DE69026685T3

DE69026685T3 - Synthetische Peptide zum Nachweis von Thrombosen

Info

Publication number: DE69026685T3
Application number: DE69026685T
Authority: DE
Inventors: Alan William John 24 Bourton Clos STUTTLE
Original assignee: Antisoma Research Ltd
Current assignee: Antisoma Research Ltd
Priority date: 1989-06-19
Filing date: 1990-06-18
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2010-06-19
Also published as: US5843402A; JPH04505330A; DE69026685D1; ES2087155T3; EP0429626B1; EP0429626A1; GB9103416D0; JP2740794B2; WO1990015818A1; DE69026685T2; ATE137245T1; GB2241243A; US6217846B1; GB2241243B; DK0429626T4; EP0429626B2; DK0429626T3; ES2087155T5; GB8914020D0

Description

Diese Erfindung betrifft die Entwicklung und Verwendung von Peptiden für die Throm benfeststellung bei Menschen und Tieren, primär natürlich aber bei der Feststellung menschlicher Erkrankung. Die hier beschriebenen Peptide sind auch bei der gezielten Ermittlung anderer Stellen in vivo, z. B. von Tumoren, die eine RGD-Bindungsstelle enthalten, brauchbar.
1984 zeigten Pierschbacher und Ruoslahti (Nature, 309, 30-33), daß die Zellbindungsaktivität von Fibronectin durch kleine synthetische Peptidbruchstücke kopiert werden könnte. Die für diese Aktivität verantwortliche Aminosäuresequenz wurde als Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS) gezeigt, und es wurde demonstriert, daß die diese Sequenz enthaltenden synthetischen Peptide in der Lage waren, die Bindung von NRK-Zellen (Zellen aus einer Neuroblastomzellinie) an mit Fibronectin überzogene Substrate zu hemmen. Die mit RGDS enthaltenden Peptiden erhaltene Hemmung wurde als dosisabhängig gezeigt, während Peptide, die die RGDS-Sequenz nicht enthalten, die Zellbindung nicht hemmten. Der Serinrest des Tetrapeptids wurde als nichtessentiell gezeigt, obwohl nur mäßige Substitutionen ausgeführt werden können, um biologische Aktivität zu behalten.
Die RGDS-Sequenz wurde als in Fibrinogen, Fibronectin und dem von Willebrand-Faktor vorkommend gezeigt. Rezeptoren für diese Proteine werden auf der Blutplättchenmembranoberfläche nach Blutplättchenaktivierung exprimiert. Vernetzung von Blutplättchen über diese zytoadhäsiven Proteine ist verantwortlich für die Blutplättchen-Blutplättchen-Wechselbeziehungen in einem Thrombus. Es wurde auch demonstriert, daß RGDS enthaltende synthetische Peptide in der Lage sind, eine Blutplättchenansammlung in vitro zu hemmen, Biochem. 1989, 28, 2909-2914. Dies würde eine spezifische Wechselwirkung mit dem GP IIb/IIIa-Komplex (Glycoprotein-Fibrinogen-Rezeptor) nahelegen, der auf der Blutplättchenmembranoberfläche vorhanden ist und die Fibrinogenbindungsdomänen enthält. Erweiterung der RGDS-Sequenz durch einen Aminosäurerest an der Carboxy- und Aminoendgruppe führt zu einer zehnfachen Verminderung ihrer biologischen Aktivität, obwohl weitere Erweiterung nicht mit einer weiteren Verminderung der Bindungskapazität verbunden ist. Substitution des Serinrestes durch Phenylalanin führt zu einem der Peptidanhäufung entgegenwirkenden Effekt, welcher vier- bis fünfmal stärker als der von RGDS ist. Es gab auch einen Vorschlag, daß der Serin in der RGDS-Sequenz entsprechende Rest einen Grad an Erkennungsspezifität für verschiedene RGDS-Rezeptoren verleihen kann. Dies steigert die Möglichkeit, daß sowohl die Spezifität als auch die Affinität durch Substitution um die RGD-Sequenz herum modifiziert werden könnten. RGD-Bindungsstellen kommen bekannterweise auch auf Zellanhaftungsmolekülen (CAMs) und einigen Tumoren vor.
Die vorliegende Erfindung enthält einen neuen Weg für Thromben- oder Tumorfeststellung in vivo und umfaßt die Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids, umfassend die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD), bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die bildliche Wiedergabe oder Feststellung eines Thrombus oder eines Tumors in vivo durch Binden an RGD-Bindungsstellen auf dem Thrombus oder Tumor in vivo. Bei der Thrombenerfassung ist die Zusammensetzung geeignet für die intravenöse Injektion eines radioaktiv markierten Peptids in den Patienten (wobei dieser Ausdruck hier sowohl Menschen als auch Tiere einschließt, wenn der Kontext nichts anderes erfordert), wobei dieses Peptid darin eine RGD (Arg-Gly-Asp)-haltige Sequenz mit einer spezifischen Bindungsaffinität für den Blutplättchen-GP IIb/IIIa-Komplex hat, und die Feststellung der Gegenwart, wenn vorhanden, der gebundenen Markierung auf dem Thrombus. Derzeitige Methoden zur Thrombenfeststellung unter Verwendung markierter Antikörper erfordern mehrere Stunden infolge der langsamen Diffusionsgeschwindigkeit des Antikörpers durch das System. Eine Verwendung von markierten Peptiden gemäß der vorliegenden Erfindung dürfte eine Thrombenfeststellung in Minuten ermöglichen und so die Diagnose und Behandlung in einer sehr frühen Stufe stark erleichtern.
Geeignete radioaktive Markierungen für die Verwendung im Aufbau radioaktiv markierter Peptide sind etwa Tc^99m, I¹²³ und In¹¹¹ und werden an das Peptid in bekannter Weise gebunden, wie beispielsweise über einen Cystinrest in dem Peptid. Andere geeignete Techniken sind in Science, 220, 613-615, Int. J. Nucl. Med. Biol., 12, 3-8, J. Nucl. Med., 27, 685-693 und J. Nucl. Med. 26, 293-299 beschrieben.
Bezüglich der Forderungen für eine Eignung zur parenteraler Verabreichung und Brauchbarkeit, d. h. bezüglich hoher Affinität und Spezifität für den GP IIb/IIIa-Komplex, wird die genaue Aminosäuresequenz des Peptids in ihrer Zusammensetzung und Länge nicht besonders kritisch sein, obwohl aus praktischen Gründen, z. B. aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und Leichtigkeit der Synthese, relativ kurzkettige Peptide bevorzugt sein werden, die beispielsweise 3 bis 10 Aminosäurereste enthalten.
Geeignete Peptide, die eine RGD-Sequenz, vorzugsweise eine RGDS- oder RGDF-Sequenz enthalten, sind aus verschiedenen Quellen erhältlich oder können ziemlich leicht unter Verwendung herkömmlicher Peptidsyntheseverfahren hergestellt werden, und insbesondere unter Verwendung einer herkömmlichen Peptidsyntheseeinrichtung.
Für Thrombenfeststellung in vivo kann eine parenteral verabreichbare Lösung des radioaktiv markierten Peptids, das eine RGD-Sequenz enthält, und eines parenteral verabreichbaren Trägers verwendet werden.
Vor weiterer detaillierter Beschreibung dieser Erfindung und zur Vermeidung von Zweifeln werden die hier bezeichneten Aminosäuresequenzen entweder durch ihre Abkürzungen mit drei Buchstaben oder ihrer Codes mit einem einzigen Buchstaben folgendermaßen identifiziert:

Arginin = arg. oder R.

Asparaginsäure = asp. oder D.

Glycin = gly. oder G.

Serin = ser. oder S

Tyrosin = tyr. oder Y

Phenylalanin = phe. oder F

Cystein = cys. oder C
Nachfolgend wird auf die beigefügte Figur, welche eine Radiographie ist, die von einem Kaninchen nach intravenöser Verabreichung eines radioaktiv markierten Peptids nach dieser Erfindung aufgenommen wurde und die Lokalisierung des Peptids in einem künstlich im linken Ohr induzierten Thrombus zeigt, Bezug genommen.
Unter Bezugnahme auf die Erfindung in etwas weiteren Einzelheiten wurden Untersuchungen unter Verwendung von vier Peptiden (RGDSY, RGDFY, RGDSYC und RGDSCRGDSY) durchgeführt, um ihre Fähigkeit als thrombenabbildende Mittel zu bewerten.
Die Wirkung dieser Peptide auf durch ADP eingeleitete Blutplättchenanhäufung wurde bestimmt und mit Peptid RGDS verglichen, welches bekannterweise Blutplättchenanhäufung hemmt. Die Ergebnisse (Tabelle 1) demonstrieren, daß alle vier untersuchten Peptide in der Lage sind, Blutplättchenanhäufung bei hohen Konzentrationen zu hemmen, und im Grunde gleich stark wie RGDS sind. Dies legt nahe, daß der Einschluß von Aminosäuren in diese Peptidsequenzen, um Radiomarkierung zu gestatten, nicht ihre Fähigkeit zerstört, Blutplättchen zu binden (eine Voraussetzung für thrombusabbildende Anwendungen).
Die zweite Untersuchung schließt eine Radiomarkierung von RGDSY, RGDFY, RGDSYC und RGDSCRGDSY mit anschließender Analyse ihrer Fähigkeit, aktivierte Blutplättchen in Gesamtblut zu binden, ein. Die Ergebnisse (Tabelle 2) zeigen, daß alle vier Peptide Blutplättchen in ADP-stimuliertem Blut binden können und daß stärkere Einarbeitung in geronnenem Blut erzielt werden kann.
Eine Untersuchung wurde unter Verwendung von RGDSY durchgeführt, das mit dem Radioisotop Jod-123 markiert und einem Kaninchen injiziert wurde, welches einen vorgeformten Thrombus in dem Mikrogefäßsystem des Ohres hatte. Die Abbildungsuntersuchungen, die in der beigefügten Figur gezeigt sind, demonstieren eine rasche Aufnahme an diesem Thrombus (innerhalb von 2 min nach der Injektion), welche für die Zeitdauer der Unterschuchung (20 min) fortdauerte.
Diese Daten demonstrieren, daß die vier untersuchten Peptide in der Lage sind, Blutplättchen zu binden, mit gamma-emittierenden Isotopen radiomarkiert werden können und in Blutplättchenanhäufungen in stimuliertem und geronnenem Blut eingearbeitet werden. Dies liefert eine gute Möglichkeit für Thrombenfeststellung und -diagnose durch diese Peptide in vivo, was in einem experimentellen Tiermodell unter Verwendung eines der Peptide bestätigt wurde. Tabelle 1 Hemmung von durch ADP (1 × 10^–5 M) induzierter Blutplättchenansammlung durch die Peptide RGDS; RGDSY, RGDFY, RGDSYC und RGDSCRGDSY

(Peptid) Prozentuale Hemmung

mM RGDS RGDSY RGDFY RGDSYC RGDSC-RGDSY

0,1 40/37 5/13 32 25 17

0,2 70/65 10/21 55 57

0,4 86/80 43/68 80 79

Tabelle 2 Bindung der radiomarkierten Peptide RGDSY, RGDFY, RGDSYC und RGDSCRGDSY an mit ADP stimuliertes und geronnenes Blut

(Peptid) (gebundenes Peptid) ng

ng RGDSY RGDFY RGDSYC RGDSCRGDSY

mit ADP stimuliertes Blut

1 0,05 0,01 0,03 0,01

10 0,64 1,00 0,94 0,85

100 9,80 4,46 9,85 9,07

geronnenes Blut

1 0,27 0,41 0,18 0,28

10 0,85 2,14 2,26 2,64

100 17,27 18,12 27,08 29,33
Die obigen Ergebnisse demonstrieren die Anwendbarkeit der Erfindung über einen Bereich von Peptiden unterschiedlicher Größen, die alle eine RGD-Sequenz enthalten. Die tatsächliche Länge der Peptide ist nicht kritisch, doch können aus praktischen Gründen die Kettenlängen im Bereich von 3 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise von 4 bis 10 Aminosäuren liegen und, wie bereits angegeben, entweder aus einer RGDS- oder RGDF-Sequenz bestehen oder eine solche umfassen. Viele solche Peptide sind bereits als bekannte Handelsprodukte erhältlich. Wenn nicht verfügbar, können sie leicht durch bekannte Peptidsynthese und/oder unter Verwendung bekannter Peptidsyntheseeinrichtungen synthetisiert werden. Ähnlich können diese Peptide nach bekannten Techniken radioaktiv markiert werden, wie beispielsweise durch Jodierung eines endständigen Tyrosinrestes (Y), der in das Oligopeptid eingearbeitet ist, mit I¹²³
Die detaillierte Herstellung radioaktiv markierten Peptiden nach dieser Erfindung ist durch das folgende Beispiel erläutert.
Beispiel
Herstellung von radioaktiv markierten (I¹²³) Peptiden: RGDSY; RGDFY, RGDSYC und RGDSCRDSY
Jodogenröhren wurden durch Auflösen von Jodogen (1,3,4,6-Tetrachlor-3α,6α-diphenylglycouril) in Chloroform in einer Konzentration von 1 mg·ml^–1 hergestellt. Anteile von 50 μl (50 μg Jodogen) wurden in Polypropylen-Tiefsttemperaturröhren verteilt, und das Chloroform wurde zur Trockene verdampft. Diese Röhren wurden dann bei –20 °C, bis sie gebraucht wurden, entwässert gelagert.
Vor der Radiomarkierung wurden die Peptide in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in einer Konzentration von 50 μg·ml^–1 gelöst. RGDSYC UND RGDSCRGDSY wurden zunächst in einem kleinen Volumen Dimethylsulfoxid (DMSO) aufgelöst, so daß die Endkonzentration an DMSO in PBS 1 Vol./Vol.% war.
Jodogenröhren wurden vor der Zugabe von 200 μl Peptidlösung und 1 bis 10 μl I¹²³ (in wäßriger Lösung) auf Raumtemperatur äquilibriert. Das Reaktionsgemäß ließ man dann 15 min bei Raumtemperatur mit gelegentlichem Schütteln stehen. Nach der Inkubationsperiode wurden das Reaktionsgemisch entfernt und durch eine Sephadex G 10-Säule geschickt, die mit PBS äquilibriert worden war. Die Säule, die radiomarkiertes Peptid von freiem Jod trennt, wurde mit PBS eluiert, und Anteile von 2 ml wurden aufgefangen. Die Radioaktivität in den Anteilen wurde gemessen, und die eluierten Peptide, ausgedrückt durch den ersten radioaktiven Peak aus der Säule, wurden gesammelt und bei 4 °C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Die Brauchbarkeit der radioaktiv markierten Peptide bei Thrombenfeststellung in vivo wird durch das folgende Experiment erläutert.
Experiment
Intravenöse Verabreichung von radioaktiv markiertem (I¹²³) RGDSY an Kaninchen mit Thromben
Ein männliches weißes Neuseeland-Kaninchen (3 kg) wurde durch intramuskuläre Injektion von Hypnorm (0,4 ml·kg^–1) sediert und dann durch intravenöse Injektion von Midazolam (2 mg·kg^–1) anästhesiert.
Zwei Scheiben-Permanentmagnete wurden außen im Bereich der Halsvene angeordnet, und dem Kaninchen wurden dann 0,2 g Carbonyleisen-Mikrokugeln, suspendiert in 1 ml Kontrastmedium (Omnipaque) über eine Arterie des linken Ohres injiziert. Dieses Verfahren verursacht Mikrothromben in den Kapillarbetten des Ohres, während durch das Ohr gehende Eisenteilchen von dem Magnetfeld eingefangen werden und Thrombenbildung in der Halsvene einleiten. I¹²³-RGDSY wurde intravenös in das gegenüberliegende Ohr 60 min nach Injektion von Eisen injiziert. Dynamische Bildaufzeichnung durch eine gamma-Kamera erfolgte unter Verwendung einer einminütigen Rahmengeschwindigkeit während 20 min, wobei die Kamera vor her so positioniert wurde, daß sie beide Ohren, die Kopf- und Halsbereiche im Blickfeld einschloß.
Nach intravenöser Verabreichung des markierten Peptids wurde das Kaninchen radio graphiert, und die resultierende Radiographie ist in der beigefügten Figur wiedergegeben. Wie durch die Radiographie gezeigt wird, gab es eine rasche Aufnahme des Peptids durch einen Thrombus in der Halsvene (Pfeil 1) und durch mehrere winzige Thromben in dem linken Ohr (Pfeil 2). Insbesondere letzteres demonstriert die mögliche Brauchbarkeit der Erfindung bei der Feststellung kleiner Thromben in vivo und die Möglichkeit einer frühen Diagnose und Behandlung.

Claims

Verwendung eines radioaktiv markierten Peptids, welches die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparaginsäure (RGD) umfaßt, bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die bildliche Wiedergabe oder Feststellung eines Thrombus oder eines Tumors in vivo durch Binden in vivo an RGD-Bindungsstellen an dem Thrombus oder Tumor.
Verwendung nach Anspruch 1, worin das Peptid ein synthetisches Peptid ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Peptid ein relativ kurzkettiges Peptid ist.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das Peptid die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparginsäure-Serin (RGDS) oder die Aminosäuresequenz Arginin-Glycin-Asparginsäure-Phenylalanin (RGDF) umfaßt.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das Peptid 3 bis 10 Aminosäureeinheiten hat.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das Peptid eine der folgenden Sequenzen RGDSY, RGDFY, RGDSYC oder RGDSCRGDSY ist.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem die radioaktive Markierung Tc^99m, I¹²³ oder In¹¹¹ ist.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das radioaktiv markierte Peptid zur Bindung an RGD-Bindungsstellen auf einem Thrombus in vivo verwendet wird.
Verwendung nach einem der vorausgehenden Ansprüche, bei dem das radioaktiv markierte Peptid zur Bindung an RGD-Bindungsstellen auf einem Tumor in vivo verwendet wird.
Radioaktiv markiertes Peptid, wobei das Peptid die Sequenz RGDSY, RGDFY, RGDSYC oder RGDSCRGDSY hat.
Radioaktiv markiertes Peptid nach Anspruch 10, bei dem das radioaktiv markierte Peptid (I¹²³) RGDSY, (I¹²³) RGDFY, (I¹²³) RGDSYC oder (I¹²³) RGDSCRGDSY ist.