TWI240632B - Purified peptides for peptide-based multimeric targeted contrast agents - Google Patents

Description

1240632 A7 -------------B7 五、發明説明（彳） 技術領域 本發明是有關用於診斷顯影之對比劑，且較特別的是有 關以肽為標靶之聚合對比劑之化合物，組合物及方法，其 中肽 < 功能是充作標靶基’及在肽之胺基及羧基末端上有 可供一種以上螯合物黏附之點。本發明也是有關含有這些 化合物之醫樂組合物，及這些化合物及組合物於顯影中加 強對比之碉法。 發明背景 診斷顯影技術，如磁振造影（MRI) , X -射線，核放射藥 物顯影，紫外線-紅外線顯影，及超音波，均在醫學診斷 中應用多年了。另外已使用對比介質來改進或增強影像之 解析，或提供更具特異性之診斷資訊。 為了有效’在顯影技術中對比介質必須要能干擾其中之 電磁輻射波長’改變組織之物理性質以生成不同的訊號， 或如在放谢藥物例子中，可供作本身照射之來源。M R I及 光學方法在顯影型式中均是獨特的，因為其均可生成對化 學環境敏感的複雜訊號。來自X -射線或放射核種作用物之 訊號’不論作用物是呈在血漿中之游離態，與蛋白質或其 他作用物結合，或截陷在骨頭内，其訊號雖然均相同，但 某些對比劑於M R I及光學顯影應用上，在不同的生物環境 中有不同的訊號特性。很重要的是，對比劑應足夠敏感且 以足夠高的濃度存在，如此才可觀察到訊號的變化。 介於釓或其他順磁性離子及有機配體間之複合物，已被 廣泛地用於加強及改進M R I之對比。釓複合物之所以可增 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) !24〇632 五 、發明説明（ 2 加對比係增加在M R I中麴义μ 弛緩速率f van，p et ^比劑之水分子中質子之核磁 (19,。在這些水分子中99, 2293 對比劑之其他水分子中之緩速率，相較於不趨近 M . t b 此外，在水分子質子特異族 ..是度的此種增加’可造成在特定時間中可收集更多 1象'貝狀能力。此因而造成訊號對雜訊比之改進。 _影也可利用光線進行，左 仃在此例中，選用光學染料以提 ^號。特…在_侧毫微米波長範圍之光線(可見 r近紅外光)可相當容易即通過生物組織，且可用於顯影 目的。可被傳送經過，或散射，反射，或再一發射(螢光） 、光泉可U及且產生影像。染料吸光度，反射性，螢光 特II之夂化’包括吸收學數目之增加或減少，或其最大波 長之又化，均可在與生物標靶結合下發生，因此提供額外 的組織對。在某些狀況下’診斷接近體表之疾病，也可 使用U V或可見光。 發明要點 本發明k出可應用於M R，光學及放射核種顯影之肽·標 革巴之聚合對比劑，其中單一肽之作用既可充作標靶基在其 Ν -及C _末端尚有可供一種以上螯合物之黏附點，其或直 接地或經.油視所需之介入連接子。令人驚訝地，其仍可能 保有與生物標靶之結合親和力，及對標靶M R I對比劑有高 的弛緩度。本發明有額外的益處，即在活體内投藥後可將新 陳代謝減低至可接受水平，使得可進行有效的顯影研究。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） A7 B7

1240632 五、發明説明（3 除非另有所定義，此中所用的所有技術及科學術誶且 本發明參與者技藝中一般技術人士廣知之相同定義。在： 行或測試本發明中，雖然可使用與此中所述相似或相各i 方法及材料，然下文仍要描述適合的方法及材料。所

物，專利案，專利及此中所述之其他參考文于J 以引用方式併入本文中。在有衝突時’本說明書包括== 可予以控W。此外材料，方法及實例僅供說明 = 制。 以限 本發明的其他特色及優點，由以下詳述及申請專利範圍 中可更加明白。 附圖說明 圖1提出非天然胺基酸之化學結構。 圖2示出每個Gd之弛緩度，在2〇 MHz，35°c下於Tris緩 衝之食鹽水（TBS)中或10毫克/毫升血纖維蛋白於tbs。 圖3示出血栓中作用物之累積情形。 圖4A示出第一數據組之最大強度投射（MIP)影像。圖4B 疋示出第二組數據之Μ I P，其中由流動中血液來之訊號因 使用在上方及下方之飽和帶而被遏止（黑色血液）。 詳細說明 在本揭示中非明確定義之常用化學縮寫，可見於The American’Chemical Society Style Guide, Second Edition; American Chemical Society, Washington, D. C. (1997), n2001 Guidelines for Authors” J. Org. Chem. 66⑴,24A (2001)，丨’A Short Guide to Abbreviations and Their Use in Peptide -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐)

裝 訂

線 1240632 A7 B7 五、發明説明（4 )

Science” J. Peptide. Sci S 465-471 (1999) ° 基於本案目的，n化學保護基”表示為預防非欲求反應， 在反應次序中於整個一種以上的合成化學步驟中，可與分 子暫時共價結合的任何的化學部份。一般的保護基策略述 於1’Protecting Groups in Organic Synthesis，Third Ed·’’ by P. Wuts and T. Greene，© 1999 John Wiley & Sons，Inc o 基於本養目的，”離去基”表示在親核置換或加成一消去 反應中可為親核試劑置換之任何化學部份。含有離去基之 分子可被分離，或其可在原位以化學反應中之暫時中間物 般被形成。 基於本案目的，”脂族”描述任何無環的或環狀，飽和或 不飽和，分支或未分支碳化合物，排除芳族化合物。 π烷基”包括飽和的脂族基，包括直鏈烷基（如甲基，乙 基，丙基，丁基，戊基，己基，庚基，辛基，壬基，癸基 等），分支鏈烷基（異丙基，第三-丁基，異丁基等），環烷 基（脂環族）（環丙基，環戊基，環己基，環庚基，環辛基） ，烷基取代的環烷基及環烷基取代的烷基。而燒基進一步 包括烷基，其可進一步含有氧，氮，硫或磷原子取代碳氫 化物骨架之一個以上碳。在某些具體實例中，直鏈或分支 鏈烷基在其骨架上有6個以下的碳原子（如於直鏈， CrC6於分，支鏈）且較好是4個以下。另外，較佳的環垸基具 有3 - 8個碳原子在其環結構上，且較好在環結構上有$或6 個碳。而C! -C6包括含有1至6個碳原子之燒基。 再者，n fe基π包括”未經取代的燒基類”及”經取代之燒 -9 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（5 ) 基類”，後者指具有取代基之垸基部份，可取代碳氫骨架 一個以上喊上之氫。此取代基包括如：晞基，決基，鹵， 經基’坑基羰氧基，芳羰氧基，烷氧羰氧基，芳氧羰氧基 ’竣化物’坑基羰基，芳基羰基，烷氧羰基，胺基羰基， 烷胺基羰基，二烷胺基羰基’烷硫羰基，烷氧基，磷酸基 ，膦酸基，次膦酸基，氰基，胺基（包括烷基胺基，二烷 胺基’芳I基，二芳胺基，及烷基芳基胺基），醯胺基（包 括燒羰基胺基，芳羰基胺基，胺甲醯基及脲基），脒基， 亞胺基，鲮基，烷硫基，芳硫基，硫羧化物，硫酸鹽，烷 基亞磺驗基’磺酸根基，胺磺醯基，磺醯胺基，硝基，三 氟甲基，氰基，疊氮化物基，雜環基，烷基芳基或芳族或 雜芳族部份。環烷基類可進一步經取代，如為上述之取代 基所取代。'’芳基烷基”部份是烷基為芳基所取代（如苯基 甲基（爷基））。’’烷基”也包括天然及非天然胺基酸之側鏈 。’’ η -烷表示直鏈（即未分支的）未經取代的烷基。 ’’烯基π包括長度為不飽和的脂族基，且可能取代至上述 的烷基’但含有至少一個雙鍵且必須含有至少二個碳原子 。如π烯基π包括直鏈烯基（如乙烯基，丙晞基，丁烯基， 戊烯基，己晞基，庚晞基，辛晞基，壬婦基，癸晞基等） ’分支鏈晞基’環缔（脂環族）基（環丙烯基，環戊烯基， 環己烯基V環庚晞基，環辛晞基），烷基或烯基取代的環 烯基，及環燒基或環烯基取代的烯基。烯基進一步包括晞 基，其中包括有氧，氮，硫或磷原子取代碳氫骨架之一個 以上的碳。在某些具體實例中，直鏈或分支鏈烯基在其骨 L_____ - 10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公爱了 1240632 A7 ____ Β7 五、發明説明（6 ) 架上有6個以下的碳原子（如C2_c6於直鏈，C3-C6於分支鏈） 。另外’環缔基在其環結構中可有3 _ 8個碳原子，且較好 在環結構中有5或6個碳。Ci-C6包括含有2至6個碳原子之 烯基。 再者，晞基包括”未經取代的埽基”及”經取代的晞基”， 後者指烯基邵份，其有取代基可取代碳氫骨架中一個以上 石反上之氲-。此取代基可包括如：燒基，決基，商，經基， 燒基羰氧基，芳基羰氧基，烷氧羰氧基，芳氧羰氧基，羧 化物’羰基羰基，芳羰基，烷氧羰基，胺基羰基，烷胺羰 基’二fe胺談基，燒硫談基，垸氧基，麟酸根基，膦酸根 基’次膦酸根基，氰基，胺基（包括烷基胺基，二烷胺基 ，芳胺基，二芳胺基，及烷基芳胺基），醯胺基（包括烷羰 胺基，芳羰胺基，胺甲醯基及脲基），脒基，亞胺基，巯 基，烷基硫基，芳硫基，硫羧化物，磷酸根基，烷基亞磺 酿基’續跛根基，胺甲醯基，績醯胺基，硝基，三氟甲基 ，氰基，疊氮化物基，雜環基，烷基芳基，或芳族或雜芳 族部份。 π決基”包括長度為不飽和的脂族基，且可能取代至上述 烷基，但其含有至少一個叁鍵及二個碳原子。如”決基”包 括直鏈炔基（如乙炔基，丙炔基，丁炔基，戊炔基，己炔 基，庚炔.羞，辛炔基，壬炔基，癸炔基等），分支鏈炔基 及環燒基或環晞基取代的決基。決基進一步包括块：基，其 包括有氧，氮，硫或磷原子取代碳氫骨架的一個以上碟。 在某些具體實例中，直鏈或分支鏈炔基在骨架上有6個以 ___- 11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（ 下 < 碳原子（如C2-C6於直鏈，（^-。於分支鏈）。c2-c6包括 含有2至6個碳原子之炔基。 一般而έ，"方基"包括5 _及6 ·員單環芳族基，其可包括 由0至4個雜原子’如甲笨’笨基”比咯，呋喃”塞吩"塞 唑，異4唑，咪唑，三唑，四唑，吡唑，哼唑，異哼唑， 吡啶’吡叫，嗒4及嘧啶等。進一步，”芳基”包括多環狀 芳基’如-三環，二環如：萘，苯並哼唑，苯並二气唑，苯 並嘧唑，苯並咪唑，苯並Β塞吩，亞甲二氧苯基，喳啉，異 4#’料’心，苯並吱喃，料，苯並吱喃，去嗓吟或 叫丨哚畊。在其環結構中有雜原子之芳基也可稱之為"芳基 雜環雜環” ’”雜芳基"或”雜芳族，，。芳基可在其一個 以上環位置上為取代基所取代。 就本案目的’ "DTPA"指含有由二乙撐三胺組成之結構之 化學化合物’纟中二個一級胺各自共價黏附至二個乙醯基 ，且二級f依據下式有一個乙醯基共價黏附.

其中x是一個雜原子供電子基團’可配價至金屬陽離子 ’較好〇，’ OH ’随2 ’ OPCV-或NHR，或㈣其 族基。當各X基是第三· 丁氧基（tBu)，、结構可疋= ”DTPE1，（，ΈΠ表示酯）。 乂為 就本案目的，”D0TA”指含有*m，7，u 1以十一烷組 -12二 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（8 ) 成之亞結構之化學化合物，其中胺各自有一個乙醯基共價 黏附，依下式：

其中X是如上文所定義。 就本案目的，πΝΟΤΑπ指含有由1，4,7-三吖環壬烷組成之 亞結構之化學化合物，其中各胺有一個乙醯基共價黏附， 依下化式：

其中X如上文所定義。 就本案目的，nD03An指含有由1，4,7，11-四吖環十二烷組 成之亞結構之化學化合物，其中四個胺中的三個，各自有 一個乙醯基共價黏附，且另一胺有一個具中性電荷之取代 基，依下 <式：

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（9 ) 其中X如上文所定義，且R1是未荷電之化學部份，較好 是氫，任何脂族，燒基，或環、丨完基，及其未荷電之衍生物 。較佳之螯合物”HP"-D〇3A，其有Rk-CH^CHOF^CH;。 在上四個結構各自中，所示伸乙基之碳原子可稱之為’’主 鏈’’碳。而"bbDTPA”之命名可用來指化學鍵結至DTPA分子 之所在（nbb’’指"主鏈”）。可注意到如此中所用的， bbCCCODT^A-Gd表示C = 0部份結合至DTPA之乙撐主鏈碳 原子。 ’’螯合配體”，”螯合部份”及’'螯合的部份π可用來指可配 價金屬離子之任何多配位基之配體，包括DTPA (及DTPE) ，DOTA，D03A或ΝΟΤΑ分子，或其他任何適合的多配位基 螯合配體（下文將詳述），其或配價金屬離子或可直接地或 於移去保護基後如此進行，或是一種試劑（有或無適合的 保護基），其用於對比劑之合成且實質上含有最終可與最 後金屬複洽物之金屬離子配價之所有原子。而π螯合”指確 實的金屬-配體複合物，且經瞭解多配位基之配體最終可 配價至醫學上有用之金屬離子上。 此中所用之’’特異結合親和力"指對比劑與其他組份比較 下，為特定生物組份吸收，保留或結合有實質上更大程度 之能力。具有此特性之對比劑稱為π對準’’至該”標靶π組份 。而缺乏.此特性之對比劑為’’非特異的π或”非標靶的”作用 物0 此中所用之’’弛緩度’’指每毫莫耳濃度（mM)順磁離子或對 比劑，M R I量1 / T 1或1 / T 2任一者所增加，若對比劑含有 ____ 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1240632

存多順磁離子，則此量可能不同，其中Τ 1是縱向或自旋一 晶格之弛緩時間，Τ2則是橫向，或自旋一自旋的水中質子 或其他顯影或分光核之弛緩時間，包括在水分子外之其他 質子。弛緩度以mlVMs·1之單位表示。 本發明描述標靶之M R I對比劑，其因與標靶結合而呈現 向的弛緩度。因結合使弛緩度增加常可達到1 ·5倍以上。甚 至影像解浙增加也是因弛緩度增加至少2至3倍之結果。較 好他緩度可增加達4倍，5倍及6倍，又甚至達7 - 8倍，9 -1 〇倍，甚或1 0倍以上。在2〇 MHz，37。(：下，MRI對比劑 較佳之弛緩度為每個順磁性金屬離子至少1 〇 mM·1 s-1，較好 至少15 mM.V1，又至少20 mM-Vi，更妤是至少25 mM-V1 ,30 mM、·1，35 及40 mM、·1以上。以整體而言對 比劑弛緩度較好在20 MHz及37°C下是大於60 mM、·1。 ’’開放的配位ff如此中所用指通常為水或溶劑分子所占據 之金屬離孑上之位置。 π多元π就此中目的而言定義為對比劑或其亞單位含有至 少二個共價鍵結之螯合物或其合成前軀體。 "非天然衍生物’’包括D -胺基酸（標以D -或d -)，但排除 經修飾以提供供偵測用標幟上胺基酸（如放射活性標幟， 光學標幟’及染料），然非天然衍生物可包括此種供偵測 之標幟，.也見圖I。 如此中所用，本發明化合物包括其藥學上可接受之衍生 物。”藥學上可接受的”表示化合物或組合物在無不可接受 之副作用下投予至動物。”藥學上可接受的衍生物”表示本 • 15 - I24〇632 、發明説明（ 1 任何藥學上可接受的鹽，@旨，酯之鹽，或其他 代謝物或殘受者可提供本發明化合物或其活性 物 /田 /、他何生物為當此化合物投予至哺乳動 明化合物生物利用率者=血液中）可增加本發 送至生物空間(如腦二二ΓΓ:可加強母化合物輸 接受鹽包方由技藏中已知之越 無明化合物樂學上可 及驗衍生之抗衡;子…上可接受之無機及有機酸 ^發明化合物可含有—個以上的不對稱碳料，且因此 :王外消捉及外消旋混合物，單—對映體，非對映立體異 構漏合物及個別的非對映立體異構物。這些化合物所有的 此種異構型式均可清楚地包括在本發明中。除非另有所示 丄各正體原碳可呈…構型。雖然在本案中示範的特殊化 :物可以特殊立體化學構型示出，但也檢視在任何特定對 手中心有兰一相對立體化學之化合物或其混合物。 由本發明檢視之取代基及變化之组合，僅有造成穩定化 合物形成者。’’穩定"一詞如此中所用的，指具有足夠穩定 性可操作之化合物’且其可維特足夠時間之化合物完整性 可使用’ JL對此中詳述之目的是安全的。典型而言，此化 合物在40t以下溫度是穩定的’無水汽或其他化學反應性 條件下，歷至少一週。 而，，標&結合，，及單純的”結合，，就此中目的而言指對比劑 與標的之非價交互作用。這些非共價的交互作用互相無關 ，且尤其可為疏水性，親水性，偶極-偶極，p i -堆積，氫 ___ - 16 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 __ B7 五、發明説明（12 ) 鍵結，靜電結合，或Lewis酸-驗交互作用。 結合基對標靶之特異結合親和力’可以量，，Kd，，表示，其 是解離反應之平衡常數。 也應瞭解’本發明化合物在溶液中，藥學組合物及活體 内了王各種構型及離子型式。雖然此中所示之本發明特別 較佳化合物有特殊的構型及離子型式，本發明揭示並未如 此限制。- 用於MRI之較佳金屬離子包括具原子數21-29，39-47 或5 7 - 8 3者，較佳的金屬離子順磁型式為具原子數2卜2 9 ，4 2，4 4或5 7 · 8 3者。特佳之順磁金屬離子係選自下列包 括· Gd(III) ’ Fe(III)，Mn(II及III) , Cr(III)，Cu(II)，Dy(III) ，Tb(III 及 IV)，Ho(III)，Er(III)，Pr(III)及 Eu(II 及 in)。最佳 者是 Gd(III)。 於放射核種顯影劑，某些較佳的放射核種是9〇Y , "mTc， 丨丨 ιΐη，47Sg，67Ga，5lCr，i77mSn , 67Cu , 167Tm，97RU，is8Re , mLu，i"Au , 2〇3Pb及mCe。也描述具有用光學特性之金屬 複合物。[Murru et al·，J. Chem. Soc. Chem. Comm 1993, 1 1 1 6-1 1 1 8]。對於使用螯合物之光學顯影而言，以鑭系螯 合物為較佳，且選自 La(III)，Ce(III)，Pr(III)，Nd(III)， Pn(III) ’ Sm(III)，Eu(III)，Gd(III)，Tb(III)，Dy(III)， Ho(III)，£r(III)，Tm(III)，Yb(III)及 Ln(III)。特佳的是 Eu(III)及Tb(III)。 在顯影劑通過身體之中，金屬螯合物不應解離至任何顯 著程度，包括與標的組織結合。游離態金屬離子之顯著釋 ___- 17 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（13 ) 出可造成毒性，其通常是不被接受的。 適於光學顯影之有機染料已有所述’且包括如：螢光樸 啉及螢光酞花青[U. S. Patent No· 5,641，878, Diatron Corp]， 微粒物質[WO 96/23524，Klaveness]及聚甲炔染料[w〇 97/13490，Licha]。常用的光學有機染料有螢光素，若丹明 [Kojima H, et al.，Anal. _______ … 、____7J ^ ( 若丹日斤「A_nal. Biochem· 223，39 (1994)]及德州紅 fproc 基

Natl. Acad. Sci. USA 85. 3546 (1988)] M R I對比劑之生物物理學 對於M R I對比劑，弛緩度之增加（1 /τ 1或1 /Τ2)通常經由 對比劑順磁離子及核之間在進行弛緩作用之偶極—偶極交 互作=而發生（如水分子中之氫原子）。已知，若由二個偶極 所疋義 < 向量旋轉速率減慢時（即由順磁性離子及水中氫 原子所疋我之向量），則此偶極之交互作用效率（即弛緩度 會有所改f (R. B. Lauffer，87, 9〇卜MM 間，向量散射一個弧度所花之時^ =較小分子慢，因此增加弛緩度的方法之 小刀子對比劑及巨分子間形成一個非共價之 一 分=量:旋轉相闕時間似乎二巨::: 動”)。偶極向量 子加合物球形運動之函數關係^巨八2螯合運動及巨分 或等於巨分子本身之旋轉相關時間：：=賈加合物少於 疋域螯合運動愈少， 1240632 A7 __ B7 五、發明説明（14 ) 則此加合物趨近巨分子旋轉相關時間愈近。 對MRI對比劑而言，弛緩度之增加通常經由對比劑金屬 離子及核進行弛緩作用時（如水中氫原子）二者間偶極-偶 極交互作用而發生。除了經由偶極-偶極交互作用增加組 織核之1 / T 1或1 / τ 2數值之外，μ R I對比劑還可影響其他 磁性，如此增加其於臨床上之用途及價值：首先，具高度 磁化感受4生之金屬螯合物，特別是Dy，Gd，Tb或Ho之 螯合物，因可生成顯微的磁化感受性梯度，因此可改變組 織中 MRI 之訊號強度（A. Villringer et aL，Magn, Re.on MM·，6，164-174 1988))。其次，金屬（如Tm或Dy)螯合物 也可用來殺動分光核心之共振頻率。分光核心較好是水質 子，但也可為其他常用之分光核心，包括ηρ，，23Na， 19F及見於水以外分子中之質子。分光核心可含有對比劑， 標把’或水。第三-金屬螯合物有大的磁矩，特別是Gd， Tb，Dy，Ho及Er之螯合物，可因化學交換及/或居里自旋弛 緩作用’而減少水核心之1/T2 (Bulte et al. Invest. Radiol. 33, 841-845 ( 1998), Keller et al. Invest. Radiol. 33, 835-840 (1998)” 一般而言，本發明是有關M R I ’光學及放射核種對比劑 ，其含有標靶肽其中N -及C -末端胺基酸各自或直接地或 經由視所·虞介入之連接子，各自共軛至至少一種順磁性（於 磁共振顯影）或放射活性（於放射核種顯影）金屬離子或光 學染料（於光學顯影）之螯合物。如此中所進一步示範的， 連接子可有分支，且因此使多重的螯合物或染料可黏附至 ______- 19 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7

五、發明説明 月大之各端上，即聚合體。 本發明之新穎的以肽為基礎之聚合物，在充作標對比 劑上可提供許多優點： L化合物單一標把肽輸送二種以上螯合物或有機染料 至標靶，如此部份因為標靶四週顯影部份之有意義 濃度，可觀察到組織對比上充份的改進。 2 ·本發明的M R I對比劑一旦結合至標乾也可呈現高的 弛緩度，此乃由於受體誘生之磁性加強作用（Rime) 混合以當與標靶結合時肽限制個別螯合物局部運動 之能力。 3·化合物對一種以上標靶有高的親和力。 4·由於依據此中所述方法化合物可被相當容易地合成 ，且每分子僅需一個肽，因此可在較經濟下將多重 的金屬離子或有機染料遞送至標乾。 5 ·本^一明化合物由減弱的酵素代謝可得更高的活體内 穩定性。 & 依據本發明以肽為基礎之聚合物，其有益之特色使彼等 為有用的標革巴對比劑。 本發明所包括之MRI及放射核種對比劑之化學結構可因 此說明： (螫合物一(連接子)P—(連接子-亞單位)s 前驅體）m

(連接子-亞單位)S—(連接子) p — (螫合物 前驅體)m 1240632

其中各m獨又地為K ms 1 〇，p是獨立的i或〇 ; Ri是任 何胺基馱側鏈包括非天然胺基酸之側鏈，且r2為任何脂族 或氫。另外，Ri及反2可一起形成一個環結構（包括脯胺酸及 其經取代型），且11是由3至50(二者包括在内）之整數；且 連接子若存在時可不同。 在一型式之對比劑中（丨型），參考上述結構，m是2，n ，R1及R2如上文所定義，且連接子部份包括： HN—f

N ΗΝ· 螯合物π較好是bb(CO)DTPA · Gd 在另一類型對比劑中（2型），參考上述結構，m是2，n ’ R1及R2及螯合部份如上文所定義，且連接子部份含有：

在上述各自中，”螯合物，，部份可為bb(CO)DTPA · Gd。 本發明之對比劑經由納入自纖維蛋白-標靶之肽可用來 顯影血栓·，。以血纖維蛋白-標靶之對比劑之肽部份較妤有 下式： X〇l-X〇2-環[C-X〇4-X〇5-X〇6-G-T-C]-Xi〇-Xii，或 X I 2 - X 1 3 -)幕[C-P-Y-G/D-L-C]-X2〇-X2l-X22， -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（17 ) 其中 Χ〇|，Χ〇2，Χ〇4，Χ〇5，Χ〇6，Χίο，Xll，Xl2，Xl3，X20， X2!及乂22是變數，且另外使用胺基酸之標準單字母碼。在 上式中，G/D表示此位置可為G或D所占據。 就說明目的，本發明欲涵蓋的一種對比劑示於下，加註 各種亞單位： 螯合物

其中R =胺基酸側鏈，如此整個肽具有對生物標靶之親和力 ，Μ =金屬離子（於M R I是順磁離子，於放射核種顯影是放 射活性，.及於光學顯影是螢光，化學發光或吸收劑）。 本發明所涵蓋之光學對比劑之化學結構可如此說明：

___-22 -_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐）

(光學染料)m P 1240632 A7 B7 五、發明説明（18 ) 其中1 S m ^ 1 0 ’ p是獨立的1或〇，R i是任何胺基酸側鏈 包括非天然胺基酸，且R2為任何脂族或氫，或R1及&2 一起 形成一個環結構（包括P r 〇及其衍生物）且η是3至5 〇 (包括 二者）；各m是獨立至少i且最多1〇，且肽•及c -末端 胺基酸直接地或經由光學連接子共軛至光學染料（即p = 〇或 1 );且二個連接子可不同。光學染料可以是有機染料或適 合的金屬令合物。 光學對比劑一特佳類型（1型）具有下式：

其中η，Ri及R2如上文所定義，c-末端連接子部份含有

且N-末端連接子含有一個羰基。”光學染料，，部份可為螢光 素。 光學對比劑一特佳型式（2型）具有下式：

-------- 23 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（19 ) 其中η，R1及R2如上文所定義，C-末端連接子部份含有

且Ν -末端連接子部份含有一個羰基。”光學染料”較好是化 學發光之斕系螯合物。 標把及標乾結合之肽 依據本發明之對比劑，其肽部份對生物標靶呈現出結合 性，且可充作骨架供多重螯合物黏附。對準標靶使得顯影 劑在欲顯影部位濃度增加，且可經由RIME作用增加M R I 對比劑在結合狀態下之弛緩度，且也由剛化經結合肽骨架 而限制定域之螯合運動。 人類血清白蛋白（HSA)及血纖維蛋白為M R I對比劑有用 的標靶。於血管匯集顯影時，血清白蛋白為較佳之標靶。因 為人類血清白蛋白（HSA)在血清中以高濃度存在（約0.6 mM) 且可以相當高的親和力與各種分子結合，其為血液匯集對 比劑較佳之標靶血漿蛋白質。H S A是心血管顯影特佳之標 靶，見 U. S. Pat· No. 08/875,3 65，公告於 1997年 7 月 24 日，在 PCT下由W0 96/23526發表，目已參考文獻列入本案中。 於顯影血栓時，血纖維蛋白為較佳之標靶，因其存在於 所有凝塊中且可對準而不致干擾正常的血栓溶解過程。關 於標靶結合部份之額外詳述，其含有與血纖維蛋白結合之 肽，見PCT案WO 01/09 188及標題為”於血纖維蛋白之結合 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7

1240632 A7 ---------B7 五、發明説明（21 ) 你一般而言，令人感興趣之蛋白質常以低（如少於微莫耳） 辰度存在。利用既存之單體釓複合物MRI對比劑，於低濃 度標把實在不能有效率地進行顯影。然而，以生物活性月太 ^基礎之聚合MIU對比劑，依據本發明可在㈣處提供較 ::作用物濃度，Μ及有高的弛緩度使這些蛋白質之顯影 變得f能。類似地，以生物活性肽為基礎之聚合放射核種 對比劑，i據本發明可輸送較多的放射核種至標靶，如此 可進一步改善受體之顯影。 原則上，對生物標靶有親和力之任何肽，均可應用於本 1明之對比劑。肽可為線型或環狀，且可含有非天然胺基 酉又大抵’不〉春性親脂性肽被視為不適藥用，但此肽依據 本發明可能是適用的，因為在肽的二個末端加上親水性金 屬螯合物可確實增加溶解度。為易於合成及成本考量，較 好是具有3至5 0個胺基酸之肽。肽較好少於或等於3 〇個胺 基酸，又f好少於或等於2 〇個胺基酸，甚至更好少於或等 於I 5個胺基酸。肽也較好至少有$個胺基酸，甚至較好至 少1 〇至1 2個胺基酸。 胺基酸之多樣性，包括立體化學及非天然胺基酸 在本發明標靶肽中，可使用各樣的胺基酸。適合的胺基 S父包括α -，β ·及γ -胺基酸，天然及非天然胺基酸，及〇 -及L -立體，化學之胺基酸。有許多不同保護基之胺基酸適合 三即用於肽之固相合成，係有商品化的。除了 2 0個自然生 成之胺基酸，以下可構成本發明之肽標靶基（常用縮寫在 括號内，見圖1 ) : β -丙胺酸（β-Ala)，γ-胺基丁酸（GABA), __ ___- 26 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（22 ) 2-胺基丁酸（2-Abu)，α，β-去氫-2-胺基丁酸（Δ-Abu)，1-胺基 環丙烷-卜羧酸（ACPC)，胺基異丁酸（Aib)，2-胺基-4唑啉-4 -竣酸，5 -胺基戊酸（5-Ava)，6 -胺基己酸（6-Ahx)，8 -胺基 辛酸（8-Aoc) ’ Π-胺基Η--燒酸（11-Aun)，12-胺基十二燒酸 (12-Ado)，2-胺基苯甲酸（2-Abz)，3-胺基苯甲酸（3-Abz)， 4 -胺基苯甲酸（4-Abz)，4 -胺基-3-經基-6-甲基庚酸（Statine， Sta)，胺基氧醋酸（Aoa)，2 -胺基莕滿-2 -羧酸（Ate)，4 -胺 基-5 -環己基-3 -羧基戊酸（ACHPA)，對位-胺基苯基丙胺 酸（4-NH2-Phe)，聯苯基丙胺基（Bip)，對位-溴苯基丙胺酸 (4-Br-Phe)，鄰位-氯苯丙胺酸（2-Cl-Phe)，間位-氯苯丙胺 酸（3-Cl-Phe)，對位-氯苯丙胺酸（4-CUPhe)，間位-氯酪胺 酸（3-Cl-Try)，對位-节醯苯丙胺酸（Bpa)，第三-丁基甘胺 酸（Tie)，環己基丙胺酸（Cha)，環己基甘胺酸（Chg)，2,3-二 胺基丙酸（Dpr)，2,4-二胺基丁酸（Dbu)，3,4-二氣苯丙胺酸 (3,4-C12-Ehe)，3,4-二氟苯丙胺酸（3,4-F2-Phe)，3,5-二碘酪 胺酸（3,5-I2-Tyr)，鄰位-氟苯丙胺酸（2-F-Phe)，間位-氟苯 丙胺酸（3-F-Phe)，對位-氟苯丙胺酸（4-F-Phe)，間位-氟酪 胺酸（3-F-Tyr)，高弱胺酸（Hse)，高苯丙胺酸（Hfe)，高酪胺 酸（Htyr) ’ 5 -羥基色胺酸（5-OH-Trp)，羥基脯胺酸（Hyp)，對 位-破苯丙胺酸（4-I-Phe)，3 -破酪胺酸（3-I-Tyr)，⑼哚4 - 2 -羧酸（Idc)，’異哌啶酸（Inp)，間位-甲基酪胺酸（3-Me-Tyr)， 卜莕基丙胺酸（1-Nal)，2-莕基丙胺酸（2-Nal)，對位-硝基苯 丙胺酸（4-N02-Phe)，3 -硝基酪胺酸（3-N02-Tyr)，新白胺酸 (Nle)，新纈胺酸（Nva) ’鳥胺酸（〇rn)，鄰位-磷酸基酪胺酸 ___- 27 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（23 ) (H2P03-Ty〇，八氫W哚-2-羧酸（Oic)，青黴素胺（Pen)，五 氟苯丙胺酸（F5-Phe)，苯基甘胺酸（Phg)，哌啶酸（Pip)，丙炔 基甘胺酸（Pra)，焦穀胺酸（pGlu)，肌胺酸（Sar)，四氫異喹 啉-3 -羧酸（Tic)及噻唑啶-4 -羧酸（硫脯胺酸，Th)。胺基酸 之立體化學之命名可在名稱或縮寫前部以適合的” D ”或 n d ”或"L ”或” Γ而成。2 0個自然生成之胺基酸可以其標準 的一或三畔碼縮寫示之。另外，α N -烷化之胺基酸也可使 用’以及具有含胺側鏈之胺基酸（如Lys及Orn)，其中胺已 被醯化或烷化。 經改善之血纖維蛋白-結合性肽 本發明的一個主題是有關對於血纖維蛋白具改善之親和 力之肽，及其可溶性片段，且在生物介質中所代謝有更大 之阻力，包括此中所述其經截斷之型式。於血纖維蛋白標 靶之對比劑較佳的肽具有下通式：XG1-XG2-環[C-XG4-Xq5_

Xo^G-T-C^-XwXh 或 χ12-χ13-環[(：415-\16-〇/〇丄-<：]_\20- X 2 1 - X 2 2。 依據標準合成方法，如WO 01/09 188或WO 01/08712中所 揭示（以全文以參考方式納入本案），合成具表丨中之化式 Η2Ν-Χ01-Ρ-環[C-D-Y-Y-G-T-C]-X1()-Xii-CO-NH2之肽（結構由 質譜儀證實），並分析與血織維蛋白DD(E)片段之親和力， 且發現各J]具有Kd S 1〇 μΜ : *7____________-乙 Ο · 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(21〇 χ 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（24 )

表1 Χοι Χίο Xu L η(癸基）G dD L η(癸基）G D L MeL Inp L Bip D L Bip dC L Me-Bip D L MeL Cmp L Bip D L L D Cha Bip D 類似地，依據標準合成方法，如WO 01/09188或WO 01/08712所述，合成具表2所示化式X12-X13-環[C-X15-X16-G/D-L-C]-JC2G-X21-X22之肽（結構由質譜證實），並分析對血 纖維蛋白15〇(Ε)片段之親和力，且發現各自具有Kd S 10 μΜ (” -π表示截斷）： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（25 Κά(μΜ) VS. Χι DD(E) ) Xz C 表2 P(4-OH) Y* Xs L C X4 X5 X6 0.04 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-C1) D L c H I L 0.04 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-C1) D L c H I 0.04 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L G H Bpa 0.04 F H c Hyp Y(3-I) D L C H Hfe 0.04 F H c Hyp Y(3-I) D L C H Bpa 0.04 Y(3-CI) H c Hyp Y(3-I) D L C H I 0.04 Y D-E c Hyp Y(3-C1) G L C W I Q 0.05 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L C H I L * 0.05 F(4-OMe) H(Bzl) c Hyp Υ(3·α) D L C H Bpa 0.05 F H c Hyp Y(3-C1) D L C H I 0.06 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L C H I 0.06 3Pal H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.06 4Pal H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.06 F(4-F) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.06 Y(3-I) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.07 F H c Hyp Y(3-I) D L c H I L 0.07 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-C1) D L c H Bpa L 0.07 F(4-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L c H Bpa L 0.07 F H(Bzl) c Hyp Y(3-C1) D L c H I L 0.07 INal H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.07 mTy* H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-0Me) H(Bzl) c Hyp Y(3-I) D L c H Bpa 0.08 F(4-OMe) H(Bzl) c Hyp Y(3-C1) D L c H I 0.08 F H c Hyp Υ(3·Ι) D L c 3Pal I 0.08 F(4-I) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-Br) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-Me) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-CF3) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-CN) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 Y(3-N02) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 Y(2-F) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-€H2NH2) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(4-NH2) H c Hyp Y(3-I) D L G H I 0.08 F(34-F2) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 DopaMe2 H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(2-OMe) H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.08 F(3-Me) H e Hyp Y(3-I) D L c H I 0.09 F H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.09 F H c Hyp Y(3-I) D L c H F(3-CF3) 0.09 F(3-CF3) H c Hyp Y(3-I) D L c H I -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（26 )

0.09 F(3-OMe) H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.09 Hfe H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.09 nTyr H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.09 W E C Hyp Y(3-C1) G L C W I 0.091 F H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.1 F H C Hyp Y(3-CI) D L C H I 0.1 F(4-OMe) H(Bzl) C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Nle 0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Tie 0.1 F H C Hyp Y(3:I) D L C H F(4-CF3) 0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H Bip 0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-Et) 0.1 F 一 H C Hyp Y(3-I) D L C H F(4-OMe) 0.1 F H C Hyp Y(3-I) D L C H F(3-OMe) 0.1 F(F5) H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.1 F H C Hyp Y(3-F) D L C H I 0.1 W E C Hyp Y(3-C1) G L C W I 0.13 T D-E C Hyp Y(3-C1) G L C W I 0.15 F H C P Y(3-C1) D L C H I 0.15 Y(26-Me) H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.15 W E C Hyp Y(3-C1) G L C H I 0.16 D-F D-E C Hyp Y(3-C1) G L C W I 0.16 Y E C Hyp Y(3-C1) G L C Y I 0.18 W E C Hyp Y(3-C1) G L C F I 0.19 H D-E C Hyp Y(3-C1) G L W I Q 0.2 F — H C Hyp Y(3-I) D L C H I 0.2 W E C P Y G L C W I 0.2 F 二 H c Hyp Y(3-I) D L c H nVal 0.2 F — H c Hyp Y(3-I) D L c H Phg 0.2 F H c Hyp Y(3-I) D L c H F(3-Me) 0.2 F H c Hyp Y(3-I) D L c 4Pal I 0.2 S D-E c Hyp Y(3-C1) G L c W IQ 0.21 W E c Hyp Y(3-C1) G L c Y I 0.22 Y E c Hyp Y(3-C1) G L c W I 0.27 F D-E c Hyp Y(3-C1) G L c W I 0.3 F H c P Y D L c H I 0.3 F H c Hyp Y(3-I) D L c H I 0.3 F . H c Hyp Y D L c H Bpa 0.33 F ’ H G Hyp Y(3-C1) G L c H I 0.36 S(Bzl) H € P Y D L c H I 0.36 H E C Hyp Y(3-C1) G L c H I 0.4 F(4-OMe) H C Hyp Y D L c H I 0.4 F H C Hyp Y(3-I) D L c Bpa I 0.4 Ad H C Hyp Y(3-I) D L c H I 0.46 F H C Hyp Y(3-C1) F L c H I 0.46 F E C Hyp Y(3-C1) G L c W I

Q L L

L QQL QQQQ L Q

QQQLL L L Q L

Q _- 31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（27

0.48 F H 0.5 F H 0.5 Hfe H 0.5 Bip H 0.5 w E 0.5 F(4-〇Me) W 0.5 F H 0.5 F H 0.5 F H 0.5 Gu H c c c c c c c c c c pppp ppppp HyHHyHypHyFHyHyHyHy

IHHHW H2pTazDhH H c c c c ccc c C CLLLLLLLLL ldddgddddd al-I)-I)-I)-I)-I) -n(3(3(3(3(3 2YYYYYIYIYIY<YI L η I ΤΧ

LLL

I I I I I I N-及C-末端連接子

C -及/或N -末端連接子之主要功能是連接螯合物至肽骨 架。在單一螯合物黏附至肽之C-4N-末端例子中，連接 子是視所需的，但當不只一個螯合物黏附至或N•末端 時則是需要的。含有連接子之試劑之功能基，可依用來連 結對比劑各種亞單位之策略而變化。精藝者明白在肽末端 可使用不同的連接子，且可依循各種保護基策略。連接子 可為分支^或未分支的，且可含有多重官能基以供螯合物 或螯合部$之共軛作用。連接子之化學結構 之物理及藥理特性，如親和，，穩定性，血液半；^ 緩度，及血漿蛋白質結合。連接子可為烷基，芳基，烯基 ，或炔基所取代。若有連接子，在各末端對MRI對比劑S 言應該相當小且剛化。較好連接子之分子量少於約3 〇且 較好少於，2 0 0。 C-及N _末端連接子之實例在以下本發明對比劑中說明： _ I 丨......... · J 乙- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4£^(210Χ 297公爱)--------- 1240632 A7 B7 五、發明説明（28 螯合物 螯合物 連接子

螯合物 螯合物 連接子 在多重合成步驟中’連接子可黏附至經保護或未經保護 的肽分子，以其整體或亞單位。在許多例子中，連接子亞 單位在多重步驟中之黏附較好基於合成理由。例如，肽通 常在N -及C -末端分別有胺及叛化物，但依據本發明其以 連接子亞單位變化肽之一端較為合宜，如此二個末端均可 有效率地有相同的官能基（如胺基或羧化物基）可用於其餘 連接子亞單位，螯合部份，連接子亞單位-螯合部份，或 連接子-螯合部份接下來之共軛作用。於共軛作用中可使 用許多反應型式，其包括醯化作用，還原胺化作用，親核 置換反應，尿素形成，硫脲形成，及化學選擇性連接作用。 不同的官能基可依所需由共軛方法引入任一或二個末端。 例如，在肽N -末端之胺基可經由與環狀酸酐反應而轉化 成幾化物，由是產生在分子末端有效率地有二個幾化物之 月大衍生物」

肽 hco2h + 7 Nt1r 肽 ^C02h 末端羧化物/ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（29 ) 可用來轉化N -末端胺至幾化物之其他連接子亞單位實例 包括：

其中R是任何脂族或芳族基。 接下來，在上實例中二個末端羧化物可同時與在連接子 片段上的嚴基反應，如下示以生成在二個末端經由醯胺鍵 為連搓子石衍生化之肽分子： Η02ι

NH7-月大-CO2H + 2 η2ν^{ NR1R2 NR1R2 R1R2Nv r1r2n Ο

NH-肽 ,NR1R2 、NR1R2 34 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210x 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（30 ) 當依循醯胺鍵構築策略生成末端有二個羧化物之肽分子 時，此有用的額外連接子試劑特殊實例如下：

其中各m是獨立的1至4 (包括二者），η是獨立的0至4 (包 括二者）（如η = 1或2 )，且R是氫或適合的化學保護基，如 甲基，芊基或第三-丁基。在這些實例中，在連接子亞單 位黏附後，保護基可移去且螯合部份經由標準方法黏附， 如酸胺鍵之形成。 另外，洽有連接子（或連接子亞單位）及螯合部份之試劑 ，可與具適合的末端官能基之肽直接地反應。可與叛化物 基反應之此合成試劑之較佳實例如下：

螯合物前軀體 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（31 ) 其中n=l至4，且R1，R2，R3，R4及R5是獨立的醋酸基，乙 醯胺基或乙醯氧基。 較佳的也有以下實例·· 連接子

其中n'l至4，且R1，R2，R3，R4及R5是獨立的醋酸基， 乙醯胺基或乙醯氧基。 可用於合成之試劑實例為有適合保護基之相當的聚胺基 羧化物： _- 36 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（32 )

經保護的 螯合部份

_3〇〇2〇 (CH3)3<

厂 0〇2_3)3 OOzCXCIU 用於聚·洽物合成中之化學中間物之較佳具體實例具以下 結構： -37 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（33 )

(CH3)3C〇2Cn (CH3)3C02C -N :02C(CH3)y-C02 C(CH A •N

另一方面，肽之c -末端羧化物可轉化成有二胺合成纖維 之胺以形成中間物，之後中間物有二個游離態胺官能基 (N -末端及來自連接子片段之胺），在此其餘的連接子部份 可被黏附-。-此中間物之實例有： H2N-肽

H2N-肽 H2N-肽 π ΝΗ Γ4 大 月 零 Ν 2 Η

Η2 Ν __- 38 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公爱) 人η十0

連接子亞單位

1240632 A7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（35 ) 在某些例子中，也可應用以下的連接子亞單位：

LG °ν 〇 〇y h2n〜nY^lg H2nvn、 丄G 鹼 CL、 Ο

、LG 其中’’鹼”是嘌呤或嘧啶鹼（nAd"=腺嘌呤核芬，nGnn=鳥 嘌呤核甞，” T h ” =胸腺嘧啶，n C y ” =胞嘧啶）。 另外，可應用α N -烷化胺基酸，以及有含胺側鏈之胺基 酸（如L y s及Ο r η )，其中胺如下實例般已被醯化或垸化：

Ο U ΗΝ八R

其中η二0 - 3且R是任何脂族或芳族基 又包括以下更多之連接子亞單位： «Α0 h2N〜Ulg gl^^:h2

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS〉A4規格(210 x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（36 ) 其中η = 1 - 2 (獨立地）且R是任何脂族或芳族基。 當依循醯胺鍵構築策略時，其中肽分子為二個末端胺基 所終止，有用的連接子試劑某些實例如下：

其中各m是-獨立的1至4，η是獨立的0至4 (包括二者）， L G是離去基，且R’或R"較好是獨立的氫或適合的化學保護 基。 另外，含有二個都是連接子，或連接子亞單位及螯合部 份之試劑，可與有適當末端官能性之肽直接地反應。此可 與胺基反應之合成試劑較佳實例如下： 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（37 )

其中1^0是離去基，11=1至4，且尺1，尺2，尺3，114及115獨立地 是醋酸基，乙醯胺基或乙醯氧基。 較佳的是以下實例：

其中LG是離去基，其中n= 1至4，且R1，R2，R3，R4及R5 是獨立的醋酸基，乙胺基，或乙酿氧基。 可用於合成之試劑為有適當保護基之相當的多胺羧化物： -42 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（38 ) (CH3)3C〇2a C02C(CH3)3/(CHs^COgC y〈」—Ν' 連接子 亞單位

NH -〇〇2〇(〇^)3

N 經保護的 蝥合部份

N-\ /—C〇2C(CH3)3

，3002。， )〈 N (CHACO〆 002啊)3^—〇〇2〇(〇^3

N NH2 /—〇〇2C(CH3)3

(CH3)3C02C， >〈 N nh2 (chac^c’ 、co2c(oy3\—C02C(CH3)3 43 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 .A7 B7 五、發明説明（39 )

用於合成本發明聚合對比劑之化學中間物較佳具體實例 具有相當1，LG = -OH之結構，下文稱’'合成纖維# 1 ” ： -44 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1240632 A7 B7

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連接子部伤也有分支點可黏附二個以上的螯合物。例如 ，當依循醯胺鍵形成策略時，含有羰基加上離去基匕〇 (如 ，羧酸或活化之酯）及三個以上經保護胺之連接子，也可 與肽胺反應，生成有三個以上末端胺之分子。為引入三個 以上胺官能基’以下以羰基為基礎之連接子試劑可能是適 合的： NR1R2 lg^Q~nr1r2 NR1R2

其中LG是離去基，且RJ及R2較好是獨立的氫或適合的保3 . 、“象 上j- — 茂基。 當依循驗胺鍵構朶策略時’其中肤分子以二個叛化物終 結，為引入三個以上的胺官能基將是適合的： NR1R2 u ^^\^NR1R2 NH2 R R2n ^NR1R2 r^n nr1r2 其中R1及R2較好是獨立的氫或適合的保護基。 涉及醯胺鍵形成之連接子策略為較佳的，因為其通常可 -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210X297公爱） 1240632 A7 B7 五、發明説明（42 ) 與肽上之保護基相容。如上文所述，肽，連接子及連接子 亞單位可經由形成其他鍵結型式而互相共價黏附（親核置 換，還原胺化及硫脲形成）。 連接子在對比劑特性上也有作用，如親和力，藥物代謝 動力學特性，活體内之穩定性及弛緩度。 、 在以下本發明M R I對比劑之實例中，包括如所列之較佳 肽，說明Ν -末端連接子對於M R I對比劑弛緩度之作用： f…Ν -連接子

_- 47 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（43 ) 列出對比劑之螯合物，肽及連接子組份，且”螯合物”代 表 bb-DTPA-Gd(III)。 上述之”連接子亞單位”依下列結果而變化（每Gd(ni)之 弛緩度在2 0 Μ Η z及3 5 °C下決定，單位為m Μ ·1 s ·1): 血纖維蛋白 端連接子 η 弛緩度 弛緩度- 親和力 亞單位 PBS 血纖維蛋白DD(E)(10 毫克/毫升） 15 Ki = 4.0 μΜ 11.7 18.7 16 Ki = 3.4 μΜ 12.6 29.5 32 Κ i = 4.7 μ Μ (直接鍵合） 12.5 21.6 如上示卞1 5及丨6具有類似3 2之結構，除了不同的Ν.末1 端連接子亞單位。實驗結果顯示，連接子可影響弛緩度， 以及本發明對比劑的其他特性。 螯合邵份及試劑 在本發明對比劑中可使用各種的螯合配體。此螯合配體 包括DTP^，D0TA，N〇TA&D03 a之衍生物，但不限於此。 方、M R I衣些較佳的金屬螯合物為：二乙撐三胺五醋酸釓-(DTPA · Gd)，四胺[,4,7,10-四吖環十二烷^，^，"-四醋. 酸乳（DOTA · Gd)及1，4,7，10-四吖環十二烷]，4，'三醋酸釓

裝 η

線 -—- —_ - 48 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇 X 297公釐）

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裴 ψ 1240632 A7 B7 五、發明説明（45 ) 其中X是可與金屬陽離子配價之雜原子電子-供予基，較好 是ο-，OH，NH2，OP〇32-，NHR或OR，其中R是任何脂族基 ，R1是未荷電的化學邵份’較好是氫，任何脂族，燒基， 或環、烷基或其未荷電之經取代版本；及Y (如可形成與連 接子之黏附點，或直接地或有介入之羰基，亞甲基，亞甲 基-氧，碳羰基），有或無配價的金屬離子。 當合成含有金屬離子之螯合物之對比劑，較合宜的是使 用包括有整個螯合配體之試劑，以製成螯合物-標靶基共 軛物，如經由胺及活化的酯形成醯·胺鍵。L 1型之Gd(III)複 合物行為如[Gd(DTPA)(H20)]2·之經取代複合物。羰基官能 基僅用於將螯合物連接至分子其餘邵份。如由配位化學原 則中所預期的，其不以此方式干擾螯合物以置換臨界的内 部範圍水分子或劇烈地加長水之滯留時間。 當合成含有金屬離子螯合物之對比劑，可合宜地使用包 括有整個f合物配體之試劑，以製成螯合物-標靶基共軛1 · 物，如經由胺及活化酯形成醯胺鍵。就製備聚合螯合物之 目的，可合成之官能化螯合物實例包括：pNCS-Bz-DTPA [Martin, V.； Ralston W. et al. Bioconiugate Chem. 6，616-23， 1995]及 Gd(4-NCS-苯基）-胺基-羰基甲基-D03A [Ramachandran， R. et al·，Invest. Rad. 1998, 33(1 1)，779-797]。至於最佳的弛 緩度特性，，當結合至標靶時，其通常可將螯合物運動減至 最低，且因此希望有最少的共價鍵數目可將標靶與螯合配 體連接。以下是試劑之實例，其含有螯合配體，其中之骨， 架羰基可連接至胺連接子，其中” L G ”是離去基（如在活化 -50 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（46 ) 的酯），且R代表可被容易地解離形成羧化物之基團（-CMBu ，如羧酸酯）： 羰基黏附至螯 合配體骨架

頃發現，羰基之化學特色（motif)緊接螯合配體，構成一 類高弛緩度之M R I對比劑。 本發明也是有關合成依據下式用於M R I之對比劑之中間 物：

其中R1，R2 , R3，R4及R5可為任何經保護或未經保護之乙醯 基配體，適於形成有適合的形成常數之順磁性金屬螯合物 ，包括下列：

ΝΗΡ 包括爷 型，包 0 及 0 ，其中Ρ是任何保護基， 基及第三-丁基。LG是’’離去基’’且代表-ΟΗ及其酯 括N H S ，五氟齡及其他活化S旨。 -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（47 ) 一個特佳之具體實例有LG = -OH，且R1，R2，R3，R4及R5 = -CH2C〇2OlBu，下文稱為，'合成纖維#3 ”，具有以下結構： HOx^^O ^C〇2C(CH3)3 X( (h3c)3c〇2( ：〇2C(CH3)3 (H3C)3co2 )〇2C(ch3)3 另外，下試劑可用來合成本發明之對比劑 c〇2h kr-C〇2C(CH3)3 (H3C)3C〇2C^N-^N\^ ^C〇2C(C H3)3 ^C( (見 Svn. Comm. 30, 3 75 5 (2000) ° ) 本發明也提出製造化合物之方法。特言之，新穎的氧化反 應有助合成纖維#3之製造，此為螯合配體之較佳具體實例。_ 合成纖-維# 3經由二個不同的合成路徑合成。均以羥甲1 · 一 ^ 基-二乙撐三胺開始。一路徑涉及一個二合成步驟次序（烷 化，再繼以氧化作用），另一為六步驟過程（保護，氧化， 酯化，去保護，烷化及氫解作用）。二者均可以高化學及 光學純度產生合成纖維# 3 (見下實例）。 先前的專利（U.S. Pat· No· 5,637,759)揭示利用硫苯氧化 鈉之選擇在水解作用，經由2,3-二胺基丙酸及吖-賴胺酸衍 生而合成纖維# 1。此中揭示之改進方法免去使用此有毒試 劑。硫苯氧化鈉可分解成有毒之硫化氫氣體對於大規模產_ 製並不實際，且需要特殊的設備。此外，所示之專利並未 -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐）

裝 訂

1240632 A7 B7 五、發明説明（48 ) _ 描述關鑑性六酯中間物之合成。 對比劑一般的合成 以肽為基礎之對比劑之合成，可依以下步驟進行。首先 ，在有或無C -末端連接子亞單下位合成標靶肽，通常利用 固相肽合成。於此中所述之環狀肽，經保護之線形肽可在 溶液中或樹脂上環化。未保護之肽也可在溶液中或樹脂上 環化。C -末端連接子亞單位可合宜地衍生自固相合成樹脂 ，且N -末端連接子或N -末端連接子亞單位可在固相合成 中偶合至肽。典型而言，在環化作用後，連接子亞單位-螯合物前軀體部份可偶合至肽。移去保護基以生成配體前 軀體，再製成螯合物。本發明之放射核種化合物利用商品 化之放射核種，製備自配前體軀物（如99mTc來自Nycomed Amersham Boston cat. #RX-290195，luIn 來自 NEN Life Science Products cat· #NEZ304，或 153Gd 來自 NEN Life Science Products eai. #NEZ 142)，係在水性介質中反應，通常在pH 1· 4-6下歷1小時。在光學對比劑例子中，有機染料可取代螯 合物前軀體。 對比劑之結構

[合成類似3 2 ] 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 1240632 A7 B7

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（53 21

23 裝

Gd-DTPA-CONIi^^

Gd-DTPA-OO^IH H - π “si 24

線 -58 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐） 1240632 A7 B7

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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（63 ) 結構5 0

HN

牵

HN

hoj1 A , ΝΗ

對比劑之特性 某些對比劑對準至血纖維蛋白之親和力 表3 -依據本發明的某些對比劑，對可溶性血纖維蛋白 _ DD(E)片段f見實例中對各化合物有詳述及結構）具有親和1 力。此數據在多次決定下，於此生物分析中之誤差頻率不 大於2 0%。 表3 化合物 4 33 5 12 6 13 7 12 12 5.0 13 5.1 14 4.9 68 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632

32 4.7 15 ^ 丨丨 一* 4.0 16 " ---—____——1 3.5 17 6.2 18 --~~—- -___ 5.9 8 8.6 9 ' 6.1 10 ------ ' --------一 9.6 11 13 27 0.7 28 5.3 29 "'-^------- 0.8 30 —-__- 3.7 19 ' 10 20 ^ ~ -------^ 1.2 21 1 〜-------—- 9.1 22 3.5 3 1 ^" 0.8 23 ----— 0.25 24 0.7 25 —-----· 5.6 T -----------J 為内源丨生酵素降解而言，本發明化合物較母肽穩定（即 .’·、任何14之黏附之螯合物之肽），也勝於在n -末端黏附有 一個以上螯合物之肽，或在C ·末端黏附有一個以上螯合物 之狀。為估計活體内之穩定性，利用大鼠肝勻漿物展開 分析。句漿化之大鼠肝含有細胞内及細胞外酵素，且對於 肽鍵而言代表特別粗糙的化學環境。 肽無螯合物（1 )及三例肽共軛有共4個螯合物之穩定性數

___- 69 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) 1240632 A7 B7

五、發明説明 據，如下：僅在C -末端有螯合物之肽(3 )，僅在N _末端有螯 合物之肽（2 )，及本發明二個對比劑，在肽之二個末端上 共軛有螯合物（5 )。化合物5證明其半衰期劇列地增加，此 乃始自在肽之C -及N -末端位置上因共軛有螯合物而達到 可抗阻肽鏈端解酶之水解作用。在一末端以螯合物改變，並 不能達到半衰期可比得上之增加，即使在另一末端有一個 非天然有機部份之加蓋，如3在N -末端有聯苯基一般。 由下列方法來決定以下化合物之穩定性數據：新鮮製備 之大鼠肝.勻漿物（6 3 0微升）置於玻璃試管中，再置3 7水 浴中4分鐘。對3 7 °C下之大鼠肝勾漿物加入7 〇微升1 mM受 試化合物溶液。在〇，5，1 5，3 0及6 0分鐘時間點，移去 一份1 0 0微升之反應混合物，與1 〇 〇微升甲醇共同混合在 微量離心管中以中止反應。所中止之反應混合物在1〇,〇〇〇 rpm下離心3分鐘使沈殿的蛋白質成團塊。上清液以lc-MS 分析，以名量留下之受試化合物含量，係將單一離子M S ;-峰之區域與一系列標準品比較。將餘留訊號百分率對數值 一 對時間作圖，以決定半衰期（T1/2)。數據利用指數曲線配 合使適合之，其中Tl/2 = In2/斜率。

1 :半衰期=< 2分鐘，游離Ν -及醯胺化之C -末端 L _- 70 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（66 )

2 :半衰期=10分鐘，N -末端共軛至螯合物及醯胺之C- 末端。

3 :半衰期=9分鐘，C -末端共軛至螯合物且N -末端以對 位（苯基）苯甲酸醯化。

5 :半衰期=6 5分鐘，N -及C -末端均共輛至螯合物。 上述數游說明，肽之半衰期經由在C -及N -末端加上釓 螯合物，可更為顯著地增加。 弛緩度 ： 分析依據本發明對比劑之弛緩度數據，且此劑對血纖維 -71 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（67 ) "' ----- 蛋白具有親和力(實例有詳述）。本發明化合物與血纖維蛋· 白結合下可增加其弛緩度，此與無生物標靶(緩衝溶液)下 之弛緩度比較而言（見圖2 )。 凝塊之吸收 將血液與血塊對作用物之吸收做比較，可決定出血纖維 蛋白-標靶之作用物之特異性。血纖維蛋白_特異性之作用 物，在血塊之吸收上顯出顯著的增加。以下列方法決定對 比劑為血栓（血塊）之吸收：6 〇 〇克天竺鼠出⑽丨巧雄性）予 以麻醉。.在腹部切開，分離出下腔靜脈（IVC)，再令血管恢 復10分鐘。夾住][VC i公分處，人類凝血酶（5〇微升，4單 位）注入血管内以促進血栓形成。打開較下方夾子再閉合 以令邵份血液流至該段中。2 - 3分鐘後移出夾子。令血栓 在動物中成熟3 0分鐘。在此時注入對比劑-化合物3 2，劑 量為2微莫耳/公斤，並加上以70微居里mIn放射標記之示 蹤物，經J貧靜脈注入。在作用物-化合物3 2注入後，經由; 頸靜脈立即注入非特異之對照組，其中含有2微莫耳/公斤 — 劑量之Gd(DTPA)，並混合以7 0微居里99mTcj)TPA。3 0分鐘 後抽血，犧牲動物，再取出血栓。將血樣稱重，並以 Packard Cobra Ι[ γ計數器計數。也對血栓稱重並計數。來 自之計數，由1 28- 1 65 keV開始偵測，而來自ΜΐΙη衰變 之計數由J90-500 keV計數。僅有MmT(：或mIn之對照實驗證 明，始自之放射活性在用於mIn之偵測能量下是可忽 略的，反之亦然。放射活性衰退數據轉化成每克組織之最 初劑量％，％ID/克，且三次實驗之平均以圖解示出。先進 -72 - 本紙張尺度適财_家標準(CNS) A4規格(21GX 297公爱) 1240632 A7 B7 五、發明説明（68 ) 行M1In足放射標記··將適合的放射化學劑量minci3 (nen) 加至血纖維蛋白對準之對比劑。加入1 M HC1調整ρ Η至4 。樣品在4 5 QC下加熱1小時。加1 M NaOH令ρ Η調至中性。 經標記之作用物化合物3 2，以γ -偵測之HPLC知其純度 >95%。 圖3示出作用物-化合物3 2，係累積在血栓中。與"mTc DTPA比較下，此中有特異的血塊吸收，且在血栓中作用 物之濃度較在周圍血液中的還高。 血塊M R I. 也利用M R I及觀察血塊訊號之加強，來證明以血纖維蛋 白為標把之對比劑之特異性。以本發明作用物於活體内顯 〜血彳五 < 步驟如下·將6 0 0克天竺氣（Hartley雄性）麻醉。 在咽喉處切開，並分離一條頸靜脈。以血管夾分出1公分 頭靜脈段落。抽自動物之新鮮血液（5 〇微升）混合以人類凝 血酶（5 0微升，4單位）並注入靜脈夾住之段落内。注入後4 ; 分1里’移開夾子令血栓成熟3 〇分鐘。作用物-化合物3 2，二 乂 6 U莫耳/公斤之劑量注入，再利用擾波梯度方法6 TE 5轉置角度=30在1.5 T下造影出天竺鼠之喉部區域 。和血液比較，血栓似乎較亮些。 本發明對比劑之用法 此中所.揭tf製成之對比劑，可和傳統μ R〗對比劑有相同 用法。當造影血栓時，為加強血栓與背景血液及組織之對 比心好使用某些M R技術及脈衝波序。包括下列但不限、 万；此·黑血血管攝影序列，此可使血液無訊號（變黑），如 -73 - 本紙張尺歧” _家標準(CNS) Α;規格(21G X 297公聲) 1240632 A7 B7 五、發明説明（69 ) —-----

ME 陕L自旋回波序列及泥動-擾相梯度回波序列。這些方法 也包括可加強對比差異之與流動無關之技術，此乃因對比 加強 < 血栓及血液和組織間T 1差異所致，如反轉恢復或飽 和恢復 < 序列，其可加強血栓及背景組織間之對比。針對 T 2檢向弛緩時間所做之方法也證明十分有用。最後，針對 核磁化矩（magIletizati〇n)轉移技術之方法也可改進本發明作 用物之對比。 、.且a物了依據例常步驟調和成藥學組合物，以適於靜脈 内投予至人類或動物。典型而言，供靜脈内投藥之組合物 為在無菌等滲水性緩衝溶液中之溶液劑。必要時，組合物 也可含有穩定劑及局部麻醉劑，如利多卡因，以減輕注射 部位之疼痛。一般而言，組份之供應或分開的，如在一個 套組中，或一起混合在單位劑型中，如呈乾燥的冷;東乾燥 散剑或無水之濃縮物。組合物可貯存在密閉且熔封容器中 ，如安瓿-矣顆粒，示出呈活性單位之活性劑含量。當組合二 物經由輸注投藥時，其可以輸注瓶調劑，其内含有無菌^ ^ 藥用等級之”注射用水”或食鹽水。當組合物採注射投藥時 ，可提供無菌注射用水或食鹽水之安瓿，如此在投藥前可 先混合組份。本發明之醫藥組合物含有本發明化合物及其 藥學上可接受之鹽，加上藥學上可接受之組份，賦形劑， 載劑’佐_朝或溶媒。對比劑較好以可注射組合物型式投予 至病人。投予對比劑之方法較好是腸外，即靜脈内，動脈 内’鞘内/間隙内或腔内。本發明之醫藥組合物可投予至、 包括人類之哺乳動物，其方式類似其他診斷或治療劑。投

________ ^紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 29^57 1240632 A7 B7 五、發明説明（70 ) " " ------一__ 予劑量及投藥模式依各種因素而定，包括病人年參，、 ，性別，條件及基因因素’最後由主治醫師決 二 驗決定各種劑量，再行此中所述之顯影。—般而言、'·，於ς 靈敏度或治療效力所需之劑量範圍在由約〇 〇〇i至5〇,咖 克/公斤，較好在0.01至25 〇微克/公斤宿主體重之間1最佳 货丨1里可依循此中所揭示的由經驗決定。 本發明以血纖維蛋白為標靶之對比劑可用於診斷深靜脈 血栓形成，肺插栓，冠狀血栓形成，頸動脈及顱内血栓形 成，動脈及心室血栓，大動脈弓血栓，及高危險性斑。’ 本發明以下列實例進一步說明，其並不限制在申請專利 範圍内所述之本發明範壽。 實例 本發明許多高鬆弛度對比劑組合物之合成，特性鑑定及 用法可在以下實例中進一步說明。包括在以下實例之特殊 變數用以說:明本發明之實務，且不欲在任何方式中限制本; 發明範圍。精藝者可確認，或在無例常實驗以外下可確定土 許多與此中所述之特殊具體實例及方法相當者。此實驗可 為申請專利範圍所涵蓋的。 以肽為基礎之M R顯影劑之合成 有連接子-亞單位部份結合至C -末端之肽（Ρ -[連接子-亞 單位部份4)。利用標準的Fmoc策略及二胺基三苯甲基樹脂 製備未保護之肽。肽利用三氟醋酸鉈在樹脂上或在溶液中 環化。一異自樹脂中解離，未保護之肽可以RP-HPLC純化， (C-18管柱，H20/CH3CN/TFA)。 -75 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(2i〇x 297公爱） 1240632 A7 __ B7 五、發明説明（71 ) 連接子部份：在B〇c-Dpr(Boc)-〇H.DCHA (1當量）及五氟 酚（1.2當量）於二氯甲烷之溶液中，加入p S -碳化二亞胺 (1.2-1 ·5當量）。混合物在室溫下震盪3 - 5小時。經過L C -質 譜結果顯示反應是完全的，樹脂以過濾移去且溶劑在減壓 下蒸發可生成粗製之連接子部份（8〇(：-〇01*(8〇(：)-〇?行（1^-〇〇-8〇〇心0-8〇(：-1^二胺基丙酸五氟笨基酯，356-1 28)呈白色泡 沫狀。 前軀體M R顯影劑：對Ρ -[連接子-亞單位部份](1當量） 及連接子部份{Boc-Dpr(Boc)-Opft (356-128)}(2·2 當量）於 D M F之溶液，加入DIPEA (4 - 6當量）。混合物在室溫下攪 拌一夜。L C -質譜後結果顯示反應是完全的，溶劑於減壓 下移去。粗製產物（ 356-130)再於TF A，水及茴香醚 (90%/5%/5%)之混合物中於室溫下攪拌3小時。加入二乙醚 且可有白色沈澱物形成，其再以RP-HPLC純化（C - 1 8管柱 ，I-^O/C^eN/TFA)可生成前軀體MR顯影劑（肆胺基-肽）,-(3 5 6-144-F8-1 1)，呈白色固體。 ~ 前身區體螯合物部份：DOTAGA-Opft (356-64)。對DOTAGA-〇H (1當量）及五氟酚（1.2當量）於二氯甲烷之溶液中，加入 P S -碳化二亞胺（1.2-1.5當量）。混合物在室溫下震盪3 - 5小 時。L C -質譜後結果顯示反應是完全的，樹脂以過濾移去 ，且溶劑』減壓下蒸發可生成粗製的前軀體螯合物部份 (356-64)，呈白色泡沬狀。 肽磁共振顯影劑。對前軀體MR顯影劑（356-144-F8-1 1，遍 1當量）及前軀體螯合物部份（356-64，4.0當量）於DMF之溶 __- 76 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（72 ) 液加入DIPEA (4.0當量）。混合物在室溫下攪捽一夜。LC-質譜後結果顯示反應是完全的，溶劑在減壓下移去。 粗製的產物（356-172)再於TFA，酚，甲基磺酸，茴香醚 及二氯甲烷（90%/2.5%/2.5%/2.5%/2.5%)之混合物中攪拌， 於室溫下歷1 5分鐘。加入二乙醚，且可形成白色沈澱，再 收集成粗製產物（356-174)。 肆00丁八0八配體（3 56-174)與0(1(：13.：«20在去離子水中反應 。亂（111)螯合物（3 56-174-0旬利用1^-1^1^純化（（：-18管柱 ，乙醇/ 5 0毫莫耳AcONH4)。混合適合的流份，乙醇在減 壓下移去，混合的流份再以醋酸鈉處理以行鹽交換。在冷 柬乾燥後，過量的鹽可利用逆相層析移去，於Waters Sep-Pak® C-18匣上，利用水及乙醇：水（50 : 50)為溶離劑。混 合適合的流份，乙醇在減壓下移去，且溶液冷凍乾燥以生 成欲求的肽M R顯影劑，呈白色固體。 經修飾之肽M R顯影劑各自之合成類似所述之方法。 合成纖維# 3之合成方法

3: R = Boc, R1 = Η 4: R = Boc, = Bn 5: R = H, Ri = Bn

c d

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（

(h3c)3co2c， (H3C)3C02C

c〇2c(ch3)3 C〇2C(CH3)3

.广 co2c(ch3):S：02C(CH3)3 a) B0C2O，NaOH-二噚烷

b) NaOCl，NaOCl2，TEMPO，磷酸鹽緩衝溶液，ACN

c) BnBr，CS2CO3，DMF d) TFA，CH2CI2 ;再來是2M HC1，Et20

e) 溴醋酸第三-丁基酯，DIPEA，DMF f) H2，Pd/C，EtOAc 合成纖維#3之合成方法 步驟1 -胺之保護

所示立體化學三氫氯化物之羥甲基-二乙撐三胺（25.15克） (光學上純的啟始物質：Svn. Comm. 29(14), 2377-2391 (1999) ，外消旋啟始物質：Coll. Czech. Chem. Comm. 34, 630-634 (1969))溶於去離子水/1,4-二哼烷中，且溶液的pH值以氫 氧化鈉水溶液調至p Η 8及9之間。二碳酸二-第三-丁基酯 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（74 (3.5當f )落於二嘮烷中，並在1 〇及2〇^間加入。反應混合 物在室溫下攪拌1 2至2 0小時。反應混合物以水稀釋，再 以乙紅乙醋卒取。有機萃取物依序以水，飽和的碳酸氫鈉 ’及飽和的氯化鈉溶液萃取。有機萃取物在硫酸鈉上乾燥 ’過;慮並於真空下濃縮，可生成油再以矽膠層析純化，利 用乙版乙醋·己燒之混合物溶離。經純化產物之總產率為 30.11 克。1H NMR (300 MHz): 5.18 (d，J=7.9 Ηζ，1Η)，4·76 (bs，1Η)，3.8-3.0 (m，10Η)，1.47-1.42 (2s，27Η)。MS (m/Z): 456.4 [M + Na]+。 步驟2 ·羥基之氧化作用 [依據 Zhao et al. J. Org. Chem. 64, 2564-2566 (1999)] , 裝

B oc ^/^NHBoc

NaOCI, NaOCI2, TEMPO, --—► 磷酸鹽緩衝溶液’ 乙腈

"N HBOC 訂

BOC -{呆護之□ hiamine (29.94克）溶於乙月青中。力口入300 毫升磷酸鹽緩衝溶液，含有21.6克NaH2P04，21.6克Na2HP04 及足夠的去離子水以產生5 00毫升體積，再加2,2,6,6-四甲 基哌啶-1 -氧基（TEMPO)(0.07當量）。混合物劇烈攪拌並加 溫至3 5 °CU。亞氯酸鈉（2.0當量）溶於去離子水（100毫克/毫 升）。加入亞氣酸鈉及漂白（0.02當量，約0.25%次氣酸鈉水 溶液），同時維持固定溫度。在加入氧化劑之後，反應攪 拌2 4小時。反應冷卻至室溫。加水，且p Η值以2.0 N ____- 79 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（75 )

Na〇H水溶液調至8。加入亞硫酸鈉冷的水溶液（3〇〇毫升） 同時維持在固定P Η值下。溶液以少量甲基第三-丁基醚萃 取’再令其暫擱。水層以2.0 N HC1水溶液酸化至ρΗ 3-4， 並以少量甲基第三-丁基醚萃取二次。有機萃取物與先前 暫搁的混合，並於真空下濃縮。產物勿需如下步驟3之純 化即可使用。iH NMR (300 MHz): 5.8 (bs，1H)，5.3 (m, 1H)， 4,4 (M，1H)，3.6-3.2 (m5 6H)，1.47-1.43 (2s，27H)。MS (m/Z): 470.2 [M+Na]+ 0 步驟3 -羧酸之芊基-保護作用

羧酸啟始物質（178克）溶於無水DMF中。加入碳酸铯(2·〇 當量），且溶液攪拌3 0分鐘。在室溫下逐滴加入爷基澳 (1 · 1當量）。反應混合物在惰性大氣下攪拌1 8小時。反應 混合物以水稀釋，並以乙酸乙酯萃取2次。混合有機層， 並依序以碳酸氫鈉飽和水溶液及氯化鈉溶液洗滌。有機層 濃縮成油（270克），可以矽膠層析純化，利用乙酸乙醋：己 烷：β NMR (300 MHz): 7.3 (s，5H)，5.6及5·15 (2bs，1H)，5.1 (s，2H)，4.5 (bs 1H)，4.0-4.1 (m，1H)，3.5-3.2 (m，6H), 1.45及 1·4 (2s，27H)。MS (m/Z): 560.3 [M+Na]+。

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（76 ) 步驟4及5 -胺之去保護作用及烷化作用

BOC-保護之三胺（250克）在1 : 1乙月f ·· 4 N HC1水溶液之 溶液中攪拌，再令其攪拌約2.0小時。乙腈於真空下移去， 留下的溶液冷凍乾燥以生成殘留物，其可立即溶於D M F及 二異丙胺中（充份量以將ρ Η值提高至8 )。加入溴醋酸第 三-丁酯（12.0當量）。一旦加入完全，反應混合物加溫至5 0 °C ，並攪拌1 8小時。一旦反應完全，反應混合物之量加水使1 -加倍，之後以乙酸乙酯萃取二次。有機萃取物混合，再依 序以水，飽和的碳酸氫鈉及飽和的氯化納溶液洗條。有機 溶液於真空下濃縮以生成油，其以乙酸乙酯··己烷行矽膠 層析純化。經純化產物之總產率為1 90克。MS (m/Z): 809.5 [M + Na]+。 - 步驟6 -羧化物之去保護作用

-81 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 ____ B7 五、發明説明（71 ~Γ~ " 不銹鋼反應器中裝入苄酯（157克），丨〇% Pd/C (19 8克）及 乙酸乙醋’並在45 psi下氫化1 2小時。經由Celite®過濾， 並於真空下濃縮成油。油溶於乙酸乙酯/己烷中，再以矽 膠層析純化以生成DTPA羧酸五-第三-丁基酯（產率·· 82%) 。MS (m/Z): 7 19·5 [MH]+。當此試劑用於利用其他對掌性 元件之對比劑合成時，並未觀察到非對映立體異構物，且 因此可結論出此物質基本上是光學上純的，至一般質子 NMR可偵測之限度。

合成纖維#3合成之方法B Η<\ 氧化作用 HC\^〇 ^CO^Bu tBu02C^N^NN^M^c〇2tBu ίβυ〇2〇 ^uOzCr x^a〇2C^ {ΒυΟ20^ 醇（見 Syju—g_omm. 29( 14)，23 77-2391 (1999)於來自羥甲 基-二乙撐三胺之合成）啟始物（105.0克），乙腈（1.0升）。磷气 酸鹽緩衝溶液（1.0升，由溶解100毫克NaH2P〇4及10毫克 ^2即〇4至1.0毫升水中而製成，再以仏卩〇4調？^1至4.5)及 TEMPO (7.0克）混合再加溫至45及5 0 °C間。在溶液中加入 由亞氯酸鈉（29.8克溶於298毫升水中）及次氯酸鈉（ 744微升） 組成之溶液，同時溫度維持在45-50°C之間。反應混合物劇 烈攪拌4墓10小時。反應混合物冷卻至室溫，再分二層。 有機層分出，混合以飽和的氣化鈉水溶液，再攪拌1 5分鐘 。有機層分出，並於真空下濃縮生成油（1 7 1克），以管柱層遽 析純化，利用己烷：異丙醇加上0.1 %三乙胺，可生成8 1克 _____- 82 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 --------- B7 五、發明説明（78 ) 加豐之產物，呈油。MS (m/z)·· 719.5 [MH]+。由此方法產生 物質之光學純度並無異於上者。 用於固相肽合成之樹脂 肽已經由固相合成而製備。在固相合成中，連接子及樹 脂之選擇依欲合成之肽（如在C -末端所需之官能基，經保 護或未經保護之肽）及所用之合成方法而定（如Fmoc或B0C 化學’手動式或自動化合成，連續流動或批次反應槽）。 例如’在其C -末端有竣酸基之肽之合成中，經保護之胺基 酸黏附至不同的樹脂，如HMPB樹脂，2 -氣三苯甲基氯樹 脂及SUSRIN樹脂。另一方面，在其c-末端有胺基之肽之 合成中，將二胺黏附至三苯甲基樹脂。聚苯乙締（p s )樹脂 可用於批次合成，而經聚乙二醇（peg)修飾之樹脂適於連 %流動及批次合成。1，3·雙·（胺基乙基）_苯三苯甲基樹脂 之合成以一實例討論。其他二胺類以類似方式黏附。 1 · P E G樹腊 製備1，3-雙-(胺甲基卜苯三苯甲基Peg樹脂。

首先，三苯甲基醇樹脂（25克，NovaSyn TGT樹脂，

NovaBiochem)置於漏斗中，再依序以dmF，CH2Ch及甲苯 洗條。移去所有溶劑之後，物質轉移至有迴流冷凝管之燒 本紙張尺度適财關家鮮(CNS) A4規格(21GX297公复) 1240632 A7 B7 五、發明説明（79 ) 瓶。加入甲苯（250亳升）及乙醯基氯（2 5毫升），且淤聚加 熱至7 0 C，再攪掉1 · 〇小時。加入另一份乙Si基氯（2 5毫升） ，且淤漿在7 0 °C下攪拌2.0小時。淤漿過濾，樹脂依序以甲 苯及CH2C12洗滌。 0

其次，新鮮製備之三苯甲基氣樹脂及THF (250毫升）置於 燒瓶中。在於漿中加A1，3-雙-(胺甲基卜苯^^當量，以 0.23毫莫耳/克之樹脂置換為基礎），且混合物在室溫下攪 拌18.0小時。淤漿過濾，樹脂依序以水，dmf，Cl^Ch，甲 西予及CPhCh洗滌。樹脂在真空下（室溫，卜5毫米汞柱）乾 爍至fe重（25.4克）。利用定量水合茚三酮步驟進行置換化 學計算。 2 · P S樹脂 許多的三苯甲基PS樹脂，包括丨，3_雙·（胺甲基）_苯三苯 甲基PS樹脂均已商品化。若買不到所需的三苯甲基”樹 脂，可使J如PEG樹脂之類似步驟，將二胺黏附至三苯甲 基P S樹脂。 連接子之合成 合成”對掌性連接子"（合成纖維# i)之方法

1240632 A7 B7 五、發明説明（80 ) Η BOC^

Η Ν.,

BOC

1. DIC, HOBT 2. H2f Pd/C 2,3-二-第三-丁氧 致基-胺基·丙酸

2,3-雙-第三-丁氧羰基胺基丙酸芊酯 碳酸铯（6.5克）及水之溶液加至2,3 -雙-第三-丁氧羰基胺 基丙酸（3.04克）於乙腈（25毫升）。混合物在室溫下攪拌40 分鐘。溶劑在真空下移去。將DMF (50毫升）加至固體殘留 物中。苄玉溴（1.43毫升）及DMF (5.0毫升）之溶液在室溫下 以1 5分鐘加入。混合物攪拌1 8小時，混合物再以乙酸乙 酯（1 00毫升）及水（5 0毫升）稀釋，並攪拌1 5分鐘。分層， 有機層在硫酸納上乾燥。混合物過遽，滤液於真空下濃縮 -85 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 _ B7 五、發明説明（81 ) 生成油（3.6克）。油以管柱層析純化，以乙酸乙酯/己烷， 可生成油（1.8 克）。MS (m/Z): [M+Na]+=417。NMR (300 MHz): 1·4 (s，9H)，2.4 (m，2H)，4·4 (m，1H)，4·8 (m，1H)，6.5 (m，1H), 7.3 (m，5H卜 2.3- 二胺基-丙酸三氫氣化物 2.3- 雙-第三-丁氧羰基胺基丙酸芊酯（l·8克），4NHCl水 溶液（4 0毫升）及乙腈（5 0毫升）之溶液在室溫下攪拌1 8小 時。溶劑於真空下移去，且混合物以乙酸乙酯（1 〇〇毫升）及 水（5 0毫升）稀釋，再攪拌1 5分鐘。分層，且水層蒸發至乾 (1·23 克泡沫 / 糖漿）。NMR (300 ΜΗζ): 3·2-3·5 (m，2H)， 4.2-4.35 (m，1H)，5·13,5.25 (q，2H，J=11.8, 3.1 Hz)。 2.3- 雙-羧基-DTPA丙酸芊酯 2.3- 二胺基-丙酸三氫氣化物（6·65克），bb(CO)DTPE (40.0 克，’’合成纖維3”），HOBt (8.5克），DIC (9·0毫升），二異 丙基乙胺（15.0毫升），CH2C12 (400毫升）及DMF (200毫升）二 之溶液攪森48小時。混合物以二氯甲烷（500毫升）及水（250 — 毫升）稀釋，再攪拌1 5分鐘。分層，且有機層以飽和的碳 酸鈉（250毫升），飽和的氣化鈉（25〇毫升）洗滌，並在硫酸 鈉上乾燦。混合物過濾，且濾液於真空下濃縮可得油狀物 。此油以碎膠層析純化，利用乙酸乙酯及己烷可得28.0克 的物質。MS (m/Z): [M + 2]+=798; [M+l]+=1595。 2,3-雙-羧基-DTPA丙酸 2.3- 雙-铁基-DTPA丙酸苄酯（17.0克）之氫化在乙酸乙酯/屬 二乙胺（10 : 3)中利用1 〇% pd/c (6.〇克）催化劑在5〇 psi下進 -—__- 86 - 本紙張尺度㈣时_ϋΠ^(.21() X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（82 ) 行24小時。容器中充入氮氣，且混合物經由Celite®過濾’ 並減壓濃縮以生戍16 〇克的油。MS (m/z): [Μ+2Γ=753; [M+l] + =1504。 合成’’對掌性連接子 (合成纖維# 2 )之方法 η2ν- DIC.HOBt;

DTPE-C02H

-87- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4规格(21〇x 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（83 ) N、N3-雙[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-3-{[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-乙基]-(第三-丁氧羰基甲 基）-胺基}-丙醒胺]-二乙撐三胺 對二乙撐三胺（3· 16毫升），乙腈（700毫升）及二異丙基乙胺 (1〇·4毫升）之溶液中，加入預-反應之（3 0分鐘）bb(CO)DTPE (42.0 克，”合成纖維 3”），HOBt (7.9克），EDC (11.2 克）及二 異丙基乙胺（1 0毫升）於乙腈在室溫下。反應攪拌16.0小時 ’再於減壓下濃縮。油與乙酸乙酯混合，以水及飽和的氯化 鈉水溶液萃取再濃縮。油以矽膠管柱層析純化，利用己烷/ 異丙醇/三乙胺，可生成22.5克產物。MS (m/Z): [Μ+Η]+=1503。 Ν'Ν3-雙[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-3-{[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-乙基]-(第三-丁氧羰基甲 基）-胺基}-丙醯胺]-Ν2·(芊氧羰基甲基）-二乙撐三胺 节基-2 -溴醋酸醋（2.5 4克）加至先前胺化合物（13.5克）， 乙腈（200毫升）及碳酸鈉（1 · 18克）之溶液中。混合物加溫至_ 6 0 °C，再说拌1 5小時。反應混合物冷卻至室溫並在減壓下 — 濃縮。加入乙酸乙酯及水，分層。有機層以飽和的氯化鈉 水溶液洗滌，再於減壓下濃縮可生成油（14.5克）。MS (m/Z): [M] + =1651。 π,Ν3-雙[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-3-{[2-(雙-第三一 丁氧羰基甲基-胺基）-乙基]-(第三-丁氧羰基甲 基）-胺基卜丙醯胺卜N2-(醋酸）·二乙撐三胺 上述苄基酯（1 4克）在乙酸乙酯/三乙胺（49 : 1)中以5〇 psi --氫化16.0小時，並有10% Pd/C (3.5克.)之存在。生成的混合 ___· 88 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（84 ) 物經由Celite®過濾，並於真空下濃縮以生成12.08克的油。 MS (m/Z): [M + H]+=1561。 合成纖維# 4

H2N NH，

Boc-ON

BocHN

.NH NHBoc

bb(CO)DTPE-HN

BocHN n NHBoc h2N， f ，NH2

TFA bb(CO)DTPE 偶合

bb(CO)DTPE-HN

kN NH-bb(CO)DTPE

NH-bb(CO)DTPE

H2/Pd-C N、N3-雙-丁氧羰基-二乙撐三胺 對二乙撐三胺（2.12克，20.6毫莫耳）及三乙胺（30.0克， 41.3毫莫耳）於THF (100毫升）之溶液，在室溫下加入8〇〇 ON (10.65克，43.3毫莫耳）。混合物攪拌一夜。在混合物中 加入700毫升乙酸，再以_酸鹽緩衝溶液（pH = 3，100毫莫耳） 萃取。水典溶液鹼化至pH=l 1，再以二氯甲烷萃取。有機 層分出，在無水硫酸鈉上乾燥。鹽過;慮，溶劑移去（減壓 下），可生成所示之化合物呈無色油（5.55克）。MS (m/Z): [M + H] + = 304.1。 -89 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（85 ) Ν!，Ν3-雙-丁氧羰基-N2-(苄氧羰基乙基）-二乙撐三胺 對上化合物（1.0克，3.30毫莫耳）於甲醇（40毫升）之溶液 ，在室溫下加入丙烯酸芊酯（1.07克，6.59毫莫耳）。混合物 迴流3天。溶劑在減壓下移去，可生成黃色液體，其含有 所示化合物及丙烯酸苄酯。MS (m/Z)·· [Μ+Η]+=466·1。 NM芊氧羰基乙基）-二乙撐三胺 對上化合物及丙晞酸苄酯（1 ·0克）於二氯甲烷（2 5毫升）之 混合物，在室溫下加入T F A (13 · 8毫升）。混合物在室溫下 攪拌3小時，再於混合物中加入IN HC1及水。分出水層並 冷凍乾燥以生成所示化合物（420毫克）呈稠厚固體。MS [m/Z]: [Μ + Η]+=266·2。 雙[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-3-{[2-(雙-第三-丁氧談基甲基-胺基）-乙基]-(第三-丁氧窥基甲 基）-胺基}-丙醯胺]-N2-(芊氧羰基乙基）-二乙撐三胺 對上述化合物，”合成纖維3 n，HOBt及二異丙基乙胺， 於C Η2 C12及D M F之溶液中，加入D I C。混合物在室溫下才覺 摔4 8小時。混合物以二氯甲烷及水稀釋，再攪拌1 5分鐘 。分層，且有機層以飽和的碳酸鈉，飽和的氯化鈉，洗滌 ，再於硫酸鈉上乾燥。混合物過滤，且滤液於真空下濃縮 以得油狀物。油經由石夕膠層析純化，利用乙酸乙g旨及己虎 可得所示it合物。 雙[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基-胺基）-3-丨[2-(雙-第三-丁氧羰基甲基·胺基）-乙基]-(第三-丁氧羰基甲 基）-胺基卜丙醯胺卜N2-(丙酸）-二乙撐三胺 ___- 90 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

裝 訂

線 1240632 A7 B7 五、發明説明（86 ) 氫化容器中裝入上述化合物，10% Pd/C，乙酸乙酯及三 乙胺。容器中裝入氮再來是氫。混合物在氫大氣下（50 psi) 震盪2 4小時。容器中充入氮且混合物經由Celite®過濾，且 濾液在減壓下濃縮可生成呈油狀之產物。 合成纖維# 5之合成 ^co2m Βγ Βγ ΒπΝΗ2 C02Me 1.4Μ HCI, ^ I dioxane

1.Boc20,2. LiOH

BnNH NHBn 2. H2/PdyC NH2 NH2 3. BnBr, 4. HCI Λ Br ^CO^Bn C〇2Bn

fiuQzCX HKI^ ^C02tBu NH2NH2 h C02tBu〇2tBUC02tBu 、N、厂 C02tBu b〇2tBul

H2/Pd/C C02H ftBuQzC tBu〇2C ©υ〇2〇 D C〇2tBu广 Nl厂 c〇2tBu 3 -(芊胺基）-2-((苄胺基）甲基）-丙酸甲酯 2-(溴甲基）-丙缔酸甲酯（1.00克，5·6毫莫耳，1·〇當量） 溶於乙腈（2 0毫升），並在室溫下逐滴於搅拌下加至芊胺 -91 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 ___ B7 五、發明説明（87 ) (1.83毫升，16.8毫莫耳，1·5當量）於無水乙腈（10毫升）之 溶液。1 6小時後’加入乙醚（1 〇〇毫升），且白色固體（芊胺 氫溴化物）過濾。濾液在減壓下濃縮可生成1.90克粗製油。 油溶於乙酸乙酯（150毫升），再以η2〇及鹽水洗滌。有機層 乾燥（MgSCU)，並在減壓下蒸發。生成之澄清油以快速層析 純化（己烷：乙酸乙酯）可生成1.38克（79%)產物。旧NMR (300 MHz, CDCh)： δ 1.68 (s, 2Η), 2.79-2.90 (m, 5H), 3.68 (s, 3H), 3·75 (s，3H)，7.21-7.32 (m，10H)。 3 -(胺基）-2-(胺甲基）-丙酸甲酯 3-(苄胺基）-2-((芊胺基）甲基）-丙酸甲酯（2.27克，7.3毫 莫耳，1·〇當量）溶於二氯甲烷（20毫升），再加入4·0毫升 4Μ HC1於二吟烷之溶液。溶液在室溫下攪拌2 〇分鐘，溶劑 再於減壓下蒸發以生成白色粉末，其可溶於5 0毫升MeOH 。在0 °C及氬下加入催化劑（1 〇% Pd/C催化劑7 5 0毫克），且 混合物在45 psi H2下震盪1 8小時，再經由Celite®過濾。將 MeOH減壓下蒸發後，可分離出產物（丨.47克）。β NMR (300 MHz，D20): 3.25-3.43 (m, 5Η)，3.82 (s，3Η)。 3 - ( BOC-胺基）-2-( B〇C-胺甲基）-丙酸甲酯 二胺（1.44克）與二碳酸二-第三-丁酯（3.22克，14.8毫莫耳 ，1·〇5當量）在二哼烷/Na2C〇3水溶液中，於0°C下反應1小 時’再於^室溫下1 8小時。混合物再以0.5N KHSCU酸化 (pH=4)，二口咢烷於減壓下蒸發。水性部份以乙酸乙酯萃取 ’在MgSQ4上乾燥及減壓濃縮可生成粗製油，其以快速層 析純化（己烷：乙酸乙酯）可生成1.86克（8 0 % )欲求產物。 ___- 92 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7 B7 五、發明説明（88 ) NMR (300 MHz, CDCh): δ 1.41 (s, 18H), 2.66-2.78 (m, 1H), 3.10-3.27 (m, 2H), 3.50-3.62 (m, 2H), 3.68 (s, 3H), 5.17-5.27 (bt, 2H)。 3-(B〇C-胺基）-2-(B〇C-胺甲基）-丙酸 甲酯（1.50克）溶於15毫升之THF/H20 2 : 1混合物中。在〇°c 下加入LiOH · H2O (0·95克）。混合物在〇 °C及室溫下攪拌4 4 小時。T H F在減壓下蒸發且水溶液以EtOAc萃取。水層以 0.5M KHS〇4水溶液酸化（pH = 3)，並以EtOAc萃取。混合的 有機流份以3 0毫升洗滌，再乾燥（MgSCU)。溶劑在減 壓下蒸發生成l·3 2克（92%)產物。1HNMR(3 00 MHz，CDCl3): δ 1.40 (s，18H)，2.66 (s，1H)，3.27-3.47 (m，4H)，5.42 (s，1H)。 3-( BOC-胺基）-2-( B〇C-胺甲基）-丙酸芊酯 酸（1 .〇 1克）在室溫下與芊基溴（0.45毫升）在含有Cs2C03 (2.07克）之無水D M F中反應。D M F在減壓下蒸發，殘留物 於Η2Ο及Et〇Ac間分配。有機層以鹽水洗條，乾燥（MgS〇4) 。溶劑在減壓下蒸發，且殘留物以矽膠上快速層析純化（己 烷/EtOAc 95 : 5 至9 : 1 至 85 : 15)。產率 1.16 克（90%)。Μ NMR (300 MHz，CDCh): δ 1.42 (s，18Η)，2.79(五峰，1Η，5·6 Hz), 3.1-3.3 (m, 2H), 3.5-3.65 (m, 2H), 5.13 (s, 2H)? 5.15-5·28 (m，1H)，7.30-7.40 (m，5H)。MS: 431.15 (M+l)。 3 一-胺基-2 -胺甲基-丙酸芊酯二氫氯化物鹽 3-(B〇C-胺基）-2-(B0C-胺甲基）-丙酸芊酉旨（1.15克）溶於5 毫升4M HC1於二吟烷之溶液中。混合物在0 °C下攪拌6小時 ，二哼烷再於減壓下蒸發。殘留物以乙醚研磨。並過濾生 __________________ - 93 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（89 ) 成未純化之二胺二氫氯化物鹽（〇.81克）1H NMR (300 MHz， MeOD): δ 3.1-3.3 (m，5H + CHD2OD)，3.55 (s,二哼烷），5.19 (s， 2H)，5.15-5.28 (m，1H)，7.20-7.40 (m, 5H)。MS: 209.00 (M+l) o

3-(N-bb(CO)DTPE羧醯胺）-2-(N-bb(CO)DTPE 羧醯胺）甲基-丙酸苄酯 酸（2.00克，2·8毫莫耳，1.5當量）溶於5毫升無水二氣甲 燒中。二胺（0.26克），HOAt (0.32克）及二異丙基乙胺（0.65 毫升）在0 °C下與HATU (0.88克）反應2小時。（Tris)胺樹脂 (0.5克），異氰酸鹽樹脂（〇·5克）及HATU (0.42克）加入，且 反應混合物在室溫下攪拌1 6小時。濾出樹脂’濾液蒸發。 殘留物分配於H2O及EtOAc之間。有機層以H2〇 ’飽和的 NaHCCh及鹽水（2〇毫升）洗滌，並乾燥（MSS〇4)。溶劑在減 壓下蒸發。油以石夕膠快速層析純化（己燒/丙酮/ EhN)可生 成產物（1.13 克）。MS: 1607.95 (M+1)及 1629.95 (M+Na)。 3-(N-bb(CO)DTPE羧醯胺）-2-(N-bb(CO)DTPE 羧醯胺）甲基丙酸 节酯（0.90克，〇·56毫莫耳）溶於30毫升EtOAc中’並加入 Et3N (1毫升）。加入1〇% Pd/C催化劑（0·50克）’且混合物在 45 psi氫下震盪1 5小時。催化劑濾出’且溶劑蒸發可生成 產物（0.82 克）。MS: 759.55 (M + 2H/2) -94 - ΐ紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7

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肽之構築：3.39克U-雙-(胺甲基卜苯三苯甲基N〇vaSyn TGT樹脂（測知之取代作用=〇·59毫莫耳）置於標準的肽管柱 中，並填加至肽合成儀中。利用標準的Fm〇c策略進行合成 。在利用醋酐，6 %二異丙基乙胺/DMF偶合第一胺基酸後 進行偶合。當合成完全後，自管柱中移去樹脂，再置於反 應容器中。樹脂以CHaCh潤洗一次再過濾。樹脂以i %三氟 醋酸/CHiCh處理，再置機械震盪器上丨〇分鐘。混合物經 由反應谷咨過濾’再收集濾液。混合的濾液以三乙胺調整 p Η值至8，溶液在真空下濃縮成油。以水沈澱後，收集白 色固體並以水及二乙醚潤洗。固體以吸空過濾乾燥，以 D M F吸收再以乙腈稀釋。反應冷卻在冰浴中，並以1 · $克 三氟醋酸鉈處理2.0小時。溶液之ρ η值以三乙胺調至pH 8 ’再於真空下濃縮。加水至油中，以吸空過濾收集所生成 之沈澱物。固體以水及二乙醚洗滌，可生成2.7克粗製的肽 產物。H2N-Leu-Pro-Cys-Asp-Tyr-Tyr-Gly-Thr-Cys-Bip-ASP-CO-NHCH2C6H4CH2NH2之分析由所觀察的 m/Z 1792.8 [M+Na] +證實。固體以製備式HPLC純化。混合類似純度之 流份（98-100%)並冷凍乾燥但勿需中和。 肽（3.2克）及合成纖維#2 (上述）（3.95克）溶於二氯甲烷。 逐滴加入二異丙基乙胺直到ρ Η值為9，再同時加二異丙基 碳化二亞胺（2當量）及HOBt (2當量）至混合物中。攪拌2分 鐘後，逐滴加入二異丙基乙胺直到ρ Η值為9。混合物在室溫 下攪拌2小時。一次加入額外預-活化之合成纖維# 2 (有二 異丙基碳化二亞胺，二異丙基乙胺及HOBt)。溶劑於真空 -97 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 1240632 A7

中移去，且殘留物溶於乙酸乙酯，其再依序以〇· 1 n鹽酸， 飽和的碳酸氫鈉及飽和的氯化鈉水溶液洗滌。有機層在硫 酸鈉上乾燥，過濾，減壓濃縮以得淺黃色泡沫（7·8克）。泡 沫溶於二氯甲烷，再以快速層析純化（二氣甲烷：甲醇溶 離液）可生成白色固體（5.6克）。白色固體TF Α ,水及三乙 基矽烷之混合物中攪拌（9〇%/5%/5%，3 〇毫升）於室溫下。 混合物加熱至4 0 C，再攪拌2小時。溶液濃縮至體積3 - 5毫 升，再冷卻至室溫。加入二乙醚且可形成白色沈澱物。混 合物攪拌1 0分鐘，且固體粒子以過濾收集，再以二乙醚洗 務。固體粒子在真空下乾燥可生成白色固體（4〇克）。固體 溶於水：乙腈（2 0毫升，4 : 1比例）之混合物中，並以prep HPLC純化生成白色固體，肆（DTPA)配體（16克）。 肆（DTPA)配體（1克）與i當量GdCl3 · 6H20在蒸餾過之去 離子水中反應，p Η值以1 M NaOH調至約6。釓複合物以逆 相層析純化（Waters Sep-Pak® C-18)利用蒸餾過之去離子水 及50 : 50 (v : v)甲醇：水為溶離劑。混合適合的流份，再 於減壓及5 0 °C下移去甲醇，並冷凍乾燥以生成8 1 1毫克的 對比劑。 和上示3 2之合成不同的，肽可如以下流程所說明的在樹 脂上環化： _____- 98 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐）

裝

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以類似方式製備之M R I對比劑 以類似上述方法合成下列各M RI對比劑。利用標準Fm〇c 策各豉備及利用二氟醋酸銳環化之肽，以HP純化，再與 合成纖維#2，二異丙基乙胺，二異丙基碳化二亞胺（2當量） 及HOBt (2當量）在二氯甲烷中反應。溶劑於真空下移去， 殘留物溶於乙酸乙酯，其再以〇.丨N鹽酸，飽和的碳酸氫鈉 及飽和的氯化鈉水溶液依序洗滌。有機層在硫酸鈉上乾燥 ，過濾及減壓濃縮以得泡沫狀物，若必要時可在快速層析 或HPLC上純化。生成之白色固體在1^八，水及三乙基矽烷 (90%/5%/5%，3 0毫升）之混合物中於室溫下攪拌2 - 6小時。 加入二乙鍵’且有白色沈澱物形成，其以prep Hplc純化 (CH3CN/H20/Ac0NH4)可生成白色固體，肆（DTPA)配體。 肆（DTPA)配體與1當量QdCh · 6H2〇在去離子水中（pH 6， NaOH)反應。利用逆相層析，在waters Sep-Pak® C-18匣上 純化釓螯合物，以水及甲醇：水（5 0 ·· 5 0 )為溶離劑。混合 適合的流份，且甲醇在5 0 t減壓下移去，經冷凍乾燥可生 成欲求之對比劑。 表4 血纖維蛋白-結合化合物之M S數據 化合物 分子量 MS (M+3H)3+/3 估計值 實測值 4 4016.884 1256.49467 1255.66 5 4025.96 1259.52 1259.9 6 4108.014 1286.87133 1284.53 7 4307.336 1353.312 1369.34 _____- 100 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（96 ) 8 4076.064 1276.22133 1298.48 9 4233.208 1328.60267 1327.94 10 4221.199 1324.59967 1324.57 11 4142.146 1298.24867 1321.13 12 4123.378 1291.99267 1289.80 13 4325.675 1359.425 1 333.3 14 4470.833 1407.8 1 1 1407.44 15 4363.362 1371.98733 1393.99 16 45 1 1.483 1421.361 1444.57 17 4169.128 1307.24267 1329.85 18 4503.826 1418.80867 1419.25 19 4387.428 1380.00933 1379.12 20 4305.369 1352.65633 1351.6 21 . 4419.473 1390.691 1390.53 22 4277.356 1343.31867 1341.04 23 _ 4357.829 1370.143 1370.63 24 4443.644 1398.748 1398.9 25 4448.209 1400.26967 1400.1 1 26 4326.73 1 1359.777 1359.9 27 4423.505 1392.035 1392.79 28 4343.375 1 365.325 1364.7 29 4342.387 1364.99567 1364.7 30 43 13.366 1 355.322 1354.9 3 1 4342.387 1364.99567 1364.8 32 43 19.303 1357.301 1357.6 ___- 101 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(21〇x 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（98 )

全者5 -羧基四甲某若丹明之化厶餉η M 肽1 (177¾克，〇·ι〇毫莫耳）及％竣基四甲基若丹明玻雖 醯亞胺基酯A (ill毫克，〇·21毫莫耳）溶於二氯甲烷（2〇毫 升）及DMF (2 0毫升）。逐滴加入二異丙基乙胺直到ρ Η值為 9。混合物攪拌一夜，再於減壓下移去溶劑。殘留物以矽 膠快速管柱層析純化（溶離劑··二氯甲烷/甲醇）可生成化合 物2 Α。 在化合物2 A中加入TFA，出0及三乙基矽烷溶液（比例·· 90/5/5，5毫升）。混合物在室溫下震盪3小時，反應混合物 溶液再倒入5 0毫升乙醚中以沈澱出粗製產物。一旦溶劑自 離心中分出後，可收集粗製產物，再利用逆相HpLC純化可 得到化合物3 A。 含有5 -幾基螢光素之化合物（3B) 以類似3 A之合成步驟，3 B可利用肽1 (177毫克，〇1〇毫 莫耳）及5 -羧基螢光素琥珀醯亞胺基酯b (99·4毫克，〇·2 ΐ毫 莫耳）合成' 含有德州紅-X (Texas Red®)之化厶你 以類似3 A之合成步驟，3 C可利用肽1 (丨77毫克，〇· 1〇毫 莫耳）及Texas Red®-X琥珀醯亞胺基酯c (172毫克，〇 21毫 莫耳）合成。 偵測對比劑與標靶之結合 本發明對比劑與標靶，如HSA或血纖維蛋白，之結合程 度可以各隹平衡結合方法評估。例如，H s A之結合可利用 超過濾、偵測。在利用超過濾之典型結合偵測中，對比劑與

1240632 A7 B7 五、發明説明（99 ) 4.5% w/v HSA混合在pH 7.4緩衝溶液中。樣品項加至商品 化之離心裝置内’其内配備有截去值3 0 fC D a分子量之滤膜 (Millipore Ultrafree MC Low Binding Regenerated Cellulose 30 KDa mol· wt. cutoff catalog # UFC3LTK00)，對標乾基是 可通透的，但H S A則否。經由截去濾膜在2000 x g下離心 2 0分鐘可濾去少量（5 - 1 0 % )樣品體積，且未結合標乾基在 樣品中之濃度可於濾、液中測及。 為偵測與血纖維蛋白之結合，可在微滴定盤的一個孔洞 中形成血纖維蛋白凝塊，並與標靶基接觸。在足以發展成 平衡之培育時間後’以吸取方式移出上清液（不溶的血纖 維蛋白仍以呈凝膠狀之凝塊方式結合至孔洞底部）。再測 出在上清液中未結合標革巴基之濃度。 在二種方法中，經決定知經結合對比劑之濃度是最初存 在之tir fe基;辰度總和及結合分析後未結合標乾基濃度間之 差兴。經結合邵份是經結合標靶基之濃度除以總標靶基濃 度。在樂物及標把之生理上相關濃度下，結合至欲求標的 之對比劑較好至少10%，較好至少50%，又較好至少80〇/〇 ，更好至少9 0 %。依據超過濾或微滴定盤方法，結合至標 靶之對比劑較好至少92%，又較好至少94%，且更好至少 9 6 %以上。 決定弛緩度之方法 本發明MRI對比劑弛緩度之評估，係利用BrukeΓNMS_ 120 Minispec NMR分光計，在〇·47特斯拉（2〇 mHz 拉莫 (Larm〇r)頻率）及37t下操作，或在K〇nig_Br〇wn弛緩計（2〇 ___~ 104 ·__ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210X297公爱）—---- 1240632 A7 _ B7 五、發明説明（100 ) MHz，H-1 Larmor(拉莫）頻率）於3 5 °C下操作。水中質子之 丁 1值，利用儀器所附軟體’以反轉恢復脈衝序列來決定。 弛緩度之決定，係在分別含有〇，2 0，3 0及40 μΜ Gd(IIl) 之多重標靶溶液（如新鮮聚合化之血纖維蛋白原之均勻分 散凝膠，1 0毫克/毫升）中測其T 1值。樣品先在3 7 t下至 少培育1 5分鐘，以確保偵測τ 1值前溫度先平衡。樣品中 Gd(III)含量之決定係誘導地結合血漿·質譜（icp-MS)而進行 。弛緩速率（1/T1)(以秒計）對Gd(III)濃度（mM計）作圖，可 決定弛緩度（每Gd(III)離子計）。由符合數據直線之斜率可 求出弛緩度。化合物之弛緩度也可以類似方式，但在無標 靶下決定而得。 在有或無黑血下，以標靶對比劑 取得血栓M R影像 2.5公斤重之雌性紐西蘭白兔，以氯胺酮（Ketarnine)(5〇毫 克/公斤）’艾西丙ρ井（Aceapromazine)(2.5毫克/公斤）及若龐 (Rompon)(I毫克/公斤）之摻和液麻醉，再以戊巴比妥鈉（約 3 5毫克/公斤，依所需）維持之。靜脈内導管（2 4克）放入耳 靜脈及耳動脈内。分出頸靜脈以及頸動脈。取1 8號針放在 血管上’以3 - 0縫線縫合定位，可在頸動脈處造成狹窄。 再移出針，以顯微血管夾在狹窄處遠端切出5毫米動脈段 片’動脈再沿5毫米段壓解二次。鬆開近處血管夾，令血 液流至段片内約3秒。再夾上爽子，動脈再沿5毫米段壓碎 二次。4分鐘後移開夾子，以顯微血管夾分出5毫米頸靜脈 片。注入1 〇〇微升3.7單位凝血酶，〇.〇6 M CaCl2，及兔子 g張尺度適用中國國家標準(CNS) 297公^· 1240632 A7 B7 五、發明説明（1〇1 ) 全血之混合物可生成血栓。4分鐘後移開夾子。 令血栓熟化約50分鐘。經耳靜脈移入ι.〇毫升血栓標靶 劑溶液（結構III，5 mM，2微莫耳/公斤）。1 〇分鐘後，動物 置 General Electric Signa LxCVi 1.5 高壓掃描器内，利用 3D RF擾相梯度回波序列（SPGR: TR=39毫秒，TEyj毫秒，轉 置角度=40°，視野=8公分，採樣波寬度=31·25 kH)可得第 一組M RI數據。應用化學脂質飽和性以及4 〇毫米空間上方 及下方飽和帶以生成π黑血（black blood)"影像。 圖4 A示出第一組數據之最大強度投影（Mip)。血管自逃 走作用時間處被邵份加強。圖4 B示出第二組]vil P數據，其 中利用上方及下方飽和帶以遏止流動中血液所帶來之訊號 (黑血）。於圖4 A及4 B中，經由使用對準標靶之對比劑， 穩態標把（血栓）之鑑定可清楚地有助益。 光學對比劑之合成

NovaSyn TGR樹脂（0.20毫莫耳/克，1〇〇毫克，20微莫耳） 以NMP /乙-醚/ NMP洗滌。肽以標準固相方法組合，利用二 PyBOP/HOBt/DIEA活化作用。第一個胺基酸殘基偶合後，與 樹脂結合之肽以哌啶/ DMF溶液處理（2 0 %按體積計，2.0毫 升），10分鐘後移去Fmoc保護基。樹脂以NMP/乙醚/NMR充 份洗滌，並以溶於DMF (1·5毫升）之螢光-5-異硫氰酸鹽（23.4 毫克，60微莫耳）及二異丙基乙胺（η.6毫克，15.7微升，90微 莫耳），於DMF (1.5毫升）溶液處理1 2個小時，該樹脂並徹 底洗滌（ΝΜΡ/醚/ΝΜΡ)再以T1(TFA)3 (18.7毫克，34·5微莫耳） 於DMF (1:5毫升）之溶液在4 °C下處理3小時。經過此處理後 樹脂洗滌，再以TFA/TIS/水（95/2.5/2.5，2.0毫升）之摻和液 _ - 106 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（102 ) 處理2小時。粗製的肽加醚至解離摻和物中以沈澱，再以 製備式HPLC利用Vydac CM8管柱純化。以此方式可形成結 構A - K，並決定其血纖維蛋白DD(E)片段親和力（表5 )。

-107 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 1240632

本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐) ；· 裝 訂

線 1240632 A7 B7 104 五、發明説明（ 表5 光學標靶之對比劑對血纖維蛋白之親和力 TD Κά(μΜ)

Vs. DD(E) Fluor X]_X^X3 X4 X. X, χ7 X, X9 XioXtiX^j^

D 0.061 Fluor Ahx W F H ;Hyp Y(3-I) D L C H I ^ J 0.055 Fluor Q w E C P Y G L C w I Q K 0.06 Fluor w F H C P Y D L H I L E 0.09 Fluor Ahx G G F H C Hyp Y(3-I) D L C Hi C 0.097 Fluor Ahx G F H c Hyp Y(3-I) D L C H I B 0.099 Fluor Ahx F H C Hyp Y(3-I) D L C H I Η 0.119 Fluor K W F H C Hyp Y(3-I) D L C H I G 0.124 Fluor K G F H c Hyp Y(3-I) D L C H I I 0.127 Fluor K G G F H C Hyp Y(3-I) D L C hi A 0.136 Fluor beta-A F H Hyp Υ(3·Ι) D L H I F 0.212 Fluor K F H 1:1 Hyp Y(3-I) D L C H I

Tn6肽之N -末端以光學探針標記可調控光學對比劑之結 合親和力。例如，當比較肽（QWECPYGLCWIQ ; Kd=3 μΜ) <勞光素，4 -甲氧基香豆素及四甲基若丹明衍生物，可觀 察到以下Kd’s : 化合物 發螢光團 Kd EP1061 螢光素 0.06 CS797 四甲基若丹明 2.0 CS796 4 -甲氧基香豆素 0.2 聯合血栓溶解劑之治療應用方法 本發明之組合物可與已知方式連接或融合，就構築m ri 對比劑而言使用上文討論之相同連接子型式。所生成之經 連接的組合物可以輸液或快速濃注方式投藥。在—個較佳

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具體實例中’組合物可依例常步 〗吊少馼凋和成藥學組合物以適 合靜脈内投予至人類。典型而今， 土向口 供靜脈内投藥之組合物 為在無菌等滲水性緩衝溶液中之唆 κ 丫又办，夜蜊。必要時，組合物 也可包括助溶劑及局部麻醉劑以舒緩注射部位之疼當 組合物以輸液方式投藥時，可以本有〜_ ' 」以s有慼囷樂用級，，注射用 水’’或食鹽水之輸液瓶調劑。當組合物以注射方式投予時 ，可提供無菌注射用水或食鹽水之安瓿劑，如此在投藥前 可先混合組份。 物演投予之Ϊ依血栓插拴狀況之嚴重程度及血塊之位置 及大小而定。應用之精確劑量及投藥模式可依主治醫師就 狀況而決定。一般而T，組合之組合物/血栓溶解劑共軛 物之劑量依例常單獨使用之血栓溶解劑劑量而定，雖然由 此中所揭示組合物之加入而改進對血纖維蛋白/血塊結合 之親和力將可使標準血栓溶解劑量有所減低。欲在此治療 中使用之特殊血栓溶解劑（依劑量實例及投藥方法）如下： 鏈激酶 1 - 3百萬單位歷3 0分鐘至3小時 乙醯化纖溶酶原鏈激酶 3 0單位；2 - 5分鐘注射 TPA(野生型）50-150毫克；輸注歷6小時以上 二鏈之尿激酶（4 0 - 1 00毫克）；輸注高達6小時 單鏈之尿激酶3-12百萬單位（30-100毫克）輸注高達5小時 雜交之血纖維蛋白溶酶原活化劑及衍生物20_10〇毫克注 射或輸注 血纖維蛋白溶酶原活化劑之突變蜇，10-100毫克；注射 或輸注 ___· 110 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐） 1240632 A7 B7 五、發明説明（觸） 在較佳特色中，本發明此處所述之組合物，以含有酵素 解離位置之連接子連接至血栓溶解劑，如酵素解離位置通 吊由酵素在凝血聯級中解離，如第X a因子，或血纖維蛋白 解離位置等。血栓溶解劑較好不被活化，直到其自本發明 血塊結合組合物中於凝塊位置處被解離，在血塊遠處非欲 求流血事件之危險性可被減至最低。以此方式，相連接之 落解部份黏附至本發明之組合物，可鑑定出血塊並顯影血 塊，並可提供溶解血塊之方法。另外，本發明之組合物可 配合分離劑使用以追蹤一旦確認出血栓後可溶解血塊之狀 況。 其他具體實例 應瞭解雖然本發明已配合其詳細說明加以描述，上述說 明僅用於說明而非限制本發明範圍，其由所附之申請專利 範圍所定義。其他方面，優點及變化均在以下申請專利範 圍之内。 -111 - 衣紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)

Claims (1)

1. 申請專利 «-fu

   丨公告本 1 · 一種經純化肽，其含有胺基酸序列·· ρ、γ*_χ广L* (seq IDN0:1)，其中： P*是脯胺酸或其非天然衍生物4 _羥基脯胺酸； Y*是酪胺酸或其非天然衍生物，其係在3位置經一個 ^自由F，C 1，B r，I或N 0 2所組成之群組之部分所取 代； 其限制條件為該P *或γ *至少一者是個別胺基酸之該 非天然衍生物； Χι*是G或G之非天然衍生物，其係選自由環己基甘胺 酸、埽丙基甘胺酸、2 -二氫茚基甘胺酸、第三丁基甘 胺酸、N-(4-苯基丁基）甘胺酸、N-癸基甘胺酸、苯基 甘胺、決丙基甘胺酸及甘胺酸之d異構物所組成之群 組；或D或其非天然衍生物，其係選自由^ _連接天冬 胺酸（b D )，N -甲基天冬胺酸及天冬胺酸之d異構物所 組成之群組及； L疋白胺或其非天然的衍生物，其係選自由n -甲 基白胺酸、正白胺酸、叔白胺酸及白胺酸之d異構物 所組成之群組。 2·根據申請專利範圍第1項之經純化肽，其中*是〇或D 且其中L*是白胺酸。 3_ —種經純化肽，其含有以下胺基酸序列： Xi-X2-C-P*-Y*-X3-L-C-X4-X5-X6 (SEQ ID N0:2)，其中： P*是脯胺酸或其非天然衍生物4 -羥基脯胺酸； Y*是酪胺酸或其非天然衍生物，其係在3位置經_個 衣紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) A B c D 1240632 六、申請專利範圍 選自由F，C 1，B r，I或N 0 2所組成之群組之部分所取 代； 其限制條件為該P *或Y *至少一者是個別胺基酸之該 非天然衍生物； Χι選自下列包括：W，Y，F，S，Bip，Hx，Dpr，Cy， Gu，Ad，Hfe，3-Pal，4-Pal，DopaMe2，nTyr，dW，dF ，F(3/4*)及Y(3*)，其中F(3/4*)是苯丙胺酸在3或4位置 上為選自下列之部份所取代，包括：CH3，CF3，NH2 ，CH2NH2，CN，F，Cl，Br，I，Et 及 OMe，且其中 Y(3*)是酪胺酸在3位置上為選自下列之部份所取代， 包括·· F，C卜 Br，I及N〇2 ; X2選自下列包括：E，Η，dE，S，H(Bzl)，2-Pal，Dpr 及Th ; X3選自下列包括G及D ; X4選自下列包括Η，F，Y及W ; X5選自下列包括 I，L，V，N，Bpa，Bal，Hfe，Nle， Tie，Nval ’ Phg，Cha，Taz，Fua，Th，4-Pal 及F(3/4*) ’其中F(3/4*)是苯丙胺酸在3或4位置上為選自下列之 部份所取代，包括：CF3，Et，iPr及OMe ;及 X6選自下列包括N，Q，I，L及V，或X6不存在。 4. 根據申請專利範圍第3項之經純化肽，其係進一步可在 非還原條件下形成二硫化物鍵。 5. 根據申請專利範圍第4項之經純化肽，肽中含有雙硫键。 6·根據申請專利範圍第5項之經純化肽，此肽對血纖維蛋 -2 - 本紙財關家標準(CNS) Α4規格(210 X 297公釐) 1240632 A8 B8 C8 -— —_______D8________ 一 六、申請專利範圍 白具有特異的結合親和力。 7· —種經純化肽，其含有胺基酸序列：p^Y^XrL (SEQ ID ΝΟ:1)，其中： Χι是G或D， p*是脯胺酸或其非天然衍生物4 -羥基脯胺酸； Y*是酪胺酸或在3位置為選自下列之部份所取代之非 天然衍生物，包括：F，Cl，Br，I及N〇2 ; 限制條件為P*或Y*至少一者是個別胺基酸之非天然衍 生物。 8_ —種經純化肽，其含有胺基酸序列：c-P^Y^Xj-L-C (SEQ ID NO:3)，其中： Χι是G或D， p*是脯胺酸或其非天然衍生物4 -羥基脯胺酸； 是酪胺酸或酪胺酸在3位置為選自下列之部份所取 代之非天然衍生物，包括：F，Cl，Br，I及N〇2 ;且 限制條件為P*或Y*至少一者是個別胺基酸之非天然衍 生物。 9.根據申請專利範圍第8項之經純化的肽，其中肽在非還 原條件下可進一步形成雙硫键。 10·根據申請專利範圍第9項之經純化的肽，其中肽含有雙 硫鍵。 u•根據申請專利範圍第1 〇項之經純化的肽，其中肽對血 纖維蛋白具有特異的結合親和力。 12.根據申請專利範圍第3項之經純化肽，其中含有的胺基 一. -3 - 本紙^5^國公釐_) 1240632 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 酸序列選自下列包括： W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:4) Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:5) Y-dE-C-P(4-OH)>Y(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:6) W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-G-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:7) W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:8) Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:9) Y-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:10) W-dE-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-Y-I-Q (SEQ ID NO:ll) F(4-OMe)-H-C-P(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID NO: 12) Y-H-C-P(4-0H)-Y(3-C1)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:13) W-dE-C-P(3-Cl)-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:14) W-dE-C-P(4-OH)-Y-G-L-C-W-I-Q (SEQ ID NO:15)，及 F-H-C-P-(4-OH)-Y(3-Cl)-D-L-C-H-I-L (SEQ ID NO:16)。 13. 根據申請專利範圍第1 2項之經純化肽，其中此肽在非 還原條件下可形成雙硫键。 14. 根據申請專利範圍第1 3項之經純化肽，其中此肽含有 雙硫键。 15. 根據申請專利範圍第1 4項之經純化肽，其中此肽與血 纖維蛋白具有特異的結合親和力。 16. —種經純化肽，其含有胺基 C-X4-X5-X6 (SEQ ID N〇:2)，其中： Χι 選自下列包括 w，Y，F，S，Bip，Hx，Dpr，Cy，Gu ，Ad，Hfe，3-Pal，4-Pal，DopaMe2，nTyr，dW，dF， -4 - 本武浪尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐)

   ♦裝 % 1240632 A8 B8 C8 〜-----08 __ 六、申請專利範圍 F(3/4*)及Y(3*)，其中F3/4*是苯丙胺酸在3或4位置上 為選自下列之部份所取代，包括：CH3，CF3，ΝΗ2， CH2NH2，CN，F，Cl，Br，I，Et及〇Me，且其中 Υ3*是 酪胺酸在3位置上為選自下列之部份所取代，包括： F，Cn，Br，I 及N02 ; X2選自下列包括 dE，H(Bzl)，2-Pal，Dpr及Th ; X3選自下列包括G及D ; X4選自下列包括Η，F，Y及W ; X5選自下列包括 I，L，V，N，Bpa，Ba卜 Hfe，Nle， Tie ，nVal ，Phg ，Cha ，Taz ，Fua ，Th，4-Pal及F(3/4*) ，其中F3/4*是苯丙胺酸在3或4位置上為選自下列的 部份所取代’包括：CF3，Et，iPr及Ome ;其中Xi，χ2 或X5至少一者是非天然的胺基酸衍生物；且 X6選自下列包括N，Q，I，L及V，或X6不存在。 17·根據申請專利範圍第1 6項之經純化肽，此肽在非還原 條件下可形成雙硫鍵。 18.根據申請專利範圍第1 7項之經純化肽，其中此肽含有 雙硫鍵。 19·根據申請專利範圍第1 8項之經純化肽，其中此肽對血 纖維蛋白具有特異的結合親和力。 2〇·—種經純化肽，其含有胺基酸序列：c-mG-T_c_ X10 (SEQ ID ΝΟ··17)，其中： Χίο選自下列包括 η(癸基）G，n(4-PhBu)G，MeL，Bpa， Bip，Me-Bip，F(4*)，F(3-Me)，F(3,4-二氟），Amh， __ _ 5 - 本紙張尺度it用巾_家鮮(CNS) M規格⑻」χ挪公费)

   η % 1240632 ABCD 六、申請專利範圍 Hfe，Υ(3,5-二-碘），pff，iNal，dlNal 及 MeL，其中 F(4*)是苯丙胺酸在4位置上為選自下列之部份所取代 ，包括 Et，CF3，I及iPr。 21·根據申請專利範圍第2 〇項之經純化的肽，其中含有胺 基酸序列：C-D-Y-Y-G-T-C-XwXu (SEQ ID N〇:18)，其 中： Χιι選自下列包括D，dD，βϋ，Inp，Nip，Me-D，dC， Cop及Cmp。 22·根據申請專利範圍第2 i項之經純化的肽，其具有選自 下列之胺基酸序列： L-P-C-D-Y-Y-G-T.C-n(癸基）G_dD (SEQ ID N0:19) L-P-C-D-Y-Y_G-T_C-n(癸基）G-D (SEQ ID NO:20) L-P-C-D-Y-Y-Q-T-C-Bip-D (SEQ ID NO:21) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-Bip-dC (SEQ ID NO:22) L-P-C-D-Y-Y-Q-T-C-MeL-Inp (SEQ ID NO:23) L-P-C-D-Y-Y-G-T-C-MeL-Cmp (SEQ ID N〇：24)，及 L-P-C-D-Y-Y-Q-T-C-MeBip-D (SEQ ID NO:25) 〇 23·根據申請專利範圍第2 〇或2丨項中之經純化肽，其中此 月太在非還原條件下可進一步形成雙硫鍵。 24.根據申請專利範圍第2 3項之經純化肽，其中此肽含有 雙硫鍵。 25·根據申請專利範圍第24項之經純化肽，其中此肽對血 纖維蛋白具有特異的結合親和力。 - 6 - 廉尺度適用中@國家鮮(CNS) A4規格(2!G x 297公羡)