KR20040020074A - 펩티드계 다량체 표적화 콘트라스트제 - Google Patents

펩티드계 다량체 표적화 콘트라스트제 Download PDF

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KR20040020074A
KR20040020074A KR10-2004-7001314A KR20047001314A KR20040020074A KR 20040020074 A KR20040020074 A KR 20040020074A KR 20047001314 A KR20047001314 A KR 20047001314A KR 20040020074 A KR20040020074 A KR 20040020074A
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카라반피터디.
맥머리토마스제이.
콜로지앤드류
나이르슈리쿠마르
아메디오존씨.
뒤마스테판
왕시팡
순웨이-추안
니보로즈킨알렉산더엘.
쾨르너슈테피카.
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Abstract

본 발명은 펩티드 및 펩티드 표적화 다량체 콘트라스트제, 뿐만 아니라 콘트라스트제의 제조 방법 및 사용 방법을 제공한다.

Description

펩티드계 다량체 표적화 콘트라스트제{PEPTIDE-BASED MULTIMERIC TARGETED CONTRAST AGENTS}
진단 영상화 기법, 예를 들어 자기 공명 영상화(MRI), X-선, 핵 방사약학 영상화, 자외선-가시광선-적외선 영상화, 및 초음파는 상당 기간 동안 의학적 진단 분야에서 사용되어 왔다. 부가적으로, 콘트라스트제는 영상의 해상도를 개선 또는 증가시키거나 특정 진단 정보를 제공하기 위해 사용되어 왔다.
콘트라스트제가 효과적으로 사용되기 위해서, 콘트라스트제는 영상화 기법에 사용된 전자기 조사의 파장과 간섭하고, 조직의 물리적 특성을 변경시켜 변경된 시그널을 생성하거나, 방사약학 분야에서, 스스로 조사원을 제공하여야만 한다. MRI 및 광학적 방법은 영상화 양상(樣相)중 독특한 것인데, 그 이유는 이들은 화학적 환경에 민감한 복잡한 시그널을 나타내기 때문이다. X-선 또는 방사성핵종 제제로부터 유래하는 시그널은, 제제가 혈장 중에서 유리 상태이건, 단백질 또는 다른 표적에 결합되어 있건 동일한 상태를 유지하는 반면, MRI 및 광학적 영상화를 위한 특정 콘트라스트제는 상이한 생리학적 환경에서 다른 시그널 특성을 보유할 것이다. 콘트라스트제는 충분히 민감하고 충분히 높은 농도로 존재하여 시그널 변화를 관찰 할 수 있어야 하는 것이 중요하다.
가돌리늄 또는 다른 상자성 이온과 유기 리간드 간의 착체는 MRI 콘트라스트를 강화 및 개선시키기 위해 널리 사용되고 있다. 가돌리늄 착체는 MRI 중 콘트라스트제에 접근할 수 있는 물 분자 내에서 확인되는 양성자의 핵 자기 이완성을 증가시킴으로써 콘트라스트를 증가시킨다(Caravan, P. et al., R. B. Chem. Rev. 99, 2293 (1999)). 이들 물 분자 내 양성자의 이완성은 콘트라스트제에 접근할 수 없는 다른 물 분자 내 양성자에 비해 크다. 이완성의 이러한 변화는 영상의 개선된 콘트라스트를 유도한다. 또한, 물 분자 양성자의 특정 군집 내에서 이러한 이완성의 증가는 주어진 시간에 더 많은 영상 데이타를 수집할 수 있는 능력으로 귀착될 수 있다. 이어서, 이러한 변화는 개선된 시그널 대 노이즈 비율로 귀착된다.
또한, 영상화는, 시그널을 제공하기 위해 광학 염료를 선택하하는 경우, 광을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 600 nm 내지 1300 nm(가시영역 내지 근적외선 영역) 범위의 빛은 생물학적 조직을 통해 상대적으로 용이하게 통과하며,영상화 목적으로 사용할 수 있다. 투과되거나, 산란되거나, 반사되거나 또는 재방출된(형광) 빛은 검출되며, 영상이 생성된다. 흡광도, 반사율 또는 염료의 형광 특성의 변화, 예를 들어 흡수 피크의 수적 변화 또는 그들의 최대 파장의 변화는 생물학적 표적에 대한 결합시 발생하며, 따라서 부가의 조직 콘트라스트를 제공한다. 몇몇 상황에서, 예를 들어 신체 표면과 근접한 질병의 진단에서, UV 또는 가시광선도 사용할 수 있다.
영상화 과정의 민감성을 개선시키기 위해 표적에 영상화 부분의 충분한 농도를 전달할 수 있는 콘트라스트제뿐만 아니라, 생체 내에서 충분한 반감기를 보유하는 콘트라스트제가 여전히 요구되고 있다.
관련 출원 정보
본 출원은 미국 가출원 제60/308,721호(2001년 7월 30일)의 우선권 주장 출원이다.
기술 분야
본 발명은 진단 영상화용 콘트라스트제, 구체적으로 펩티드 표적화된 다량체 콘트라스트제에 관한 것으로, 이때 펩티드는 표적화기 및 상기 펩티드의 아미노 말단 및 카르복시 말단 둘 다에서 1 종 이상의 킬레이트를 위한 결합점으로 기능한다.
도 1은 비천연 아미노산의 화학 구조를 나타내는 도면이다.
도 2는 트리스 완충 염수내 20 MHz, 35℃에서 또는 TBS내 10 mg/㎖ 피브린에서 Gd 당 이완도를 나타내는 도면이다.
도 3은 혈전증에서 콘트라스트제의 축적을 나타내는 도면이다.
도 4A는 혈전증의 영상이며, 도 4B는 혈액이 검게 나타나는 혈전증의 영상이다.
발명의 상세한 설명
정의
본 명세서에 명백하게 정의하지 않은 통상적으로 사용되는 화학 약어는 문헌(The American Chemical Society Style Guide, Second Edition; American Chemical Society, Washington, D.C. (1997), "2001 Guidelines for Authors" J. Org. Chem. 66(1), 24A (2001), "A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide Science" J. Peptide. Sci. 5, 465-471 (1999))에서 확인할 수 있다.
본 출원의 목적을 위해, 본원에서 사용한 용어 "화학적 보호기" 또는 "보호기"는 일련의 반응에서 바람직하지 않은 반응을 방지하기 위해 1 이상의 합성 화학 단계를 통해 분자에 일시적으로 공유 결합한 임의의 화학 부분을 의미한다. 통상적인 보호기 기법은 문헌("Protecting Groups in Organic Synthesis, Third Ed." by P. Wuts 및 T. Greene, ⓒ 1999 John Wiley & Sons, Inc.)에 기술되어 있다.
본 출원의 목적을 위해, 본원에서 사용한 용어 "이탈기"는 친핵성 치환 또는 일련의 첨가-제거 반응에서 친핵성기에 의해 치환된 임의의 화학 부분을 의미한다. 이탈기를 포함하는 분자는 화학 반응에서 분리될 수 있거나, 또는 일시적인 중간체로서 동일계 내에서 형성될 수 있다.
본 출원의 목적을 위해, 본원에서 사용한 용어 "지방족"은 임의의 비고리 또는 고리, 포화 또는 불포화, 분지 또는 비분지 탄소 화합물을 의미하는데, 이때 방향족 화합물은 배제된다.
용어 "알킬"은 포화 알킬기, 예를 들어 직쇄 알킬기(예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 등), 분지쇄 알킬기(이소프로필, t-부틸, 이소부틸, 등), 시클로알킬(지환족)기(시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸), 알킬 치환된 시클로알킬기 및 시클로알킬 치환 알킬기를 의미한다. 용어 알킬은 또한 탄화수소 골격의 1 이상의 탄소를 치환하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 추가로 포함할 수 있는 알킬기를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그 골격 내에 6 개 이하의 탄소 원자(예컨대, 직쇄의 경우 C1-C6, 분지쇄의 경우 C3-C6), 더욱 바람직하게는 4 개이하의 탄소 원자를 가진다. 마찬가지로, 바람직한 시클로알킬은 그들의 고리 구조 내에 3 내지 8 개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 그들의 고리 구조 내에 5 개 또는 6 개의 탄소 원자를 포함한다. 용어 C1-C6은 1 내지 6 개의 탄소 원자를 함유하는 알킬기를 포함한다.
또한, 용어 "알킬"은 "비치환 알킬" 및 "치환 알킬" 둘 다를 포함하는 의미인데, 후자는 탄화수소 골격의 1 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 가진 알킬을 의미한다. 이러한 치환기의 예로는 알켄일, 알킨일, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포나토, 포스피나토, 시아노, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포나토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 데센일 헤테로시클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 부분을 들 수 있다. 또한, 시클로알킬은 치환된, 예를 들어, 상기한 치환기로 치환된 것일 수 있다. "아릴알킬" 부분은 아릴로 치환된 알킬(예컨대, 페닐메틸(벤질))을 의미한다. 또한, 용어 "알킬"은 천연 및 비천연 아미노산의 측쇄를 포함한다. 용어 "n-알킬"은 직쇄(즉, 비분지)의 비치환된 알킬기를 의미한다.
용어 "알켄일"은 알킬의 경우에 기술한 바와 같이 치환 또는 비치환될 수 있는 지방족기를 포함하는데, 이는 하나 이상의 이중 결합 및 2 개 이상의 탄소 원자를 포함한다. 예를 들어, 용어 "알켄일"은 직쇄 알켄일기(예컨대, 에틸렌일, 프로펜일, 부텐일, 펜텐일, 헥센일, 헵텐일, 옥텐일, 노넨일, 데센일, 등), 분지쇄 알켄일기, 시클로알켄일(지환족)기(시클로프로펜일, 시클로펜텐일, 시클로헥센일, 시클로헵텐일, 시클로옥텐일), 알킬 또는 알켄일 치환 시클로알켄일기 및 시클로알킬 또는 시클로알켄일 치환 알켄일기를 포함한다. 용어 알켄일은 또한 탄화수소 골격의 1 이상의 탄소를 치환하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 포함하는 알켄일기를 포함한다. 특정 구체예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알켄일기는 그의 골격 내에 6 개 이하의 탄소 원자를 포함한다(예컨대, 직쇄의 경우 C2-C6, 분지쇄의 경우 C3-C6). 마찬가지로, 시클로알켄일기는 그들의 고리 구조 내에 3 내지 8 개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 그들의 고리 구조 내에 5 개 또는 6 개의 탄소 원자를 보유한다. 용어 C2-C6은 2 내지 6 개의 탄소 원자를 가진 알켄일기를 포함한다.
또한, 용어 알켄일은 "미치환 알켄일" 및 "치환 알켄일" 둘 다를 포함하는 의미인데, 이때 후자는 탄화수소 골격의 1 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 치환기를 가진 알켄일 부분을 의미한다. 이러한 치환기의 예로는 알킬기, 알킨일기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐,알콕실, 포스페이트, 포스포나토, 포스피나토, 시아노, 아미노(알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노를 포함함), 아실아미노(알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도를 포함함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포나토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 데센일 헤테로시크릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 부분을 들 수 있다.
용어 "알킨일"은 길이 및 가능한 치환에서 상기한 알킬기와 유사한 불포화 지방족기를 포함하나, 하나 이상의 삼중 결합 및 2 개의 탄소 원자를 함유한다. 예를 들어, 용어 "알킨일"은 직쇄 알킨일기(예컨대, 에틴일, 프로핀일, 부틴일, 펜틴일, 헥신일, 헵틴일, 옥틴일, 노닌일, 데신일 등), 분지쇄 알킨일기 및 시클로알킬 또는 시클로알켄일 치환 알킨일기를 포함한다. 용어 알킨일은 또한 탄화수소 골격의 1 이상의 탄소를 치환하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 포함하는 알킨일기를 포함한다. 특정 구체예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킨일기는 그의 골격 내에 6 개 이하의 탄소 원자를 가진다(예컨대, 직쇄의 경우 C2-C6, 분지쇄의 경우 C6-C6). 용어 C2-C6은 2 내지 6 개의 탄소 원자를 함유하는 알킨일기를 의미한다.
일반적으로, 용어 "아릴"은 0 내지 4 개의 이종 원자를 포함할 수 있는 5원 및 6원 단환 방향족기를 포함하는 기를 의미하는데, 그 예로는 벤젠, 페닐, 피롤, 푸란, 티오펜, 티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸, 피라졸, 옥사졸, 이소옥사졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등을 들 수 있다. 또한, 용어 "아릴"은 다환 아릴기, 예를 들어 삼환, 이환, 예를 들어 나프탈렌, 벤즈옥사졸, 벤조디옥사졸, 벤조티아졸, 벤조이미다졸, 벤조티오펜, 메틸렌디옥시페닐, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 나프티리딘, 인돌, 벤조푸란, 푸란, 벤조푸란, 데아자푸란 또는 인돌리진을 의미한다. 고리 구조 내에 헤테로원자를 보유하는 이들 아릴기들은 "아릴 헤테로시클", "헤테로시클", "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"을 의미한다. 아릴기는 1 이상의 고리 위치에서 치환기로 치환된다.
본 출원의 목적을 위해, "DTPA"는 디에틸렌트리아민으로 구성되는 구조를 포함하는 화학 화합물을 의미하는데, 여기서 2 개의 1차 아민은 각각 2 개의 아세틸기에 공유 결합하고, 2차 아민은 하기 화학식에 따라 공유 결합된 1 개의 아세틸기를 가진다:
상기 식에서, X는 금속 양이온을 배위할 수 있는 헤테로원자 전자 공여기, 바람직하게는 O-, OH, NH2, OPO6 2-또는 NHR이거나, 또는 R은 임의의 지방족기이다. 각각의 X기가 tert-부톡시(tBu)인 경우, 상기 구조는 "DTPE"("E"는 에스테르를 의미함)라 칭한다.
본 출원의 목적을 위해, "DOTA"는 1,4,7,11-테트라아자시클로도데칸으로 구성되는 구조를 포함하는 화학 화합물을 의미하는데, 여기서 각각의 아민은 하기 화학식에 따랄 공유 결합된 1 개의 아세틸기를 가진다:
상기 식에서, X는 상기 정의한 바와 같다.
본 출원의 목적으로 위해, "NOTA"는 1,4,7-트리아자시클로노난으로 구성되는 구조를 포함하는 화학 화합물을 의미하는데, 여기서 상기 각각의 아민은 하기 화학식에 따라 공유 결합된 1 개의 아세틸기를 가진다:
상기 식에서, X는 상기 정의한 바와 같다.
본 출원의 목적을 위해, "DO3A"는 1,4,7,11-테트라아자시클로도데칸으로 구성되는 구조를 포함하는 화학 화합물을 의미하는데, 여기서 4 개의 아민 중 3 개의 아민은 각각 하기 화학식에 따라 공유 결합된 1 개의 아세틸기를 가지며, 다른 아민은 중성 전하를 가진 치환기를 가진다:
상기 식에서, X는 상기 정의한 바와 동일하고, R1은 하전되지 않은 화학 부분, 바람직하게는 수소, 임의의 지방족, 알킬기 또는 시클로알킬기 및 그것의 하전되지 않은 유도체이다. 바람직한 킬레이트 "HP"-DO3A는 R1= -CH2(CHOH)CH6를 가진다.
상기한 4 개의 구조 각각에서, 표시된 에틸렌의 탄소 원자는 "골격" 탄소로 언급될 수 있다. 용어 "bbDTPA"는 DTPA 분자에 대한 화학 결합 위치를 지칭하기 위해 사용할 수 있다("골격"의 경우 "bb"). 전술한 바와 같이, bb(CO)DTPA-Gd는 DTPA의 에틸렌 골격 탄소 원자에 결합된 C=O 부분을 의미함에 유념해야 한다.
용어 "킬레이팅 리간드", "킬레이팅 부분" 및 "킬레이트 부분"은 금속 이온을 배위할 수 있는 임의의 다자리 리간드를 지칭하기 위해 사용될 수 있는데, 그 예로는 DTPA(및 DTPE), DOTA, DO3A 또는 NOTA 분자, 또는 본원에 추가로 기술하는 바와 같은 임의의 적합한 다자리 킬레이팅 리간드를 들 수 있는데, 이는 직접적으로 또는 보호기의 제거 후 금속 이온을 배위하거나 또는 그렇게 할 수 있는 것이거나, 또는 적합한 보호기를 보유하거나 또는 보유하지 않은 시약이고, 콘트라스트제의 합성에 사용할 수 있고, 궁극적으로 최종 금속 착체의 금속 이온을 배위할 실질적으로 모든 원자를 포함한다. 용어 "킬레이트"는 실질적인 금속-리간드 착체를 의미하며, 다자리 리간드는 실질적으로 의학적으로 유용한 금속 이온에 배위될 것으로 이해된다.
용어 "특이적인 결합 친화성"은 다른 성분보다 높은 정도로 특정 생물학적 성분에 의해 흡수되거나, 상기 성분에 의해 보유되거나, 또는 상기 성분에 결합되는 콘트라스트제의 능력을 의미하는 것이다. 이러한 특성을 보유하는 콘트라스트제는 "표적" 성분에 "표적화"되었다고 언급된다. 이러한 특성이 결핍된 콘트라스트제는 "비특이적" 제제 또는 "비표적화된" 제제라 칭한다. 표적에 대한 결합기의 특이적 결합 친화성은 평형 해리 상수 "Kd"로 표현된다.
용어 "이완성"은 상자성 이온 또는 콘트라스트제의 밀리몰(mM) 농도 당 MRI 양 1/T1 또는 1/T2에서의 증가를 의미하는데, 그 양은 콘트라스트제가 다중 상자성 이온을 함유하는 경우 상이할 수 있으며, 이때 T1은 물 양성자 또는 물 이외의 분자내에서 확인되는 양성자를 포함하는 기타 영상화 또는 분광학적 핵의 세로 또는 스핀 격자 완화 시간이며, T2는 가로 또는 스핀-스핀 완화 시간이다. 이완성은 mM-1s-1단위로 나타낸다.
용어 "개방 배위 위치"는 일반적으로 물 또는 용매 분자에 의해 점유되는 금속 이온 상의 위치를 의미한다.
용어 "정제된"은 회합되는 자연 발생 유기 분자로부터 분리된, 또는 화학적으로 합성된 펩티드의 경우, 화학 합성에서 존재하는 임의의 다른 유기 분자로부터 분리된 것을 의미한다. 전형적으로, 상기 폴리펩티드는 임의의 다른 단백질 또는 유기 분자를 함유하지 않고 70 중량% 이상(예를 들어, 70 중량%, 80 중량%, 90 중량%, 95 중량% 또는 99 중량%)인 경우, 정제된 것으로 간주된다.
용어 "펩티드"는 길이가 약 2 내지 약 75 개의 아미노산(예를 들어, 3 내지 50 개의 아미노산)인 아미노산의 사슬을 의미한다.
용어 "생중합체"는 생물학적 시스템 내에서 자연적으로 형성된 중합체 물질을 의미한다. 특정 생중합체는 한정된 빌딩 서브유닛 세트 및 서브유닛을 연결하는 통상적인 작용기로 구성될 수 있는데, 예를 들어 펩티드는 통상적으로 아미노산 세트(천연 아미노산 또는 비천연 아미노산 둘 다)로 구성되며, 서브유닛을 연결하는 이미드 결합을 보유한다.
본 출원의 목적을 위해 사용한 용어 "다량체"는 2 개 이상의 공유 결합된 킬레이트 또는 그것의 합성 전구체를 포함하는 콘트라스트제 또는 그것의 서브유닛으로 정의된다.
용어 "천연" 또는 "자연 발생하는" 아미노산은 통상적인 20 개의 아미노산 중 하나이다. 검출 목적의 표지(예를 들어, 방사능 표지, 광학 표지, 또는 염료를 제공하기 위해 변경된 천연 아미노산은 천연 아미노산으로 간주된다. 천연 아미노산은 1문자 약어 또는 3문자 약어로 기재한다.
용어 "비천연 아미노산" 또는 "비천연"은 D 형태를 포함하는 천연 아미노산의 임의의 유도체, 및 β및 γ아미노산 유도체를 의미한다. 주의할 것은 특정 아미노산, 예를 들어 본원에서 비천연 아미노산으로 분류된 히드록시프롤린은 특정 유기체 또는 특정 단백질 내에서 자연적으로 확인될 수 있다.
용어 "안정한"은 제조가 가능할 정도로 충분한 안정성을 보유하며, 충분한 기간동안 본원에 상술한 목적을 위해 유용하고 안전하게 화합물의 완전성이 유지되는 화합물을 의미한다. 전형적으로, 이러한 화합물은 습기 또는 기타 화학적으로 반응성인 조건의 부재 하에 40℃ 이하의 온도에서 1 주 이상 동안 안정하다. 본 발명에 따른 치환기와 가변부의 결합은 단지 안정한 화합물을 형성시키는 것으로 한정된다.
본 출원의 목적을 위해 사용한 용어 "표적 결합" 및 "결합"은 콘트라스트제와 표적의 비공유 상호작용을 의미한다. 이들 비공유 상호작용은 서로 독립적이며, 특히 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용, 파이-스택킹, 수소 결합, 정전기적 회합 또는 루이스 산-염기 상호작용을 그 예로 들 수 있다.
용어 "캡핑 부분"은 킬레이트, 유기 염기, 콘트라스트제, 혈전용해 부분 또는 안정화 부분을 의미한다. 적하한 안정화 부분은 생물학적으로 불활성인, 즉 생물학적 활성을 보유하지 않는 것이다.
콘트라스트제
일반적으로, 본 발명은 N-말단 및 C-말단 아미노산 둘 다가 직접적으로 또는 임의의 개재 링커-서브유닛 및 링커에 의해 상자성 금속 이온(MRI의 경우) 또는 방사성 금속 이온(방사성핵종 영상화의 경우) 또는 광학 염료(광학 영상화의 경우)의 하나 이상의 킬레이트에 콘쥬게이트된 표적 중합체(예를 들어, 펩티드)를 포함하는, MRI 콘트라스트제, 광학 콘트라스트제 및 방사성핵종 콘트라스트제에 관한 것이다. 본원에 추가로 예시하는 바와 같이, 링커 또는 링커-서브유닛은 분지될 수 있으며, 따라서 다중 킬레이트 또는 염료가 펩티드, 즉 다량체의 각각의 단부에 부착될 수 있다. 본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 탄소 원자를 함유할 수 있으며, 따라서 라세미체 및 라세미 화합물, 단일 거울상 이성질체, 부분 입체 이성질체 혼합물 및 개개의 부분 입체 이성질체로서 발생할 수 있다. 이들 화합물의 상기한 바와 같은 모든 이성질체 형태는 본 발명에 포함되는 것으로 이해된다. 각각의 입체 형성 탄소(stereogenic carbon)는 특별한 언급이 없으면 R 또는 S 배치일 수 있다. 본원에 예시된 특정 화합물이 특정 입체화학 배치로 기술될 수 있음에도 불구하고, 임의의 키랄 중심에서 반대 입체 화학을 가진 화합물 또는 이의 혼합물도 고려된다. 본 발명의 화합물은 용액, 약학 조성물 및 생체 내에서 다양한 배좌 및 이온 형태를 채택할 수 있다. 본 발명의 특이적인 바람직한 화합물이 특정 배좌 또는 이온 형태로 기술되는 경우에도, 본 발명은 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 신규한 펩티드계 다량체는 표적화된 콘트라스트제로서 몇 가지 이점을 제공한다:
1. 상기 화합물은 단일 표적화 펩티드를 이용하여 표적에 2 개 이상의 캡핑 부분(예를 들어, 킬레이트, 유기 염료 또는 혈전 용해제)를 전달하여 조직 콘트라스트에서 충분한 개선점이 관찰되게 할 수 있는데, 이는 부분적으로 표적 주위의 영상화 부분의 유의적인 농도 때문이다.
2. 또한, 본 발명의 MRI 콘트라스트제는 표적에 결합시 높은 이완성을 나타내는데, 이는 표적에 결합되는 경우 개개의 킬레이트의 국소 운동을 제한할 수 있는 펩티드의 능력과 결부된 수용체 유도된 자기 증강(RIME) 효과에 기인한 것이다.
3. 상기 화합물은 하나 이상의 표적에 대한 높은 친화성을 보유한다.
4. 상기 화합물은 본원에 기술된 방법에 따라 비교적 용이하게 합성되고 분자당 단지 하나의 펩티드가 필요하기 때문에, 다수의 금속 이온 또는 유기 염료가 표적에 더 경제적으로 전달될 수 있다.
5. 본 발명의 화합물은 감소된 효소 대사(예를 들어, 펩티다제에 의한 감소된 절단)으로 인해 생체 내에서 더 높은 안정성(즉, 더 긴 반감기)를 보유할 수 있다.
본 발명에 따른 펩티드계 다량체의 이러한 바람직한 특징으로 인해 펩티드계 다량체는 더 유용한 표적화된 콘트라스트제가 된다.
본 발명에 따라 고려되는 MRI 콘트라스트제 및 방사성핵종 콘트라스트제의 화학 구조는 하기 화학식으로 예시할 수 있다:
상기 식에서, 각각의 m은 독립적으로 1 ≤m ≤10이고, 킬레이트는 금속 킬레이트 착체를 의미하며, p는 독립적으로 정수 0 내지 5이고, s는 독립적으로 1 또는 0이며, R1은 비천연 아미노산의 측쇄를 포함하는 임의의 아미노산 측쇄이고; R2는 임의의 지방족기 또는 수소이며; n은 정수 3 내지 50(3과 50 포함)이다. 대안으로, R1및 R2는 함께 고리 구조(프롤린 및 이의 치환된 형태를 포함함)를 형성할 수 있다. 링커는 존재하는 경우 상이할 수 있다.
MRI용으로 바람직한 금속 이온으로는 원자 번호 21 내지 29, 39 내지 47 또는 57 내지 83의 원소, 더 바람직하게는 원자 번호 21 내지 29, 42, 44 또는 57 내지 83의 금속 이온의 상자성 형태를 들 수 있다. 특히 바람직한 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV),Ho(III), Er(III), Pr(III) 및 Eu(II 및 III)로 구성된 군 중에서 선택된다. Gd(III)가 특히 유용하다. 본원에 사용한 용어 "Gd"는 가돌리늄 금속의 이온 형태를 의미하는 것으로, 예를 들어 이온 형태는 GD(III), GD3+, gado 등으로 표현하는데, 고려된 이온 형태의 차이는 없음에 유념해야 한다.
방사성핵종 영상화제의 경우, 방사성핵종90Y,99mTc,111In,47Sc,67Ga,51Cr,177mSn,67Cu,167Tm,97Ru,188Re,177Lu,199Au,203Pb 및141Ce가 특히 유용하다. 또한, 유용한 광학 특성을 보유하는 금속 착체도 기술한다(Murru et al., J. Chem. Soc. Chem. Comm. 1993, 1116-1118 참조). 킬레이트를 이용하는 광학 영상화에서, 란탄계열 킬레이트, 예컨대 La(III), Ce(III), Pr(III), Nd(III), Pn(III), Sm(III), Eu(III), Gd(III), Tb(III), Dy(III), Ho(III), Er(III), Tm(III), Yb(III) 및 Ln(III)가 유용하다. Eu(III) 및 Tb(III)가 특히 유용하다.
금속 킬레이트는 표적 조직에 결합하는 동안을 포함하여 신체를 통해 영상화제가 통과하는 도중에 임의의 유의적인 정도로 해리되지 않아야 한다. 유리 금속 이온의 유의적인 방출은 일반적으로 허용될 수 없는 독성을 유발시킬 수 있다.
한 구체예에서, 콘트라스트제의 상기 구조에서, m은 2이고, n, s, R1및 R2는 상기 정의한 바와 같고, 링커 부분은 하기를 포함한다:
"킬레이트"는 bb(CO)DTPA·Gd가 바람직하다.
다른 구체예에서, 콘트라스트제의 상기 구조에서, m은 2이고, n, s, R1및 R2는 상기 정의한 바와 같고, 링커 부분은 하기를 포함한다:
"킬레이트"는 bb(CO)DTPA·Gd가 바람직하다.
예시를 목적으로, 본 발명에서 고려된 한 콘트라스트제는 하기하는 바와 같이 주석을 단 여러 가지 서브유닛을 가진다:
상기 식에서, R은 상기 펩티드가 생물학적 표적에 대한 친화성을 갖도록 하는 아미노산 측쇄이며, m은 금속 이온(MRI의 경우 상자성 금속 이온, 방사성핵종 영상화의 경우 방사성 금속 이온, 광학 영상화의 경우 형광, 발광 또는 흡광 금속이온)이다.
본 발명에 의해 고려되는 광학 콘트라스트제의 화학 구조는 하기 화학식으로 예시된다:
상기 식에서, 각각의 m은 독립적으로 1 ≤m ≤10이고, p는 독립적으로 정수 0 내지 5이며, n은 정수 3 내지 50(3과 50 포함)이고, R1은 비천연 아미노산의 측쇄를 포함하는 임의의 아미노산 측쇄이며; R2는 임의의 지방족기 또는 수소이다. 대안으로, R1및 R2는 함께 고리 구조(프롤린 및 이의 유도체를 포함함)를 형성할 수 있다. 상기 펩티드의 N-말단 및 C-말단 아미노산은 직접적으로 또는 임의의 링커(예를 들어, p = 0 또는 1)에 의해 광학 염료에 콘쥬게이트될 수 있다. 링커 부분은 상이할 수 있다.
광학 염료는 유기 염료 또는 적합한 금속 킬레이트일 수 있다. 광학 영상화에 적합한 유기 염료는 기술하였으며, 그 예로는 형광 포르피린 및 형광 프탈로시아닌(예컨대, 미국 특허 제5,641,878호 참조), 미립자 물질(예컨대, WO 96/23524호 참조) 및 폴리메틴 염료(예컨대, WO 97/13490 참조)를 들 수 있다. 통상적으로 사용되는 광학 염료는 플루오레신, 로다민(Kojima H et al., Anal. Chem. 73, 1967-1973 (2001)), 테트라메틸로다민(예컨대, Anal. Biochem. 223, 39 (1994)) 및 텍사스 레드(예컨대, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 3546 (1988))이다. 플루오레신및 발광성 란탄계열 킬레이트가 특히 유용하다.
표적 및 표적 결합 펩티드
본 발명의 콘트라스트제의 펩티드 부분은 생물학적 표적에 대한 특이적인 결합을 나타내며, 각각의 단부에서 하나 이상의 킬레이트를 위한 결합점으로서 기능할 수 있다. 일반적으로, 생물학적 표적은 저농도(예를 들어, 마이크로몰 이하)로 존재하며 기존의 단량체 가돌리늄 착체 MRI 콘트라스트제를 이용하는 경우에는 효율적으로 영상화되지 않는다. 그러나, 본 발명에 따른 펩티드계 다량체성 MRI 콘트라스트제는 표적에서 상기 제제의 훨씬 더 높은 농도를 제공할 뿐만 아니라, 이들 표적을 영상화하기 위한 높은 이완성을 제공하는 것이 가능하다. 유사하게, 본 발명의 펩티드계 다량체성 방사성핵종 콘트라스트제는 더 많은 방사성핵종을 표적에 전달하여 영상화를 추가로 개선시킬 수 있다. 표적화가 영상화하려는 위치에서 영상화제의 증가된 농도를 생성하며, RIME 효과를 통해 결합된 상태에서 MRI 콘트라스트제의 이완성을 증가시키고, 또한 결합된 펩티드를 부동화함으로써 국소 킬레이트 운동을 제한하는 것으로 생각되는데, 이러한 견해가 특정 메카니즘에 국한되는 것은 아니다.
콘트라스트제에 대한 표적은 임의의 신체 구획 세포, 장기 또는 조직 또는 이의 성분일 수 있다. 바람직한 표적은 진단 및 치료와 관련된 것으로서, 질병 상태와 관련되어 있는 것이다. 특히 바람직한 표적은 체액과 관련된 것이며, 구체적으로 혈액, 혈장, 림프 및 중추신경계액과 관련된 것이다. 기타 바람직한 표적은 고농도로 존재하거나 특정 리간드에 대한 다수의 결합 위치를 가진 단백질 및 수용체이다. 이러한 표적 단백질 중에는 효소와 당단백질이 포함된다.
인간 혈청 알부민(HSA) 및 피브린이 MRI 콘트라스트제에 대한 유용한 표적이다. 맥관 혈액 풀 영상화에서, 혈청 알부민은 바람직한 표적이다. HSA는 혈청 내에 고동도(약 0.6 mM)로 존재하여 이상적으로 높은 친화성으로 광범위한 분자 어레이에 결합하기 때문에, 이는 혈액 풀 콘트라스트제에 대한 바람직한 표적 혈장 단백질이다. HSA는 심혈관 영상화에서 특히 바람직한 표적이다(1997년 7월 24일에 출원된 미국 특허 출원 번호 제08/875,365호 및 WO 96/23526호 참조).
혈전증 영상화에서, 피브린은 바람직한 표적인데, 그 이유는 피브린이 모든 응혈 내에 존재하며, 정상적인 혈전 용해 과정을 방해하지 않고 표적화될 수 있기 때문이다. 피브린 결합 펩티드를 포함하는 표적 결합 부분에 관한 추가의 상세한 설명은 PCT 특허 출원 WO 01/09188호를 참조할 수 있다.
다른 단백질 표적으로는 알파산 당단백질, 피브리노겐, 콜라겐, 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체, 주화성 펩티드 수용체, 소마토스타틴 수용체, 혈관 활성 장 펩티드(VIP) 수용체, 봄베신/가스트린 방출 펩티드 수용체 및 인테그린 수용체를 들 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용하기 위한 적합한 펩티드로는 상기한 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드를 포함한다. 실제로, 이러한 펩티드 중에는 혈전증 영상화를 위해 혈소판 GPIIb/IIIa 수용체를 표적화하는 RGD-함유 펩티드, 감염/염증 영상화를 위해 백혈구를 표적화하는 주화성 펩티드, 종양 영상화를 위해 소마토스타틴 수용체를 표적화하는 옥트레오티드와 P-829 펩티드, 종양 영상화를 위해 VIP 수용체를표적화하는 혈관활성 장 펩티드(VIP), 종양 영상화를 위한 봄베신/가스트린 방출 펩티드 수용체를 표적화하는 봄베신 유사체 및 종양 영상화를 위해 인테그린 αvβ3(비트로넥틴 수용체)를 표적화하는 RGD-함유 펩티드가 있다.
원칙적으로, 생물학적 표적에 대한 친화성을 보유하는 임의의 펩티드는 본 발명의 콘트라스트제에 사용할 수 있다. 상기 펩티드는 선형이거나 고리형일 수 있다. 보통, 불용성의 친유성 펩티드는 약학적 용도를 위해 부적절한 것으로 간주되나, 이러한 펩티드는 본 발명에 따라 적합할 수 있는데, 그 이유는 펩티드의 두 말단에 친수성 금속 킬레이트를 첨가하면 가용성이 증가될 수 있기 때문이다. 합성의 용이성 및 비용을 고려하면, 상기 펩티드는 3 내지 50 개의 아미노산(예를 들어, 길이가 3 내지 30, 3 내지 20, 3 내지 15, 5 내지 30, 5 내지 20, 5 내지 15, 10 내지 12 아미노산임)을 보유하는 것이 바람직하다.
본 발명의 표적화 펩티드에서, 다양한 아미노산이 사용될 수 있다. 적합한 아미노산으로는 천연 및 비천연 아미노산을 들 수 있다. 펩티드의 고상 합성에서 중간체용으로 적합한 다수의 상이한 보호기를 보유하는 아미노산이 시판되고 있다. 통상적으로 자연 발생하는 20 개의 아미노산 이외에, 하기하는 비천연 아미노산 또는 아미노산 유도체가 본 발명의 펩티드 표적화기의 구성성분일 수 있다(통상적인 약어는 괄호 내에 표기하였으며, 도 1을 참조할 수 있다): β-알라닌(β-Ala), γ-아미노부티르산(GABA), 2-아미노부티르산(2-Abu), α,β-데히드로-2-아미노부티르산(Δ-Abu), 1-아미노시클로프로판-1-카르복실산(ACPC), 아미노이소부티르산(Aib), 2-아미노-티아졸린-4-카르복실산, 5-아미노발레르산(5-Ava), 6-아미노헥산산(6-Ahx), 8-아미노옥탄산(8-Aoc), 11-아미노운데칸산(11-Aun), 12-아미노도데칸산(12-Ado), 2-아미노벤조산(2-Abz), 3-아미노벤조산(3-Abz), 4-아미노벤조산(4-Abz), 4-아미노-3-히드록시-6-메틸헵탄산(스타틴, Sta), 아미노옥시아세트산(Aoa), 2-아미노테트랄린-2-카르복실산(Atc), 4-아미노-5-시클로헥실-3-히드록시펜탄산(ACHPA), 파라-아미노페닐알라닌(4-NH2-Phe), 비페닐알라닌(Bip), 파라브로모페닐알라닌(4-Br-Phe), 오르토-클로로페닐알라닌(2-Cl-Phe), 메탄-클로로페닐알라닌(3-Cl-Phe), 파라-클로로페닐알라닌(4-Cl-Phe), 메타-클로로티로신(3-Cl-Tyr), 파라-벤조일페닐알라닌(Bpa), t-부틸글리신(Tle), 시클로헥실알라닌(Cha), 시클로헥실글리신(Chg), 2,3-디아미노프로피온산(Dpr), 2,4-디아미노부티르산(Dbu), 3,4-디클로로페닐알라닌(3,4-Cl2-Phe), 3,4-디플루오로페닐알라닌(3,4-F2-Phe), 3,5-디요오도티로신(3,5-I2-Tyr), 오르토-플루오로페닐알라닌(2-F-Phe), 메타-플루오로페닐알라닌(3-F-Phe), 파라-플루오로페닐알라닌(4-F-Phe), 메타-플루오로티로신(3-F-Tyr), 호모세린(Hse), 호모페닐알라닌(Hfe), 호모티로신(Htyr), 5-히드록시트립토판(5-OH-Trp), 히드록시프롤린(Hyp), 파라-요오도페닐알라닌(4-I-Phe), 3-요오도티로신(3-I-Tyr), 인돌린-2-카르복실산(Idc), 이소니페코트산(Inp), 메타-메틸티로신(3-Me-Tyr), 1-나프틸알라닌(1-Nal), 2-나프틸알라닌(2-Nal), 파라-니트로페닐알라닌(4-NO2-Phe), 3-니트로티로신(3-NO2-Tyr), 노르루신(Nle), 노르발린(Nva), 오르니틴(Orn), 오르토-포스포티로신(H2PO3-Tyr), 옥타히드로인돌-2-카르복실산(Oic), 페니실아민(Pen), 펜타플루오로페닐알라닌(F5-Phe), 페닐글리신(Phg), 피페콜산(Pip), 프로파르길글리신(Pra),피로글루탐산(pGlu), 사르코신(Sar), 테트라히드로이소놀린-3-카르복실산(Tic) 및 티아졸리딘-4-카르복실산(티오프롤린, Th). 아미노산의 입체화학은 전술한 명칭 또는 약어와 "D" 또는 "d" 또는 "L" 또는 "l"에 의해 지정될 수 있다. 부가적으로, αN-알킬화 아미노산을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 아실화되거나 알킬화된 아민 함유 측쇄를 보유하는 아미노산(예를 들어, Lys 및 Orn)도 사용할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 화학식 P*-Y*-X1*-L*(서열 번호1)을 포함할 수 있는데, 상기 식에서, P*는 프롤린 또는 프롤린의 비천연 유도체이고, Y*는 티로신 또는 이의 비천연 유도체이며, X1*는 글리신 또는 아스파르트산 또는, 글리신 또는 아스파르트산의 비천연 유도체이고, L*는 루신 또는 이의 비천연 유도체이다. 전형적으로, P*, Y*, X1* 또는 L* 중 1 이상은 각각의 아미노산의 비천연 유도체이다. 예를 들어, X1*는 글리신 또는 아스파르트산일 수 있고, L*는 루신일 수 있으며, P* 또는 Y* 중 1 이상은 비천연 유도체, 예를 들어 3번 위치에서 F, Cl, Br, I 또는 NO2로 치환된 히드록시프롤린 또는 티로신일 수 있다.
또한, 본 발명의 펩티드는 화학식 X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(서열 번호 2)를 포함할 수 있는데, 상기 식에서, P*는 프롤린 또는 이의 비천연 유도체이고, Y*는 티로신 또는 이의 비천연 유도체이고, X1은 W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) 또는 Y(3*)이다. F(3/4*)은 CH6, CF6, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et 또는 Ome와 같은 부분으로3번 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌일 수 있다. Y(3*)은 F, Cl, Br, I 및 NO2와 같은 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신일 수 있다. X2는 E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr 또는 Th일 수 있고; X3은 G 또는 D일 수 있고; X4는 H, F, Y 또는 W일 수 있고; X5는 I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal 또는 F(3/4*)일 수 있는데, 이때 F(3/4*)는 CF6, Et, iPr 또는 OMe와 같은 부분으로 3번 위치 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이며; X6은 N, Q, I, L 또는 V이거나, 존재하지 않는다. 전형적으로, X1, X2, X5, P* 및 Y* 중 1 이상은 아미노산의 비천연 유도체이다. 예를 들어, P*는 프롤린일 수 있고, Y*는 F, Cl, Br, I 또는 NO2와 같은 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신의 비천연 유도체일 수 있다. 대안으로, P*는 4-히드록시옥시프롤린과 같은 프롤린의 비천연 유도체일 수 있고, Y*는 티로신일 수 있다. 상기한 바와 같은 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있다.
피브린에 결합할 수 있는 펩티드의 다른 예로는 화학식 C-P*-Y*-X1-L-C(서열 번호 3)를 들 수 있는데, 상기 식에서, X1은 G 또는 D이고, P*는 프로린 또는 그의 비천연 유도체인 4-히드록시프로린이며; Y*는 티로신 또는 F, Cl, Br, I 또는 NO2와 같은 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신의 비천연 유도체이다. 전형적으로, P* 또는 Y*중 하나 이상은 각각의 아미노산의 비천연 유도체이다. 예를 들어, 상기 펩티드는 하기 서열을 보유할 수 있다: W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(서열 번호 5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(서열 번호 7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(서열 번호 8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(서열 번호 9), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(서열 번호 10), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(서열 번호 11), F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(서열 번호 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 13), W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 15) 또는 F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(서열 번호 16). 상기한 바와 같은 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있다.
WO 01/09188호 또는 WO 01/08712호에 기재된 방법과 같은 표준 합성법에 따라, 하기 표 1에 기재한 서열을 보유하는 펩티드를 합성하고(구조는 질량 분광 분석으로 확인하였다), 고리화하고, 피브린의 DD(E) 단편에 대한 친화성을 분석하였다. 각각의 펩티드는 Kd≤10 μM("-"는 절단을 의미한다)인 것으로 확인되었다.
또한, 펩티드는 화학식 C-D-Y-Y-G-T-C-X10(서열 번호 17)을 보유할 수 있는데, 상기 식에서, X10은 n(데실)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-디플루오로), Amh, Hfe, Y(3,5-디요오도), Pff, 1Nal, d1Nal 또는 MeL이며, 이때 F(4*)는 Et, CF3, I 또는 iPr과 같은 부분으로 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이다. 몇몇 구체예에서, 펩티드는 추가 잔기 X1, P* 및/또는 X11을 포함하여 화학식 C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(서열 번호 18) 또는 X1-P*-C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(서열 번호 26)을 제공할 수 있는데, 상기 식에서, X1은 임의의 천연 또는 비천연 아미노산이고, P*는 프롤린 또는 이의 비천연 아미노산이며, X11은 D, dD, βD, Inp, Nip, Me-D, Cop 또는 Cmp이다. 예를 들어, 펩티드는 서열 L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-dD(서열 번호 19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-D(서열 번호 20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(서열 번호 21), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(서열 번호 22), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp(서열 번호 23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(서열 번호 24) 또는 L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(서열 번호 25)를 보유할 수 있다.
서열 번호 26의 화학식을 보유하는 펩티드는 WO 01/09188호 또는 WO 01/08712호에 기재된 방법과 같은 표준 합성법으로 합성하고(구조는 질량 분광 분석으로 확인함), 피브린의 DD(E) 단편에 대한 친화성을 분석하였다. 각각의 펩티드는 Kd ≤10 μM인 것으로 확인되었다(표 2).
HSA 또는 피브린과 같은 표적에 결합할 수 있는 펩티드의 능력은 공지된 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들어, 피브린에 대한 펩티드의 친화성은 55 kD(단편 E) 및 190 kD(단편 DD)의 서브유닛을 함유하는, 피브린의 DD(E) 단편을 이용하여 평가할 수 있다. 상기 DD(E) 단편은 비오티닐화되고 아비딘에 의해 고형 기재(예를 들어, 다중 웰 플레이트)에 고정화될 수 있다. 펩티드는 적합한 완충액 내에서 고정화된 DD(E) 단편과 함께 항온처리하고, 결합은 공지된 방법을 이용하여 검출할 수 있다(예컨대, WO 01/09188 참조).
N-말단 및 C-말단 링커-서브유닛 및 링커
존재할 경우, 링커-서브유닛 및 링커를 펩티드의 두 말단에 캡핑 부분, 예컨대 킬레이트, 혈전 용해제 및 기타 기들을 공유 결합시키는 데 사용한다. 링커-서브유닛 부분은 (i) C-말단 카르복실레이트의 작용기를 아민 작용기로 또는 N-말단 아민의 작용기를 카르복실레이트 작용기로 전환시킬 수 있거나 또는 (ii) 펩티드 말단과 링커, 또는 존재할 경우, 캡핑기 간에 스페이서 부분이나 기를 제공할 수있다. 한 구체예에서, 펩티드를 링커-서브유닛과 반응시켜 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기를 갖는 변성 펩티드를 형성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 펩티드를 링커-서브유닛과 반응시켜 N-말단 카르복실레이트 작용기 및 C-말단 카르복실레이트 작용기를 갖는 변성 펩티드를 형성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 수지와 결합된 C-말단 링커-서브유닛으로부터 펩티드를 합성할 수 있어 펩티드를 수지로부터 개열할 때 C-말단 아민 작용기를 갖는 펩티드를 생성한다. 또 다른 구체예에서, 링커-서브유닛을 말단 작용기를 변화시키지 않고 스페이서기로서 사용할 수 있다. 링커-서브유닛은 링커 부분들 또는 캡핑 부분들의 결합을 위한 다작용기를 가질 수 있다. 아실화, 환원 아민화, 친핵성 치환 반응, 우레아 형성, 티오우레아 형성 및 링커-서브유닛을 펩티드, 링커 및/또는 캡핑 부분에 화학적으로 콘쥬게이트시킴에 있어 화학선택적 결찰을 비롯한 다수 유형의 반응을 사용할 수 있다. 링커-서브유닛을 사용하는 이점 중 하나는 펩티드 상에 유사한 작용기를 생성하여 차후 합성을 용이하게 한다는 것이다.
1 이상의 캡핑 부분을 펩티드 말단에 공유 결합시키기 위하여 링커 부분을 사용할 수 있다. 링커는 분지되거나 분지되지 않을 수 있고, 킬레이트 결합 및 전구체 킬레이트를 위한 다작용기를 포함할 수 있다. 링커의 화학적 구조는 친화성, 안정성, 혈액 반감기, 이완성 및 혈장 단백질 결합과 같은 콘트라스트제의 물리적 및 약리학적 특성에 영향을 줄 수 있다. 링커는 알킬, 아릴, 알켄일 또는 알킨일 기로 치환될 수 있다. 각 말단의 링커는 존재할 경우 일반적으로 MRI 콘트라스트제에 대하여 비교적 작고 강성이다. 예컨대, 링커의 분자량은 약 350 미만(예컨대,약 200 미만)일 수 있다.
C-말단 링커-서브유닛 부분 및 C- 및 N-말단 링커의 예는 하기의 구조로 예시된다:
펩티드의 C-말단 카르복실레이트는 링커-서브유닛(예컨대, 디아민 합성 단위체)으로 아민 작용기로 전환되어, 나머지 링커 부분이 결합할 수 있는 펩티드의 각 말단에 아민 작용기를 갖는 펩티드를 형성할 수 있다. C-말단 아민 작용기를 갖도록 변성된 이러한 펩티드의 예는 다음과 같다:
상기 식에서, n은 1 내지 4이다.
다수의 디아민 C-말단 링커-서브유닛은 고상 수지로부터 용이하게 유도될 수있다:
하기의 수지(R)는 Nova Biochem이 시판하는 제품이다:
몇몇의 경우, 하기 링커-서브유닛을 N-말단 아민 작용기에서 스페이서기로서사용할 수 있다:
상기 식에서, "염기"는 푸린 또는 피리미딘 염기("Ad"는 아데노신, "Gu"는 구아노신, "Th"는 티민, "Cy"는 시토신)이고 "LG"는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 또는 무수물과 같은 이탈기이다.
또한, αN-알킬화 아미노산을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 하기의 예들과 같이 아민이 아실화 또는 알킬화된 아민 함유 측쇄(dPzjseo, Lys 및 Orn)를 갖는 아미노산을 사용할 수 있다:
상기 식에서, n은 0 내지 3의 정수이고, R은 임의의 지방족 또는 방향족기이며, LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물과 같은 이탈기이다.
또 다른 링커-서브유닛은 다음을 포함한다:
상기 식에서, n은 독립적으로 1 또는 2이고, R은 임의의 지방족 또는 방향족기이며, LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물과 같은 이탈기이다.
펩티드 분자가 두 말단 아민기를 갖는 아미드 결합 구조 전략을 따를 경우 유용한 링커 부분의 예는 다음을 포함한다:
상기 식에서, 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며, LG는 이탈기이고, R' 또는 R"은 독립적으로 수소 또는 화학적 보호기이다.
링커 부분은 2 이상의 킬레이트의 결합을 위한 분지점을 가질 수 있다. 예컨대, 아미드 결합 형성 전략을 따를 경우, 이탈기 LG(예컨대, 카르복실산 또는 활성화 에스테르)를 갖는 카르보닐 및 3 개 이상의 보호된 아민을 포함하는 링커는 펩티드 아민으로 보호되어 3 개 이상의 말단 아민을 갖는 분자를 생성시킬 수 있다. 하기의 카르보닐계 링커 시약은 3 개 이상의 아민 작용기를 도입하는 데 적절할 수 있다:
상기 식에서, LG는 이탈기(예컨대, -OH, 활성화 에스테르, 예컨대 펜타플루오로페놀(Pfp), N-히드록시숙신이미드(NHS), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염(NHSS), 2-티옥속티아졸리딘-1일 또는 히드록시벤조티아졸(HBT))이고, R1및 R2는 바람직하게는 독립적으로 수소 또는 화학적 보호기(예컨대, Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 또는 알릴)이다.
다른 구체예에서, 펩티드의 N-말단에서 아민 작용기는 고리 산 무수물(링커-서브유닛 부분)과의 반응에 의하여 N-말단 카르복실레이트 작용기로 전환되어 N-말단 카르복실레이트 작용기를 갖는 변성 펩티드를 생성할 수 있다:
N-말단 아민을 카르복실레이트 작용기로 전환시키기 위하여 사용할 수 있는 다른 링커-서브유닛의 예는 다음을 포함한다:
상기 식에서, R은 임의의 지방족 또는 방향족기이다.
차후, 상기 예의 두 말단 카르복실레이트는 하기에 나타낸 바와 같이 링커 부분 상의 아미노기와 동시에 반응하여 전구체 MR 영상화제를 형성할 수 있다. 이 예에서, 전구체 MR 영상화제는 아미드 결합을 통하여 양 말단의 링커로 유도되는 펩티드 분자이다:
2 개의 카르복실레이트로 종결되는 전구체 MR 영상화제를 제조하는 데 유용한 추가의 링커 부분의 구체적 예는 다음과 같다:
상기 식에서, 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4이고, n은 독립적으로 0 내지 4이며(예컨대, n은 1 또는 2), R은 수소, 또는 메틸, 에틸, 벤질 또는 t-부틸과 같은 적절한 화학적 보호기이다. 이들 예에서는, 링커-서브유닛의 결합 후, 보호기는 제거되고, 킬레이트 부분 또는 전구체 킬레이트 부분은 예컨대, 아미드 결합 형성과 같은 표준 방법으로 결합될 수 있다.
펩티드 분자가 2 개의 카르복실레이트로 종결되는 아미드 결합 구축 전략을 따를 경우, 3 개 이상의 아미드 작용기를 도입시키기 위하여 하기의 링커 시약들이 적절할 수 있다:
상기 식에서, R1및 R2는 독립적으로 수소, 또는 OS, Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 또는 알릴과 같은 화학적 보호기이다.
아미드 결합의 형성과 관계있는 링커 전략은 일반적으로 펩티드 상의 보호기와 상용성이 있으므로 유용하다. 상기한 바와 같이, 펩티드, 링커 및 링커-서브유닛은 다른 결합 유형(예컨대, 친핵성 치환, 환원 아민화 및 티오우레아 형성)의 형성에 의해 서로 공유 결합할 수 있다.
링커는 또한 친화성, 약물동력학적 특성, 생체내 안정성 및 이완성과 같은 콘트라스트제의 특성에 영향을 줄 수 있다.
대안으로, 링커 부분과 킬레이트 부분 또는 전구체 킬레이트 부분을 둘 다 포함하는 공유 결합 콘쥬게이트를 적절한 말단 작용기를 갖는 펩티드와 직접 반응시킬 수 있다. 말단 카르복실레이트 기와 반응할 수 있는 이러한 공유 결합 콘쥬게이트의 한 예는 다음과 같다:
상기 식에서, n은 1 내지 4이고, R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트기, 아세트아미드기 또는 아세톡시기이다.
이러한 공유 결합 콘쥬게이트의 또 다른 예는 하기의 구조를 가진다:
상기 식에서, R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트기, 아세트아미드기 또는 아세톡시기이다.
두 말단에 카르복실레이트 작용기를 갖는 변성 펩티드를 전구체 영상화제로 전환시키는 데 유용한 공유 결합 콘쥬게이트의 예는 하기의 구조를 가진다:
변성 펩티드 상에서 아민 작용기와 반응할 수 있는 공유 결합 콘쥬게이트의예는 하기와 같다:
상기 식에서, LG는 이탈기이고, n은 1 내지 4이며, R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트기, 아세트아미드기 또는 아세톡시기이다.
상기 식에서, LG는 이탈기이고, n은 1 내지 4이며, R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트기, 아세트아미드기 또는 아세톡시기이다.
다량체 콘트라스트제를 합성하는 데 특히 유용한 공유 결합 콘쥬게이트는 하기의 구조를 갖는데, 이하에서는 "합성 구조체 1"이라 하겠다:
다량체를 합성하는 데 유용한 공유 결합 콘쥬게이트의 또 다른 구체예는 하기의 구조를 갖는데, 이하에서는 "합성 단위체 2"라 하겠다:
상기에서 개괄한 바와 같이, 펩티드를 포함하는 본 발명 MRI 콘트라스트제의 하기 예에서, N-말단 링커가 MRI 콘트라스트제의 이완도에 미치는 효과를 설명한다:
이 예에서, "킬레이트"는 bb-DTPA-Gd(III)를 의미한다.
상기의 "링커-서브유닛"을 하기의 결과를 갖도록 변화시켰다(Gd(III) 이온당 이완도는 35℃, 20 MHz에서 측정하였고, 단위는 mM-1s-1이다):
상기 도시한 바와 같이, 구조 15 및 16은 N-말단 링커-서브유닛이 상이한 것을 제외하고 32와 유사하다. 실험 결과는 링커가 이완도 뿐만 아니라, 본 발명 콘트라스트제의 다른 특성에도 영향을 줄 수 있음을 보여준다.
킬레이트 부분 및 시약
킬레이트 부분은 금속 이온으로 착화된 킬레이트 리간드이다. 이들 킬레이트 부분은 링커, 링커-서브유닛 및/또는 변성 펩티드에 결합점을 형성시킬 수 있는 합성 성분을 함유한다. 1 이상의 킬레이트 부분은 변성 펩티드의 각 말단 작용기에 공유적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 한 구체예에서, 킬레이트는 링커-서브유닛에 결합된다. 또 다른 구체예에서, 킬레이트는 링커 부분에 결합된다. 다른 구체예에서는, 킬레이트를 링커 부분과 콘쥬게이트시켜 공유 결합 콘쥬게이트를 형성한 다음 이것을 변성 펩티드에 결합할 수 있다.
전구체 킬레이트 부분은 금속 이온으로 착화된 킬레이트 리간드이다. 킬레이트 리간드는 보호기를 갖거나 또는 킬레이트 리간드에 대한 전구체일 수 있다. 전구체 킬레이트 부분은 링커, 링커-서브유닛 및/또는 변성 펩티드에 대한 결합점을 형성할 수 있는 합성 부분을 가진다. 전구체 킬레이트 부분은 금속 이온과 착화됨으로써 킬레이트 부분으로 전환될 수 있다. 1 이상의 전구체 킬레이트 부분은 변성 펩티드의 각 말단 작용기에 공유적으로 콘쥬게이트될 수 있다. 한 구체예에서, 전구체 킬레이트는 링커-서브유닛에 결합될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 킬레이트는 링커 부분에 결합된다. 다른 구체예에서는, 킬레이트를 링커 부분과 콘쥬게이트시켜 공유 결합 콘쥬게이트를 형성한 다음 이것을 변성 펩티드에 결합할 수 있다.
전구체 킬레이트 부분 및 킬레이트 부분은 임의의 하기 구조를 가질 수 있다:
상기 식에서, X는 O-, OH, NM2, OPO3 2-, NHR 또는 OR(R은 임의의 지방족기임)과 같이 금속 양이온을 배위 결합시킬 수 있는 헤테로원자 전자-공여기이고; R1은 수소, 임의의 지방족기, 알킬기 또는 시클로알킬기에서 선택되는 대전되지 않은 화학적 부분이거나 이의 대전되지 않은 치환 버전(예컨대, 알콜)이며; Y는 (예컨대, 직접적으로 또는 매개 카르보닐, 메틸렌, 메틸렌-산소, 티오카르보닐을 가지고, 변성 펩티드, 링커 및/또는 링커-서브유닛의 작용기에 대한 결합점이거나 결합점을 형성시킬 수 있는) 합성 부분이다.
배위 결합된 금속 이온을 갖는 부분(킬레이트 부분) 또는 배위 결합된 금속 이온을 갖지 않는 부분(전구체 킬레이트 부분)을 사용할 수 있다.
여러 가지 킬레이트 리간드를 본 발명의 콘트라스트제에 사용할 수 있다. 이러한 킬레이트 리간드는 DTPA, DOTA, NOTA 및 DO3A의 유도체를 포함하지만, 이것으로 한정되지 않는다. MRI에 대하여, 가돌리늄 디에틸렌트리아민펜타아세테이트(DTPAㆍGd), 가돌리늄 테트라아민 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N'N",N'"-테트라아세테이트(DOTAㆍGd) 및 가돌리늄 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7-트리아세테이트(DO3AㆍGd)가 특히 유용하다. 특히 유용한 킬레이트는 bb(CO)DTPAㆍGd를 포함한다. MRI 적용에서 다른 금속들이 Gd(III)를 대체할 수 있다.
다량체 킬레이트를 제조할 목적으로 합성한 작용화된 킬레이트의 예는 pNCS-Bz-DTPA[Martin, V. et al., Bioconjugate Chem. 6, 616-23, 1995] 및 Gd(4-NCS-페닐)-아미노-카르보닐메틸-DO3A[Ramachandran, R. et al., Invest Rad. 1998, 33(11), 779-797]를 포함한다. 표적에 결합할 때 최적 이완 특성을 위하여 킬레이트 거동을 최소화하는 것이 종종 바람직하므로 표적과 킬레이트 리간드를 결합시키는 공유 결합은 최소수가 바람직하다. 아민 작용기 또는 링커-서브유닛 또는 링커에 결합하기 위해 주쇄 카르보닐기를 갖는 킬레이트 리간드를 포함하는 시약의 예는 하기하는 바와 같은데, 여기서 "LG"는 이탈기(예컨대, 활성화 에스테르)이고, R은 용이하게 절단되어 O-(-OtBu, 예컨대, 카르복실레이트 에스테르)를 형성함으로써 이웃하는 카르보닐기를 갖는 카르복실레이트를 형성하는 기를 나타낸다:
킬레이트 리간드에 바로 접하는 카르보닐의 화학적 모티프는 이완도가 높은 한 부류의 MRI 콘트라스트제를 구성하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은 또한 하기의 화학식을 따르는 MRI용 콘트라스트제의 합성에 유용한 중간체에 관한 것이다:
상기 식에서, R1, R2, R3, R4및 R5는 적절한 형성 상수를 갖는 상자성 금속 킬레이트를 형성하기에 적당한 임의의 보호되거나 보호되지 않는 아세틸 리간드일 수 있는데, 하기 식을 포함한다:
상기 식에서, P는 벤질 및 t-부틸기를 비롯한 임의의 보호기이다. LG는 "이탈기"이고, -OH 및 NHS 에스테르, 펜타플루오로페놀 및 기타 활성화 에스테르를 비롯한 이의 에스테르 형태를 나타낸다.
특히 유용한 구체예에서, LG는 -OH이고, R1, R2, R3, R4및 R5는 CH2COtBu인데, 이는 이하에서 "합성 단위체 3"이라 하며 하기 구조식을 가진다:
대안으로, 하기의 시약을 본 발명 콘트라스트제의 합성에 사용할 수 있다:
(Syn. Comm. 30, 3755 (2000) 참조)
본 발명은 또 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 특히, 신규한 산화 반응은 킬레이트 리간드의 바람직한 구체예인 합성 단위체 3의 제조를 용이하게 한다. 합성 단위체 3의 합성은 두 상이한 합성 경로를 통하여 행할 수 있는데, 둘다 히드록시메틸-디에틸렌트리아민으로 개시된다. 한 경로는 두 합성 단계 순서(알킬화, 그 후 산화)를 포함하고, 다른 경로는 6-단계 방법(보호, 산화, 에스테르화, 탈보호, 알킬화 및 가수분해)을 포함한다. 둘 다 화학적 및 광학적으로 순도가 높은 합성 단위체 3을 생성한다(하기 실시예 참조).
미국 특허 제5,637,759호에는 나트륨 티오페녹시드를 사용하는 선택적 가수분해 프로토콜에 의하여 2,3-디아미노프로피온산 및 아자-리신으로부터 합성 단위체 1을 합성하는 것이 개시되어 있다. 본원에 기재된 방법은 이러한 독성 시약을 사용하지 않는다.
콘트라스트제의 합성
펩티드계 콘트라스트제의 합성은 하기의 단계로 행할 수 있다. 먼저, 일반적으로 고상 펩티드 합성법을 사용하여 C-말단 링커-서브유닛을 이용하거나 이용하지 않고 표적 펩티드를 합성할 수 있다. 본 명세서에 기재된 고리 펩티드를 얻기 위하여는, 보호된 선형 펩티드를 용액 내에서 또는 수지 상에서 고리화시킬 수 있다. 보호되지 않은 펩티드도 또한 용액 내에서 또는 수지 상에서 고리화될 수 있다. C-말단 링커-서브유닛은 편리하게는 고상 합성 수지로부터 유도될 수 있고, N-말단 링커 또는 N-말단 링커-서브유닛은 고상 합성시 펩티드에 커플링시킬 수 있다. 일반적으로, 고리화 후 링커-서브유닛-킬레이트 전구체 성분을 펩티드에 커플링시켰다. 보호기를 제거하여 리간드 전구체를 제공한 다음 킬레이트를 제조하였다. 본 발명의 방사성핵종 화합물은 1 시간 동안 일반적으로 pH 4 내지 6의 수성 매질 내 반응에 의하여 시판 방사성핵종(예컨대, Nycomed Amersham Boston cat.99mTc, #RX-290195, NEN Life Science Products cat.111In, #NEZ304 또는 NEN Life Science Products cat.153Gd, #NEZ142)을 사용하여 리간드 전구체로부터 제조하였다. 광학적 콘트라스트제의 경우, 유기 염료가 킬레이트 전구체를 대신할 수 있다.
콘트라스트제의 구조:
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[합성은 32와 유사하다]
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콘트라스트제의 특성
본 발명 화합물은 모 펩티드(즉, 임의의 결합된 킬레이트가 없는 펩티드),N-말단에 1 이상의 킬레이트가 결합되어 있는 펩티드 또는 C-말단에 1 이상의 킬레이트가 결합되어 있는 펩티드보다 내생 효소에 의한 분해에 대하여 더 안정할 수 있다. 생체 안정성을 평가하기 위하여, 테스트 화합물을 래트의 간 호모게네이트로 항온 처리할 수 있다. 소정의 간격 후, 반응물을 급냉시키고, 원심분리한 다음, 상청액을 액체 크로마토그래피-질량 분광계로 분석하여 잔류하는 화합물의 양을 정량할 수 있다.
또한, 본 발명 화합물은 사람 혈청 알부민 또는 피브린과 같은 표적을 결합할 수 있다. 예컨대, 생리학적으로 합당한 농도의 약물 및 표적에서 10% 이상(예컨대, 50% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 92% 이상, 94% 이상 또는 96% 이상)의 콘트라스트제를 의도하는 표적에 결합할 수 있다. HSA 또는 피브린과 같은 표적에 대한 콘트라스트제의 결합 정도는 여러 가지 평형 결합 방법으로 평가할 수 있다. 예컨대, HSA에 대한 결합은 한외여과로 측정할 수 있다. 피브린에 대한 결합을 측정하기 위하여, 마이크로타이터 플레이트의 웰에 피브린 응혈을 형성시켜 표적화기와 접촉시킬 수 있다. 평형을 이루기에 충분한 항온 처리 시간 후, 흡인하여 상청액을 분리한다(불용성 피브린은 겔화된 응혈로서 웰의 바닥에 붙은 채로 있음). 그 후, 상청액 안의 결합되지 않은 표적화기의 농도를 측정한다. 양 방법에서, 결합된 콘트라스트제의 농도는 처음에 존재하는 총 표적화기 농도 및 결합 분석 후의 결합되지 않은 표적화기 농도 간의 차이로서 측정한다. 결합 분율은 결합된 표적화기를 총 표적화기 농도로 나눈 농도이다.
본 발명 화합물은 표적 결합(예컨대, 피브린에 대한)의 결과로서 높은 이완도를 나타낼 수 있는데, 이것은 이미지 해상도를 더 양호하게 할 수 있다. 결합시 이완도 증가는 일반적으로 1.5 배 이상이다(예컨대, 이완도가 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 배 증가한다). 이완도가 7 내지 8 배, 9 내지 10 배 또는 심지어 10 배가 넘게 증가한 표적된 콘트라스트제가 특히 유용하다. 일반적으로, 이완도는 NMR 분광계를 사용하여 측정한다. 37℃, 20 MHz에서 MRI 콘트라스트제의 바람직한 이완도는 상자성 금속 이온 당 10 mM-1s-1이상(예컨대, 상자성 금속 이온 당 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 60 mM-1s-1이상)이다. 37℃, 20 MHz에서 이완도가 60 mM-1s-1을 넘는 콘트라스트제가 특히 유용하다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적된 콘트라스트제는 응혈 흡수 증가를 나타낼 수 있다. 피브린 표적 제제의 흡수 특성은 혈액에 의한 흡수에 응혈에 의한 제제의 흡수를 비교함으로써 측정할 수 있다. 보다 상세한 사항은 실시예 11을 참조할 수 있다. 피브린 표적 콘트라스트제의 특성은 MRI를 사용하고 응혈 시그널 증가를 관찰함으로써 설명될 수 있다.
본 발명의 펩티드 및 콘트라스트제의 용도
본 발명의 펩티드는 혈전색전증 질환을 치료하는 치료를 개선시키기 위하여 사용할 수 있다. 현재의 혈전 치료는 현저한 출혈 위험, 혈류 복구 실패, 치료 중단 후 혈전 폐색 및 치료 개시 및 응혈 용해 간의 시간차를 비롯한 한계가 있다. 개선된 치료 지수는 본 발명 피브린 표적 펩티드를 혈전 용해제(예컨대, 사람 또는 박테리아 기원의 플라스미노겐 활성화제와 같은 단백질 혈전 용해제)에 콘쥬게이트함으로써 얻을 수 있다. 이러한 콘쥬게이트는 국소적으로 플라스미노겐을 활성화시키거나 tPA의 내생 수준을 증가시킬 수 있다. 예컨대, 피브린 표적 펩티드를 재조합 조직형 플라스미노겐 활성화 인자(tPA), 프로우로키나제 및 우로키나제(둘 다 1쇄형 및 2쇄형), 스트렙토키나제, 스타필로키나제를 비롯한 박테리아 유도 플라스미노겐 활성화 인자 및 뱀파이어 박쥐 플라스미노겐 활성화 인자를 비롯한 동물 유도 플라스민조겐 활성화 인자에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 또한, 피브린 표적 펩티드를 직접적인 피브린 용해 활성을 보이는 코퍼헤드 스네이크 피브롤라제와 같은 피브린 용해제에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 이러한 효소 및 단백질은 시판되며, 천연 공급원 또는 조직으로부터 추출되거나 재조합하여 제조할 수 있다.
본 발명의 조성물은 MRI 콘트라스트제 구축에 관하여 상기 논의한 바와 동일한 유형의 링커를 사용하여 공지된 방식으로 결합 또는 융합시킬 수 있다. 아미드, 에스테르, 디술피드 및 티오에테르 결합을 비롯한 표준 화학적 기법으로 단백질에 콘쥬게이트시킬 수 있다. 예컨대, 피브린 결합 펩티드는 피브린 결합 펩티드 또는 링커 및 단백질 표면 상의 리신 잔기 간에 아미드 결합을 형성함으로써 직접적으로 또는 링커를 통하여 단백질에 공유 결합할 수 있다. 이들 표면 리신 잔기들은 통상적으로 효소의 촉매 부위로부터 떨어져 있다. 따라서, 묶인 부분이 효소의 촉매 활성을 방해하지 않는다. 다중 결찰은 단일 단계로 행할 수 있다. 혈전 용해제 또는 피브린 용해제에 대한 피브린 표적 펩티드의 비율은 결찰 화학의 화학량론적 양을 조절함으로써 제어할 수 있다. 친화도가 높은 결합은 소위 "결합 활성" 효과를 통하여 실현할 수 있으므로, 약간 강한 피브린 결합 리간드의 경우 다중 결찰이 특히유용하다. 특히, 커플링제 또는 활성화 에스테르를 사용하여 리신 및 피브린 결합 부분 또는 링커 간에 아미드 결합을 형성시킬 수 있다. 하기 도식은 링커 부분을 통하여 다중 피브린 결합 펩티드에 대해 우로키나제의 화학적 결찰에 의하여 형성시킨 하이브리드 분자의 예를 나타낸다. 표면 리신 잔기의 수 및 피브린 결합 분자의 수는 예시적이다. 대안으로, 피브린 표적 펩티드를 재조합 DNA 기법을 사용하여 하이브리드 분자에 포함시킬 수 있다.
몇 가지 구체예에서, 본 발명 펩티드는 효소 절단 부위, 예컨대, 인자 Xa, 트롬빈 또는 플라스민 절단 부위 등과 같이, 통상적으로 응고 캐스케이드에서 효소에 의해 절단되는 효소 절단 부위를 포함하는 링커를 갖는 트롬빈 용해제에 결합할 수 있다. 트롬빈 용해제는 혈괴 부위에서 본 발명 혈괴 결합 조성물로부터 절단될 때까지 활성화되지 않아서 응혈로부터 떨어진 부위에서 원하지 않는 출혈이 발생할 위험이 최소화될 것이다. 또한, 트롬빈 용해제 부분은 응혈이 식별되어, 영상화되고, 용해될 수 있도록 펩티드-표적 다량체 콘트라스트제에 결합시킬 수 있다.
본원의 개시 내용에 따라 제조한 콘트라스트제는 종래의 MRI 콘트라스트제와 동일한 방식으로 사용할 수 있고, 심정맥 혈전증, 폐색전, 관상동맥 혈전증, 경동맥 및 두개골내 혈전증, 심방 및 심실 혈전, 대동맥궁 혈전 및 고 위험 플라크의 진단에 유용하다. 혈전을 영상화할 경우, 백그라운드 혈액 및 조직에 대비되는 혈전의 콘트라스를 증대시키기 위하여 특정한 MR 기법 및 펄스 시퀀스가 바람직할 수 있다. 이들 기법은 급회전 에코 시퀀스 및 흐름막이 경사 에코 시퀀스와 같이, 혈액을 어둡게 하는 블랙 블러드 혈관조영술 시퀀스를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 이들 방법은 혈전 및 백그라운드 조직 간의 콘트라스를 증가시킬, 반전-회복 조작된 시퀀스 또는 포화-회복 조작된 시퀀스와 같이 콘트라스 증강 혈전 및 혈액과 조직 간의 T1 차로 인한 대비차를 증강시키는 흐름 독립 기법을 포함한다. T2 기법의 조작 방법도 또한 유용한 것으로 입증될 수 있다. 최종적으로, 자기화 전달 기법에 대한 조작도, 또한 본 발명 제제를 사용할 때 콘트라스트를 개선시킬 수 있다.
펩티드, 트롬빈 용해제에 콘쥬게이트된 펩티드 및 펩티드 표적 다량체 콘트라스트제를 비롯한 본 발명 조성물은 일상적인 절차에 따라 약학 조성물로 조제될 수 있다. 여기서 사용되는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 그것의 약학적으로 허용 가능한 유도체를 포함할 수 있다. "약학적으로 허용 가능한"이란, 화합물 또는 조성물을 허용할 수 없는 부작용없이 동물에 투여할 수 있음을 의미한다. "약학적으로 허용 가능한 유도체"란, 투여시 투여받은 자에게 본 발명의 화합물 또는 그것의 잔기 또는 활성 대사물을 (직간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 약학적으로 허용 가능한 염, 에스테르, 에스테르 염 또는 기타 본 발명 화합물의 유도체를 의미한다. 기타 유도체는 이러한 화합물을 포유동물에 투여할 때(예컨대, 경구 투여된 화합물이 혈액 내로 더 용이하게 흡수되게 함으로써) 본 발명 화합물의 생체 이용 가능성을 증가시키거나 생물학적 구획(예컨대, 뇌 또는 림프계)으로의 모 화합물의 전달을 증대시킴으로써 모 화학종들에 대한 노출을 증가시키는 것들이다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 공지된 약학적으로 허용 가능한 무기 및 유기 산 및 염기에서 유도되는 반대 이온을 포함한다.
본 발명 약학 조성물은 경구 및 비경구 투여를 비롯한 임의의 경로로 투여할 수 있다. 비경구 투여는 피하, 정맥내, 동맥내, 조직내, 척수강내 및 강내 투여를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 투여가 정맥내 투여인 경우, 약학 조성물은 환괴, 시간적으로 분리된 2 이상의 투약분 또는 일정 또는 비선형 유동 주입으로 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명 조성물은 임의의 투여 경로용으로 조제될 수 있다.
일반적으로, 정맥내 투여 조성물은 무균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 또한, 필요에 따라, 조성물은 용해제, 안정화제 및 주사 부위의 고통을 경감시키기 위한 리도카인과 같은 국소마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로, 예컨대 키트 내에, 또는 예컨대, 무수 동결 건조 분말 또는 무수 농축액과 같이 단위 제형 내에 함께 혼합되어 공급될 것이다. 조성물은 활성 제제의 양을 활성 단위로 나타내는 주머니 또는 앰풀과 같은 밀봉 용기 내에서 저장할 수 있다. 조성물을 주입 투여할 경우, 무균 약학 등급의 "주사용수" 염수 또는 기타 적당한 정맥내 유체를 함유하는 주입 병으로 투여할 수 있다. 조성물을 주사 투여할 경우, 투여 전에 성분들을 혼합시킬 수 있도록 주사용 무균수 또는 염수의 앰풀을 제공할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 화합물 및 그것의 약학적으로 허용가능한 염과 임의의 약학적으로 허용 가능한 성분, 부형제, 담체, 보조제 또는 비히클을 포함한다.
콘트라스트제는 주사할 수 있는 조성물의 형태로 환자에 투여하는 것이 바람직하다. 콘트라스트제를 투여하는 방법은 비경구, 즉 정맥내, 동맥내, 척수강내, 조직내 또는 강내 투여가 바람직하다. 본 발명 약학 조성물은 기타 진단 제제 또는 치료 제제와 유사한 방식으로 사람을 비롯한 포유 동물에 투여할 수 있다. 투여량 및 투여 방식은 환자의 연령, 체중, 성별, 상태 및 유전적 요인에 따라 달라질 것이고, 궁극적으로는 본 명세서에 기재된 바와 같이 투약량을 변화시킨 다음, 영상화하여 실험적으로 측정함으로써 환자에 의해 결정될 것이다. 일반적으로, 진단 감도 또는 치료 효율성에 필요한 투여량은 대상체 1 kg당 0.001 내지 50,000 ㎍, 바람직하게는 0.01 내지 25.0 ㎍ 범위일 것이다. 최적 투여량은 본 발명이 개시 내용에 따라 경험적으로 측정될 것이다.
트롬빈 용해 상태의 치료에 대하여, 투여되는 물질의 양은 혈전색전증 상태의 중증도 및 응혈의 위치 및 크기에 따라 달라질 것이다. 사용될 정확한 투여량 및 투여 방식은 치료를 담당하는 의사가 환경에 따라 결정할 수 있다. 일반적으로, 조성물/트롬빈 용해제 콘쥬게이트를 조합한 투여량은, 본 명세서에 기재된 조성물에 의해 추가되는 피브린/응혈 결합에 대한 개선된 친화도가 표준 트롬빈 용해제 투여량을 감소시킬 수 있을지라도 트롬빈 용해제 단독에 대해 일상적인 투약량을 따를 것이다. 특히 이러한 치료에 사용할 것으로 사료되는 트롬빈 용해제는 하기와 같다(투여 방법 및 투여량의 예):
스트렙토키나제30 분 내지 3 시간에 걸쳐 1 내지 3 메가 단위
아니스트레플라제30 단위; 2 내지 5 분 주사
tPA(야생형)50 내지 150 mg; 6 시간 이하에 걸쳐 주입
2쇄 우로키나제(40 내지 100 mg); 6 시간 이하에 걸쳐 주입
1쇄 우로키나제(scuPA)3 내지 12 메가 단위(30 내지 100 mg; 5 시간 이하에 걸쳐 주입)
하이브리드 플라스미노겐 활성화제 및 유도체20 내지 100 mg; 주사 또는 주입
플라스미노겐 활성화제의 뮤테인10 내지 100 mg; 주사 또는 주입
본 발명은 하기 실시예로 더 설명하고자 하지만, 이것이 청구의 범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
발명의 개요
본 발명은 MR, 광학 영상화 및 방사성핵종 영상화를 위한 펩티드 및 펩티드 표적화 다량체 콘트라스트제에 기초하는데, 여기서 단일 펩티드는 표적화기 및, 직접적으로 또는 임의의 개재 링커에 의해 N-말단과 C-말단 둘 다에 1 종 이상의 킬레이트를 위한 결합점으로서 기능할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 콘트라스트제는 피브린과 같은 생물학적 표적에 대한 결합 친화성과 높은 이완성을 유지한다. 본 발명의 제제는 생체내 투여 후 충분한 반감기를 보유하여 효과적인 영상화 연구를 수행하는 것이 가능하다.
한 가지 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 P*-Y*-X1*-L*(서열 번호 1)을 포함하는 정제된 펩티드에 관한 것이며, 여기서 P*는 프롤린 또는 그것의 비천연유도체이고; Y*는 티로신 또는 그것의 비천연 유도체이며; X1*는 G 또는 D, 또는 G 또는 D의 비천연 유도체이고; L*는 루신 또는 그것의 비천연 유도체이며; P*, Y*, X1* 및 L* 중 1 이상은 각 아미노산의 비천연 유도체이다. X1*는 G 또는 D일 수 있고, L*는 루신일 수 있다. 몇몇 구체예에서, P*는 프롤린 또는 4-히드록시프롤린이며, Y*는 티로신 또는 3번 위치에서 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신의 비천연 유도체이다. 본 발명의 화합물은 혈전 용해제에 연결된 상기한 바와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 아미노산 서열 X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(서열 번호 2)을 포함하는 정제된 펩티드에 관한 것이며, 여기서 P*는 프롤린 또는 그것의 비천연 유도체이고; Y*는 티로신 또는 그것의 비천연 유도체이며; X1은 W, Y, F, 5, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) 및 Y(3*)로 구성된 군 중에서 선택되고, F(3/4*)은 CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이며, Y(3*)은 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신이고; X2는 E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr 및 Th로 구성된 군 중에서 선택되며; X3은 G 및 D로 구성된 군 중에서 선택되고; X4는 H, F, Y 및 W로 구성된 군 중에서 선택되며; X5는 I, L, V,N, Epa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal 및 F(3/4*)으로 구성된 군 중에서 선택되고, F(3/4*)는 CF3, Et, iPr 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이며; X6은 N, Q, I, L 및 V로 구성된 군 중에서 선택되거나, 또는 X6은 존재하지 않으며; X1, X2, X5, P* 및 Y*중 하나 이상은 아미노산의 비천연 유도체이다. 예를 들어, P*는 프롤린 또는 4-히드록시프롤린일 수 있고, Y*는 티로신 또는 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신의 비천연 유도체일 수 있다. 정제된 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있고, 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유한다. 몇몇 구체예에서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함한다. 본 발명의 화합물은 혈전 용해제에 연결된 상기한 바와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 4), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q(서열 번호 5), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 6), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-CI)-G-L-C-Y-I-Q(서열 번호 7), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q(서열 번호 8), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(서열 번호 9), Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-C1)-D-L-C-W-l-Q(서열 번호 1O), W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q(서열 번호 11), F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(서열 번호 12), Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 13), W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 14), W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q(서열 번호 15) 및 F-H-C-P-(4-0H)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L(서열 번호 16)로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 정제된 펩티드를 특징으로 한다. 이 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있는 것이며, 다른 구체예에서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함한다. 상기 펩티드는 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 혈전 용해제에 연결된 상기한 바와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
몇몇 구체예에서, P*는 프롤린이고; Y*는 티로신이며; X1은 W, Y, F, S. Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*), 및 Y(3*)로 구성된 군 중에서 선택되고, F3/4*는 CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이며, Y3*는 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신이고; X2는 dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr 및 Th로 구성된 군 중에서 선택되며; X3은 G 및 D로 구성된 군 중에서 선택되고; X4는 H, F, Y 및 W로 구성된 군 중에서 선택되며; X5는 I, L, V, N, Epa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal 및 F(3/4*)으로 구성된 군 중에서 선택되며, F(3/4*)는 CF3, Et, iPr 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 또는 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이고, X1, X2또는 X5중 하나 이상은 비천연 아미노산 유도체이며; X6은 N, Q, I, L 및 V로 구성된 군 중에서 선택되고, X6은 존재하지 않는다. 이러한 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있으며, 몇몇 구체예에서 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함한다. 상기 펩티드는 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드를 특징으로 한다: C-P*-Y*-X1-L-C(서열 번호 3), 여기서 X1은 G 또는 D이고, P*는 프롤린 또는 이의 비천연 유도체 4-히드록시프롤린이며; Y*는 티로신 또는 F, Cl, Br, I, 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 3번 위치에서 치환된 티로신의 비천연 유도체이며; 단, P* 또는 Y* 중 하나 이상은 각각의 아미노산의 비천연 아미노산이다. 정제된 펩티드들은 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있고, 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함한다. 본 발명의 화합물은 혈전 용해제에 연결된 상기한 바와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드를 특징으로 한다: C-D-Y-Y-G-T-C-X10(서열 번호 17), 여기서 X10은 n(데실)G, n(4-PbBu)G, MeL, Epa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-디플루오로), Amb, Hfe, Y(3,5-디요오도), Pff, 1Nal, d1Nal 및 MeL로 구성된 군 중에서 선택되고, F(4*)는 Et, CF3, I 및 iPr로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 4번 위치에서 치환된 페닐알라닌이다. 정제된 서열은 하기 아미노산 서열을 포함한다: C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(서열 번호 l8), 여기서 X11은 D, dD, βD, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop 및 Cmp로 구성된 군 중에서 선택된다. 예를 들어, 펩티드는 다음과 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다: L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-dD(서열 번호 19), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-D(서열 번호 20), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D(서열 번호 21), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD(서열 번호 22), L-P-C-D-Y-Y-G-TC-MeL-Lnp(서열 번호 23), L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp(서열 번호 24), 또는 L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D(서열 번호 25) 정제된 펩티드들은 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있고, 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함한다. 본 발명의 화합물은 혈전 용해제에 연결된 상기한 바와 같은 펩티드를 포함할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 MR 영상화제를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 이 방법은 N-말단 아민 작용기와 링커-서브유닛 부분을 반응시켜 C-말단 아민 작용기와 N-말단 아민 작용기 둘 다를 보유하는 변성 펩티드를 형성시키는 단계; C-말단 아민 작용기와 N-말단 아민 작용기에 링커 부분을 공유 결합시켜 전구체 MR 영상화제를 형성시키는 단계; 및 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계를 포함한다. 상기 링커-서브유닛 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, n은 1 내지 4의 정수이고; m은 1 내지 12의 정수이며; R은 지방족 또는 방향족기이다. 상기 링커 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, m은 1 내지 4의 정수이고, n은 0 내지 4의 정수이며; LG는 이탈기이고; R' 및 R"은 독립적으로 수소와 화학적 보호기로 구성된 군 중에서 선택된다.
또한, 링커 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, LG는 이탈기이고; R1및 R2는 독립적으로 수소 또는 화학적 보호기로 구성된 군 중에서 선택된다. 상기 LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택된다. 상기 활성화 에스테르는 펜타플루오로페놀(Pfp), N-히드록시숙신이미드(NHS), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨 염(NHSS), 2-티옥소티아졸리딘-1-일 및 히드록시벤조트리아졸(OBT)로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다. 상기 할로겐화물은 F, Cl, Br 및 I로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다. 화학적 보호기는 Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 및 알릴로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다.
전구체 MR 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 전구체 영상화제와 전구체 킬레이트 부분을 반응시켜 전구체 킬레이트 부분과 전구체 MR 영상화제의 링커 부분 사이에 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 카르복실레이트 부분으로 전환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함하는 것인 단계; 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계; 및 다수의 카르복실레이트 부분에 상자성 금속 이온을 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함한다. 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택된다:
상기 식에서, Y는 결합된 링커 부분과 공유 결합을 형성할 수 있는 합성 부분이고; 각각의 X는 독립적으로 O-또는 O-전구체여서, O-로 전환시 X는 그의 인접카르보닐과 함께 카르복실레이트 부분을 형성할 수 있으며, R1은 전하를 띠지 않는 화학적 부분, 지방족, 알킬기 또는 시클로알킬기 또는 이의 전하를 띠지 않는 치환된 형태이다. 합성 부분은 카르복실산, 활성화 에스테르, 산 할로겐화물, 무수물, 알킬 할로겐화물, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트로 구성된 군 중에서 선택되며, 여기서 O-전구체는 -OH, -O-Me, O-Et, O-tBu, O-벤질 및 O-알릴로 구성된 군 중에서 선택된다. 또한, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되며, 각각의 R1은 독립적으로 O-또는, OH, -O-Me, O-Et, O-tBu, O-벤질 및 O-알릴로 구성된 군 중에서 선택되는 O-전구체이며, O-로 전환시 R은 그의 인접한 카르보닐과 함께 카르복실레이트 부분을 형성할 수 있다.
또한, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기 화합물로부터 선택할 수 있다:
상기 식에서, n은 1 내지 4의 정수이고; R은 음전하 및 음전하로 전환될 수 있는 음전하 전구체로 구성된 군 중에서 선택되며; X는 -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO 및 -TfO로 구성된 군 중에서 선택되는 화학적 이탈기이다.
상기 전구체 킬레이트 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택된다:
상기 식에서, R은 음전하 또는 음전하로 전환될 수 있는 음전하 전구체로 구성된 군 중에서 선택되고; X는 -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO 및 -TfO로 구성된 군 중에서 선택되는 화학적 이탈기이다. 상기 음전하 전구체는 -H, -Me, -Et, -tBu, -벤질 및 -알릴로 구성된 군 중에서 선택된다.
몇몇 구체예에서, 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유적으로 콘쥬게이트될 수 있고, 공유 콘쥬게이트는 카르복실레이트 부분으로 전환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함한다. 전구체 MRI 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 다수의 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체 기를 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 카르복실레이트 부분으로 전환시키는 단계; 및 상자성 금속 이온을 다수의 카르복실레이트 부분으로 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함한다. 상자성 금속 이온은 하기 이온으로부터 선택된다: Gd(III), Fe(III), Mn(II및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III). 특히 유용한 상자성 금속은 Gd(III)이다.
상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택된다:
상기 식에서, n은 1 내지 4의 정수이고, LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이며; R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택된다.
또한, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택될 수있다:
상기 식에서, LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이고; R1, R2, R3및 R4는 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택된다.
상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화학식으로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다:
합성단위체 1:
합성단위체 2:
또한, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, R은 -t-Bu 기이고, LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
또한, 본 발명의 방법은 C-말단 및 N-말단 아민 기에 링커 부분을 공유 결합하기 전에 링커-서브유닛과 상기 펩티드의 N-말단 아민 작용기를 반응시켜 상기 펩티드의 유도체화된 N-말단 아민 작용기를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 링커-서브유닛은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, 염기는 아데노신, 구아노신, 티민 및 시토신으로 구성된 군 중에서 선택되고; LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이며; R은 지방족 부분 또는 방향족 부분이다. 상기 링커-서브유닛은 또한 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, n은 0 내지 3의 정수이고; R은 지방족기 또는 방향족기이며; LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
또한, 상기 링커-서브유닛은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택된다:
상기 식에서, n은 독립적으로 0 또는 1이고; R은 지방족 또는 방향족기이며; LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
다른 양태에서, 본 발명은 MR 영상화제를 제조하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 링커-서브유닛 부분에 아미노산 잔기를 공유 결합시켜 펩티드의 C-말단부를 형성하는 단계로서, 상기 링커-서브유닛 부분은 수지에 공유 결합시키는 단계; 상기 수지 상에서 공유 결합된 C-말단부로부터 상기 펩티드의 N-말단 잔기까지 펩티드를 합성하는 단계로서, 상기 N-말단 잔기가 N-말단 아민 작용기를 포함하는 것인 단계; 상기 수지로부터 펩티드를 절단하여 C-말단 아민 작용기를 보유하는 펩티드를 형성하는 단계; 펩티드의 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기에 링커 부분을 공유적으로 부착시켜 전구체 MR 영상화제를 형성시키는 단계; 및 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가로 수지로부터 펩티드를 절단하기 전에 N-말단 아미노 작용기에 링커-서브유닛 부분을 공유 결합하여 유도체화된 N-말단 아민 작용기를 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유적으로 콘쥬게이트할 수 있는데, 상기 공유 콘쥬게이트는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함하며, 상기 카르복실레이트 전구체 기는 카르복실레이트 전구체 기로 전환될 수 있다.
전구체 MR 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 전구체 MR 영상화제와 전구체 킬레이트 부분을 반응시켜 전구체 킬레이트 부분과 전구체 MR 영상화제의 링커 부분 사이의 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 카르복실레이트 부분으로 전환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함하는 것인 단계; 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 카르복실레이트 전구체 기를, 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 다수의 카르복실레이트 부분으로 전환시키는 단계; 및 상자성 금속 이온을 다수의 카르복실레이트에 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함할 수 있다.
전구체 MRI 영상화제의 MR 영상화제로 전환은 다수의 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체 기를, 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 카르복실레이트 부분으로 전환시키는 단계; 및 상자성 금속 이온을 다수의 카르복실레이트 부분으로 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함한다. 상자성 금속 이온은 하기 이온으로부터 선택된다: Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III). 특히 유용한 상자성 금속은 Gd(III)이다.
다른 양태에서, 본 발명은 MR 영상화제를 제조하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 C-말단 카르복실레이트 작용기를 보유하는 펩티드와 링커-서브유닛 부분을 반응시켜 C-말단 카르복실레이트 작용기와 N-말단 카르복실레이트 작용기 둘 다를 보유하는 변형된 펩티드를 형성시키는 단계; 상기 변형된 펩티드의 N-말단 및 C-말단 카르복실레이트 작용기 둘 다에 링커 부분을 공유적으로 부착시켜 전구체 MR 영상화제를 형성시키는 단계; 및 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계를 포함한다. 상기 링커-서브유닛 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택된다:
상기 식에서, LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이고; R은 방향족기 또는 지방족기이다. 상기 링커 부분은 또한 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택될 수 있다:
상기 식에서, m은 1 내지 4의 정수이고; n은 0 내지 4의 정수이며; R은 독립적으로 -H, -Me, -Et, -Bz 및 -t-Bu로 구성된 군 중에서 선택되고; R1및 R2는 독립적으로 수소 또는 화학적 보호기로부터 선택된다.
상기 링커 부분은 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, R1및 R2는 독립적으로 수소 및 화학적 보호기로 구성된 군 중에서 선택되며, 화학적 보호기는 Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 및 알릴로 구성된 군 중에서 선택된다.
또한, 전구체 MR 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 전구체 MR 영상화제와 전구체 킬레이트 부분을 반응시켜 전구체 MR 영상화제의 링커 부분과 전구체 킬레이트 부분 사이에 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함하는 것인 단계; 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및 상자성 금속 이온을 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함한다. 상기 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유적으로 콘쥬게이트될 수 있으며, 상기 공유 콘쥬게이트는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함한다.
또한, 전구체 MR 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 다수의 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체 기를, 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계; 및 상기 상자성 금속 이온을 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함한다.
공유 콘쥬게이트는 하기 화합물로 구성된 군 중에서 선택할 수 있다:
상기 식에서, n은 1 내지 4의 정수이며; R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택된다. 상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화합물일 수 있다:
또한, 전구체 MR 영상화제의 MR 영상화제로의 전환은 전구체 영상화제와 킬레이트 부분을 반응시키는 단계를 포함하는데, 이때 상기 킬레이트 부분은 상자성 금속 이온을 포함하며, 상기 반응으로 킬레이트 부분과 전구체 MR 영상화제의 링커 부분 사이에 공유 결합이 형성되어 MR 영상화제가 생성된다. 적합한 상자성 금속 이온은 상기한 바와 같다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 생중합체(예컨대, 펩티드)의 -CO2R 및 NHR 말단에 금속 킬레이트 착체를 포함하는 콘트라스트제를 특징으로 하며, 여기서 R은 독립적으로 수소, 알킬, 지방족기 및 이탈기로 구성된 군 중에서 선택된다. 상기 콘트라스트제는 생중합체의 CO2R 및 NHR 단부에 2 개의 금속 킬레이트 착체를 포함할 수 있다. 상기 생중합체는 피브린에 대한 특이적인 결합 친화성을 보유할 수 있다. 상기 펩티드는 비환원 조건 하에서 디술피드 결합을 형성할 수 있으며, 몇몇구체예에서 디술피드 결합을 포함한다. 콘트라스트제는 하기 화학식을 포함할 수 있다:
상기 식에서, 킬레이트는 금속 킬레이트 착체를 의미하고; 링커는 링커 부분을 의미하며; 링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 의미하고; m은 독립적으로 0 내지 5의 정수를 의미하며; s는 독립적으로 0 또는 1을 의미하고; R1은 아미노산 사슬 또는 이의 유도체를 의미하며; R2는 독립적으로 수소 또는 지방족기를 의미한다. 또한, 콘트라스트제는 구조 4 내지 55 중 임의의 한 구조를 보유할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 펩티드의 안정성을 변경시키는 방법을 특징으로 하는데, 상기 펩티드는 N-말단 아민 작용기를 보유하고 있다. 상기 방법은 상기 펩티드와 링커-서브유닛 부분을 반응시켜 C-말단 아민 작용기를 보유하는 펩티드를 형성시키는 단계; 및 상기 펩티드의 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기에 링커 부분을 공유 결합켜 변성 펩티드를 형성시키는 단계를 포함한다. 상기 방법은 또한 상기 변성 펩티드와 캡핑 부분을 반응시켜 상기 캡핑 부분과 상기 변성 펩티드의 링커 부분 사이에 공유 결합을 형성시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 방법은 상기 변성 펩티드와 전구체 킬레이트 부분을 반응시켜 상기 전구체 킬레이트 부분과 상기 변성 펩티드의 링커 부분 사이에 공유 결합을 형성시키는 단계를 포함할 수 있는데, 상기 전구체 킬레이트 부분은 카르복실레이트 부분으로변환될 수 있는 다수의 카르복실레이트 전구체 기를 포함한다. 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 카르복실레이 전구체 기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시킨 후, 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있으며; 상자성 금속 이온은 다수의 카르복실레이트 부분에 착화될 수 있다. 상기 방법은 추가로 변성 펩티드의 안정성을 분석하는 단계 또는 변경되지 않은 펩티드의 안정성을 분석하고 변성 펩티드의 안정성과 미변성 펩티드의 안정성을 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 변성 펩티드의 안정성은 미변성 펩티드의 안정성보다 개선될 수 있다(예를 들어, 미변성 펩티드의 안정성보다 10 배, 20 배 또는 30 배 개선될 수 있다). 안정성은 래트 간 균질화물 분석을 이용하여 분석할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 하기 구조의 변성 펩티드를 특징으로 한다:
상기 식에서, 킬레이트 전구체는 킬레이트 전구체 부분을 나타내고; 링커는 링커 부분을 나타내며; 링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 나타내고; m은 독립적으로 1 내지 10의 정수이며; p는 독립적으로 0 내지 5의 정수이고; s는 독립적으로 0 또는 1이며; R1은 아미노산 측쇄 또는 이의 유도체이고; R2는 H 및 지방족기로 구성된 군 중에서 선택된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하기 구조식의 변성 펩티드를 특징으로 한다:
상기 식에서, 링커는 링커 부분을 나타내고; 링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 나타내며; p는 독립적으로 0 내지 5의 정수이고; s는 독립적으로 0 또는 1이며; R1은 아미노산 측쇄 또는 이의 유도체이고; R2는 H 및 지방족기로 구성된 군 중에서 선택된다.
또한, MR 영상화제의 제조 방법은 N-말단 아민 작용기를 보유하는 펩티드와 링커-서브유닛 부분을 반응시켜 그의 N-말단 및 C-말단 둘 다에 아민 작용기를 보유하는 변성 펩티드를 형성시키는 단계, 또는 C-말단 카르복실레이트 작용기를 보유하는 펩티드와 링커-서브유닛 부분을 반응시켜 그의 C-말단 및 N-말단 둘 다에 카르복실레이트 작용기를 보유하는 변성 펩티드를 형성시키는 단계; 및 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 변성 펩티드의 MR 영상화제로의 전환은 변성 펩티드에 킬레이트 부분을 공유적으로 부착시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이때 상기 킬레이트 부분은 상자성 금속 이온을 함유하며, 상기 반응으로 MR 영상화제가 생성된다. 또한, 변성 펩티드의 MR 영상화제로의 전환은 킬레이트 부분에 링커 부분을 공유적으로 연결시켜 공유 콘쥬게이트를 형성시키는 단계로서, 상기 킬레이트 부분이 상자성 금속 이온을 함유하는 것인 단계; 및 상기 공유 콘쥬게이트와 변성 펩티드를 반응시켜 MR 영상화제를 형성시키는 단계를 포함한다. 적합한 상자성 금속 이온은 상기한 바와 같다.
다른 양태에서, 본 발명은 MR 영상화제를 제조하는 방법을 특징으로 하는데, 이 방법은 링커-서브유닛 부분에 아미노산 잔기를 공유 결합하여 펩티드의 C-말단부를 형성시키는 단계로서, 이때 상기 링커-서브유닛 부분이 수지에 공유적으로 부착되는 것인 단계; 상기 수지 상에서 공유 결합된 C-말단부로부터 상기 펩티드의 N-말단부로 펩티드를 합성하는 단계로서, 상기 N-말단 잔기가 N-말단 아민 작용기를 포함하는 것인 단계; 상기 수지로부터 펩티드를 절단하여 변성 펩티드의 C-말단 아민 작용기를 생성시키는 단계; 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계를 포함한다. 변성 펩티드의 MR 영상화제로의 전환은 변성 펩티드에 킬레이트 부분을 공유 결합시키는 단계를 포함할 수 있는데, 이때 상기 킬레이트 부분은 상자성 금속 이온을 포함하며, 상기 반응으로 MR 영상화제가 생성된다. 또한, 변성 펩티드의 MR 영상화제로의 전환은 킬레이트 부분에 링커 부분을 공유적으로 연결하여 공유 콘쥬게이트를 형성시키는 단계로서, 상기 킬레이트 부분이 상자성 금속 이온을 포함하는 것인 단계; 및 상기 공유 콘쥬게이트와 변성 펩티드를 반응시켜 MR 영상화제를 형성시키는 단계를 포함할 수 있다. 적합한 상자성 금속 이온은 상기한 바와 같다.
특별한 언급이 없으면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자간에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미로 사용된다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 재료는 후술한다. 본원에기술된 모든 공보, 특허 출원, 특허 및 기타 문헌은 전적으로 참고로 인용한 것이다. 상충되는 경우에는 용어 정의 정의를 포함한 본 명세서를 통해 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 발명을 제한하려는 의도는 없는 것임을 밝혀둔다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 후술하는 발명의 상세한 설명 및 특허청구의 범위를 통해 명백하게 될 것이다.
본 발명의 몇 가지 고 이완성 콘트라스트제의 합성, 특성화 및 용도에 관하여는 이하의 실시예를 통하여 추가로 기술될 것이다. 다음의 실시예에 포함된 특정 매개변수들은 본 발명의 실시를 예시하기 위한 것이지, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 당업자들은 본원에 기술된 통상적인 실험, 특정 구체예에 대한 다수의 균등물 및 방법을 사용할 수 있음을 인지할 것이거나, 또는 확신할 수 있다. 이러한 실험은 본 발명의 청구의 범위에 포함된다.
실시예 1 - 펩티드계 MR 영상화제
C-말단에 결합된 링커 서브유닛 부분을 가진 펩티드(P-[링커-서브유닛 부분])
표준 Fmoc 기법과 디아미노트리틸 수지를 사용하여 비보호된 펩티드를 제조하였다. 수지 상에서 또는 용액 중에서 탈륨 트리플루오로아세테이트를 사용하여 펩티드를 고리화시켰다. 상기 수지로부터 절단한 후, RP-HPLC(C-18 컬럼, H2O/CH3CN/TFA)를 사용하여 비보호된 펩티드를 정제하였다.
링커 부분:디클로로메탄 중의 Boc-Dpr(Boc)-OH.DCHA(1 당량) 및 펜타플루오로페놀(1.2 당량)의 용액에 PS-카르보디이미드(1.2 내지 1.5 당량)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3 내지 5 시간 동안 진탕시켰다. LC-질량 분석을 통하여 반응이 종결되었음을 확인한 후, 여과에 의하여 수지를 제거하고, 감압 하에 용매를 증발시켜서, 백색 발포체인 미정제 링커 부분(Boc-Dpr(Boc)-OPft(N-α-Boc-N-β-Boc-L-디아미노프로피온산 펜타플루오로페닐 에스테르, 356-128)를 얻었다.
전구체 MR 영상화제:DMF 중의 P-[링커-서브유닛 부분](1 당량) 및 링커 부분 {Boc-Dpr(Boc)-Opft}(2.2 당량)의 용액에 DIPEA(4 내지 6 당량)을 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. LC-질량 분석을 통하여 반응이 종결되었음을 확인한 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다. 그 후, 미정제 생성물을 실온에서 3 시간 동안 TFA, 물 및 아니졸(90%/5%/5%)의 혼합물 중에서 교반하였다. 디에틸 에테르를 첨가한 결과 백색 침전이 형성되었으며, 이를 RP-HPLC(C-18 컬럼, H2O/CH3CN/TFA)에 의하여 정제한 결과, 전구체 MR 영상화제(테트라키스아미노-펩티드, 백색 고체)를 얻었다.
전구체 킬레이트 부분:디클로로메탄 중의 DOTAGA-Opft. DOTAGA-OH(1 당량) 및 펜타플루오로페놀(1.2 당량)의 용액에 PS-카르보디이미드(1.2 내지 1.5 당량)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3 내지 5 시간 동안 진탕시켰다. LC-질량 분석을 통하여 반응이 종결되었음을 확인한 후, 여과에 의하여 수지를 제거하고, 감압 하에서 용매를 증발시킨 결과, 백색 발포체인 미정제 전구체 킬레이트 부분을 얻었다.
MR 영상화제.DMF 중의 전구체 MR 영상화제(1 당량) 및 전구체 킬레이트 부분(4.0 당량)의 용액에 DIPEA(4.0 당량)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하였다. LC-질량 분석을 통하여 반응이 종결되었음을 확인한 후, 감압 하에서 용매를 제거하였다.
그 후, 미정제 생성물을 15 분 동안 실온에서 TFA, 페놀, 메틸술폰산, 아니솔 및 디클로로메탄의 혼합물(90%/2.5%/2.5%/2.5%/2.5%) 중에서 교반하였다. 여기에 디에틸 에테르를 첨가한 결과, 백색 침전물이 형성되었으며, 이를 미정제 생성물로서 수집하였다.
미정제 생성물을 탈이온수 중에서 GdCl3·H2O와 반응시킨 결과, MR 영상화제가 생성되었으며, 이를 RP-HPLC(C-18 컬럼, 에탄올/50 mmol AcONH4)를 사용하여 정제하였다. 감압 하에서 적당한 분획을 합하고 에탄올을 제거한 다음, 합한 분획을 염 교환을 위하여 아세트산나트륨으로 처리하였다. 동결 건조 후, 용리액으로서 물과 에탄올:물(50:50)을 사용하는 Waters Sep-Pak(등록상표) C-18 카트리지 상에서 역상 크로마토그래피를 사용하여 과량의 염을 제거하였다. 적당한 분획을 합하고, 감압 하에서 에탄올을 제거한 다음, 이 용액을 동결 건조시킨 결과, 백색 고체인 목적 펩티드 MR 영상화제를 얻었다.
유사한 방법을 사용하여 다른 MR 영상화제를 합성하였다.
실시예 2 - 킬레이트 전구체 부분(합성 단위체 3)의 합성 방법
합성 단위체 3의 합성 방법 A
단계 a - 아민의 보호
소정의 화학량론적 삼염화물의 히드록시메틸-디에틸렌트리아민(25.15 g)(광학적으로 순수한 출발 물질 : Syn. Comm. 29(14), 2377-2391(1999), 라세미 출발 물질: Coll. Czech. Chem. Comm. 34, 630-634(1969))을 탈이온수/1,4-디옥산의 혼합물에 용해시키고, 이 용액의 pH를 수성 수산화나트륨을 사용하여 8 내지 9로 맞추었다. 디-tert-부틸 디카르보네이트(3.5 당량)를 디옥산에 용해시키고, 10 내지 20℃에서 이를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 12 내지 20 시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 이를 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 추출물을 물, 포화 중탄산나트륨 및 포화 염화나트륨 용액을 사용하여 차례로 추출하였다. 유기 추출물을 진공 하에서 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축시킨 결과, 에틸 아세테이트:헥산의 혼합물을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제된 오일을 얻었다. 정제된 생성물의 총 수득량은 30.11 g이었다.
1H NMR(300 MHz):5.18(d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.76(bs, 1H), 3.8-3.0(m, 10H), 1.47-1.42(2s, 27H), MS(m/Z):456.4[M+Na]+
단계 b - 히드록실기의 산화
[문헌(Zhao et al, J. Org. Chem. 64, 2564-2566(1999))에 개시된 산화 방법을 기초로 함]
BOC-보호된 트리아민(29.94 g)을 아세토니트릴에 용해시켰다. NaH2PO421.6 g, Na2HPO421.6 g 및 충분한 양의 탈이온수로 이루어진 포스페이트 완충액(300 ㎖)을 첨가한 후, 2,2,6,6-테트라메틸피페리딘일-1-옥시(TEMPO)(0.07 당량)를 첨가하여 부피를 500 ㎖로 만들었다. 이 혼합물을 격렬하게 교반한 후, 35℃로 승온시켰다. 아염소산나트륨(2.0 당량)을 탈이온수(100 ㎎/㎖)에 용해시켰다. 온도를 일정하게 유지시킨 상태에서 이 아염소산나트륨 용액과 표백제(0.02 당량, 대략 0.25% 수성 하이포아염소산나트륨)를 첨가하였다. 여기에 산화제를 첨가한 후 반응물을 24 시간 동안 교반하였다. TEMPO(0.07 당량)를 추가로 첨가하고, 반응 혼합물을 24 시간 동안 교반하였다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 물을 첨가하고, 2.0 N 수성 NaOH를 사용하여 pH를 8로 맞추었다. pH를 일정하게 유지시키면서 아황산나트륨 냉각 수용액(300 ㎖)을 첨가하였다. 소부피의 메틸 tert-부틸 에테르로 이 용액을 추출한 다음, 따로 분리하였다. 2.0 N 수성 HCl을 사용하여 수성층을 pH 3 내지 4로 산성화시키고, 소부피의 메틸 tert-부틸 에테르로 2 회 추출하였다. 이전에 따로 분리해 놓았던 유기 추출물을 합하여 이를 진공 하에서 농축시켰다. 이하 단계 3에서는 이 생성물을 정제하지 않고 사용하였다.1H NMR(300 MHz): 5.8(bs, 1H), 5.3(m, 1H), 4.4(m, 1H), 3.6-3.2(m, 6H), 1.47-1.43(2s, 27H). MS(m/Z):470.2[M+Na]+.
단계 c - 카르복실산의 벤질-보호
출발 물질인 카르복실산(178 g)을 무수 DMF 중에 용해시켰다. 탄산세슘(2.0 당량)을 첨가하고, 이 용액을 30 분 동안 교반하였다. 브롬화벤질(1.1 당량)을 실온에서 적가하였다. 이 반응 혼합물을 비활성 분위기 하에서 18 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고, 에틸 아세테이트로 2 회 추출하였다. 유기층을 합한 후, 포화 중탄산나트륨 및 염화나트륨 용액의 순으로 세척하였다. 유기층을 농축시킨 결과, 오일(270 g)이 얻어졌으며, 이를 에틸 아세테이트:헥산을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다.1H NMR(300 MHz): 7.3(s, 5H), 5.6 및 5.15(2bs, 1H), 5.1(s, 2H), 4.5(bs, 1H), 4.0-4.1(m, 1H), 3.5-3.2(m, 6H), 1.45 및 1.4(2s, 27H). MS(m/Z): 560.3[M+Na]+.
단계 d 및 e - 아민의 탈보호 및 알킬화
BOC-보호된 트리아민(250 g)을 아세토니트릴:4 N 수성 HCl의 1:1 용액 중에서 교반한 후, 약 2.0 시간 동안 교반하였다. 아세토니트릴을 진공 하에서 교반하고, 나머지 용액을 동결 건조시켜서 잔류물을 제공하였으며, 즉시 DMF 및 디이소프로필아민(pH를 8로 상승시키기에 충분한 양) 중에 용해시켰다. tert-부틸 브로모아세테이트(12.0 당량)를 첨가하였다. 모두 다 첨가한 후, 반응 혼합물을 50℃로 승온시키고, 18 시간 동안 교반하였다. 반응 종결 후, 물을 첨가하여 반응 혼합물의 부피를 2 배로 만든 후, 에틸 아세테이트로 2 회 추출하였다. 유기 추출물을 합하고, 물, 포화 중탄산나트륨 및 염화나트륨 포화 용액으로 차례로 세척하였다. 유기층을 진공 하에서 농축시켜 오일을 얻은 후, 에틸 아세테이트:헥산을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다. 정제된 생성물의 총 수득량은 190g이었다. MS(m/Z): 809.5[M+Na]+.
단계 f - 카르복실레이트의 탈보호
스테인레스 강철 반응기를 벤질 에스테르(157 g), 10% 탄소상 팔라듐(19.8 g) 및 에틸 아세테이트로 충전시키고, 45 psi에서 12 시간 동안 수소화시켰다. Celite(등록상표)를 통과시켜 여과한 다음, 이를 진공 하에서 농축시킨 결과, 오일이 얻어졌다. 이 오일을 에틸 아세테이트/헥산 중에 용해시키고, 실리카 겔 크로마토그래피로 정제한 결과, DTPA 카르복실산 펜타-tert-부틸 에스테르(수율 : 82%)를 얻었다. MS(m/Z): 719.5[MH]+. 이 시약을 다른 키랄 원소를 사용하는 콘트라스트제의 합성에 사용할 경우, 어떠한 부분입체이성질체도 관찰되지 않았으므로, 이 물질은 통상의 양자 NMR을 통하여 본질적으로 검출 한도까지 광학적으로 순수하다는 결론을 내릴 수 있었다.
방법 B : 합성 단위체 3의 합성 방법 B
알콜[Syn. Comm. 29 (14), 2377-2391 (1999): 히드록시메틸-디에틸렌트리아민으로부터의 합성법에 관한 문헌 참조]을 출발 물질(105.0 g)로 하여, 아세토니트릴(1.0 ℓ), 포스페이트 완충액[1.0 ℓ, NaH2PO4100 mg 및 Na2HP0410 mg을 물 1㎖에 용해시킨 후, H3P04에 의하여 pH를 4.5로 맞추어 제조] 및 TEMPO(7.0 g)를 합하여 이를 45 내지 50℃의 온도로 승온시켰다. 아염소산나트륨(29.8 g, 물 298 ㎖ 중에 용해) 및 차아염소산나트륨(744 ㎕)으로 이루어진 용액을 그 온도를 45 내지 50℃로 유지시키면서 상기 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 4 내지 10 시간 동안 격렬하게 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시킨 결과, 2 개의 층으로 분리되었다. 유기층을 분리한 다음, 이를 포화 수성 염화나트륨과 합하여 15 분 동안 교반하였다. 유기층을 분리하고 진공 하에서 농축시킨 결과, 오일(171 g)이 얻어졌으며, 이를 0.1% 트리에틸아민과 함께 헥산:이소프로판올을 사용하는 컬럼 크로마토그래피에 의하여 정제한 결과, 오일인 농축 생성물 81 g이 얻어졌다. MS(m/Z): 719.5[MH]+. 이 방법에 의하여 제조된 물질의 광학적 순도는 상기 물질의 순도와 다르지 않았다.
실시예 3 - C-말단 아민 작용기를 가진 변성 펩티드의 고상 합성용 수지
고상 합성법에 의하여 펩티드를 제조하였다. 고상 합성법에서는, 링커 및 수지를 합성하고자 하는 펩티드의 유형(예를 들면, C-말단에 필요한 작용기, 보호 또는 비보호 펩티드) 및 사용하고자 하는 합성 방법(예를 들면, Fmoc 또는 BOC 화학, 수동 또는 자동 합성법, 연속적 유동 또는 회분식 반응기)에 따라서 선택하였다. 예를 들면, C-말단에 카르복실기를 보유하는 펩티드의 합성에서, 보호된 아미노산은 상이한 수지 예컨대, HMPB 수지, 2-클로로트리틸클로라이드 수지 및 SUSRIN 수지에 부착된다. 다른 한편으로는, C-말단에 아미노기를 보유하는 펩티드의 합성에서, 디아민은 트리틸 수지에 부착될 수 있다. 폴리스티렌(PS) 수지는 회분식 합성법에 사용될 수 있는 반면에, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 변성 수지는 연속적 유동 및 회분식 합성법에 적당하다. 1,3-비스-(아미노메틸)-벤젠 트리틸 PS 수지를 비롯한 다수의 트리틸 PS 수지는 시판되고 있다. 필요로 하는 트리틸 PS 수지를 입수할 수 없으면, PEG 수지에 대하여 기술된 유사한 방법이 트리틸 PS 수지에 디아민을 부착시키는데 사용될 수 있다.
1,3-비스-(아미노메틸)-벤젠 트리틸 수지의 합성법에 관하여는 예시하였다. 다른 디아민도 유사한 방식으로 트리틸 수지에 부착될 수 있다.
1,3-비스-(아미노메틸)-벤젠 트리틸 PEG 수지의 제법
우선, 트리틸 알콜 수지(25 g, NovaSyn TGT 수지, NovaBiochem)를 깔대기에 넣고, 이를 DMF, CH2Cl2및 톨루엔의 순서로 세척하였다. 모든 용매를 제거한 후, 이 물질을 환류 냉각기가 장착된 플라스크로 옮겼다. 톨루엔(250 ㎖) 및 염화아세틸(25 ㎖)을 첨가하고, 슬러리를 70℃로 가열한 다음, 1.0 시간 동안 교반하였다. 염화아세틸(25 ㎖) 일부를 추가로 첨가하고, 슬러리를 2.0 시간 동안 70℃에서 교반하였다. 슬러리를 여과하고 수지를 톨루엔과 CH2Cl2의 순서로 세척하였다.
두번째로, 새로 제조된 염화트리틸 수지 및 THF(250 ㎖)를 플라스크에 넣었다. 이 슬러리에 1,3-비스-(아미노메틸)-벤젠(10 당량, 0.23 mmol/g의 수지 치환물을 기준)을 첨가하고, 이 혼합물을 18.0 시간 동안 실온에서 교반하였다. 슬러리를 여과하고 수지를 물, DMF, CH2Cl2, 메탄올 및 CH2Cl2의 순서로 세척하였다. 수지를 진공(실온, 1 내지 5 mm Hg) 하에서 건조시켜 일정한 중량(25.4 g)만큼을 얻었다.정량적 닌히드린 방법을 사용하는 치환 화학량론법을 수행하였다.
실시예 4 - 공유 콘쥬게이트의 합성(합성 단위체 1, 2, 4 및 5)
합성 단위체 1의 합성 방법
2,3-비스-tert-부톡시카르보닐아미노 프로피온산 벤질 에스테르
탄산세슘(6.5 g) 및 물의 용액을 아세토니트릴(25 ㎖) 중의 2,3-비스-tert-부톡시카르보닐아미노 프로피온산(3.04 g)에 첨가하였다. 이 혼합물을 40 분 동안 실온에서 교반하였다. 이 용매를 진공 하에서 제거하였다. 고체 잔류물에 DMF(50 ㎖)를 첨가하였다. 브롬화벤질(1.43 ㎖) 및 DMF(5.0 ㎖)의 용액을 15 분에 걸쳐 실온에서 첨가하였다. 이 혼합물을 18 시간 동안 교반한 후, 이 혼합물을 에틸 아세테이트(100 ㎖) 및 물(50 ㎖)로 희석시키고, 15 분 동안 교반하였다. 이 층을 분리하고, 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 이 혼합물을 여과하고, 이 여액을 진공 하에서 농축시킨 결과, 오일(3.6 g)을 얻었다. 이 오일을 에틸 아세테이트/헥산을 사용하는 컬럼 크로마토그래피를 수행시킨 결과, 오일(1.8 g)이 얻어졌다. MS(m/Z): [M+Na]+= 417.1H NMR(300 MHz): 1.4(s, 9H), 2.4(m, 2H), 4.4(m, 1H), 4.8(m, 1H), 6.5(m, 1H), 7.3(m, 5H).
2,3-디아미노-프로피온산 삼염산염
2,3-비스-tert-부톡시카르보닐아미노 프로피온산 벤질 에스테르(1.8 g) 용액, 4 N 수성 HCl(40 ㎖) 및 아세토니트릴(50 ㎖)을 18 시간 동안 실온에서 교반하였다. 진공 하에서 용매를 제거하고, 혼합물을 에틸 아세테이트(100 ㎖)와 물(50 ㎖)로 희석시킨 후, 이를 15 분 동안 교반하였다. 그 후, 층들이 분리되었으며, 이들 중 수성 층을 증발 건조시켰다(1.23 g, 발포체/시럽).1H NMR(300 MHz): 3.2-3.5(m, 2H), 4.2-4.35(m, 1H), 5.13-5.25(q, 2H, J = 11.8, 3.1 Hz)
2,3-비스-카르복시-DTPA 프로피온산 벤질 에스테르
2,3-디아미노-프로피온산 삼염산염(6.65 g), bb(CO)DTPE(40.0g, "합성 단위체 3"), HOBt(8.5 g), DIC(9.0 ㎖), 디이소프로필에틸아민(15.0 ㎖), CH2Cl2(400 ㎖) 및 DMF(200 ㎖)를 48 시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 염화메틸렌(500 ㎖)과 물(250 ㎖)로 희석시킨 다음, 15 분 동안 교반하였다. 이 혼합물은 층으로 분리되었으며, 이 층들 중 유기층을 포화 탄산나트륨(250 ㎖), 포화 염화나트륨(250 ㎖)으로 세척한 다음, 황산나트륨으로 건조시켰다. 혼합물을 여과하고, 여액을 진공 하에서 농축시켜 오일을 얻었다. 오일을 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하는 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하여 물질 28.0 g을 얻었다. MS(m/Z): [M+2]+= 798; [M+1]+= 1595.
2,3-비스-카르복시-DTPA 프로피온산
에틸 아세테이트/트리에틸아민(10:3) 중에서 10% 탄소상 팔라듐(6.0 g) 촉매를 사용하여 24 시간 동안 50 psi에서 2,3-비스-카르복시-DTPA 프로피온산 벤질 에스테르(17.0 g)의 수소화를 수행하였다. 용기를 질소로 정화시키고, 혼합물을 Celite(등록상표)로 여과하여, 감압 하에서 농축시킨 결과 오일 16.0 g을 얻었다. MS(m/Z): [M+2]+= 753; [M+1]+= 1504.
합성 단위체 2의 합성 방법
N 1 ,N 3 -비스[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-3-{[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-에틸]-(tert-부톡시카르보닐메틸)-아미노}-프로피온아미드]-디에틸렌트리아민
디에틸렌트리아민(3.16 ㎖), 아세토니트릴(700 ㎖) 및 디이소프로필에틸아민(10.4 ㎖)의 용액에 아세토니트릴 중의 예비 반응시킨(30 분 동안) bb(CO)DTPE(42.0 g, "합성 단위체 3"), HOBt(7.9 g), EDC(11.2 g) 및 디이소프로필에틸아민(10 ㎖)을 실온에서 첨가하였다. 반응물을 16 시간 동안 교반한 다음, 이를 감압 하에서 농축시켰다. 오일을 에틸 아세테이트와 합하고, 물 및 염화나트륨의 포화 수용액으로 추출한 다음 농축시켰다. 오일을 헥산/이소프로판올/트리에틸아민을 사용하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피를 행한 결과, 생성물 22.5 g을 얻었다. MS(m/Z): [M+H]+= 1503.
N 1 ,N 3 -비스[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-3-{[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-에틸]-(tert-부톡시카르보닐메틸)-아미노}-프로피온아미드]-N 2 -(벤질옥시카르보닐메틸)-디에틸렌트리아민
벤질-2-브로모아세테이트(2.54 g)을 이전에 제조한 아민 화합물(13.5 g), 아세토니트릴(200 ㎖) 및 탄산나트륨(1.18 g)의 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 60℃로 승온시키고 15 시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 이를 감압 하에서 농축시켰다. 에틸 아세테이트 및 물을 첨가하였더니, 층이 분리되었다. 유기층을 포화 수성 염화나트륨으로 세척한 후, 감압 하에서 농축시킨 결과, 오일(14.5 g)이 얻어졌다. MS(m/Z): [M]+= 1651.
N 1 ,N 3 -비스[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-3-{[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-에틸]-(tert-부톡시카르보닐메틸)-아미노}-프로피온아미드]-N 2 -(아세트산)-디에틸렌트리아민
상기 벤질 에스테르(14 g)를 50 psi 및 16 시간 동안, 10% 목탄상팔라듐(3.5 g)의 존재 하에 에틸 아세테이트/트리에틸아민(49:1) 중에서 수소화시켰다. 생성된 혼합물을 Celite(등록상표)로 여과시키고, 이를 진공 하에서 농축시킨 결과, 오일 12.08 g을 얻었다. MS(m/z): [M+H]+= 1561.
합성 단위체 4의 합성
N 1 ,N 3 -비스-부톡시카르보닐-디에틸렌트리아민
실온에서 THF(100 ㎖) 중의 디에틸렌트리아민(2.12 g, 20.6 mmol) 및 트리에틸아민(30.0 g, 41.3 mmol)의 용액에 Boc-ON(10.65 g, 43.3 mmol)을 첨가하였다. 이 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 이 혼합물에 에테르 700 ㎖를 첨가하고, 포스페이트 완충액(pH = 3, 100 mmol)으로 추출하였다. 수용액을 염기화시켜 pH 11로 만들고, 이를 디클로로메탄으로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 이를 무수 황산나트륨으로 건조시켰다. 감압 하에서 염을 여과하고, 용매를 제거하여 무색 오일인 표제 화합물(5.55 g)을 얻었다. MS(m/z): [M+H]+= 304.1.
N 1 ,N 3 -비스-부톡시카르보닐-N 2 -(벤질옥시카르보닐에틸)-디에틸렌트리아민
실온에서 메탄올(40 ㎖)중 상기 화합물(1.0 g, 3.30 mmol) 용액에 벤질 아크릴레이트(1.07 g, 6.59 mmol)를 첨가하였다. 이 혼합물을 3 일 동안 환류시켰다. 감압 하에서 용매를 제거한 결과, 표제 화합물과 벤질 아크릴레이트를 함유하는 황색의 액체를 얻었다. MS(m/Z): [M+H]+= 466.1.
N 2 -(벤질옥시카르보닐에틸)-디에틸렌트리아민
실온에서 디클로로메탄(25 ㎖) 중의 상기 화합물 및 벤질 아크릴레이트(1.0 g)의 혼합물에 TFA(13.8 ㎖)를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반한 후, 이 혼합물에 1 N HCl과 물을 첨가하였다. 수성층을 분리하여 이를 동결 건조시킨 결과, 점착성 고체인 표제 화합물(420 ㎎)을 얻었다. MS(m/Z): [M+H]+= 266.2.
N 1 ,N 3 -비스[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-3-{[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-에틸]-(tert-부톡시카르보닐메틸)-아미노}-프로피온아미드]-N 2 -(벤질옥시카르보닐에틸)-디에틸렌트리아민
CH2Cl2및 DMF 중의 상기 화합물, "합성 단위체 3", HOBt 및 디이소프로필에틸아민의 용액에 DIC를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 48 시간 동안 교반하였다. 이 혼합물을 디클로로메탄과 물로 희석시킨 다음, 이를 15 분 동안 교반하였다. 층들이 분리되었으며, 이 층들 중 유기층을 포화 탄산나트륨, 포화 염화나트륨으로 세척한 다음, 이를 황산나트륨으로 건조시켰다. 이 혼합물을 여과하고, 여액을 진공 하에서 농축시켜 오일을 얻었다. 이 오일을 에틸 아세테이트 및 헥산을 사용하여 실리카 겔 크로마토그래피시켜 표제 화합물을 얻었다.
N 1 ,N 3 -비스[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-3-{[2-(비스-tert-부톡시카르보닐메틸-아미노)-에틸]-(tert-부톡시카르보닐메틸)-아미노}-프로피온아미드]-N 2 -(프로피온산)-디에틸렌트리아민
수소화 용기를 상기 화합물, 10% 탄소상 팔라듐, 에틸 아세테이트 및 트리에틸아민으로 충전시켰다. 이 용기를 질소로 정화시킨 후, 다시 수소로 정화시켰다. 이 혼합물을 24 시간 동안 수소 분위기(50 psi) 하에서 진탕시켰다. 용기를 질소로 정화시키고, 혼합물을 Celite(등록상표)로 여과시킨 다음, 이 여액을 감압 하에서 농축시켜 오일인 생성물을 얻었다.
합성 단위체 5의 합성
메틸 3-(벤질아미노)-2-((벤질아미노)메틸)-프로피오네이트
아세토니트릴(20 ㎖) 중에 용해된 메틸-2-(브로모메틸)-아크릴레이트(1.00 g, 5.6 mmol, 1.0 당량)를 실온에서 교반하면서 무수 아세토니트릴(10 ㎖) 중의 벤질아민(1.83 ㎖, 16.8 mmol, 1.5 당량)의 용액에 적가하였다. 16 시간 경과 후, 에테르(100 ㎖)를 첨가하고, 백색 고체(브롬화수소벤질아민)를 여과하였다. 감압 하에서 이 여액을 농축시킨 결과, 미정제 오일 1.90 g을 얻었다. 이 오일을 에틸 아세테이트(150 ㎖) 중에 용해시키고, 이를 H2O 및 NaCl 염수로 세척하였다. 유기층을 감압 하에서 건조(MgSO4) 및 증발시켰다. 생성된 맑은 오일을 플래쉬 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트)로 정제한 결과, 생성물 1.38 g(79%)을 얻었다.1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ1.68(s, 2H), 2.79-2.90(m, 5H), 3.68(s, 3H), 3.75(s, 3H), 7.21-7.32(m, 10H).
메틸 3-(아미노)-2-(아미노메틸)-프로피오네이트
메틸 3-(벤질아미노)-2-((벤질아미노)메틸)-프로피오네이트(2.27 g, 7.3 mmol, 1.0 당량)를 염화메틸렌(20 ㎖) 중에 용해시키고, 디옥산 중의 HCl의 4 M 용액 4.0 ㎖를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 20 분 동안 교반한 다음, 용매를 감압하에서 증발시킨 결과, 백색의 분말을 얻었으며, 이를 50 ㎖의 MeOH 중에 용해시켰다. 0℃의 아르곤 대기 하에서 촉매(10% 탄소 촉매상 팔라듐, 750 ㎎)를 첨가하고, 이 혼합물을 45 psi H2에서 18 시간 동안 진탕시킨 다음, Celite(등록상표)로 여과시켰다. 생성물(1.47 g)을 분리한 다음, MeOH를 분리하고, 감압 하에서 증발시켰다.1H NMR(300 MHz, D20): δ3.25-3.43(m, 5H), 3.82(s, 3H).
메틸 3-(Boc-아미노)-2-(BOC-아미노메틸)-프로피오네이트
디아민(1.44 g)을 0℃에서 1 시간 동안, 그 다음 실온에서 18 시간 동안 디옥산/수성 Na2CO3중의 디-tert-부틸 디카르보네이트(3.22 g, 14.8 mmol, 1.05 당량)와 반응시켰다. 그 후, 이 혼합물을 0.5 N KHSO4로 산성화(pH = 4)시키고, 디옥산을 감압 하에서 증발시켰다. 수성 부분을 에틸 아세테이트로 추출하고, 이를 MgSO4로 건조시킨 다음, 감압 하에서 농축시킨 결과, 미정제 오일을 얻었으며, 이를플래쉬 크로마토그래피(헥산:에틸 아세테이트)를 행하여 정제한 결과, 목적 생성물 1.86 g(80%)을 얻었다. NMR(300 MHz, CDCl3): δ1.41(s, 18H), 2.66-2.78(m, 1H), 3.10-3.27(m, 2H), 3.50-3.62(m, 2H), 3.68(s, 3H), 5.17-5.27(bt,2H).
3-(BOC-아미노)-2-(BOC-아미노메틸)-프로판산
메틸 에스테르(1.50 g)를 THF/H2O의 2:1 혼합물 15 ㎖에 용해시켰다. LiOH·H2O(0.95 g)를 0℃에서 첨가하였다. 이 혼합물을 0℃ 내지 실온의 온도에서 44 시간 동안 교반하였다. THF를 감압 하에서 증발시키고, 수용액을 EtOAc로 추출하였다. 수성층을 0.5 M 수성 KHSO4로 산성(pH = 3)으로 만들고, EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 분획을 H2O 30 ㎖로 세척하고, 이를 건조(MgSO4)시켰다. 감압 하에서 용매를 증발시킨 결과, 생성물 1.32 g(92%)을 얻었다.1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ1.40(s, 18H), 2.66(s, 1H), 3.27-3.47(m, 4H), 5.42(s, 1H).
벤질 3-(BOC-아미노)-2-(BOC-아미노메틸)-프로피오네이트
산(1.01 g)을 실온에서 Cs2CO3를 함유하는 무수 DMF(2.07 g) 중에서 브롬화벤질(0.45 ㎖)과 반응시켰다. 감압 하에서 DMF를 증발시키고, 잔류물을 H2O와 EtOAc 사이에 분배시켰다. 유기층을 염수로 세척하고, 건조(MgSO4)시켰다. 감압 하에서 용매를 증발시키고, 잔류물을 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피(헥산/EtOAc 95:5→9:1 →85:15)로 정제하였다. 수득량 = 1.16 g(90%).1H NMR(300 MHz, CDCl3): δ1.42(s, 18H), 2.79(quint,1H, 5.6 Hz), 3.1-3.3(m, 2H), 3.5-3.65(m, 2H), 5.13(s, 2H), 5.15-5.28(m, 1H), 7.30-7.40(m, 5H). MS: 431.15(M+1).
벤질 3-아미노-아미노메틸-프로피오네이트 디하이드로클로라이드 염
벤질 3-(BOC-아미노)-2-(BOC-아미노메틸)-프로피오네이트(1.15 g)를 디옥산 중의 4 M HCl 용액 5 ㎖에 용해시켰다. 이 혼합물을 0℃에서 6 시간 동안 교반하고, 디옥산을 감압 하에서 증발시켰다. 잔류물을 에테르로 분쇄시키고, 이를 여과한 결과, 미정제 디아민 이염산염(0.81 g)을 얻었다.1H NMR(300 MHz, MeOD): δ3.1-3.3(m, 5H + CHD20D), 3.55(s, 디옥산), 5.19(s, 2H), 5.15-5.28(m, 1H), 7.20-7.40(m, 5H) MS: 209.00(M+1).
벤질 3-(N-BB(CO)DTPE 카르복시아미드)-2-(N-BB(CO)DTPE 카르복시아미드 메틸-프로피오네이트
산(2.00 g, 2.8 mmol, 1.5 당량)을 5 ㎖ 무수 디클로로메탄 중에 용해시켰다. 디아민(0.26 g), HOAt(0.32 g) 및 디이소프로필에틸아민(0.65 ㎖)을 0℃에서 HATU(0.88 g)와 2 시간 동안 반응시켰다. 트리스 아민 수지(0.5 g), 이소시아네이트 수지(0.5 g) 및 HATU(0.42 g)를 첨가하고, 이 반응 혼합물을 실온에서 16 시간 동안 실온에서 교반하였다. 이 수지를 여과시키고, 여액을 증발시켰다. 잔류물을 H2O와 EtOAc 사이에 분배시켰다. 유기층을 H2O, 포화 NaHCO3및 염수(20 ㎖)로 세척하고, 건조(MgSO4)시켰다. 감압 하에서 용매를 증발시켰다. 오일을 실리카 겔 상 플래쉬 크로마토그래피(헥산/아세톤/Et3N)로 정제한 결과, 생성물(1.13 g)을 얻었다. MS: 1607.95(M+1) 및 1629.95(M+Na).
3-(N-BB(CO)DTPE 카르복시아미드)-2-(N-BB(CO)DTPE 카르복시아미드)메틸-프로피온산
벤질 에스테르(0.90 g, 0.56 mmol)를 EtOAc 30 ㎖에 용해시키고, 여기에 Et3N(1 ㎖)을 첨가하였다. 10% 탄소상 팔라듐 촉매(0.50 g)을 첨가하고, 이 혼합물을 15 시간 동안 45 psi 수소 하에서 진탕시켰다. 촉매를 여과하고, 용매를 증발시킨 결과, 생성물(0.82 g)을 얻었다. MS: 759.55 (M+2H/2).
실시예 5 - 피브린-결합 MR 영상화제의 합성법
32
펩티드 구성: 1,3-비스-(아미노메틸)-벤젠 트리틸 NovaSyn TGT 수지(측정 치환값 = 0.59 mmol) 3.39 g을 표준적인 펩티드 컬럼에 넣고, 펩티드 합성기에 로딩하였다. 표준적인 Fmoc 기법을 사용하여 합성을 수행하였다. DMF 중의 무수아세트산, 6% 디이소프로필에틸아민을 사용하여 제1 아미노산을 커플링시킨 후, 캡핑하였다. 합성을 완료하였을 때, 컬럼으로부터 수지를 분리하여 이를 반응 용기에 넣었다. 수지를 CH2Cl2로 1 회 세정한 다음, 여과시켰다. 그 후, 수지를 CH2Cl2중의 1% 트리플루오로아세트산으로 처리하고, 10 분 동안 기계식 진탕기 상에 놓았다. 반응 용기를 통하여 혼합물을 여과하고, 이 여과물을 수집하였다. 트리에틸아민을 사용하여 합한 여액의 pH를 약 8로 맞추고, 이 용액을 진공 하에서 농축시킨 결과, 오일이 생성되었다. 물로 침전시킨 후, 백색 고체를 여과하여 이를 물과 디에틸 에테르로 세정하였다. 고체를 흡출 여과법으로 건조시키고, 이를 DMF 중에 용해시킨 다음, 아세토니트릴로 희석시켰다. 이 용액을 얼음욕에서 냉각시키고, 탈륨 트리플루오로아세테이트 1.5 g으로 2.0 시간 동안 처리하였다. 트리에틸아민으로 용액의 pH를 pH 8로 맞춘 다음, 진공 하에서 농축시켰다. 물을 오일에 첨가하여 생성된 침전물을 흡출 여과법으로 수집하였다. 고체를 물과 디에틸 에테르로 세척한 결과, C-말단 아민 작용기를 가진 미정제 변성 펩티드 2.7 g을 얻었다. H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-Asp-CO-NHCH2C6H4CH2NH2(서열 번호 21)의 합성예는 1792.8[M+Na]+의 m/Z 값을 관찰함으로써 확인되었다. 변성 펩티드를 조제용 HPLC에 의하여 정제하였다. 순도(98 내지 100%)가 유사한 분획을 합한 다음, 중화시키지 않고 동결 건조시켰다.
변성 펩티드(3.2 g) 및 공유 콘쥬게이트(합성 단위체 2)(3.95 g)를 디클로로메탄 중에 용해시켰다. pH가 9로 측정될 때까지 디이소프로필아민을 적가하고, 이 혼합물에 디이소프로필카르보디이미드(2 당량) 및 HOBt(2 당량)를 동시에 첨가하였다. 2 분 동안 교반한 후, pH가 9로 측정될 때까지 디이소프로필에틸아민을 적가하였다. 이 혼합물을 실온에서 2 시간 동안 교반하였다. 추가의 예비 활성화된 합성 단위체 2(디이소프로필카르보디이미드, 디이소프로필에틸아민 및 HOBt 함유)를 일부 첨가하였다. 용매를 진공 하에서 제거하고 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰으며, 이를 0.1 N 염산, 포화 중탄산나트륨 및 포화 수성 염화나트륨으로 차례로 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 감압 하에서 농축시킨 결과, 밝은 황색의 발포체(7.8 g)를 얻었다. 상기 발포체를 디클로로메탄 중에 용해시키고, 이를 플래쉬 크로마토그래피(용리액 = 디클로로메탄:메탄올)에 의하여 정제한 결과, 백색 고체(5.6 g)를 얻었다. 이 백색 고체를 실온에서 TFA, 물 및 트리에틸실란의 혼합물(90%/5%/5%, 30 ㎖) 중에서 교반하였다. 이 혼합물을 40℃의 온도로 가열한 후, 2 시간 동안 교반하였다. 이 용액을 부피 3 내지 5 ㎖가 되도록 농축시킨 다음, 실온으로 냉각시켰다. 디에틸 에테르를 첨가한 결과, 백색 침전물이 형성되었다. 이 혼합물을 10 분 동안 교반하고, 고체를 여과에 의하여 수집한 다음, 디에틸 에테르로 세척하였다. 상기 고체를 진공 하에서 건조시킨 결과, 백색 고체(4.0 g)가 형성되었다. 이 고체를 물:아세토니트릴의 혼합물(비율 = 4:1, 20 ㎖) 중에 용해시킨 후, 조제용 HPLC로 정제한 결과, 백색 고체인 전구체 MR 영상화제(1.6 g)를 얻었다.
전구체 MR 영상화제(1 g)를 증류 탈이온수 중에서 GdCl3·6H2O 1 당량과 반응시키고, 여기에 1 M NaOH를 첨가하여 pH를 약 6으로 맞추었다. 상기 가돌리늄 착체를 증류 탈이온수 및 50:50(v:v) 메탄올:물의 용리액을 사용하는 역상 크로마토그래피(Waters Sep-Pak(등록상표) C-18)로 정제하였다. 적당한 분획들을 합하고, 50℃ 및 감압 하에서 메탄올을 제거한 다음, 동결 건조시킨 결과, MR 영상화제 811 ㎎을 얻었다.
상기 제시된 32의 합성법에 대한 대안으로서, 다음의 반응식에 나타낸 바와같이, 펩티드를 수지 상에서 고리화시킬 수도 있다:
실시예 6 - 유사한 방식으로 제조된 MR 영상화제
각각의 하기 MR 영상화제를 전술한 방법과 유사하게 합성하였다. 표준 Fmoc 방법을 이용하여 제조하고, 탈륨 트리플루오로아세테이트를 사용하여 고리화시킨펩티드를 HPLC로 정제하고, 디클로로메탄 중에서 합성 단위체 2, 디이소프로필에틸아민, 디이소프로필카르보디이미드(2 당량) 및 HOBt(2 당량)와 반응시켰다. 용매를 진공 하에 제거하고, 잔류물을 에틸 아세테이트 중에 용해시켰으며, 이것을 0.1 N 염산, 포화 중탄산나트륨 및 포화 수성 염화나트륨으로 연속 세척하였다. 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과하며, 감압 하에 농축하여 발포체을 얻었고, 이것을 필요한 경우 플래쉬 크로마토그래피 또는 HPLC로 정제하였다. 형성된 백색 고체를 TFA, 물 및 트리에틸실란의 혼합물(90%/5%/5%, 30 ㎖) 중에 2 내지 6 시간 동안 실온에서 교반하였다. 디에틸 에테르를 첨가하고, 형성된 백색 침전물을 정제용 HPLC(CH3CN/H2O/AcONH4)로 정제하여 백색 고체의 전구체 MR 영상화제를 얻었다.
전구체 MR 영상화제를 탈이온수(pH 6, NaOH) 중의 GdCl3ㆍ6H20 1 당량과 반응시켰다. 물과 메탄올:물 50:50 용출제를 사용하는 워터스(Waters) Sep-Pak(등록상표) C-18 카트리지 상에서의 역상 크로마토그래피를 사용하여 가돌리늄 킬레이트를 정제하였다. 적당한 분획을 조합하고, 50℃에서 감압 하에 메탄올을 제거하였으며, 동결 건조하여 소정 MR 영상화제를 얻었다. 표 3은 각 화합물을 확인하는 질량 분광학적 데이터를 제공한 것이다. 각 화합물의 구조식에 대해서는 상세한 설명을 참조할 수 있다.
피브린-결합 화합물의 MS 데이터
화합물 분자량 MS(M + 3H)3+/3
계산치 관측치
4 4016.884 1256.49467 1255.66
5 4025.96 1259.52 1259.9
6 4108.014 1286.87133 1284.53
7 4307.336 1353.312 1369.34
8 4076.064 1276.22133 1298.48
9 4233.208 1328.60267 1327.94
10 4221.199 1324.59967 1324.57
11 4142.146 1298-24867 1321.13
12 4123.378 1291.99267 1289.80
13 4325.675 1359.425 1333.3
14 4470.833 1407.811 1407.44
15 4363.362 1371.98733 1393.99
16 4511.483 1421.361 1444.57
17 4169.128 1307.24267 1329.85
18 4503.826 1418.80867 1419.25
19 4387.428 1380.00933 1379.12
20 4305.369 1352.65633 1351.6
21 4419.473 1390.691 1390.53
22 4277.356 1343.31867 1341.04
23 4357.829 1370.143 1370.63
24 4443.644 1398.748 1398.9
25 4448.209 1400.26967 1400.11
26 4326.731 1359.777 1359.9
27 4423.505 1392.035 1392.79
28 4343.375 1365.325 1364.7
29 4342.387 1364.99567 1364.7
30 4313.366 1355.322 1354.9
31 4342.387 1364.99567 1364.8
32 4319.303 1357.301 1357.6
실시예 7 - 피브린-결합 광학 콘트라스트제의 합성
상기 설명한 방법과 유사하게 하기 광학 콘트라스트제를 각각 합성한다. 하기 반응식 X는 2 가지 동일한 광학 염료가 동일한 펩티드에 첨가되는 것인 일반적인 예를 나타낸 것이다.
5-카르복시테트라메틸로다민-함유 화합물(3A)
펩티드 1(177 mg, 0.10 mmol) 및 5-카르복시테트라메틸로다민 숙신이미딜에스테르 A(111 mg, 0.21 mmol)를 디클로로메탄(20 ㎖)과 DMF(20 ㎖) 중에 용해시킨다. pH가 9.0로 측정될 때까지 디이소프로필에틸아민을 적가한다. 이 혼합물을 밤새 교반한 후, 용매를 감압 하에 제거한다. 잔류물을 실리카 겔 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(용출제: 디클로로메탄/메탄올)로 정제하여 화합물 2A를 얻는다.
화합물 2A에 TFA, H2O 및 트리에틸실란의 용액(비율: 90/5/5, 5 ㎖)을 첨가한다. 이 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 진탕시킨 후, 반응 혼합물 용액을 에테르 50 ㎖에 부어 미정제 생성물을 침전시킨다. 용매를 원심분리에 의해 분리한 후, 미정제 생성물을 수집하고, 이어서 역상 HPLC로 정제하여 화합물 3A를 얻는다.
5-카르복시플루오레신 함유 화합물(3B)
화합물 3A의 합성에서 설명한 바와 같은 유사한 절차로, 화합물 3B는 펩티드 1(177 mg, 0.10 mmol) 및 5-카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르 B(99.4 mg,0.21 mmol)을 사용하여 합성한다.
텍사스 레드(등록상표) 함유 화합물(3C)
화합물 3A의 합성에서 설명한 바와 같은 유사한 절차로, 화합물 3C는 펩티드 1(177 mg, 0.10 mmol) 및 텍사스 레드(등록상표)-X 숙신이미딜 에스테르 C(172 mg, 0.21 mmol)를 사용하여 합성한다.
실시예 8 - 표적에 대한 콘트라스트제의 결합을 측정하는 방법
표적, 예컨대 HSA 또는 피브린에 대한 본 발명에 따른 콘트라스트제의 결합 정도는 다양한 평형 결합 방법으로 평가할 수 있다. 예를 들면, HSA에 대한 결합은 한외여과법으로 측정할 수 있다. 한외여과법을 이용하는 전형적인 결합 측정에서는, pH 7.4의 완충제 중에 HSA 1 부피 당 4.5 중량%로 콘트라스트제를 혼합한다. 이 샘플은 표적화기에 대하여 침투 가능하지만, HSA에 대하여 침투 불가능한 30 kDa 분자량 컷오프 필터(Millipore Utrafree MC Low Binding Regenerated Cellulose 30 kDa mol. wt. cutoff catalog # UFC3LTK00)를 구비한 시판되는 원심분리 장치 내로 적재한다. 샘플 부피의 소량 부분(5 내지 10%)은 컷오프 필터를 통해 20 분 동안 2000 ×g의 원심분리로 여과하고, 샘플 내에서 미결합된 표적화기의 농도를 여액 중에서 측정한다.
피브린에 대한 결합을 측정하기 위해서는, 피브린 응혈을 마이크로타이터 플레이트의 웰 내에 형성시키고, 표적화기와 접촉시킬 수 있다. 평형을 달성하기에 충분한 항온 처리 시간 후, 상청액을 흡입에 의해 제거한다(불용성 피브린은 웰의 바닥에 겔화된 응혈로서 결합된 상태를 유지한다). 이어서, 상청액 중의 미결합된표적화기의 농도를 측정한다.
양쪽 방법론에서, 결합된 콘트라스트제의 농도는 결합 분석을 수행하여 초기 존재하는 전체 표적화기 농도와 미결합된 표적화기 농도 간의 차이로서 측정한다. 결합된 분율은 결합된 표적화기의 농도를 전체 표적화기의 농도로 나눈 값이다.
용해성 피브린 DD(E) 단편에 대한 콘트라스트제의 친화성은 상기 설명한 바와 같이 검사하였고, 하기 표 4에 기재한다. 표 4에 제공된 화합물 번호는 상세한 설명에서 설명한 구조식을 의미한다. 복수 측정에 있어서 이러한 데이터는 이러한 생물학적 분석에서 단지 20%만의 오차 빈도를 갖는다.
피브린에 대한 화합물의 친화성
화합물 Kd, DD(E), μM 화합물 Kd, DD(E), μM
4 33 19 10
5 12 20 1.2
6 13 21 9.1
7 12 22 3.5
12 5.0 31 0.8
13 5.1 23 0.25
14 4.9 24 0.7
32 4.7 25 5.6
15 4.0 42 0.07
16 3.5 43 0.08
17 6.2 44 0.09
18 5.9 45 0.1
8 8.6 33 0.1
9 6.1 35 0.11
10 9.6 46 0.15
11 13 47 0.18
27 0.7 48 0.199
28 5.3 49 0.22
29 0.8 50 0.3
30 3.7 34 0.39
실시예 9 - 콘트라스트제의 안정성
안정성은 세포내 효소 및 세포외 효소를 모두 함유하고, 펩티드 결합에 대하여 매우 가혹한 화학적 환경을 제공하는 래트 간 호모게네이트를 사용하여 분석하였다. 새로 제조한 래트 간 호모게네이트(630 ㎕)를 유리 시험 튜브 내에 배치하고, 수조에서 4 분 동안 37℃로 항온 처리하였다. 37℃의 래트 간 호모게네이트에 시험 화합물의 1 mM 용액 70 ㎕를 첨가하였다. 시간 0, 5, 15, 30 및 60 분에서, 반응 혼합물의 분액 100 ㎕를 제거하고, 마이크로퓨즈 튜브 내의 메탄올 100 ㎕와 혼합하여 반응 혼합물을 급냉시켰다. 이 급냉된 반응 혼합물을 3 분 동안 10,000 rpm으로 원심 분리하여 침전된 단백질을 펠릿화하였다. 상청액을 LC-MS로 분석하여, 단일 이온 MS 피크의 면적과 일련의 표준물 면적의 비교에 의한 잔류 시험 화합물의 양을 정량화하였다. 반감기(T1/2)는 시간에 대하여 로그 잔류 시그널(%)을 도시함으로써 결정하였다. 데이터는 지수 곡선 접합을 이용하여 접합하였는데, 여기서 T1/2 = In2/기울기였다.
하기 화합물들의 안정성 데이터를 시험하였다. 펩티드의 C-말단 및 N-말단에서 모두 킬레이트를 갖는 화합물 5는 엑소펩티다제 가수분해에 대한 내성으로 인하여 그 결과 반감기가 현저하게 상승하였다. 반감기의 비교할 만한 증가는, 다른 말단이, 예를 들면 (N-말단 상에 바이페닐기를 함유하는) 화합물 3에서와 같이 비천연 유기 부위로 캡핑 처리된 경우라고 할 지라도, 킬레이트에 의한 1 개 말단의 변형을 통해서는 달성되지 않았다.
구조 1: 반감기 = < 2 분, 자유 N-말단 및 아미드화된 C-말단
구조 2: 반감기 = 10 분, 킬레이트에 콘쥬게이트된 N-말단 및 아미드화된 C-말단
구조 3: 반감기 = 9 분, 킬레이트에 콘쥬게이트된 C-말단 및 파라-(페닐)벤조산에 의해 아실화된 N-말단
구조 5: 반감기 = 65 분, 킬레이트에 모두 콘쥬게이트된 N-말단 및 C-말단
놀랍게도, 상기 데이터는 펩티드의 반감기가 C-말단 및 N-말단에 모두 가돌리늄 킬레이트를 첨가함으로써 가장 현저하게 증가된다는 점을 예시하고 있다.
실시예 10 - 콘트라스트제의 이완성
본 발명의 MRI 콘트라스트제는 0.47 Tesla(20 MHz H-1 Larmor 진동수) 및 37℃에서 작동하는 Bruker NMS-120 Minispec NMR 분광계 또는 35℃에서 작동하는 Konig-Brown 이완계(relaxometer)(20 MHz, H-1 Larmor 진동수)를 사용하여 이완성에 대하여 평가하였다. 물 양성자의 T1은 기기 소프트웨어를 사용하는 반전 회복 펄스시퀀스(inversion recovery pulse sequence)로 측정하였다. 이완도는 0, 20, 30 및 40 μM Gd(III)을 각각 함유하는 표적(예를 들면, 새로 중합된 피브리노겐의 균일분산성 겔, 10 mg/㎖)의 다중 용액의 T1을 측정함으로써 결정하였다. 샘플을 37℃에서 15 분 이상 동안 항온 처리하여 T1 측정을 수행하기 전에 온도 평형을 확실하게 한다. 샘플의 Gd(III) 함량은 유도성 커플링 플라즈마-질량 분광계(ICP-MS)로 측정한다. (Gd(III) 이온 당) 이완도는 Gd(III) 농도(mM) 대하여 이완 속도(1/T1)(s)를 도시함으로써 측정한다. 데이터에 대한 선형 접합의 기울기는 이완성을 부여한다. 또한, 표적의 부재 하에 화합물의 이완도도, 표적이 전혀 존재하지 않는다는 점을 제외하고는, 유사한 방식으로 측정한다.
본 발명의 화합물은 생물학적 표적의 부재 하에서의 이완도와 비교하였을 때 피브린에 대한 결합시 증가된 이완도를 나타낸다(도 2).
실시예 11 - 콘트라스트제의 응혈 흡수
콘트라스트제의 혈전(응혈) 내로의 흡수는 다음과 같은 방법에 의해 측정하였다. 600 g 기니 피그(Hartley 수컷)를 마취하였다. 복부 절개하고, 하대정맥(IVC)을 분리하며, 혈관을 10 분 동안 회복시켰다. IVC의 1 cm 부분을 겸자로 고정하고, 사람 트롬빈(50 ㎕, 4 단위)을 혈관 내로 주입하여 혈전 형성을 촉진시켰다. 하부 겸자를 개방하고 폐쇄하여, 분절에 부분적인 혈액을 흐르게 하였다. 2 내지 3 분 후, 클립을 제거하였다. 혈전을 30 분 동안 동물 내에서 노화시켰다. 이 시점에서, 2 μmol/kg과111In 70 μCi로 방사능 표지화된 미량의 투여량으로 콘트라스트제, 화합물 32를 경정맥을 통해 주입하였다. 콘트라스트제, 화합물 32를 주입한 직후, 2 μmol/kg과 이에 혼합된 70 μCi99mTcDTPA의 투여량으로 Gd(DTPA)를 포함하는 비특이성 대조예를 경정맥을 통해 주입하였다. 30 분 후, 혈액을 채혈하고, 동물을 희생하였으며, 혈전을 제거하였다. 핼액 샘플을 평량하고, Packard Cobra II 감마 카운터를 사용하여 계수하였다. 또한, 혈전도 평량하고 계수하였다.99mTc로부터 야기된 계수를 128 내지 165 keV로부터 검출하고, 동시에111In의 붕괴로부터 야기되는 계수를 390 내지 500 keV로부터 검출하였다. 단지99mTc 또는111In만을 사용한 대조 실험은99mTc로부터 야기되는 방사능활성이111In의 경우에 사용된 검출 에너지에서 무시할 만하였고, 반대의 경우도 마찬가지였다는 점을 입증한다. 방사 활성 붕괴 데이터를 조직 1 g 당 초기 투여량 %, % ID/g로 전환시키고, 3 회 실험의 평균치를 그래프로 표시하였다.111In로 방사능 표지화를 미리 수행하였다.111InCl3(뉴잉글랜드 뉴클리어)의 적당한 방사화학적 양을 피브린 표적화 콘트라스트제에 첨가하였다. 1 M HCl를 첨가하여 pH를 4로 조정하였다. 샘플을 45℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 1 M NaOH를 첨가하여 pH를 중성으로 조정하였다. 표지화된 콘트라스트제, 화합물 32는 γ-검출된 HPLC에 의하면 > 95% 순도였다.
피브린 특이성 제제는 응혈 흡수에서 현저한 증가를 나타낸다. 도 3은 콘트라스트제, 화합물 32가 혈전 내에 축척되고 있다는 것을 보여준다.99mTcDTPA와 비교하여 특이적인 응혈 흡수가 존재하고, 주위 혈액 내의 것보다 더 높은 혈전내 콘트라스트제 농도가 존재한다.
또한, 응혈 흡수의 특이성은 MRI를 사용하면 입증할 수 있다. 콘트라스트제를 사용하여 혈전을 생체내 영상화시키기 위한 절차는 다음과 같다. 600 g 기니 피그(Hartley 수컷)를 마취시킨다. 목을 절개하고, 경정맥 중 하나를 분리한다. 경정맥의 1 cm 절단부를 혈관 겸자로 분리한다. 동물로부터 새로 채혈한 혈액(50 ㎕)을 사람 트롬빈(50 ㎕, 4 단위)과 혼합하고, 겸자 고정된 정맥의 분절 내로 주입한다. 주입한 지 4 분 후, 겸자를 제거하고, 혈전을 30 분 동안 노화시킨다. 콘트라스트제, 화합물 32를 6 μmol/kg의 투여량으로 주입하고, 손상된 구배 방법(spoiled gradient method)(TR = 36, TE = 5, 플립 각도 = 30˚)를 이용하여 1.5 T에서 기니아 피그의 목 부위를 영상화한다. 혈전은 혈액에 비하여 밝게 나타난다.
실시예 12 - 흑색 혈액을 이용하거나 이용하지 않고 표적화된 콘트라스트제로 혈전의 MR 영상을 얻는 방법
2.5 kg 암컷 뉴질랜드 화이트 래빗을 케타민(50 mg/kg), 아세프로마진(2.5 mg/kg) 및 롬폰(5 mg/kg)의 칵테일로 마취하고, 나트륨 펜토바르비탈(필요에 따라약 0.35 mg/kg)으로 마취 상태를 유지하였다. 생체내 카테터(24 g)를 귀 정맥 및 귀 동맥 내에 배치하였다. 경정맥 및 경동맥을 분리하였다. 혈관의 상부에 18 g 바늘을 배치한 후 이것을 3-0 봉합으로 적소에 봉합함으로써 경동맥 내에 협착증을 형성시켰다. 이어서, 바늘을 제거하였다. 경동맥 5 mm 부분을 미세혈관 클립으로 협착증에 대하여 말단 위치에서 분절로 절단하였다. 이어서, 경동맥을 5 mm 절단부 따라 2 회 압착하였다. 기부 혈관 클립을 해제하여 혈액을 절단부 내로 약 3 초 동안 흐르게 하였다. 클립을 재부착하고, 경동맥을 다시 5 mm 절단부 따라 2 회 압착하였다. 4 분 후, 클립을 제거하였다. 경정맥의 5 mm 분절을 미세혈관 클립으로 분리하였다. 트롬빈, 0.06 M CaCl2, 래빗 전혈 혼합물의 3.7 단위 100 ㎕를 주입함으로써 혈전을 형성시켰다. 4 분 후, 클립을 제거하였다.
혈전을 50 분 동안 노화시켰다. 혈전 표적화된 콘트라스트제(구조식 III, 5 mM, 2 μmol/kg)의 1.0 ㎖ 용액을 귀 동맥을 통해 투여하였다. 10 분 후, 동물을 제너랄 일렉트릭 시그마(General Electric Sigma) LxCVi 1.5 테슬라 스캐너 내부에 배치하고, 3D RF 손상된 구배 에코 시퀀스(spoiled gradient echo sequence)(SPGR: TR = 39 ms, TE = 3.1 ms, 플립 각도 = 40˚, 시각 범위 = 8 cm, 습득 밴드폭 = 31.25 kH)를 사용하여 제1 MRI 데이터 세트를 얻었다. 화학적 지방 포화 밴드 뿐만 아니라 40 mm 공간적 열등 및 우수 포화 밴드를 부착하였다. 이 스캔을 수행한 직후(8 분 후), 40 mm 공간적 열등 및 우수 포화 밴드를 첨가하여 "흑색 혈액" 영상을 발생시키는 동일한 파라미터를 이용하여 제2 MRI 데이터 세트를 얻었다.
도 4A는 제1 데이터 세트의 최대 세기 투사(MIP)를 나타낸 것이다. 혈관은주행 효과 시간으로부터 부분적으로 강화된다. 도 4B는 제2 데이터 세트의 MIP를 나타낸 것이며, 여기서 유입 혈액으로부터 유래하는 시그널은 우수 및 열등 포화 밴드를 사용함으로써 억제되었다(흑색 혈액). 도 4A 및 도 4B에서는 표적화된 콘트라스트제의 사용을 통해 정지상 표적(혈전)을 확인하는 것이 명백히 용이하게 된다.
실시예 13 - 광학 콘트라스트제의 합성
NovaSyn TGR 수지(0.20 mmol/g, 100 mg, 20 μmol)를 NMP/에테르/NMP로 세척하였다. 펩티드는 PyBOP/HOBt/DIEA 활성화를 이용하는 표준 고체상 방법으로 어셈블링하였다. 최종 아미노산 잔기의 커플링 후, 수지 결합된 펩티드를 DMF 중의 피페리딘 용액(20 부피%, 2.0 mL)으로 10 분 동안 처리하여 Fmoc 보호기를 제거하였다. 수지를 NMP/에테르/NMP로 완전히 세척하고, DMF(1.5 ㎖) 중의 플루오레신-5-이소티오시아네이트(23.4 mg, 60 μmol) 및 디이소프로필에틸아민(11.6 mg, 15.7 ㎕, 90 μmol)의 용액으로 12 시간 동안 처리하였다. 수지를 NMP/에테르/NMP로 완전히 세척하고, DMF(1.5 ㎖) 중의 T1(TFA)3(18.7 mg, 34.5 μmol)의 용액으로 4℃에서 3 시간 동안 처리하였다. 이러한 처리 후, 수지를 세척하고, TFA/TIS/물의 칵테일(95/2.5/2.5, 2.0 ㎖)로 2 시간 동안 처리하였다. 미정제 펩티드는 에테르를 절단 칵테일에 첨가하여 침전시키고, Vydac C-18 컬럼을 사용하는 정제용 HPLC로 정제하였다. 이러한 방식으로 구조식 A-N를 형성시키고, 이들 피브린 DD(E) 단편친화성을 결정하였다(표 5).
구조식
A
B
C
D
E
F
G
H
I
N
M
L
K
J
피브린에 대한 광학 표적화된 콘트라스트제의 친화성
ID Kd(μM) 대 DD(E) 불소 X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13
D 0.061 불소 Ahx W F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
J 0.055 불소 Q W E C P Y G L C W I Q
K 0.06 불소 W F H C P Y D L C H I L
E 0.09 불소 Ahx G G F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
C 0.097 불소 Ahx G F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
B 0.099 불소 Ahx F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
H 0.119 불소 K W F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
G 0.124 불소 K G F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
I 0.127 불소 K G G F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
A 0.136 불소 베타-A F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
F 0.212 불소 K F H C Hyp Y(3-I) D L C H I
광학 프로브로 펩티드를 N-말단 표지화하는 것은 광학 콘트라스트제의 결합 친화도를 조정할 수 있다. 예를 들면, 펩티드(QWECPYGLCWIQ(SEQ ID NO: 27); Kd = 3 μM)의 플루오레신, 4-메톡시쿠마린 및 테트라메틸로다민 유도체를 비교했을 때,하기 Kd가 하기 표 6에서와 같이 관찰되었다.
화합물 형광단 Kd
J 플루오레신 0.06
L 테트라메틸로다민 2.0
N 4-메톡시쿠마린 0.2
실시예 14 - 피브린 표적화된 우로키나제
피브린 표적화된 우로키나제를 하기 절차에 따라 제조한다. Gly-Gly 디펩티드 링커를 지닌 피브린 결합 펩티드를 고상 절차에 따라 제조한다. 펩티드의 N-말단을 아세틸기로 차단하고, C-말단 카르복실산을 숙신아미달 활성 에스테르로 전환시켰다. 우로키나제와 활성화 펩티드를 수성 완충액 중에 적당한 비율로 혼합하고, 30 분 동안 용액을 완만하게 교반함으로써 직접적인 화학적 결찰을 달성한다.
피브린 표적화된 우로키나제는 HPLC로 정제할 수 있다. 피브린에 대한 결합은 평가할 수 있다. 화합물 1은 피브리노겐보다 선택적으로 피브린을 결합시킨다.
문헌(Collen et al., J. Clin. Invest. 1983, 71, 368-376)의 래빗 경정맥 모델을 혈전용해 분석에 대하여 평가한다. 환괴(총 투여량의 20%로 구성됨)를 1 분에 걸쳐 주입함으로써 화합물(2 mg/kg)을 투여하고, 이와 함께 헤파린 환약(300 단위/kg)을 1 분에 걸쳐 투여한다. 나머지 투여량을 다음 60 분에 걸쳐 연속 주입하고, 헤파린(60 단위/kg/hr)을 다음 180 분에 걸쳐 연속 주입한다. 3 시간째에, 동물을 희생하고, 응혈을 분석한다. 화합물 1은 응혈 용해에서 scuPA 단독보다 더 강력하다. 3 시간에서, 화합물 1 2 mg/kg을 사용하면, scuPA 단독의 동등한 투여량에 비하여 피브리노겐 및 α2-안티플라스민의 소모가 덜 하는데, 이는 화합물 1이 scuPA 단독보다 더 피브린에 특이성을 나타내었다는 것을 입증하는 것이다.
기타 구체예
본 발명은 발명의 상세한 설명과 관련하여 설명하였지만, 전술한 설명은 예시하기 위한 것이지 본 발명의 영역을 한정하기 위한 것이 아니며, 본 발명은 첨부된 특허청구범위의 영역에 의해 한정된다는 것을 이해해야 한다. 기타 양태, 이점 및 변형예는 하기 특허청구범위의 범주 내에 속한다.

Claims (106)

  1. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) N-말단 아민 작용기를 가진 펩티드를 링커-서브유닛 부분과 반응시켜서 C-말단 아민 작용기 및 상기 N-말단 아민 작용기를 가진 변성 펩티드를 형성하는 단계;
    b) 링커 부분을 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기에 공유 결합시켜서 전구체 MR 영상화제를 형성하는 단계; 및
    c) 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 링커-서브유닛 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    m은 1 내지 12 중에서 선택되는 정수이며;
    R은 지방족기 또는 방향족기이다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 링커 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    m은 1 내지 4의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수이며;
    LG는 이탈기이고;
    R' 및 R"은 독립적으로 수소 및 화학 보호기로 구성된 군 중에서 선택된다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 링커 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인방법:
    상기 식에서,
    LG는 이탈기이고;
    R1및 R2는 독립적으로 수소 및 화학 보호기로 구성된 군 중에서 선택된다.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되고, 상기 화학 보호기는 Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 및 알릴로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 활성화 에스테르는 펜타플루오로페놀(Pfp), N-히드록시숙신이미드(NHS), N-히드록시술포숙신이미드 나트륨염(NHSS), 2-티옥소티아졸리딘-1-일 및 히드록시벤조트리아졸(OBT)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 할로겐화물은 F, Cl, Br 및 I로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    (a) 상기 전구체 영상화제를 전구체 킬레이트 부분과 반응시켜서 상기 전구체 MR 영상화제의 전구체 킬레이트 부분과 링커 부분 간에 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하고, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 단계;
    (b) 상기 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 상기 카르복실레이트 전구체기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    (c) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    Y는 결합된 링커 부분과 공유 결합을 형성할 수 있는 합성 부분이고;
    각각의 X는 독립적으로 O-또는 O-전구체이어서, X가 O-로 전환시 그 인접 카르보닐기와 함께 카르복실레이트 부분을 형성할 수 있도록 하며;
    R1은 비하전 화학 부분, 지방족, 알킬기 또는 시클로알킬기 또는 그것의 비하전 치환 형태이다.
  10. 제9항에 있어서, 상기 합성 부분은 카르복실산, 활성화 에스테르, 산 할로겐화물, 무수물, 알킬 할로겐화물, 이소시아네이트 및 이소티오시아네이트로 구성된 군 중에서 선택되고, O-전구체는 -OH, -OMe, OEt, O-tBu, O-벤질 및 O-알릴로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이고;
    각각의 R은 독립적으로 OH, -O-Me, O-Et, O-tBu, O-벤질 및 O-알릴로 구성된군 중에서 선택되는 O-또는 O-전구체이어서, R이 O-로 전환시 그 인접 카르보닐기와 함께 카르복실레이트 부분을 형성할 수 있도록 한다.
  12. 제8항에 있어서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    R은 음전하 또는 음전하로 변환될 수 있는 음전하 전구체로 구성된 군 중에서 선택되며;
    X는 -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO 및 -TfO로 구성된 군 중에서 선택되는 화학 이탈기이다.
  13. 제8항에 있어서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    R은 음전하 및 음전하로 변환될 수 있는 음전하 전구체로 구성된 군 중에서 선택되고;
    X는 -Cl, -Br, -I, -MsO, -TsO 및 -TfO로 구성된 군 중에서 선택되는 화학 이탈기이다.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 음전하 전구체는 -H, -Me, -Et, -t-Bu,-벤질 및 -알릴로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유 콘쥬게이트되고, 상기 공유 콘쥬게이트는 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하며, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이며;
    R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택된다.
  17. 제15항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이고;
    R1, R2, R3및 R4는 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택된다.
  18. 제15항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    합성 단위체 1:
    합성 단위체 2:
  19. 제15항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    R은 -t-Bu기이고;
    LG는 -OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
  20. 제15항에 있어서, 상기 전구체 MRI 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 다수의 상기 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체기를 카르복실레이트 부분으로 변환하는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    b) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  21. 제8항 또는 제20항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III)인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 단계 b) 전에 링커-서브유닛을 상기 펩티드의 N-말단 아민 작용기와 반응시켜서 상기 펩티드의 유도화된 N-말단 아민 작용기를 생성하는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 링커-서브유닛은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    염기는 아데노신, 구아노신, 티민 및 시토신으로 구성된 군 중에서 선택되고;
    LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이며;
    R은 지방족 또는 방향족 부분이다.
  25. 제23항에 있어서, 상기 링커-서브유닛은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 독립적으로 0 내지 3의 정수이고;
    R은 지방족 또는 방향족기이며;
    LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
  26. 제23항에 있어서, 상기 링커-서브유닛은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 독립적으로 1 또는 2이고;
    R은 지방족 또는 방향족기이며;
    LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이다.
  27. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 아미노산 잔기를 링커-서브유닛 부분에 공유 결합시켜서 펩티드의 C-말단을 형성하는 단계로서, 상기 링커-서브유닛 부분은 수지에 공유 결합되는 것인 단계;
    b) 상기 펩티드의 상기 공유 결합된 C-말단에서 N-말단 잔기로 상기 수지 상에서 펩티드를 합성하는 단계로서, 상기 N-말단 잔기는 N-말단 아민 작용기를 포함하는 것인 단계;
    c) 상기 수지로부터 상기 펩티드를 개열하여 C-말단 아민 작용기를 가진 펩티드를 생성하는 단계;
    d) 링커 부분을 상기 펩티드의 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기에 공유 결합시켜서 전구체 MR 영상화제를 형성하는 단계; 및
    e) 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 방법은 단계 c) 전에 링커-서브유닛 부분을 N-말단 아미노 작용기에 공유 결합시켜서 유도화 N-말단 아민 작용기를 생성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 상기 전구체 MR 영상화제를 전구체 킬레이트 부분과 반응시켜서 상기 전구체 MR 영상화제의 전구체 킬레이트 부분과 링커 부분 간에 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하고, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 단계;
    b) 상기 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 상기 카르복실레이트 전구체기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    c) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유 콘쥬게이트되고, 상기 공유 콘쥬게이트는 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하며, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 전구체 MRI 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 다수의 상기 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체기를 카르복실레이트 부분으로 변환하는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    b) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III)인 방법.
  34. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) C-말단 카르복실레이트 작용기를 가진 펩티드를 링커-서브유닛 부분과 반응시켜서 C-말단 카르복실레이트 작용기 및 N-말단 카르복실레이트 작용기를 가진 변성 펩티드를 형성하는 단계;
    b) 링커 부분을 상기 변성 펩티드의 N-말단 및 C-말단 카르복실레이트 작용기에 공유 결합시켜서 전구체 MR 영상화제를 형성하는 단계; 및
    c) 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 링커-서브유닛 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    LG는 OH, 활성화 에스테르, 할로겐화물 및 무수물로 구성된 군 중에서 선택되는 이탈기이고;
    R은 방향족 또는 지방족기이다.
  36. 제34항에 있어서, 상기 링커 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    m은 1 내지 4의 정수이고;
    n은 0 내지 4의 정수이며;
    R은 독립적으로 -H, -Me, -Et, -Bz 및 -tBu로 구성된 군 중에서 선택되고;
    R1및 R2는 독립적으로 수소 또는 화학 보호기 중에서 선택된다.
  37. 제34항에 있어서, 상기 링커 부분은 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    R1및 R2는 독립적으로 수소 및 화학 보호기로 구성된 군 중에서 선택되고,상기 화학 보호기는 Boc, Fmoc, CBZ, t-부틸, 벤질 및 알릴로 구성된 군 중에서 선택된다.
  38. 제34항에 있어서, 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 상기 전구체 MR 영상화제를 전구체 킬레이트 부분과 반응시켜서 상기 전구체 MR 영상화제의 상기 링커 부분과 상기 전구체 킬레이트 부분 간에 공유 결합을 형성하는 단계로서, 상기 전구체 킬레이트 부분은 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하고, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 단계;
    b) 상기 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 상기 카르복실레이트 전구체기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    c) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  39. 제34항에 있어서, 상기 링커 부분은 전구체 킬레이트 부분에 공유 콘쥬게이트되고, 상기 공유 콘쥬게이트는 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하며, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 다수의 상기 공유 콘쥬게이트의 카르복실레이트 전구체기를 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    b) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법:
    상기 식에서,
    n은 1 내지 4의 정수이고;
    R1, R2, R3, R4및 R5는 독립적으로 아세테이트 부분, -Me, -Et 또는 -t-Bu 보호된 아세테이트 부분, 아세트아미드 부분 및 아세톡시 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 공유 콘쥬게이트는 하기 화합물인 방법:
  43. 제1항, 제27항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전구체 MR 영상화제를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    (a) 상기 전구체 영상화제를, 상자성 금속 이온을 함유하는 킬레이트 부분과 반응시켜서 상기 전구체 MR 영상화제의 링커 부분과 킬레이트 부분 간에 공유 결합을 형성하여 MR 영상화제를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III)인 방법.
  46. 생중합체의 -CO2R 및 NHR 말단에서 금속 킬레이트 착체를 포함하며, 상기 식 중에서 R은 독립적으로 수소, 알킬, 지방족 및 이탈기로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 콘트라스트제.
  47. 제46항에 있어서, 상기 생중합체의 CO2R 및 NHR 말단에 2 개의 금속 킬레이트 착체를 포함하는 것인 콘트라스트제.
  48. 제46항에 있어서, 상기 생중합체는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 콘트라스트제.
  49. 제46항에 있어서, 상기 생중합체는 펩티드인 콘트라스트제.
  50. 제49항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 형성할 수 있는 것인 콘트라스트제.
  51. 제50항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 콘트라스트제.
  52. 제46항에 있어서, 상기 콘트라스트제는 하기 화학식을 갖는 것인 콘트라스트제:
    상기 식에서,
    킬레이트는 금속 킬레이트 착체를 나타내고;
    링커는 링커 부분을 나타내며;
    링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 나타내고;
    m은 독립적으로 1 내지 10의 정수를 나타내며;
    p는 독립적으로 0 내지 5의 정수를 나타내고;
    s는 독립적으로 0 또는 1을 나타내며;
    R1은 아미노산 측쇄 또는 그것의 유도체를 나타내고;
    R2는 독립적으로 수소 또는 지방족기를 나타낸다.
  53. 제52항에 있어서, 상기 콘트라스트제는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 구조를 갖는 것인 콘트라스트제:
    구조 4
    구조 5
    구조 6
    구조 7
    구조 8
    구조 9
    구조 10
    구조 11
    구조 12
    구조 13
    구조 14
    구조 15
    구조 16
    구조 17
    구조 18
    구조 19
    구조 20
    구조 21
    구조 22
    구조 23
    구조 24
    구조 25
    구조 26
    구조 27
    구조 28
    구조 29
    구조 30
    구조 31
    구조 32
    상기 식에서, Gd는 상자성 금속 이온 Gd(III)이고, 상기 Gd(III)는 DTPA 부분에 배위되며, 상기 DTPA 부분은 DTPA 부분 상의 에틸렌 또는 아세테이트 탄소에서 C(=O) 기를 포함하는 부분에 공유 결합된다.
  54. 제52항에 있어서, 상기 콘트라스트제는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 구조를 갖는 것인 콘트라스트제:
    구조 33
    구조 34
    구조 35
    구조 36
    구조 37
    구조 38
    구조 39
    구조 40
    구조 41
  55. 제52항에 있어서, 상기 콘트라스트제는 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 구조를 갖는 것인 콘트라스트제:
    구조 42
    구조 43
    구조 44
    구조 45
    구조 46
    구조 47
    구조 48
    구조 49
    구조 50
  56. N-말단 아민 작용기를 가진 펩티드의 안정성 변경 방법으로서, 상기 방법은
    a) 상기 펩티드를 링커-서브유닛 부분과 반응시켜서 C-말단 아미노 작용기를 가진 펩티드를 형성하는 단계; 및
    b) 링커 부분을 상기 펩티드의 C-말단 아민 작용기 및 N-말단 아민 작용기에공유 결합시켜서 변성 펩티드를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 변성 펩티드를 전구체 킬레이트 부분과 반응시켜서 상기 변성된 펩티드의 상기 링커 부분과 상기 전구체 킬레이트 부분 간에 공유 결합을 형성하는 단계를 더 포함하며, 상기 전구체 킬레이트 부분은 다수의 카르복실레이트 전구체기를 포함하고, 상기 카르복실레이트 전구체기는 카르복실레이트 부분으로 변환될 수 있는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서,
    (a) 상기 결합된 전구체 킬레이트 부분의 다수의 상기 카르복실레이트 전구체기를 다수의 카르복실레이트 부분으로 변환시키는 단계로서, 상기 카르복실레이트 부분은 상자성 금속 이온을 착화시킬 수 있는 것인 단계; 및
    (b) 상자성 금속 이온을 상기 다수의 카르복실레이트 부분에 착화시키는 단계
    를 더 포함하는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 상기 변성 펩티드의 안정성을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  60. 제57항에 있어서,
    a) 상기 미변성 펩티드의 안정성을 분석하는 단계; 및
    b) 상기 변성 펩티드의 안정성을 상기 미변성 펩티드의 안정성과 비교하는 단계
    를 더 포함하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 변성 펩티드의 안정성은 상기 미변성 펩티드의 안정성에 비하여 개선된 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 변성 펩티드의 안정성은 상기 미변성 펩티드의 안정성에 비하여 10 배 개선된 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 변성 펩티드의 안정성은 상기 미변성 펩티드의 안정성에 비하여 20 배 개선된 것인 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 변성 펩티드의 안정성은 상기 미변성 펩티드의 안정성에 비하여 30 배 개선된 것인 방법.
  65. 제59항 또는 제60항에 있어서, 상기 안정성은 래트 간 호모게네이트 분석을 이용하여 분석되는 것인 방법.
  66. 하기 구조를 가진 변성 펩티드:
    상기 식에서,
    킬레이트 전구체는 킬레이트 전구체 부분을 나타내고;
    링커는 링커 부분을 나타내며;
    링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 나타내고;
    m은 독립적으로 1 내지 10의 정수이며;
    p는 독립적으로 0 내지 5의 정수이고;
    s는 독립적으로 0 또는 1이며;
    R1은 아미노산 측쇄 또는 그것의 유도체이고;
    R2는 H 및 지방족기로 구성된 군 중에서 선택된다.
  67. 하기 구조를 가진 변성 펩티드:
    상기 식에서,
    링커는 링커 부분을 나타내고;
    링커-서브유닛은 링커-서브유닛 부분을 나타내며;
    p는 독립적으로 0 내지 5의 정수이고;
    s는 독립적으로 0 또는 1이며;
    R1은 아미노산 측쇄 또는 그것의 유도체이고;
    R2는 H 및 지방족기로 구성된 군 중에서 선택된다.
  68. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) N-말단 아민 작용기를 가진 펩티드를 링커-서브유닛 부분과 반응시켜서 N-말단 및 C-말단 상에 아민 작용기를 가진 변성 펩티드를 형성하는 단계; 및
    b) 상기 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  69. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) C-말단 카르복실레이트 작용기를 가진 펩티드를 링커-서브유닛 부분과 반응시켜서 N-말단 및 C-말단 상에 카르복실레이트 작용기를 가진 변성 펩티드를 형성하는 단계; 및
    b) 상기 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  70. MR 영상화제의 제조 방법으로서, 상기 방법은
    a) 아미노산 잔기를 링커-서브유닛 부분에 공유 결합시켜서 펩티드의 C-말단을 형성하는 단계로서, 상기 링커-서브유닛 부분은 수지에 공유 결합된 것인 단계;
    b) 상기 펩티드의 상기 공유 결합된 C-말단에서 N-말단 잔기로 상기 수지 상에서 펩티드를 합성하는 단계로서, 상기 N-말단 잔기는 N-말단 아민 작용기를 포함하는 것인 단계;
    c) 상기 수지로부터 상기 펩티드를 개열하여 상기 변성 펩티드의 C-말단 아민 작용기를 생성하는 단계; 및
    d) 상기 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는 상자성 금속 이온을 함유하는 킬레이트 부분을 상기 변성 펩티드에 공유 결합시켜서 MR 영상화제를 생성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  73. 제71항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III)인 방법.
  74. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성 펩티드를 MR 영상화제로 전환시키는 단계는
    a) 링커 부분을 킬레이트 부분에 공유 결합시켜서 공유 콘쥬게이트를 형성하는 단계로서, 상기 킬레이트 부분은 상자성 금속 이온을 함유하는 것인 단계; 및
    b) 상기 공유 콘쥬게이트를 상기 변성 펩티드와 반응시켜서 MR 영상화제를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III), Fe(III), Mn(II 및 III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III 및 IV), Ho(III), Er(III), Pr(III), Eu(II) 및 Eu(III)로 구성된 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  76. 제74항에 있어서, 상기 상자성 금속 이온은 Gd(III)인 방법.
  77. 제56항에 있어서, 상기 변성 펩티드를 캡핑 부분과 반응시켜서 상기 변성 펩티드의 상기 링커 부분과 상기 캡핑 부분 간에 공유 결합을 형성하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  78. 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드:
    P*-Y*-X1*-L* (서열 번호 1)
    상기 서열에서,
    P*는 프롤린 또는 그것의 비천연 유도체이고;
    Y*는 티로신 또는 그것의 비천연 유도체이며;
    X1*는 G 또는 D, 또는 G 또는 D의 비천연 유도체이고;
    L*는 루신 또는 그것의 비천연 유도체이며;
    P*, Y*, X1* 및 L* 중 1 이상은 각각의 아미노산의 비천연 유도체이다.
  79. 제78항에 있어서, X1*는 G 또는 D이고, L*는 루신인 정제된 펩티드.
  80. 제79항에 있어서, P*는 프롤린 또는 4-히드록시프롤린이고, Y*는 티로신 또는 3 번 위치에서 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신의 비천연 유도체인 정제된 펩티드.
  81. 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드:
    X1-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6(서열 번호 2)
    상기 서열에서,
    P*는 프롤린 또는 그것의 비천연 유도체이고;
    Y*는 티로신 또는 그것의 비천연 유도체이며;
    X1은 W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) 및 Y(3*)로 구성된 군 중에서 선택되고, 여기서 F(3/4*)는 3 번 또는 4 번 위치에서 CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 페닐알라닌이며, Y(3*)는 3 번 위치에서 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신이고;
    X2는 E, H, dE, S, H(Bzl), 2-Pal, Dpr 및 Th로 구성된 군 중에서 선택되며;
    X3은 G 및 D로 구성된 군 중에서 선택되고;
    X4는 H, F, Y 및 W로 구성된 군 중에서 선택되며;
    X5는 I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, Nval, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal 및 F(3/4*)로 구성된 군 중에서 선택되고, 여기서 F(3/4*)는 3 번 또는 4 번 위치에서 CF3, Et, iPr 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 페닐알라닌이며;
    X6은 N, Q, I, L 및 V로 구성된 군 중에서 선택되거나, 또는 X6은 존재하지 않고;
    X1, X2, X5, P* 및 Y* 중 1 이상은 아미노산의 비천연 유도체이다.
  82. 제81항에 있어서, P*는 프롤린 또는 4-히드록시프롤린이고, Y*는 티로신 또는 3 번 위치에서 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신의 비천연 유도체인 정제된 펩티드.
  83. 제80항 또는 제81항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 더 형성할 수 있는 것인 정제된 펩티드.
  84. 제83항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 정제된 펩티드.
  85. 제84항에 있어서, 상기 펩티드는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 정제된 펩티드.
  86. 제82항에 있어서, 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 정제된 펩티드:
    W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 4)
    Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (서열 번호 5)
    Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 6)
    W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (서열 번호 7)
    W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (서열 번호 8)
    Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (서열 번호 9)
    Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (서열 번호 10)
    W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (서열 번호 11)
    F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (서열 번호 12)
    Y-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 13)
    W-dE-C-P-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 14)
    W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q (서열 번호 15) 및
    F-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (서열 번호 16).
  87. 제86항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 더형성할 수 있는 것인 정제된 펩티드.
  88. 제87항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 정제된 펩티드.
  89. 제86항에 있어서, 상기 펩티드는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 정제된 펩티드.
  90. 제81항에 있어서,
    P*는 프롤린이고;
    Y*는 티로신이며;
    X1은 W, Y, F, S, Bip, Hx, Dpr, Cy, Gu, Ad, Hfe, 3-Pal, 4-Pal, DopaMe2, nTyr, dW, dF, F(3/4*) 및 Y(3*)으로 구성된 군 중에서 선택되고, 여기서 F3/4*는 3 번 또는 4 번 위치에서 CH3, CF3, NH2, CH2NH2, CN, F, Cl, Br, I, Et 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 페닐알라닌이며, Y3*는 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신이고;
    X2는 dE, H(Bzl), 2-Pal, Dpr 및 Th로 구성된 군 중에서 선택되며;
    X3은 G 및 D로 구성된 군 중에서 선택되고;
    X4는 H, F, Y 및 W로 구성된 군 중에서 선택되며;
    X5는 I, L, V, N, Bpa, Bal, Hfe, Nle, Tle, nVal, Phg, Cha, Taz, Fua, Th, 4-Pal 및 F(3/4*)로 구성된 군 중에서 선택되고, 여기서 F3/4*는 3 번 또는 4 번 위치에서 CF3, Et, iPr 및 OMe로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 페닐알라닌이며, X1, X2또는 X5중 1 이상은 비천연 아미노산 유도체이고;
    X6은 N, Q, I, L 및 V로 구성된 군 중에서 선택되거나, 또는 X6은 존재하지 않는다.
  91. 제90항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 더 형성할 수 있는 것인 정제된 펩티드.
  92. 제90항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 정제된 펩티드.
  93. 제91항에 있어서, 상기 펩티드는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 정제된 펩티드.
  94. 혈전 용해제에 결합된 제78항의 펩티드를 포함하는 화합물.
  95. 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드:
    C-P*-Y*-X1-L-C (서열 번호 3)
    상기 서열에서,
    X1은 G 또는 D이고;
    P*는 프롤린 또는 그것의 비천연 유도체 4-히드록시프롤린이며;
    Y*는 티로신 또는 3 번 위치에서 F, Cl, Br, I 및 NO2로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 티로신의 비천연 유도체이고;
    단, P* 또는 Y* 중 1 이상은 각각의 아미노산의 비천연 유도체이다.
  96. 제95항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 더 형성할 수 있는 것인 정제된 펩티드.
  97. 제95항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 정제된 펩티드.
  98. 제96항에 있어서, 상기 펩티드는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 정제된 펩티드.
  99. 혈전 용해제에 결합된 제95항의 펩티드를 포함하는 화합물.
  100. 하기 아미노산 서열을 포함하는 정제된 펩티드:
    C-D-Y-Y-G-T-C-X10(서열 번호 17)
    상기 서열에서,
    X10은 n(데실)G, n(4-PhBu)G, MeL, Bpa, Bip, Me-Bip, F(4*), F(3-Me), F(3,4-디플루오로), Amh, Hfe, Y(3,5-디요오도), Pff, 1Nal, d1Nal 및 MeL로 구성된 군 중에서 선택되고, 여기서 F(4*)는 4 번 위치에서 Et, CF3, I 및 iPr로 구성된 군 중에서 선택되는 부분으로 치환된 페닐알라닌이다.
  101. 제100항에 있어서, 하기 아미노산 서열을 포함하는 것인 정제된 펩티드:
    C-D-Y-Y-G-T-C-X10-X11(서열 번호 18)
    상기 서열에서,
    X11은 D, dD, βD, Inp, Nip, Me-D, dC, Cop 및 Cmp로 구성된 군 중에서 선택된다.
  102. 제101항에 있어서, 하기로 구성된 군 중에서 선택되는 아미노산 서열을 가진 정제된 펩티드:
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-dD (서열 번호 19)
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-n(데실)G-D (서열 번호 20)
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-D (서열 번호 21)
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dD (서열 번호 22)
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Inp (서열 번호 23)
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (서열 번호 24) 및
    L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeBip-D (서열 번호 25).
  103. 제101항 또는 제102항에 있어서, 상기 펩티드는 비환원 조건 하에 디술피드 결합을 더 형성할 수 있는 것인 정제된 펩티드.
  104. 제103항에 있어서, 상기 펩티드는 디술피드 결합을 포함하는 것인 정제된 펩티드.
  105. 제101항에 있어서, 상기 펩티드는 피브린에 대해 특이적인 결합 친화성을 가진 것인 정제된 펩티드.
  106. 혈전 용해제에 결합된 제101항의 펩티드를 포함하는 화합물.
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