MH]+. La pureza óptica del material producido por este método no difirió de aquella anterior. Ejemplo 3 - Resinas para Síntesis de Fase Sólida de Péptidos Modificados con Grupos Fu ncionales Amina de terminal C Los péptidos se han preparado por síntesis de fase sólida. En la síntesis de fase sólida, los enlazadores y resinas se seleccionan dependiendo del tipo de los péptidos a sintetizar (por ejemplo, el grupo funcional requerido en la terminal C, el peptido sin proteger o protegido) y el método sintético a utilizar (por ejemplo, Fmoc o química BOC, síntesis automática o manual, el reactor de grupo o flujo continuo). Por ejemplo, en la síntesis de un peptido con un grupo carboxílico en la terminal C, un aminoácido protegido se une a las diferentes resinas tales como resinas H PB, resina 2-clorotritilcloruro y resina SUSRIN. Por el otro lado, en la síntesis de un peptido con un grupo amino en la terminal C, una diamina puede unirse a una resina de tritilo. Las resinas de poliestireno (PS) pueden utilizarse para síntesis de grupo, mientras que las resinas modificadas de polietilenoglicol (PEG) son adecuadas para la síntesis de grupo y flujo continuo. Varias resinas PS de tritilo que incluyen resina PS de tritilo 1 ,3-bis-(aminometil)^benceno se encuentran comercialmente disponibles. Si la resina PS de tritilo requerida no se encuentra disponible, un procedimiento similar como se describe para las resinas PEG puede utilizarse para unir una diamina a una resina PS de tritilo. La síntesis de resina de tritilo 1 ,3-bis-(aminometil)-benceno se discute como un ejemplo. Otras diaminas pueden unirse a resina de tritilo en una manera similar. Preparación de resina PEG de tritiló 1 ,3-bis-(aminometil)-benceno.
Primero, la resina de alcohol de tritilo (25 g, resina TGT NovaSyn, NovaBiochem) se colocó en un embudo y se lavó secuencialmente con DMF, CH2CI2 y tolueno. Después de remover todo el solvente, el material se transfirió a un matraz equipado con un condensador de reflujo. Tolueno (250 mL) y cloruro de acetilo (25 ml_) se agregaron y la mezcla se calentó a 70°C y se agitó por 1 .0 hora. Una parte adicional de cloruro de acetilo (25 mi) se agregó y la mezcla se agitó por 2.0 horas a 70°C. La mezcla se filtró y la resina se lavó secuencialmente con tolueno y CH2CI2.
Segundo, la resina de cloruro de tritilo frescamente preparada y THF (250 ml_) se colocó en un matraz. A la mezcla se agregó 1 ,3-bis-(aminometil)-benceno (10 eq. , en base a una sustitución de resina de 0.23 mmol/g) y la mezcla se agitó por 18.0 horas a temperatura ambiente. La mezcla se filtró y la resina se lavó secuencialmente con agua, DMF, CH2CI2, metanol, y CH2CI2. La resina se secó bajo vacío (temperatura ambiente, 1 -5 mm Hg) a un peso constante (25.4 g). La estequiometfía de sustitución se condujo utilizando un procedimiento de ninhidrina cuantitativa. Ejemplo 4 - Síntesis de los Conjugados Covalentes (synthon #1 , #2, #4, y #5) Método para la Síntesis de Synthón #1 ácido 2,3-di-tert-butoxicarbonil- 1 HC1 amino-propiónico ' Ester de bencilo de ácido 2,3-Bis-íerí-butoxicarbonilamino propiónico Una solución de carbonato de cesio (6.5 g) y agua se agregó a ácido 2,3-bis-ferf-butoxicarbonilamino propiónico (3.04 g) en acetonitrilo (25 mi). La mezcla se agitó por 40 minutos a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo vacío. DMF (50 mi) se agregó al residuo sólido. Una solución de bromuro de bencilo (1 .43 mi) y DMF (5.0 mi) se agregó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se agitó por 18 horas, y después la mezcla se diluyó con acetato de etilo (100 mi) y agua (50 mi) y se agitó por 15 minutos. Las capas se separaron y la capa orgánica se secó Sobre sulfato de sodio. La mezcla se filtró , y el filtrado se concentró bajo vacío para dar un aceite (3.6 g). El aceite se purificó por cromatografía de columna con acetato/hexano para proporcionar un aceite (1 .8 g). MS (miz): [M+Na]+ = 417. 1H NMR (300 MHz): 1 .4 (s, 9H), 2.4 (m , 2H), 4.4 (m, 1 H), 4.8 (m, 1 H), 6.5 (m, 1 H), 7.3 (m , 5H). Trihidrocloruro de ácido 2,3-Diamino-propiónico Una solución de éster de bencilo de ácido 2,3-bis-ferf-butoxicarbonilamino propiónico (1 .8 g), 4N HCI acuoso (40 mi), y acetonitrilo (50 mi) se agitó por 18 horas a temperatura ambiente. El solvente se removió bajo vacío, y la mezcla se diluyó con acetato de etilo (1 00 mi) y agua (50 mi) y se agitó por 15 minutos. Las capas se separaron y la capa acuosa se evaporó para resequedad (1 .23 g de una espuma/jarabe). 1H NMR (300 MHz): 3.2-3.5 (m, 2H), 4.2-4.35 (m, 1 H), 5.13-5.25 (q, 2H, J=1 1 .8, 3.1 Hz). Éster de bencilo de ácido 2,3-Bis-carboxi-DTPA propiónico Una solución de trihidrocloruro de ácido 2,3-diamino-propiónico (6.65 g), bb(CO)DTPE (40.0 g, "Synthon 3"), HOBt (8.5 g), DIC (9.0 mi), diisopropiletilamina (15.0 mi), CH2CI2 (400 mi) y DMF (200 mi) se agitó por 48 horas. La mezcla se diluyó con cloruro de metano (500 mi) y agua (250 mi), y se agitó por 15 minutos. Las capas se separaron y la capa orgánica se lavó con carbonato de sodio saturado (250 mi), cloruro de sodio saturado (250 mi) y se secó sobre sulfato de sodio. La mezcla se filtró y el filtrado se concentró ¡n vacuo para obtener un aceite. El aceite se purificó por cromatografía de gel de sílice utilizando acetato de etilo y hexanos para obtener 28.0 g de material. MS (m/Z): [M+2]+=798; [M + 1 ]+=1 595. Ácido 2,3-Bis-carboxi-DTPA propiónico La hidrogenación de éster de bencilo de ácido 2,3-bís-carboxi-DTPA propiónico (17.0 g) se realizó en acetato de etilo/trietilamina (10:3) utilizando 10% de paladio en catalizador de carbono (6.0 g) por 24 horas a 50 psi. El recipiente se purgó con nitrógeno y la mezcla se filtró a través de Celite®, y se concentró bajo presión reducida para dar 16.0 g de un aceite. S (m/Z): [ +2]+=753; [M+1 ]+=1 504. Método para la Síntesis de Synthon #2 N1-N3-Bis[2-(bis-íerí-butoxicarbonilmetil-amino)-3-{[2-(bis-ferf- butoxicarbonilmetiI-amino)-etil]-(íerr-butoxicarboniimetil)-annino}- propionamidaj-dietilenotriamina A una solución de dietilenotriamina (3.16 mi), acetonitriio (700 mi), y diisopropiletilamina (10.4 mi) se agregó bb(CO)DTPE (42.0 g, "Synthon 3") pre-reaccionado (30 min), HOBt (7.9 g), EDC (11.2 g) y diisopropiletilamina (10 mi) en acetonitriio a temperatura ambiente. La reacción se agitó por 16.0 horas y después se concentró bajo presión reducida. El aceite se combinó con acetato de etilo, se extrajo con agua y cloruro de sodio acuoso saturado y después se concentró. El aceite se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice, utilizando hexanos/isopropanol/trietilamina para proporcionar 22.5 de producto. MS (m/Z): [M+H]+=1503. N1-N3-Bis[2-(bis-ferf-butox¡carbonilmetiI-amino)-3-{[2-(bis-íerí- butoxicarbontImetil-amino)-etil]-(íerr-butoxicarbonilmetil)-amino}- propionamida]-N2-(benciloxicarbonilmetil)-dietilenotriamina BenciI-2-bromoacetato (2.54 g) se agregó a una solución del compuesto amina previo (13.5 g), acetonitriio (200 mi) y carbonato de sodió (1.18 g). La mezcla se caientó a 60°C y se agitó por 15 horas. La mézcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente y se concentró bajo presión reducida. Se agregaron acetato de etilo y agua, las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con cloruro de sodio acuoso saturado, después se concentró bajo presión reducida para dar un aceite (14.5 g). MS (m/Z): [M+H]+=1651. N1-N -Bis[2-(bis-íerf-butoxicarbon¡lmetil-amino)-3-{[2-(bis-íerí- butoxicarbonilmetil-amino)-etil]-(ferí-butoxicarbonnmetil)-amino}- propionamida]-N2-(ácido acético)-dietilenotriamina El éster de bencilo anterior (14 g) se hidrogenó en acetato de etilo/trietilamina (49: 1 ) a 50 psi por 16.0 horas en la presencia de 10% de paladio en carbón vegetal (3.5 g). La mezcla resultante se filtró a través de Celite®, y se concentró ¡n vacuo para proporcionar 1 2.08 g de un aceite. S (m/Z): [M+H]+=1 561 . Síntesis de Synthon #4 — v / Boo-ON y — / H2N N NH2 *- BocHN j NHBtxs N1,N3-Bis-Butoxicarbonil-Dietilenotriamina A una solución de dietilenotriamina (2.12 g, 20.6 mmol) y trietilamina (30.0 g, 41 .3 mmol) en THF (100 mL) se agregó Boc-ON (10.65 g, 43.3 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó durante toda la noche. A la mezcla se agregó 700 mL de éter y después se extrajo con regulador de fosfato (pH=3, 1 00 mmol). La solución acuosa se basificó en pH=1 1 y se extrajo con diclorometano. La capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio anhidro. Las sales se filtraron y el solvente se removió bajo la presión reducida par dar el compuesto indicado como un aceite incoloro (5.55 g). S (m/Z): [M+H]+=304. 1. N1,N3-Bis-Butoxicarbonil-N2-(Benciloxicarbon¡let¡l)-Dietilenotriamina A una solución del compuesto anterior (1 .0 g, 3.30 mmol) en metanol (40 mL) se agregó acrilato de bencilo (1.07 g, 6.59 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla se refluyó por 3 días. El solvente se removió a presión reducida para dar un líquido amarillo que contiene el compuesto indicado y acrilato de bencilo. MS (m/Z): [M+H]+=466.1 . N2-(Benciloxicarboniletil)-Dietilenotriamina A una mezcla del compuesto anterior y acrilato de bencilo (1 .0 g) en diclorometano (25 mL) se agregó TFA (13.8 mL) a temperatura ambiente. La mezcla se agitó por 3 h a temperatura ambiente y después se le agregó a la mezcla 1 N HCI y agua- La capa acuosa se separó y se liofilizó para dar el compuesto indicado (420 mg) como un sólido pegajoso. MS (m/Z): [M+H]+=266.2. N1,N3-B¡s[2-(Bis-7"erí-Butoxicarbonilmetil-Amino)-3-{[2-(BSs-rerf- ButoxicarboniImetil-Amino)-Etil]-(rerf-Butoxicarbonilmetil)-Amino}- Prop¡onamida]-Nz-(Benciloxicarboniletil)-Dietilenotriamina A una solución del compuesto anterior, "Synthon 3", HOBt y diisopropiletilamina, en CH2CI2 y DMF se agrega DIC. La mezcla se agita por 48 h a temperatura ambiente. La mezcla se diluye con diclorometano y agua, y después se agita por 15 minutos. Las capas se separan y la capa orgánica se lava con carbonato de sodio saturado, cloruro de sodio saturado y se secan sobre sulfato de sodio. La mezcla se filtra y el filtrado se concentra in vacuo para obtener un aceite. El aceite se purifica por cromatografía de gel de sílice utilizando acetato de etilo y hexanos para obtener el compuesto indicado. N1,N3-Bis[2-(Bis-reri-Butoxicarbonilmeti!-Amino)-3-{[2-(Bis-reri- Butoxicarbonilmetii-Amino)-Etil]-( rerí-Butoxicarbon¡lmetiI)-Amino}- Propíonamida]-N2-(Ác¡do Propiónico)-Dietilenotr ¡amina Un recipiente de hidrogenación se carga con el compuesto anterior, 10% de paladio en carbono, acetato de etilo, y trietilamina. El recipiente se purga con nitrógeno después hidrógeno. La mezcla se agita por 24 horas bajo una atmósfera de hidrógeno (50 psi). El recipiente se purga con nitrógeno y la mezcla se filtra a través de Celite®, y el filtrado se concentra bajo presión reducida para dar el producto como un aceite. Síntesis de Synthon #5 3-(Bencilamino)-2-((Bencilamino) etil)-Propionato de Metilo etil-2-(bromometil)-acrilato (1 .00 g, 5.6 mmol, 1 .0 eq.) disuelto en acetonitrilo (20 mL) se agregó gota a gota con agitación a temperatura ambiente a una solución de bencilamina (1 .83 mL, 16.8 mmol, 1 .5 eq.) en acetonitrilo anhidro (10 mL). Después de 16 horas, se agregó éter (100 mL), y el sólido blarico (hidrobromuro de bencilamina) se filtró. El filtrado se concentró bajo presión reducida para dar 1 .90 g de un aceite crudo. El aceite se disolvió en acetato de etilo (150 mL) y se lavó con H20 y agua salada NaCI. La capa orgánica se lavó (MgS04), y se evaporó bajo presión reducida. El aceite claro resultante se purificó por cromatografía de flash (hexanos:acetato de etilo) para dar 1 .38 g (79%) del producto. H N R (300 HZ, CDCI3): d 1 .68 (s, 2H), 2.79-2.90 (m, 5H), 3.68 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 7.21 -7.32 (m, 10H). 3-(Amino)-2-(Aminometíl)-Propionato de Metilo 3-(bencilamino)-2-((bencilamino)metil)-propionato de metilo (2.27 g, 7.3 mmol, 1.0 eq.) se disolvió en cloruro de metileno (20 mL) y se agregó 4.0 mL de una solución de 4M de HCI en dioxano. La solución se agitó a temperatura ambiente por 20 minutos y los solventes se evaporaron así bajo presión reducida para dar un polvo blanco que se disolvió en 50 mL de MeOH. El catalizador (10% de paladio en catalizador de carbono, 750 mg), se agregó a 0°C bajo argón y la mezcla se agitó a 45 psi H2 por 18 horas, después se filtró a través de Celite®. El producto (1 .47 g) se aisló siguiendo un MeOH y la evaporación fue bajo presión reducida. 1H NMR (300 MHZ, D20): d 3.25-3.43 (m, 5H), 3.82 (s, 3H). 3-(BOC-Amino)-2-(BOC-Aminometil)-Propionato de Metilo Diamina (1 .44 g) reaccionó con dicarbonato di-rerf-butilo (3.22 g, 14.8 mmol, 1 .05 eq.) en dioxano/Na2C03 acuoso en solución 0°C por 1 hora y después a temperatura ambiente por 18 horas. La mezcla se acidificó así (pH=4) con 0.5 N de KHS04 y el dioxano se evaporó bajo presión reducida. La parte acuosa se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre MgS04 y se concentró bajo presión reducida para dar un aceite crudo que se purificó por cromatografía de flash (hexanos:acetato de etilo) para dar 1.86 g (80%) de lo deseado. NMR (300 MHz, CDCI3): d 1 .41 (s, 18H), 2.66-2.78 (m, 1 H), 3.10-3.27 (m, 2H), 3.50-3.62 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 5.17-5.27 (bt, 2H). Ácido 3-(BOC-Amino)-2-(BOC-Aminometil)-Propanoico Ester de metilo (1 .50 g) se disolvió en 15 mL de una mezcla 2: 1 de THF/H20. Se agregó LiOH»H20 (0.95 g) a 0°C. La mezcla se agitó entre 0°C y temperatura ambiente por 44 horas. THF se evaporó bajo presión reducida y la solución acuosa se extrajó con EtOAc. La capa acuosa se hizo acídica (pH=3) con 0.5M de KHSO4 acuoso y se extrajo con EtOAc. Las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con 30 mL de H20, y se secaron (MgS04). Los solventes se evaporaron bajo presión reducida para dar 1 .32 g (92%) del producto. H NMR (300 MHz, CDCI3): d 1 .40 (s, 18H), 2.66 (s, 1 H), 3.27-3.47 (m, 4H), 5.42 (s, 1 H). 3-(BOC-Amino)-2-(BOC-Aminometil)-Propionato de Bencilo El ácido (1.01 g) reaccionó a temperatura ambiente con bromuro de bencilo (0.45 mL) en DMF anhidro que contiene Cs2C03 (2.07 g). DMF se evaporó bajo presión reducida y el residuo se dividió entre H20 y EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua salada, y se secó (MgS04). El solvente se evaporó bajo presión reducida y el residuos se purificó por cromatografía de flash en gel de sílice (Hexanos/EtOAc 95:5 a 9: 1 a 85:15). Producción 1 .16 g (90%). 1 H NMR (300 MHz, CDCI3): d 1 .42 (s, 18H), 2.79 (quinto, 1 H, 5.6 Hz), 3.1 -3.2 (m, 2H), 3.5-3.65 (m, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.15-5.28 (m, 1 H), 7.30-7.40 (m, 5H). MS: 431 .15 (M+1 ). Sal de Hidrocloruro Bencilo 3-Amino-2-Aminometil-Propionato 3-(BOC-amino)-2-(BOC-aminometil)-propionato de bencilo (1 .15 g) se disolvió en 5 mL de 4M de solución HCI en dioxano. La mezcla se agitó a 0°C por 6 horas y el dioxano se evaporó bajo presión reducida. El residuo se concentró con éter y se filtró para dar la sal de dihidrocloruro de diamina sin purificar (0.81 g). 1H NMR (300 MHz, MeOD): d 3.1 -3.3 (m, 5H + CHD2OD), 3.55 (s, dioxano), 5.19 (s, 2H), 5.15-5.28 (m, 1 H), 7.20-7.40 (m, 5H) MS: 209.00 (M+1). 3-(NBB(CO)DTPE Carboxamida)-2-(NBB(CO)DTPE Carboxamida)Metil- Propionato de Bencilo El ácido (2.00 g, 2.8 mmol, 1 .5 eq.) se disolvió en 5 mL de diclorometano anhidro. La diamina (0.26 g), HOAt (0.32 g), y diisopropiletilamina (0.65 mL) reaccionaron 0°C con HATU (0.88 g) por 2 hr. La resma de amina tris (0.5 g), resina de isocianato (0.5 g), y HATU (0.42 g) se agregaron y la mezcla de reacción se agitó por 16 h a temperatura ambiente. Las resinas se filtraron y el filtrado se evaporó. El residuo se dividió entre H20 y EtOAc. La capa orgánica se lavó con H20, NaHC03 saturado, y agua salada (20 mL), y se secó (MgS04). El solvente se evaporó bajo presión reducida. El aceite se purificó por cromatografíá de flash en gel de sílice (Hexanos/Acetona/Et3N) y dio el producto (1 .13 g). MS: 1607.95 (M+ ) y 1629.95 (M+Na). Ácido 3-(N-BB(CO)DTPE Carboxamida)-2-(N-BB(CO)DTPE Carboxamida) Metí l-Prop ión ico Ester de bencilo (0.90 g, 0.56 mmol) se disolvió en 30 ml_ de EtOAc y se agregó Et3N (1 mL). 10% de catalizador de paladio en carbono (0.50 g) se agregó y la mezcla se agitó por 15 h bajo 45 psi de Hidrógeno. El catalizador se filtró y los solventes se evaporaron para dar el producto (0.82 g). MS: 759.55 (M+2H/2). Ejemplo 5 - Síntesis de los Agentes de Representación por Imágenes MR de Unión de Fibrina 32 resina de trifilo Diamina síntesis de peptido ?? Construcción de Peptido: 3.39 g de la resina NovaSyn TGT de tritilo 1 ,3-bis-(aminometil)-benceno (sustitución de medida=0.59 mmol) se colocó en una columna de peptido estándar y se cargó en un Sintetizador de peptido. La síntesis se llevó a cabo utilizando una estrategia Fmoc estándar. El cubrimiento se llevó a cabo después de acoplar el primer aminoácido utilizando anhídrido acético, 6% de diisopropiletilamina en DMF. Cuando la síntesis se completó, la resina se removió de la columna y se colocó en un recipiente de reacción. La resina se enjuagó una vez con CH2CI2 y se filtró. La resina se trató así con 1 % de ácido trifluoroacético en CH2CI2 y se colocó en un agitador mecánico por 10 minutos. La mezcla se filtró a través del recipiente de reacción y el filtrado se colectó. El pH del filtrado combinado se ajustó a aproximadamente 8 con trietilamina, y la solución se concentró bajo vacío para un aceite. Siguiente a la precipitación con agua, el sólido blanco se filtró y se enjuagó con agua y éter de dietilo. El sólido se secó por filtración de succión, se tomó en DMF y se diluye con acetonitrilo. La solución se enfrió en un baño frío y se trató con 1 .5 g de trifluoroacetato de talio por 2.0 horas. El pH de la solución se ajustó con trietilatnina a pH 8 y después se concentró bajo vacío. Se agrega agua al aceite y el precipitado resultante se colectó por filtración de succión. El sólido se lavó con agua y éter de dietilo para dar 2.7 g de peptido modificado crudo que tiene un grupo funcional amina de terminal C. Una síntesis de ejemplo de H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-Asp-CO- HCH2C6H4CH2NH2 (SEQ ID NO: 21 ) se confirmó por un m/Z observada de 1792.8 [M+Na]+. El peptido modificado se purificó por HPLC preparativo. Las fracciones de pureza similar (98-100%) se combinaron y se liofilizaron sin neutralización. El peptido modificado {3.2 g) y el conjugado covalente (Synthon #2 anterior) (3.95 g) se disolvieron en diclorometano. Se agregó diisopropiletilamina gota a gota hasta que el pH midió 9, y se agregaron diisopropilcarbodiimida (2 eq.) y HOBt (2 eq.) simultáneamente a la mezcla. Después de agitarse 2 minutos, se agregó diisopropiletilamina gota a gota hasta que el pH midió 9. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por dos horas. Se agregó Synthon #2 pre-activadó adicional (con diisopropilcarbodiimida, diisopropiletilamina, y HOBt) en una parte. Los solventes se removieron in vacuo y el residuo se disolvió en acetato de etilo, que sé lavó secuencialmente con 0.1 N de ácido hidroclórico, bicarbonato de sodio saturado, y cloruro de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró bajo presión reducida para obtener una espuma amarilla ligera (7.8 g). La espuma se disolvió en diclorometano y se purificó por cromatografía de flash (eluyente diclorometano:metanol) para proporcionar un sólido blanco (5.6 g). El sólido blanco se agitó en una mezcla de TFA, agua, y trietilsilano (90%/5%/5%, 30 ml_) a temperatura ambiente. La mezcla se calentó a 40°C y se agitó por 2 horas. La solución se concentró a un volumen entre 3-5 mi, después se enfrió a temperatura ambiente. El éter de dietilo se agregó y un precipitado blanco se formó. La mezcla se dejó agitar por 10 minutos, y los sólidos se colectaron por filtración y se lavaron con éter de dietilo. Los sólidos se secaron bajo vacío proporcionando un sólido blanco (4.0 g). El sólido se disolvió en una mezcla de agua: acetonitrilo (20 m, 4:1 proporción) y se purificó por HPLC prep. para producir un sólido blanco, agente de representación por imágenes MR precursor (1.6 g). El agente de representación por imágenes MR precursor (1 g) reaccionó con un equivalente de GdCI3»6H20 en agua desmineralizada destilada con el pH ajustado a ca. 6 por la adición de 1 M NaOH. El complejante gadolinio se purificó por cromatografía de fase inversa (Waters Sep-Pak® C-18) utilizando agua desmineralizada destilada y 50:50 (v:v) de eluyente metanol:agua. Las fracciones adecuadas se combinaron y el metanol se removió bajo presión reducida a 50°C y se liofiíizó para dar 81 1 mg del agente de representación por imágenes MR. Alternativamente a la síntesis de 32 anteriormente presentado, el peptido puede ciclizarse en una resina según se ilustra en el siguiente Esquema: Ejemplo 6 - Agentes de Representación por Imágenes MR náloga: Cada uno de los siguientes agentes de representación MR se sintetizó análogamente para los métodos anteriormente descritos. El peptido, preparado utilizando la estrategia Fmoc estándar y ciclizado utilizando trifluoroacetato de talio, se purificó por HPLC y reaccionó con Synthon #2, diisopropiletilamina, diisoprilcarbodiimida (2 eq.) y HOBt (2 eq.) en diclorometano. Los solventes se removieron in vacuo y el residuo se disolvió en acetato de etilo, que se lavó secuencialmente con 0.1 N de ácido hidroclórico, bicarbonato de sodio saturado, y cloruro de sodio acuoso saturado. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró, y se concentró bajo presión reducida para obtener una espuma que se purifica si es necesario por cromatografía de flash o HPLC. El sólido blanco resultante se agitó en una mezcla de TFA, agua, y trietilsilano (90%/5%/5%, 30 mi) a temperatura ambiente por 2-6 horas. Se agregó éter de dietilo y un precipitado blanco se formó, el cual se purificó por HPLC prep. (CH3CN/H20/AcONH4) para producir un sólido blanco, agente de representación por imágenes MR precursor. El agente de representación por imágenes MR precursor reaccionó con un equivalente de GdCI3*6H20 en agua desmineralizada (pH 6, NaOH). El quelato de gadolinio se purificó utilizando la cromatografía de fase inversa en un cartucho Waters Sep-Pak® C-18 con agua y eluyente metanol:agua 50:50. Las fracciones adecuadas se combinaron y el metanol se removió bajo presión reducida a 50°C y se liofilizó para dar el agente de representación por imágenes MR deseado. La Tabla 3 proporciona los datos de espectrometría de masa que confirma cada uno de los compuestos. Ver la descripción detallada para la estructura de cada uno de los compuestos.
TABLA 3 Datos de MS de los compuestos de unión de f ib Compuesto Peso Molecular MS (M+3H)3+/3 caled obsd 4 4016.884 1256.49467 1255.66 5 4025.96 1259.52 1259.9 6 41 08.014 1286.87133 1284.53 7 4307.336 1353.312 1369.34 8 4076.064 1276.22133 1298.48 9 4233.208 1328.60267 1327.94 10 4221 .199 1324.59967 1324.57 1 1 4142.146 1298.24867 1321 .13 12 4123.378 1291 .99267 1289.80 13 4325.675 1359.425 1333.3 14 4470.833 1407.811 1407.44 15 4363.362 1371 .98733 1393.99 16 4511 .483 1421 .361 1444.57 17 4169.128 1307.24267 1329.85 18 4503.826 1418.80867 1419.25 19 4387.428 1380.00933 1379.12 20 4305.369 1352.65633 1351.6 21 4419.473 1390.691 1390.53 22 4277.356 1343.31867 1341.04 23 4357.829 1370.143 1370.63 24 4443.644 1398.748 1398.9 25 4448.209 1400.26967 1400.1 1 26 4326.731 1359.777 1359.9 27 4423.505 1392.035 1392.79 28 4343.375 1365.325 1364.7 29 4342.387 1364.99567 1364.7 30 4313.366 1355.322 1354.9 31 4342.387 1364.99567 1364.8 Ejemplo 7 - Síntesis de los Agentes de Contraste Ópticos de Unión de Fibrina: Cada uno de los siguientes agentes de contraste ópticos se sintetiza análogamente para los métodos anteriormente descritos. El esquema X muestra un ejemplo general en donde dos tintes ópticos idénticos se agregan al mismo peptido. Compuesto que contiene 5-Carboxitetrametilrodamina (3A) El peptido 1 (177 mg, 0.10 mmol) y éster de succinimidilo 5- carboxitetrametilrodamina A (1 1 1 mg, 0.21 mmol) se disuelven en diclorometano (20 ml_) y DMF (20 ml_). La diisopropiletilamina se agrega gota a gota hasta que el pH mide 9. La mezcla se agita durante la noche y después los solventes se remueven bajo presión reducida. El residuo se purifica por cromatografía de columna de flash de gel de sílice (eluyentesrdiclorometano/metanol) para dar el compuesto 2A. Al compuesto 2A se agrega una solución de TFA, H20 y trietilsilano (proporción: 90/5/5, 5 mL). La mezcla se agita por 3 h a temperatura ambiente, y después la solución de la mezcla de reacción se vierte en 50 mL de éter para precipitar el producto crudo. Después de que los solventes se separan por centrifugación, el producto crudo se colecta y después se purifica utilizando HPLC de fase inversa para obtener el compuesto 3A.
?? Compuesto que contiene 5-Carboxifluoresceína (3B) En un procedimiento similar según se describe en la síntesis de 3A, 3B se sintetiza utilizando el peptido 1 (1 77 mg, 0.1 0 mmol) y éster de succinimidilo 5-carboxifluoresceína B (99.4 mg, 0.21 mmol). Compuesto que contiene Rojo Texas®-X- (3C) En un procedimiento similar según se describe en la síntesis de 3A, 3C se sintetiza utilizando el peptido 1 (177 mg, 0.10 mmol) y éster de succinimidilo Rojo Texas®-X C (172 mg, 0.21 mmol). Ejemplo 8 - Medición de la, Unión de los Agentes de Contraste a los Objetivos: El grado de unión de un agente de contraste de acuerdo a la presente invención a un objetivo, tal como HSA o fibrina, puede valorarse por una variedad de métodos de unión de equilibrio. Por ejemplo, la unión a HSA puede medirse por ultrafiltración. En una medición de unión típica utilizando ultrafiltración, el agente de contraste se mezcla con 4.5% de peso/volumen de HSA en un regulador pH 7.4. La muestra se carga en un aparato de centrifugación comercialmente disponible equipado con un filtro de corte de 30 kDa de peso molecular (Millipore Ultralibre MC Celulosa Regenerada de Baja Unión 30 Kda mol. en peso, de corte, catálogo # UFC3LTK00), permeable al grupo de objetivo, pero no para HSA. Una pequeña parte (5-10%) del volumen de muestra se filtra por centrifugación a 2000 x g por 20 min a través del filtro de corte, y la concentración del grupo de objetivo sin unir en la muestra se mide en el filtrado. Para medir la unión a fibrina, un coágulo de fibrina puede formarse en una cavidad de una lámina dé microconcentración y contactares con el grupo de objetivo. Después de un tiempo de incubación suficiente para establecer el equilibrio, el sobrenadante se remueve por aspiración (la fibrina insoluble permanece unida como un coágulo gelificado en la parte inferior de la cavidad). La concentración del grupo de objetivo sin unir en el sobrenadante se mide así. En ambas metodologías, la concentración del agente de contraste unido se determina como la diferencia entre la concentración de grupo de objetivo total inicialmente presente y la concentración de grupo de objetivo sin unir siguiente al ensayo de unión. La fracción unida es la concentración de grupo de objetivo unido dividido por la concentración del grupo de objetivo total. La afinidad de los agentes de contraste para un fragmento de fibrina soluble DD(E) se examinó según se establece anteriormente y se reporta en la Tabla 4. Los números del compuesto proporcionados en la Tabla 4 se refieren a las estructuras establecidas en la descripción detallada. Esta información en múltiples determinaciones tiene una frecuencia de error de no más de 20% en este ensayo biológico. TABLA 4 Afinidad de los Compuestos para Fib Compuesto Kd, DD(E). µ? 4 33 5 12 6 13 7 12 12 5.0 13 5.1 32 4.7 1 5 4.0 16 3.5 17 6.2 18 5.9 5 8 8.6 9 6.1 1 0 9.6 1 1 13 27 0.7 28 5.3 10 29 0.8 30 3.7 19 10 20 1.2 21 9.1 22 3.5 15 31 0.8 23 0.25 24 0.7 25 5.6 42 0.07 43 0.08 44 0.09 20 45 0.1 33 0.1 35 0.1 1 46 0.15 47 0.18 48 0.199 25 49 0.22 50 0.3 34 0.39 Ejemplo 9 - Estabilidad de los Agentes de Contraste: La estabilidad se ensayó utilizando homogenato de hígado de rata, que contiene tanto enzimas intra- como extracelulares y representa un ambiente químico particularmente nocivo para los enlaces peptido. El homogenato de hígado de rata frescamente preparado (630 µ!_) se colocó en un tubo de prueba de vidrió y se incubó a 37°C en un baño de agua por 4 minutos. Al homogenato de hígado de rata a 37°C se agregó 70 µ?_ de una solución 1 mM de compuesto de prueba. En los puntos de tiempo 0, 5, 1 5, 30, y 60 minutos, una alícuota de 100 µ?_ de la mezcla de reacción se removió y se mezcló con 100 µ?. de metanol en un tubo micrófugo para enfriar rápidamente la reacción. La mezcla de reacción enfriada rápidamente se centrífugo por 3 minutos a 10,000 rpm para hacer en forma de pastilla la proteína precipitada. El sobrenadante se analizó por LC-MS para cuantificar la cantidad de compuesto de prueba restante al comparar el área del valor máximo MS de ión único a aquel de una serie de estándares. La vida media (T1/2) se determinó al representar el logaritmo de porcentaje de la señal restante contra el tiempo. Los datos se fijaron utilizando un ajuste de curva exponencial, en donde T1/2=ln2/inclinación. Los datos de estabilidad de los compuestos posteriores, se probó. El compuesto 5, que tiene quelatos tanto en la terminal N como C del peptido, tuvo un aumento dramático en vida medida dándose como resultado de la resistencia a la hidrólisis de exopeptidasa. Un aumento comparable en la vida media no se logró a través de la modificación de una terminal con quelatos, aún cuando la otra terminal se cubrió con una porción orgánica no natural como en, por ejemplo, el compuesto 3 (que contiene un grupo bifenilo sobre la terminal N).
Estructura 1 : vida media =<2 min, libre N- y terminal C amidatada Estructura 2: vida media = 10 min, terminal N conjugada en quelatos y terminal C amidatáda Estructura 3: vida media = 9 min, terminal C conjugada en quelatos y terminal N acilatada con ácido para-(fenil)benzoico.
Estructura 5: vida media = 65 min, ambas terminales C y N conjugadas en quelatos Sorprendentemente, los datos anteriores ilustran que la vida media de un peptido se aumenta más significativamente por la adición de quelatos de gadolinio tanto para la terminal N como C. Ejemplo 10 - Relajación de los Agentes de Contraste Los agentes de contraste MRI de la presente invención se evaluaron para relajación utilizando un espectrómetro Bruker N S-120 Minispec N R que opera a 0.47 Tesla (20 MHz H-1 frecuencia Larmor) y 37°C o un relajómetro Konig-Brown (20 MHz, H-1 frecuencia Larmor) que opera a 35°C. T1 de protones de agua se determinó por una secuencia de pulso de recuperación inversa utilizando el software del instrumento. La relajación se determinó al medir el T1 de múltiples soluciones del objetivo (por ejemplo, geles homodispersos de fibrinogen frescamente polimerizados, 10 mg/mL) que contienen cero, 20, 30 y 40 µ Gd(lll), respectivamente. Las muestras se incuban a 37°C por al menos 15 minutos para asegurar el equilibrio de la temperatura antes de que la medida T1 se realice. El contenido Gd(l l l) de las muestras se determina por plasma inductivamente acoplado - espectrometría de masa (ICP-MS). La relajación (por Gd(ll l) ión) se determina al representar la velocidad de relajación (1 /T1 ) en s"1 contra la concentración Gd (l l l) en m M . La inclinación de un ajuste lineal para los datos brinda la relajación . La relajación de los compuestos en la a usencia de objetivo también se determi na en una ma nera análoga , excepto que n o se presenta objetivo. Los compuestos de la invención muestran la relajación aumentada en la unión a fibrina (FIG. 2) según se com para con la relajación en la ausencia de objetivo biológico. Ejemplo 11 - Toma de coágulos de los Agentes de Contraste La toma de un agente de contraste en un trombo (coágulo sangu íneo) se determinó por el siguiente método: Un conejillo de indias de 600 g (macho Ha rtley) se anestesió. Se hizo u na incisión en el abdomen y la cava de vena inferior (IVC) se aisló y el vaso sangu íneo se dejó recuperar por 1 0 minutos. Una parte de 1 cm de la IVC se sujetó y la trombina humana (50 µ?, 4 unidades) se inyectó en el vaso sangu íneo para promover la formación de trombo. La abrazadera inferior se abrió y se cerró permitiendo el flujo sanguíneo parcial al segmento. Después de 2-3 minutos, las abrazaderas se removieron. El trombo se dejo crecer en el animal por 30 minutos. En este punto, el agente de contraste, compuesto 32 en una dosis de 2 µp???/?^ y elemento radiomarcado con 70 µ?? de 1 1 1 ln, se Inyectó por medio de la vena yugular. Inmediatamente siguiendo la inyección del agente compuesto 32, un control no específico que comprende Gd(DTPA) en una dosis de 2 µ?G???/kg mezcladas con 70 µ??99G??????? se inyectó por medio de la vena yugular. Después de 30 minutos de que se extrajo la sangre, el animal se sacrificó, y el trombo se removió. La muestra sanguínea se peso y se contó utilizando un contador Packard Cobra II gamma. El trombo también se pesó y se contó. Los conteos que se elevan de 99mTc se detectaron de 128-165 keV mientras que los conteos se elevan de la disminución de 1 1 ln se detectaron de 390-500 keV. Los experimentos de control con solamente 99mTc o 111ln demostraron que la radioactividad que se eleva de 9BmTc fue insignificante en energías de detección utilizadas para 11 ln y viceversa. Los datos de disminución radioactiva se convirtieron a % de dosis inicial por gramo de tejido, % de ID/g, y el valor promedio de tres experimentos se presenta gráficamente. El radiomarcado con 1 1 In se realizó en avance: Una cantidad radioquímica adecuada de 11 1 lnCl3 (New England Nuclear) se agregó al agente de contraste de objetivo de fibrina. El pH se ajustó a 4 por adición de 1 HCI. La muestra se calentó a 45°C por 1 hora. El pH se ajustó a neutral por adición de 1 M NaOH. El compuesto 32 de agente marcado fue >95% puro por HPLC y-detectado. Los agentes específicos de fibrina muestran un aumento marcado en la toma de coágulos. La FIG. 3 muestra que un agente, compuesto 32, se está acumulando en el trombo. Existe una toma de coágulos específica en comparación a "TcDTPA y existe una concentración más alta del agente en el trombo que en la sangre circundante. La especificidad de ia toma de coágulos también puede demostrarse utilizando MRI. El procedimiento para la representación por imágenes ¡n vivo con un agente es como sigue: un conejillo de indias de 600 g (Hartley macho) se anestesia. Se hace una incisión en la garganta y una de las venas yugulares aisladas. Una sección de 1 cm de la vena yugular se aisla con abrazaderas vasculares. La sangre frescamente extraída del animal (50 µ?_) se mezcla con trombina humana (50 µ?_, 4 unidades) y se inyecta en el segmento sujetado de la vena. Cuatro minutos después de la inyección, las abrazaderas se remueven y el trombo se deja crecer por 30 minutos. El agente, compuesto 32, se inyecta en una dosis de 6 µG???/kg y el área de garganta del conejillo de indias se representa por imágenes a 1 .5 T utilizando un método gradiente deteriorado TR=36, TE=5, ángulo explorador=30°. El trombo aparece brilloso en relación a la sangre. Ejemplo 12 - La obtención de una imagen MR de un trombo con un agente de contraste de objetivo con y sin sangre negra: Un conejo blanco neocelandés de 25 kg se anestesió con un coctel de Cetamina (50 mg/kg), Aceopromazina (2.5 mg/kg) y Rompon (5 mg/kg) y la anestesia se mantuvo con pentobarbital de sodio (aprox. .35 mg/kg según es necesário). Un catéter i.v. (24 g) se colocó en la vena de la oreja y la arteria de la oreja. La vena yugular y la arteria carótida se aislaron. Una estenosis Se creó en la arteria carótida al colocar una aguja de 18 g sobre la parte superior del vaso sanguíneo y después suturarla en su lugar con 3-0 de sutura. La aguja se removió así. Una parte de 5 mm de la arteria se segmentó después distalmente para la estenosis. La arteria se apretó dos veces a lo largo de la sección de 5 mm. La abrazadera vascular próxima se liberó para permitir el flujo sanguíneo en la sección por ca. 3 seg. La abrazadera se volvió a aplicar y la arteria se apretó dos veces nuevamente a lo largo de la sección de 5 mm. Después de 4 minutos, las abrazaderas se removieron. Un segmento de 5 mm de la vena yugular se aisló con abrazaderas microvasculares. Se creó un trombo al inyectar 100 µL· de 3.7 unidades de trombina, 0.06 M CaCI2 de conejo de mezcla sanguínea completa. Después de 4 minutos, las abrazaderas se removieron. Los trombos se dejaron envejecer por 50 minutos. Una solución de 1 .0 ml_ dél agente de objetivo de trombo (Estructura III, 5 mM, 2 µ????/kg) se administró por medio de la vena de oreja. Después de 10 minutos, el animal se colocó dentro de un escáner General Electric Signa LxCVi 1 .5 tesla y un primer grupo de datos MRI se obtuvo utilizando una secuencia eco de gradiente deteriorado 3D RF (SPGR: TR=39 ms, TE=3.1 ms, ángulo explorador=40 grados, campo de visión=8 cm, ancho de banda de adquisición=31 .25 kH). La saturación de grasa química se aplicó así como también 40 mm de bandas de saturación superiores e inferiores espaciales. Inmediatamente siguiendo esta exploración (8 minutos después), un segundo grupo de datos MRI se adquirió utilizando los mismos parámetros con la adición de 400 mm de bandas de saturación superiores e inferiores espaciales para generar una imagen de "sangre negra". La FIG. 4A muestra la máxima proyección de intensidad (MIP) del primer grupo de datos. Los vasos sanguíneos se mejoran parcialmente del momento de los efectos de vuelo. La FIG. 4B muestra la MIP del segundo grupo de datos en donde la señal de la sangre en corriente se suprimió (sangre negra) por el uso de bandas de saturación inferiores y superiores. En la FIG. 4A y 4B, la identificación del objetivo estacionario (un trombo) a través del uso del agente de contraste de objetivo se facilita claramente. Ejemplo 13 - Síntesis de un agente de contraste óptico: La resina NovaSyn TGR (0.20 mmol/g, 1 00 mg, 20 µ????) se lavó con NMP/éter/NMP. El peptido se instaló por el método de fase sólida estándar utilizando la activación de PyBOP/HOBt/DIEA. Después del acoplamiento del residuo de aminoácido final, el peptido unido de resina se trató con una solución de piperidina en DMF (20% en volumen, 2.0 mL) por 10 minutos para remover el grupo protector Fmoc. La resina se lavó completamente con NMP/éter/NMP, y se trató con una solución de fluorasceína-5-isotiocianato (23.4 mg, 60 µp???) y diisopropiletilamina (1 1 .6 mg, 15.7 µL·, 90 µp???) en DMF (1.5 mL) por 12 horas. La resina se lavó completamente (NMP/éter/NMP), y se trató con una solución de TI(TFA)3 (18.7 mg, 34.5 µ?t???) err DMF (1.5 mL) a 4°C por tres horas. La resina se lavó después de este tratamiento, y se trató con un coctel de TFA/TIS/agua (95/2.5/2.5, 2.0 mL) por dos horas. El peptido crudo se precipitó al agregar éter al coctel de división, y se purificó por HPLC preparativo utilizando una columna C-18 Vydac. Las estructuras A-N se formaron en esta manera y sus afinidades de fragmento de fibrina DD(E) se determinaron (Tabla 5). 2. TfXFAyDWlF, 3h aTFATIS/agua, S5Í2.5/2.5, 2h Estructuras 20 25 25 TABLA 5 Afin idad de los agentes de contraste de objetivo óptico para fibrina Kd (µ?) ID Vs. Flúor Xi X2 Xa X4 Xs Xe XT Xs Xs Xio Xl1 Xt DD(E) , D 0.061 Flúor Ahx w F H c Hyp Y(3-l) D L C H I J 0.055 Flúor Q w E C P Y G L C W I Q K 0.06 Flúor W F H C P Y D L C H I L E 0.09 Flúor Ahx G G F H C Hyp Y(3-l) D L C H C 0.097 Flúor Ahx G F H C Hyp Y(3-l) D L C H I B 0.099 Flúor Ahx F H C Hyp Y(3-l) D L C H I H 0.119 Flúor K W F H C Hyp Y(3-l) D L C H G 0.124 Flúor K G F H C Hyp Y(3- D L C H I 0.127 Flúor K G G F H C Hyp Y(3-l) D L C A 0.136 Flúor Beta-A F H C Hyp Y(3-l) D L C H I F 0.212 Flúor F H C Hyp Y(3-l) D L ' C H I El marcado de terminal N de los péptidos con probetas ópticas puede modular la afinidad de unión de los agentes de contraste ópticos. Por ejemplo, cuando se comparan los derivados de fluoresceína, 4-metoxicoumarin y tetrametilrodamina del peptido (QWECPYGLCWIQ (SEQ ID NO: 27); Kd=3 µ?) los siguientes Kd's se observaron (Tabla 6): TABLA 6 Ejemplo 14 - uroquinasa de objetivo de fibrina: La uroquinasa de objetivo de fibrina se prepara de acuerdo al siguiente procedimiento. Un péptido de unión de fibrina con un enlazador de dipéptido Gly-Gly se prepara de acuerdo a los procedimientos de fase sólida. La terminal N del peptido se bloquea con un grupo acetilo, y el ácido carboxílico de terminal C se convierte en un éster activo succinimidal. La ligación química directa se logra al mezclar la uroquinasa y el peptido activado en proporciones adecuadas en un regulador acuoso y agitar suavemente la solución por 30 minutos.
La uroquinasa de objetivo de fibrina puede purificarse por HPLC. La unión a fibrina puede valorarse. El Compuesto 1 une la fibrina selectivamente contra el fibrinogen. El modelo de vena yugular del conejo de Collen et al. (J. Clin. Invest.. 1983, 71 , 368-376) se utiliza para los ensayos de trombolosis. El compuesto (2 mg/kg) se administra por infusión de un bolo (que consiste de 20% de la dosis total) durante 1 min, junto con un bolo de heparina (300 unidades/kg) durante 1 min. El resto de la dosis se infusiona continuamente durante los siguientes 60 min, y la heparina (60 unidades/kg/hr) se infusiona continuamente durante los siguientes 180 min. A las 3 horas, los animales se sacrificaron, y los coágulos se analizaron. El compuesto 1 es más potente en la lisis de coágulo que scuPA sola. A las 3 hr, con 2 mg/kg de compuesto 1 , existe menos consumo de fibrinogen y a2-antiplasmina, en relación a las dosis equivalentes de scuPA sola, demostrando que el compuesto 1 fue más fibrina específica que scuPA sola.
OTRAS MODALIDADES Se entenderá que mientras la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción precedente se pretende que ilustre y no limite el alcance de la invención, el cual se define por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas, y modificaciones se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES 1 . Un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR, dicho método comprendiendo: a) reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal N con una porción de subunidad de enlazador para formar u n peptido modificado que tiene un grupo funcional amina de terminal C y dicho grupo funcional amina de terminal N; b) unir covalentemente una porción enlazadora al grupo funcional amina de terminal C y al grupo funcional amina de terminal N para formar un agente de representación por imágenes MR precursor; y c) ponvertir el agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación MR. 2. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la porción de subunidad de enlazador se selecciona del grupo que consiste de: en donde: n es un entero de 1 a 4; m es un entero seleccionado de 1 a 12; y R es un grupo aromático o alifático. 3. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la porción enlazadora se selecciona del grupo que consiste de en donde: m es un entero de 1 a 4; n es un entero de 0 a 4; L6 es un grupo de salida; y R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico. 4. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la porción enlazadora se selecciona del grupo que consiste de R1R*N NR'R2 R'RÍN N 1R2 en donde: LG es un grupo de salida; y R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico. 5. El método según la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque el LG se selecciona del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido, y en donde el grupo protector se selecciona del grupo que consiste de Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo, bencílo, y alilo. 6. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque el éster activado se selecciona del grupo que consiste de pentafluorofenol (Pfp), N-hidroxisuccinimida (NHS), Sal Sódica Hidroxisulfosuccinimida (NHSS), 2-Tioxotiazolidin-1 -il, e hidroxibenzotriazola (OBT). 7. El método según la reivindicación 5, caracterizado porque el haluro se selecciona del grupo que consiste de F, Cl, Br, e I. 8. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MR precursor al agente de representación por imágenes MR comprende: (a) reaccionar el agente de representación por imágenes precursor con una porción de quelato precursor para formar un enlace covalente entre la porción de quelato precursor y la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato; (b) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unido a una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; (c) y complejar un ión metálico paramagnético a la pluralidad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. 9. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la porción de quelato precursor se selecciona del grupo que consiste de: en donde Y es una porción sintética capaz de formar un enlace covalente con la porción enlazadora unida, y en donde cada X, independientemente, es un O" o un precursor de O" de tal forma que X, en la conversión a O", es capaz de formar una porción de carboxilato con su carbonilo adyacente, y R1 es una porción química sin cargar, un grupo alquilo, alifático, o grupo cicloalquilo, o versiones sustituidas sin cargar de los mismos. 10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque la porción sintética se selecciona del grupo que consiste de un ácido carboxílico, éster activado, haluro ácido, anhídrido, haluro de alquilo, isocianato, e isotiocianato, y en donde el precursor de O" se selecciona del grupo que consiste de -OH, -O e, Oet, OtBu, Obencilo, y O-alilo. 1 1 . El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la porción de quelato precursor se selecciona del grupo que consiste de: en donde LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido, y en donde cada R, independientemente, es un O" o un precursor de O" seleccionado del grupo que consiste de OH, -O-Me, O-Et, O-tBu, O-bencílo, y O-alílo, de tal forma que R, en la conversión a O", es capaz de formar una porción de carboxilato con su carbonilo adyacente. 12. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la porción de quelato precursor se selecciona del grupo que consiste de: en donde: n es un entero de 1 a 4; R se selecciona del grupo que consiste de una carga negativa y un precursor de carga negativa capaz de transformarse en una carga negativa; y X es un grupo de salida químico seleccionado del grupo que consiste de -Cl, -Br, -I, - sO, -TsO, y -TfO. 13. El método según la reivindicación 8, caracterizado porque la porción de quelato precursor se selecciona del grupo que consiste de: en donde: R se selecciona del grupo que consiste de una carga negativa y un precursor de carga negativa capaz de transformarse en una carga negativa; y X es un grupo de salida químico seleccionado del grupo que consiste de -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO, y -TfO. 14. El método según la reivindicación 12 o 13, caracterizado porque el precursor de carga negativa se selecciona del grupo que consiste de -H, -Me, -Et, .-t-Bu, -bencilo, y -alilo. 15. El método según la reivindicación 1 , caracterizado porque la porción enlazadora se conjuga covalentemente en una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. 16. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el conjugado covalente se selecciona del grupo que consiste de: en donde n es un entero de 1. a 4; LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de éster activado, haluro, y anhídrido; y R , R2, R3, R4 y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido de -Me, -Et, o t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. 17. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el conjugado covaíente se selecciona del grupo que consiste de: en donde: LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R1 , R2, R3, y R4 se seleccionan del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido de -Me, -Et, o -t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. 1 8. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el conjugado covaíente se selecciona del grupo que consiste de: Synthon 1 : Synthon 2: 1 9. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque el conjugado covalente se selecciona del grupo que consiste de: en donde: R es un grupo -tBu, LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de -OH, éster activado, haluro y anhídrido. 20. El método según la reivindicación 15, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MRI precursor en el agente de representación por imágenes MR comprende: (a) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y (b) complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para dar como resultado el agente de representación por imágenes MR. El método según la reivindicación 8 o la reivindicación 20, caracterizado porque el ión metálico paramagnético se selecciona del grupo que consiste de: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y (III), Cr(ll l), Cu(ll), Dy(lll), Tb(ll l y IV), Ho(lll), Er(l l l), Pr(l ll), Eu(l l) y Eu(lll). 22. El método según la reivindicación 21 , caracterizado porque el ión metálico paramagnético es Gd(l ll). 23. El métodó según la reivindicación 1 , comprendiendo además, antes de la etapa b), reaccionar una subunidad de enlazador con el grupo funcional amina de terminal N del peptido para dar como resultado un grupo funcional amina de terminal N derivada del peptido. 24. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque la subunidad de enlazador se selecciona del grupo que consiste de: en donde; la Base se selecciona del grupo que consiste de adenosina, guanosina, timina, y citosina; LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R es una porción aromática o alifática. 25. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque la subunidad de enlazador se selecciona del grupo que consiste de: en donde: n es independientemente un entero de 0 a 3; R es un grupo aromático o alifático; y LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de: OH, éster activado, haluro y anhídrido. 26. El método según la reivindicación 23, caracterizado porque la subunidad de enlazador se selecciona del grupo que consiste de: en donde n es independientemente 1 o 2; R es un grupo aromático o aüfático; y LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de: OH, 0 éster activado, haluro, y anhídrido. 27. Un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR, el método comprendiendo: (a) unir covalentemente un residuo de aminoácido a una porción de subunidad de enlazador para formar un extremo de terminal C 5 de un peptido, en donde la porción de subunidad de enlazador se une covalentemente a una resina; (b) sintetizar un peptido en la resina del extremo de terminal C covalentemente unido a un residuo de terminal N del peptido, el residuo de terminal N comprendiendo un grupo funcional amina de terminal N; a (c) dividir el peptido de la resina para producir un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C; (d) unir covalentemente una porción enlazadora al grupo funcional amina de terminal C del peptido y grupo funcional de amina de terminal N para formar un agente de representación por imágenes MR 5 precursor; y (e) convertir el agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR. 29. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MR en el agente de representación por imágenes MR comprende: (a) reaccionar el agente de representación por imágenes MR precursor con una porción de quelato precursor para formar un enlace covalente entre la porción de quelato precursor y la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los gru pos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato; (b) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unido en una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ion metálico paramagnético; y (c) complejar un ión metálico paramagnético a la pluralidad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. 30. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la porción enlazadora se conjuga covalentemente en una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. 31 . El método según la reivindicación 30, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MRI precursor en el agente de representación por imágenes MR comprende: (a) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y (b) complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para dar como resultado el agente de representación por imágenes MR. 32. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque el ión metálico paramagnético se selecciona del grupo que consiste de: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll y IV), Ho(lll), Er(l l l), Pr(ll l), Eu(ll), y Eu(ll l). 33. El método según la reivindicación 31 , caracterizado porque el ión metálico paramagnético es Gd(lll). 34. El método para elaborar un agente de representación por imágenes MR, el método comprendiendo: (a) reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional de carboxilato de terminal C con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene tanto un grupo funcional de carboxilato de terminal C como un grupo funcional de carboxilato de terminal N; (b) unir covalentemente una porción enlazadora a ambos grupos funcionales de carboxilato de terminal C y terminal N del peptido modificado para formar un agente de representación por imágenes MR precursor; y (c) convertir el agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR. 35. El método según la reivindicación 34, caracterizado porque la porción de subunidad de enlazador se selecciona del grupo que consiste de: en donde, LG es un grupo de salida seleccionado del grupo que consiste de OH, éster activado, haluro, y anhídrido; y R es un grupo alifático o aromático. 36. El método según la reivindicación 34, caracterizado porque la porción enlazadora se selecciona del grupo que consiste de: en donde: m es un entero de 1 a 4; n es un entero de 0 a 4; R se selecciona independientemente del grupo que consiste de -H, -Me, -Et, -Bz, y -tBu; y R1 y R2 se seleccionan independientemente de un hidrógeno o un grupo protector químico. 37. El método según la reivindicación 34, caracterizado porque la porción enlazadora se selecciona del grupo que consiste de: en donde R y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y un grupo protector químico, el grupo protector químico seleccionado del grupo que consiste de: Boc, Fmoc, CBZ, t-butilo, bencilo, y alilo. 38. El método según la reivindicación 34, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en agente de representación por imágenes MR comprende: (a) reaccionar el agente de representación por imágenes MR precursor con una porción de quelato precursor a fin de formar un enlace covalente entre la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor y la porción de quelato precursor, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, Ips grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones dé carboxilato; (b) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unido en una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ¡ón metálico paramagnético; y (c) complejar un ion metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. 39. El método según la reivindicación 34, caracterizado porque la porción enlazadora se conjuga covalentemente a una porción de quelato precursor, el conjugado covalente comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porciones de carboxilato. 40. El método según la reivindicación 39, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en agente de representación por imágenes MR comprende: (a) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato del conjugado covalente en porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; y (b) complejar un ión metálico paramagnético en la pluralidad de porciones de carboxilato para producir el agente de representación por imágenes MR. 41 . El método según la reivindicación 39, caracterizado porque el conjugado covalente se selecciona del grupo que consiste de: en donde: n es un entero de 1 a 4; y R1 , R2, R?, R4, y R5 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de una porción de acetato, una porción de acetato protegido dé -Me, -Et, o -t-Bu, una porción de acetamida, y una porción de acetoxi. 42. El método según la reivindicación 39, caracterizado porque el conjugado covalente es: 43. Un método según la reivindicación 1 , la reivindicación 27, o la reivindicación 34, caracterizado porque la conversión del agente de representación por imágenes MR precursor en el agente de representación por imágenes MR comprende: (a) reaccionar el agente de representación por imágenes precursor con una porción de quelato, en donde la porción de quelato contiene un íón metálico paramagnético, para formar un enlace covalente entre la porción de quelato y la porción enlazadora del agente de representación por imágenes MR precursor para producir el agente de representación por imágenes MR. 44. El método según la reivindicación 43, caracterizado porque el ión metálico paramagnético se selecciona del grupo que consiste de: Gd(ll l), Fe(lll), Mn(ll y II I), Cr(lll), Cu(l l), Dy(lll), Tb(l l l y IV), Ho(IH), Er(ll l), Pr(ll l), Eu(ll), y Eu(lll). 45. El método según la reivindicación 44, caracterizado porque el ion metálico paramagnético es Gd(ll l). 46. Un agente de contraste que incluye un compiejo de quelato metálico en una terminal NHR y -C02R de un biopolímero, caracterizado porque R se selecciona independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alifático, y un grupo de salida. 47. El agente de contraste según la reivindicación 46, comprendiendo dos complejos de quelato metálico en la terminal NHR y C02R del biopolímero. 48. El agente de contraste según la reivindicación 46, caracterizado porque el biopolímero tiene una afinidad de unión específica para fibrina. 49. El agente de contraste según la reivindicación 46, caracterizado porque el biopolímero es un peptido. 50. El agente de contraste según la reivindicación 49, caracterizado porque el peptido es capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras. 51 . El agente de contraste según la reivindicación 46, caracterizado porque el peptido comprende un enlace de disulfuro. 52. El agente de ontraste según la reivindicación 46, teniendo el agente de contraste la fórmula: en donde: Quelato representa un complejante de quelato metálico; Enlazador representa una porción enlazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; m es independientemente un entero de 1 a 10; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 es independientemente un hidrógeno o un grupo alifático. 53. El agente de contraste según la reivindicación 52, el agente de contraste teniendo una estructura seleccionada del grupo que consiste de: Estructura 4 Estructura 6 25 Estructura 9 Estructura 10 Estructura 13 Estructura 14 Estructura 15 Estructura 16 Estructura 18 25 Estructura 21 Estructura 23 Estructura 24 Estructura 25 Estructura 26 Estructura 27 Estructura 28 Estructura 29 Estructura 30 Estructura 31 Estructura 32 en donde Gd es un ión metálico paramagnético Gd(lll), y en donde el Gd(ll l) se coordina para la porción DTPA; y en donde la porción DTPA se une covalentemente a una porción que comprende un grupo C(=0) en un carbono de acetato o etileno en la porción de DTPA. 54. El agente de contraste según la reivindicación 52, el agente de contraste teniendo una estructura seleccionada del grupo que consiste de: Estructura 33 Estructura 34 Estructura 35 25 Estructura 37 Estructura 39 Estructura 40 Estructura 41 55. El agente de contraste según la reivindicación 52, el agente de contraste teniendo una estructura seleccionada del grupo que consiste de: Estructura 42 Estructura 43 25 ?? Estructura 50 56. Un método para alterar la estabilidad de un peptido, el peptido teniendo un grupo funcional amina de Terminal N, el método comprendiendo: (a) reaccionar el peptido con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C; y (b) unir covalentemente una porción enlazadora al grupo funcional amina de terminal C del peptido y grupo funcional amina de terminal N para formar un peptido modificado. 57. El método según la reivindicación 56, comprendiendo además reaccionar el peptido modificado con una porción de quelato precursor para formar un enlace covalente entre la porción de quelato precursor y la porción enlazadora del peptido modificado, la porción de quelato precursor comprendiendo una pluralidad de grupos precursores de carboxilato, los grupos precursores de carboxilato capaces de transformarse en porcionés de carboxilato. 58. El método según la reivindicación 57, comprendiendo además: (a) transformar una pluralidad de los grupos precursores de carboxilato de la porción de quelato precursor unido a una pluralidad de porciones de carboxilato, las porciones de carboxilato capaces de complejar un ión metálico paramagnético; (b) complejar un ión metálico paramagnético para la pluralidad de las porciones de carboxilato. 59. El método según la reivindicación 57, comprendiendo además ensayar la estabilidad del peptido modificado. 60. El método según la reivindicación 57, comprendiendo además: (a) ensayar la estabilidad de dicho peptido sin modificar; y (b) comparar la estabilidad de dicho peptido modificado a la estabilidad del peptido sin modificar. 61 . El método según la reivindicación 60, caracterizado porque la estabilidad del peptido modificado se mejora en relación a la estabilidad del peptido sin modificar. 62. El método según la reivindicación 61 , caracterizado porque la estabilidad del peptido modificado se mejora 10 pliegues en relación a la estabilidad del peptido sin modificar. 62. El método según la reivindicación 61 , caracterizado porque la estabilidad del peptido modificado se mejora 10 pliegues en relación a lá estabilidad del peptido sin modificar. 63. El método según la reivindicación 61 , caracterizado porque la estabilidad del peptido modificado se mejora 20 plieg ues en relación a la estabilidad del peptido sin modificar. 64. El método según la reivindicación 61 , caracterizado porque la estabilidad del peptido modificado se mejora 30 pliegues en relación a la estabilidad del peptido sin modificar. 65. El método según la reivindicación 59 o 60, caracterizado porque la estabilidad se ensaya utilizando un ensayo homogenato de hígado de rata. 66. Un peptido modificado que tiene la estructura: en donde: el precursor de Quelato representa una porción de precursor de quelato; Enlazador representa una porción enlazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; m es independientemente un entero de 1 a 10; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R1 es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 se selecciona del grupo que consiste de H y un grupo alifático. 67. Un peptido modificado que tiene la estructura: en donde: Enlazador representa una porción enlazadora; subunidad de Enlazador representa una porción de subunidad de enlazador; p es independientemente un entero de 0 a 5; s es independientemente 0 o 1 ; R es una cadena lateral de aminoácido o un derivado del mismo; y R2 se selecciona del grupo que consiste de H y un grupo alifático. 68. Un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR, el método comprendiendo: (a) reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional ámina de terminal N con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene un grupo funcional amina tanto en su terminal C como en su terminal N; y (b) convertir el peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR. 69. El método para elaborar un agente de representación por imágenes, MR, dicho método comprendiendo: (a) reaccionar un peptido que tiene un grupo funcional amina de terminal C con una porción de subunidad de enlazador para formar un peptido modificado que tiene un grupo funcional carboxilato tanto en su terminal C como en su terminal N; y (b) convertir el peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR. 70. Un método para elaborar un agente de representación por imágenes MR, dicho método comprendiendo: a) unir covalentemente un residuo de aminoácido a una porción de subunidad de enlazador para formar un extremo de terminal C de un peptido, en donde la porción de subunidad de enlazador se une covalentemente a una resina; b) sintetizar un peptido en la resina del extremo de terminal C unido covalentemente a un residuo de terminal N del peptido, el residuo de terminal N comprendiendo un grupo funcional amina de terminal N: c) dividir el peptido de la resina para producir un grupo funcional amina de terminal C del peptido modificado; d) convertir el peptido modificado en el agente de representación por imágenes. 71 . El método según la reivindicación 68, la reivindicación 69, o la reivindicación 70, en donde la conversión del peptido modificado en el agente de representación por imágenes MR puede incluir unir covalentemente una porción de quelato al peptido modificado, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético, para producir el agente de representación por imágenes MR. 72. El método según la reivindicación 71 , caracterizado porque el ión metálico paramagnético se selecciona del grupo que consiste de: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y IJI), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(lll y IV), Ho(lll), Er(l ll), Pr(l l l), Eu(il) y Eu(lll). 73. El método según la reivindicación 71 , caracterizado porque el ión metálico paramagnético es Gd(lll). 74. El método según la reivindicación 68, la reivindicación 69, o la reivindicación 70, caracterizado porque la conversión del peptido modificado al agente de representación MR comprende: a) unir covalentemente una porción enlazadora a una porción de quelato para formar un conjugado covalente, en donde la porción de quelato contiene un ión metálico paramagnético; y b) reaccionar el conjugado covalente con el peptido modificado para formar el agente de representación por imágenes MR. 75. El método según la reivindicación 74, caracterizado porque el ión metálico paramagnético se selecciona del grupo que consiste de: Gd(lll), Fe(lll), Mn(ll y III), Cr(lll), Cu(ll), Dy(lll), Tb(l ll y IV), Ho(lll), Er(lll), Pr(lll), Eu(ll) y Eu(lll). 76. El método según la reivindicación 74, caracterizado porque el ión metálico paramagnético es Gd(lll). 77. El método según la reivindicación 56, comprendiendo además reaccionar el peptido modificado con una porción cubierta para formar un enlace covalente entre la porción cubierta y la porción enlazadora del peptido modificado. 78. Un peptido purificado comprendiendo la secuencia de aminoácidos: P*-Y*-Xi*-L* (SEQ ID NO:1 ), en donde: P* es prolina o un derivado no natural de la misma; Y* es una tirosina o un derivado no natural de la misma; i* es G o D, o un derivado no natural de G o D; y L* es leucina o un derivado no natural del mismo; en donde al menos uno de P*, Y*, X^*, o L* es un derivado no natural del aminoácido respectivo. 79. Un peptido purificado según la reivindicación 78, caracterizado porque Xi* es G o D y en donde L* es leucina. 80. Un peptido purificado según Ja reivindicación 79, caracterizado porque P* es prolina o 4-hidroxiprolina, y en donde Y* es tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, y N02. 81. Un peptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos: X!-Xs-C- ^Y^Xa-L-C^-Xs-Xe (SEQ ID NO:2), en donde: P* es una prolina o un derivado no natural de la misma; Y* es una tirosina o un derivado no natural de la misma; Xi se selecciona del grupo que consiste de W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, Dopa e2, nTyr, dW, dF, F(3/4*), o Y(3*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et, o OMe, y en donde Y(3*) es una tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, y NOz; X2 se selecciona del grupo que consiste de E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr, y Th; X3 se selecciona del grupo que consiste G y D; X se selecciona del grupo que consiste de H, F, Y, o W; X5 se selecciona del grupo que consiste de I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fuá, Th, 4-Pal, o F(3/4*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CF3, Et, iPr, y OMe; X6 se selecciona del grupo que consiste de N, Q, I, L o V, o no se presenta; y en donde al menos uno de Xi , X2, ?ß, P* y Y* es un derivado no natural de un aminoácido. 82. Un peptido purificado según la reivindicación 81 , caracterizado porque P* es prolina o 4-hidroxiprolina, y Y* es tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, l, o N02. 83. El peptido purificado según la reivindicación 80 u 81 , el peptido además capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras. 84. El peptido purificado según la reivindicación 83, el peptido comprendiendo un enlace de disulfuro. 85. El peptido purificado según la reivindicación 83, el peptido teniendo una afinidad de unión específica para fibrina. 86. Un peptido purificado según la reivindicación 82, comprendiendo una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q- (SEQ ID NO:4) Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-0 (SEQ ID NO: 5) Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 6) W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 7) W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 8) Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ID NO: 9) Y-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 10) W-dE-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-Y-l-Q (SEQ ÍD NO: 11) F(4-OMe)-H-C-P-(4-OH)-Y-(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 12) Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-0 (SEQ ID NO: 13) -dE-C-P-Y(3-CI)-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 14) W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-l-Q (SEQ ID NO: 15) y F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-CI)-D-L-C-H-l-L (SEQ ID NO: 16). 87. El peptido purificado según la reivindicación 86, el peptido además capaz de formar un enlace de sulfuro bajo condiciones no reductoras. 88. El peptido purificado según la reivindicación 87, el peptido comprendiendo un enlace de disulfuro. 89. El peptido purificado según la reivindicación 86, el peptido teniendo una afinidad específica de unión para fibrina. 90. Un peptido según la reivindicación 81, caracterizado porque: P* es una prolina; Y* es una tirosina; i se selecciona del grupo que consiste de W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Paí, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*), o Y(3*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3 o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CH3 l CF3, NH2, CH2N H2) CN, F, Cl, Br, I, Et, o OMe, y en donde Y(3*) es una tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I, y NOz; X2 se selecciona del grupo que consiste de E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr, y Th; X3 se selecciona del grupo que consiste G y D; X4 se selecciona del grupo que consiste de H, F, Y, o W; X5 se selecciona del grupo que consiste de I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fuá, Th, 4-Pal, y F(3/4*), en donde F(3/4*) es una fenilalanina sustituida ya sea en la posición 3-o 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de CF3, Et, iPr, y OMe; y en donde al menos uno de X1 , X2 o X5 es un derivado de aminoácido no natural; y X6 se selecciona del grupo que consiste de N, Q, 1, L o V, o no se presenta. 91. El peptido purificado según la reivindicación 90, el peptido además capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras. 92. El peptido purificado según la reivindicación 90, el peptido comprendiendo un enlace de disulfuro. 93. El peptido purificado según la reivindicación 91 , el peptido teniendo una afinidad de unión específica para fibrina. 94. Un compuesto que comprende el peptido de la reivindicación 78 unido a un agente trombolítico. 95. Un peptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos: C - P* - Y* - Xi - L - C (SEQ ID NO: 3), en donde: P* es prolina o su derivado no natural 4-hidroxiprolina; Y* es tirosina o un derivado no natural de tirosina sustituida en la posición 3 con una porción seleccionada del grupo que consiste de F, Cl, Br, I y N02; con la condición de que al menos uno de P* o Y* es un derivado natural del aminoácido respectivo. 96. El peptido purificado según la reivindicación 95, el peptido además capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductores. 97. El peptido purificado según la reivindicación 95, el peptido comprendiendo un enlace de disulfuro. 98. El peptido purificado según la reivindicación 96, el peptido teniendo una afinidad de unión específica para fibrina. 99. Un compuesto que comprende el peptido de la reivindicación 95 unido a un agente trombolítico. 100. Un peptido purificado que comprende la secuencia de aminoácidos: C-D-Y-Y-G-T-C-X10 (SEQ ID NO: 17), en donde: X10 se selecciona del grupo que consiste de n(decil)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-difluoro), Amh, Hfe, Y(3,5-di-yodo), Pff, 1 Nal, dI al, y MeL, en donde F(4*) es una fenilalanina sustituida en la posición 4 con una porción seleccionada del grupo que consiste de Et, CF3, I , e iPr. 1 01 . Un peptido purificado según la reivindicación 100 comprendiendo la secuencia de aminoácidos: C-D-Y-Y-G-T-C-X10-Xi i (SEQ ID NO: 1 8), en donde: Xi i se selecciona del grupo que consiste de D, dD, ß?, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop, y Cmp. 1 02. Un peptido purificado según la reivindicación 1 01 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(Decil)G-dD (SEQ ID NO: 19) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(Decil)G-D (SEQ ID NO: 20) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (SEQ ID NO: 21 ) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (SEQ ID NO: 22) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C- eL-lnp (SEQ ID NO: 23) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID NO: 24) y L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (SEQ ID NO: 25). 103. El peptido purificado según la reivindicación 1 01 o la reivindicación 102, el peptido además capaz de formar un enlace de disulfuro bajo condiciones no reductoras. 1 04. El peptido purificado según la reivindicación 1 03, el peptido comprendiendo un enlace de disulfuro. 1 05. El peptido purificado según ta reivindicación 101 , el peptido teniendo una afinidad de unión especifica para fibrina. 1 06. Un compuesto que comprende el peptido según la reivindicación 101 unido a un agente trombolítico.
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