JPH04503106A - 定量免疫検定システム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高強度の光の前記カラムで前記透明容器を通じて前記混合物を照射する手段であ って、光源と、光をこの光源から前記容器中の前記混合物に導（手段を備えた照 射手段と；前記照射光経路に対して約１０”〜約２０”の鋭角の前方方向に混合 物によって散乱された光を検出する検出器とからなり；前記処理制御システムが ； 前記の検出された散乱光の強度に比例するデジタル試験データを生成する手段と ； 検出された散乱光の強度を示すデジタル試験データを記憶し、散乱光の強度の関 数として対象の物質の濃度を示す他のデータを記憶するメモリと； 記憶された試験データを、メモリ中の他のデータと比較して対象の物賀の濃度を 決定するデータ処理手段と；前記の試験試料中の前記対象物質の濃度の定量測定 を行う前記データ処理手段に連結された出力手段とからなる、請求項１記載の装 置。

３、前記照射手段が、高強度の発光ダイオードと、前記発光ダイオードの強度を 制御する制御手段とを備えている請求項２記載の装置。

４、前記照射手段が、さらに、前記発光ダイオードからの光を前記透明容器内の 前記混合物に導くコリメータと、前記光源と前記コリメータ間に位置する孔あき 板とを備えている請求項３記載の装置。

５、前記光の波長が約６６０ナノメートルである請求項３記載の装置。

６、前記制御手段が、前記発光ダイオードに連結する、制御された電源、前記光 源の電源を制御する手段、および前記光源の強度を監視し、前記電源を制御して 前記光の強度を選択されたレベルに維持する手段を備えている請求項３記載の装 置。

７、前記光源の強度を監視し前記電源を制御する前記手段が、前記光源からの光 を受ける位置にありかつ電源を制御する信号を与えて前記光の強度を前記の選択 されたレベルに維持するよう構成された光強度検出器を備えている請求項６記載 の装置。

８、前記検出器が光検出器を備えている請求項２記載の装置。

９、前記検出器が、さらに前記容器と前記光検出器との間に孔あき板を備え、光 検出器に到達する光を、前記コリメータの光の方向に対して鋭角をなして走行す る光に限定する請求項８記載の装置。

１０、前記メモリがランダムアクセスメモリを備え、前記データ処理手段が、マ イクロコントローラーと、前記システムに対する作動プログラムを記憶する第２ メモリとを備えている請求項２記載の装置。

１１、さらに、複数の対象物質のいずれかの標準曲線データを前記ランダムアク セスメモリに入力する手段を備えている請求項１０記載の装置。

１２、前記重合体粒子の粒径が約０．１０　ミクロン−約０．４０ミクロンであ る請求項２記載の装置。

１３、前記重合体粒子の粒径が０．１８８ミフロン±０．０ミクロンである請求 項１２記載の装置。

１４、前記メモリが、デジタル試験データ値の時間に対する変化率とそのデジタ ル試験データの測定時間を示す別のデータを記憶し、データ処理手段が、上記の 記憶されたデジタル試験データと時間から、そのデジタル試験データの変化率を 計算し、別の記憶データと比較して対象物質の濃度を決定する請求項２記載の装 置。

１５、前記の光照射測定システムが、第１孔あき板の背後に約１．３２０インチ の間隔をおいて光源を備え、前記第１孔あき板が約０．２００インチの直径のオ リフィスを形成し、前記第１孔あき板がコリメーティングレンズから０．７９０ インチの間隔をおいて位置し、直径が約０．２００インチの光のカラムを提供し 、前記コリメーティングレンズが前記流体試料容器の中心部から約１．４５９イ ンチの間隔を置いて位置している請求項１記載の装置。

１６、前記の光照射測定システムが、直径が約０．１５２インチの１つの孔を形 成している光遮断板の背後に光検出器を備え、前記光遮断板の孔と前記光検出器 とが、光のカラムに対して約１０°〜約２０゜の鋭角で光のカラムの経路からは ずれた軸上にある請求項１記載の装置。

１７、前記処理制御システムが、光照射測定システムから光の強度に関するデー タを生成し、光照射測定システムの校正された出力に関するデータを記憶し、お よび前記の光照射測定システムの可変電流供給を制御して光源の強度を保持して 校正された出力を与えるよう校正されている請求項１記載の装置。

１８、前記システムが、前記光検出器の出力と接続された可変ゲイン増幅器を備 え、前記処理制御システムが、異なる試験に対して、可変ゲイン増幅器のゲイン を変える請求項１６記載の装置。

１９、前記処理制御システムが； 散乱光の強度に関するデジタル情報を生成する光照射測定システムの誤りのない 出力に対するＡ−Ｄ変換器と；上記Ａ−Ｄ変換器に接続され、散乱光の強度に関 するデジタル情報を受けて装置を作動させる中央処理装置と；対象の生物学的活 性物質の複数の濃度に関連する散乱光強度に関するデータを記憶し、かつ光照射 測定システムの作動に由来する複数のデジタルデータと時間のデータを記憶する のに充分なアドレス指定可能の情報記憶容量を有するランダムアクセスメモリ、 装置を作動させるプログラムを記憶し、上記ランダムアクセスメモリがらの情報 を記憶し検索し、そこに記憶されたデータと装置の作動から得られるデータとか ら対象の生物学的活性物質の濃度を決定する、電気的にプログラム可能なＲＯＭ と： 少なくとも１つの情報入力装置と１つの情報出力装置と；からなる請求項１記載 の装置。

２０、前記の処理制御システムが、１以上の対象物質に関する試験プログラムと 標準曲線データを記憶するのに充分なメモリを有する装置へ挿入しかつこの装置 から取り出すよう構成された１換可能な試験メモリを備えている請求項１記載の 装置。

２１、前記流体試料容器が、実質的に平行な側面を有する透明な試料容器で構成 されている請求項１記載の装置。

１２２、光照射測定システムとＡ−Ｄ変換器を相互連結して、中央処【　理装置 に光照射測定システムからの複数の入力を与えるアナログマルチプレクサを備え ている請求項１９記載の装置。

２３、少なくとも、均一な大赤さの小粒子の懸濁液を含む１つ以上の試薬であっ て、その小粒子が、高屈折率を与えるよう選択された１つの単量体と、上記小粒 子が生体の血清と非特異的に反応するのを阻害するよう選択されたもう１つの単 量体との共重合体で構成され、前記粒子は、その表面が対象の生物学的活性物質 に対して感作されている１つ以上の試薬を準備し； 前記１つ以上の試薬を、対象の生物学的活性物質の被検流体と混合して、前記粒 子と反応を起こさせて前記粒子を凝集させ；光のカラムを生成して、これを中心 光軸に沿って混合された１つ以上の試薬と生体血清の凝集反応混合物に導き；中 心光軸から鋭角ではずれた方向に、前記凝集反応によって粒子が散乱した光の強 度を測定し； 前記散乱光の強度の測定値から、流体中の対象の生物学的活性物質の濃度を決定 する； ことからなる凝集免疫検定法。

２４、前記準備段階が、対象の生物学的活性物質に対する抗原もしくは抗体を結 合させて感作された粒子の緩衝懸濁液からなる試薬懸濁液を準備し： その試薬懸濁液を被検粒体と混合し凝集反応を行わせることからなる； 請求項２３記載の凝集免疫検定法。

２５、粒子が約０．１００ミフロン〜０．３５ミクロンの粒径を有し、光が約６ ６０ナノメートルの波長の光を含有し、その光の強度が、約１０°〜約２０°の 鋭角方向で測定される請求項２３記載の方法。

２６、前記の均一な大きさの小粒子が約０．１０〜約０．４０ミクロンの粒径範 囲内にあり、前記の１つの単量体が芳香族ビニル単量体で、前記の他の単量体が ビニルアクリレートエステルの単量体であり、前記鋭角が中心光軸から約１０° 〜約２０°傾斜している請求項２３記載の方法。

２７、前記の均一な大きさの小粒子が、０．１８８ミフロン±０．ミクロンの粒 径範囲内にあり、前記鋭角が約１７°である請求項２６記載の方法。

２８、凝集した粒子によって、中心光軸から傾斜した鋭角方向に散乱された光の 強度を複数の既知の時間に測定し、その測定した強度と時間を記憶させて、各種 濃度の対象の生物学的活性物質の光強度と時間を予め測定し記憶しておいた数値 と比較し、前記生体血清中の生物学的活性物質の濃度を決定する請求項２３記載 の方法。

２９、複数の既知の時間に散乱された光の強度の複数の前記記憶値を強度の変化 率を計算するのに用い、その強度の変化率を記憶し、対象の生物学的活性物質の 散乱光の強度の変化率の予め測定された値と比較して、前記生体血清中の生物学 的活性物質の濃度を決定する請求項２８記載の方法。

３０、前記準備段階が、少なくとも緩衝剤と対象の生物学的活性物質に対する抗 体とを含有する第１試薬を準備し、ついで対象の生物学的活性物質に対する上記 抗体に対する抗原を結合された、前記の均一な大きさの小さな共重合体粒子の緩 衝懸濁液を含有する第２試薬を準備することからなる請求項２３記載の方法。

３１、対象の生物学的活性物質がテオフィリンであり、第１試薬の抗体がモノク ローナル抗テオフィリン抗体であり、第２試薬の抗原がテオフィリン−８−ヒド ロキシプロピルアミンであり、テオフィリンの濃度が凝集反応の阻害程度から決 定される請求項３０記載の方法。

３２、体液と感作ラテツクス粒子とを接触させることからなる体液の処理法であ って； ラテックス粒子が、ビニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体と を約１：３〜３：１のビニルアクリレートエステル単量体対ビニル芳香族単量体 比率で含有し、感作されたラテックス粒子と、体液とを接触させて抗体／抗原反 応を起こして抗体／抗原／ラテックス粒子複合体を形成することからなる体液を 処理する方法。

３３、スチレン、ビニルトルエン、ｔ−ブチルスチレンおよびその混合物からな る群から選択されるビニル芳香族単量体と、１〜６の炭素原子のペンダントアル キルエステル基を有するビニルアクリレートエステル単量体とを含有し、そのビ ニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体が、約１：３〜３：１の 重量比のビニルアクリレートエステル単量体対ビニル芳香族単量体で用いられ、 さらに、ビニルカルボン酸であるタンパク質結合性変性単量体を、ビニル芳香族 単量体およびビニルアクリレートエステル単量体の約０゜５〜約１０重量％含有 するラテックス粒子。

３４、ビニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体が約１＝１の比 率で用いられる請求項３３記載のラテックス粒子。

３５、ビニルアクリレートエステルが、メタクリレート、ｎ−ブチルアクリレー ト、Ｓ−ブチルアクリレートおよびその混合物からなる群から選択される請求項 ３３記載のラテックス粒子。

３６、ビニルカルボン酸が、アクリル酸、メチルアクリル酸およびその混合物か らなる群から選択される請求項３３記載のラテックス粒３７、タンパク質結合性 変性単量体が、共重合体の約１．０〜３．０重量％の濃度で用いられる請求項３ ３記載のラテックス粒子。

３８、前記ラテックス粒子が約０．１〜１．０ミクロンである請求項３３記載の ラテックス粒子。

３９、前記ラテックス粒子が約０．１８８ミフロン〜０．２ミクロンである請求 項３３記載のラテックス粒子。

４０、ｎ−ブチルアクリレート単量体とスチレン単量体を、約１：３〜３：１の 比率のｎ−ブチルアクリレート単量体対スチレン単量体の比率で含有し、共重合 体を形成し、診断免疫検定法の用途に用いられるラテックス粒子。

４１、　ｎ−ブチルアクリレート単量体とスチレン単量体が、約１：１の重量比 で結合している請求項４０記載のラテックス粒子。

４２、ラテックス粒子がさらに、連結法によつてタンパク質をラテックス粒子に 結合させるタンパク質結合性変性単量体で変性され、このようにしてラテックス 粒子が感作され、その感作されたラテックス粒子が診断免疫検定法の用途に用い られる請求項４１記載のラテックス粒子。

４３、タンパク質結合性変性単量体がカルボン酸である請求項４２記載のラテッ クス粒子。

４４、タンパク質結合性変性単量体が、共重合体の約０．５〜ｉｏ、ｏ重量％の 濃度で使用される請求項４２記載のラテックス粒子。

４５、タンパク質結合性変性単量体が、共重合体の約１．０〜３．０重量％の濃 度で使用される請求項４４記載のラテックス粒子。

４６、前記ラテックス粒子が、約０．１〜１．０ミクロンである請求項４２記載 のラテックス粒子。

４７、前記ラテックス粒子が約０．１８〜０．２０ミクロンである請求項４６記 載のラテックス粒子。

４８、ビニル芳香族単量体、ビニルアクリレート単量体およびタンパク質結合性 変性単量体からなり、ビニルカルボン酸である前記タンパク質結合性変性単量体 がタンパク質を前記ラテックス粒子に結合させ、このようにしてラテックス粒子 を感作させて、前記ラテックス粒子が診断免疫検定の用途で使用されるラテック ス粒子。

４９．タンパク質が、カルボジイミド法によって、ラテックス粒子明　細　書 定量免疫検定システム 技術分野 この発明は流体試料中の対象物質の濃度を測定するシステム、方法および装置に 関する。さらに詳しくは、この発明は、共働して、凝集反応を促進もしくは阻害 することができる生物学的に活性な物質の濃度を定量測定する、共重合体に基づ いて免疫検定を行うシステムと方法と装置に関する。

医学界では、体液中の例えば抗原および抗体のような生物学的活性物質の濃度の 測定法の改良法が、引続き要望されている。このような測定法は、例えば、医療 診断と医薬投与を行う際の一助として、血液、血清、血漿、尿などの体液中の医 薬、ホルモンなどの物質の濃度を測定するのに必要である。

流体試料中の生物学的活性物質の存在を決定する各種の免疫検定法が開発されて いる。今日使用される最も有力な免疫検定法は、恐らく放射能免疫検定法（ＲＩ 　Ａ）である。この方法では、未知濃度の抗原を含有する試料を、固定量の抗体 と、放射線標識をつけた固定量の抗原と混合する。得られた抗体抗原複合体を回 収し、その放射能を測定して、放射性抗原と、試料に基因する抗原との相対濃度 ・を決定し、試料中の抗原の濃度を決定する。

放射能検定法は、比較的感度が高いので、普及している。しかし放射能物質を扱 う必要があり、その貯蔵寿命が比較的短く、またこれらの物質には処理の問題が あることを含む周知の多くの制限を受けている。また放射能免疫検定システムは 、比較的高価なので、一般的に、充分な試験量があって設備費用が有効になる大 きな診療所と病院にのみ使用されている。また放射能免疫検定法は一般に抗体濃 度の測定には使用されず、通常、抗原濃度を測定する用途に使用される。

市場のいくつかの分野では、酵素免疫検定法が、放射能免疫検定法にとつてかわ り、酵素免疫検定法の人気が上昇しているが、この方法の感度はいぜんとして制 限がある。その上に、その装置が複雑なので測定員に高い熟練度が必要なことか ら、この方法の使用は、病院などの大きな施設に同定されるようである。

凝集免疫検定法は、３０年間にわたって利用されている。その凝集反応によって 、抗原もしくは抗体の一方が表面に固定化されている顕微鏡的担体粒子が抗体と 抗原間の特異的反応で生体外で凝集している。初期のシステムでは担体粒子とし て赤血球細胞が使用されたが、ごく最近のシステムでは、ラテックスベースの粒 子を利用している。

凝集免疫検定法は、２つの基本的な方法、すなわち直接法と間接法で行われる。

直接法では、担体粒子は、その表面に特異的抗体が結合されて感作される。次い で流体の試験試料を上記の感作担体粒子の懸濁液と混合すると、対応する抗原が 試験試料中に存在する場合、その粒子は、起こった抗体抗原結合反応によって凝 集する。この凝集反応を検出することによって、試験試料中の抗原の存在を確認 することができる。

あるいは、抗原を担体粒子の表面に結合させて、試験試料中に対応する抗体が存 在することを確認することができる。

間接法では、多量の対象抗体（または抗原）が試験試料中に存在する場合には、 対象の抗体（または抗原）は、さもなければ起こったであろう担体粒子の凝固を 阻害するが、その阻害度は、試験試料中の対象の抗原（または抗体）の濃度を示 す。

凝集試験法は、一般に、スライドガラス上で視覚で読み取って行われるので、か なりの専門的技術を要する非常に主観的な試験法である。凝集反応が起こらない 場合は、混合物は均一でミルク状であるが（ラテックス粒子を担体粒子として用 いる場合）、凝集が起こると、ラテックス粒子は、最初顆粒状になるが、時間の 経過とともに凝集する。この反応の結果の判定が一般に主観的であることから、 定量的な情報を引き出すことが困難なので、この方法は、ホルモンのレベルを監 視するとかもしくは癌の標識を検出するというような多くの用途には不満足な方 法である。

従来の凝集免疫検定システムが非常に定性的で主観的なために、より定量的な測 定を行えるシステムの開発に各種の努力がなされている。さらに、大型で高価な 装置と、複雑で過敏な試料調製法に依存しない非常に高感度の免疫検定システム を提供することが長年にわたる要望であった。

例えば、Ｌｅｎｔｒｉｃｈｉａらの米国特許第４．７２１．６８１号には、例え ば対象の抗原を含有する試料を、抗体でコートされ遠心力場では軽い粒子を含有 する第１試薬、および抗原でコートされ遠心力場では重い粒子を含有する第２試 薬を反応させる凝集免疫検定システムが記載されている。第１粒子、第２粒子、 および凝集反応によって第２粒子に結合された第１粒子の特異な泳動が、時間経 過による軌跡に、濃度の関数である。

Ｅｒｎ５ｔ　Ａ、　Ｆｉｓｃｈｅｒの米国特許第４．２６４．７６６号には、凝 集免疫検定試験用の改良ラテックス粒子を提供するラテックス重合体とその製造 法が記載されている。このＦｉｓｃｈｅｒの特許では、粒径の範囲が約０゜０１ 〜約０．９ミクロンで比重が約１．０のラテックス担体粒子が、免疫活性体と共 有結合できる、共有結合をした水溶性ポリヒドロキシ化合物をもっている。この ラテックス粒子は、水性ラテックス懸濁液中で、カルボキシル、アミノ、アミド もしくはニトリル基からなる群から選択される反応性官能基を有する懸濁ラテッ クス粒子を、水溶性ポリヒドロキシ化合物と反応させることによって製造される 。

Ｓａｗａｉらの米国特許第４．１１８．１９２号、同４．２０３．７２４号およ び同４．２０８゜１８５号には、次のような凝集免疫検定システムが記録されて いる。

すなわち、平均直径が１．６ミクロン以下の抗体もしくは抗原で感作されたラテ ックス粒子に、波長が０．６〜２．４ミクロンの範囲にあって、担体粒子の平均 直径より長く少なくともその１．５倍の光（実質的に物の吸光度が測定される。

記載されているシステムでは、ポリスチレンおよびスチレンブタジェン共重合体 のような有機重合体のラテックス、無機酸化物の微細粒子のみならず分散球菌、 ならびに微細に粉砕された鉱物質、金属などのような不溶性担体粒子が用いられ る。

光源としては、タングステンランプ（単色光にフィルターされているかもしくは フィルターされていない）、キセノンランプ、ハロゲンランプ、ネルンストグロ ーアー、ニクロム線、または発光ダイオードが含まれるが、Ｇａ−Ａｓ発光ダイ オードが特に好ましい。光を分割して、反応生成物と、補償のための対照試料と を透過させ、光電導要素である硫化鉛が入っているような２つの光電セルで測定 する。この光電セルの出力が増幅され、時間に対して記録された。

このようなシステムを三菱化学工業（株）が大病院の免疫検定設備に組み込んだ が、１０〜６〜１０”ｇ、／＋１の感度を与えることはできなかった。

Ｃｏｈｅｎらの米国特許第４．０８０．２６４号には、光散乱分光法を利用して 、試験試料中の対象の抗体もしくは抗原の濃度を測定する凝集免疫検定法が開示 されている。Ｃｏｈｅｎらの特許では、凝集反応の生成物の平均拡散定数が、準 弾性光散乱分光法で測定され、予めきめた平均拡散定数と比較して、試験試料中 の対象の抗体もしくは抗原の濃度が定量測定される。Ｃｏｈｅｎらの特許では、 光源はレーザーである。

このような要素は、購入と保守に要する費用が比較的高価であり、誤った出力を 与え、そのシステムは、比較的大容量の施設にしか有用でなくなってしまう。こ のようなシステムは、感度がかなり不足しており、高度の凝集が起こらなければ 、すなわちかなり高濃度の対象物質が存在していなければ、凝集反応を正確に検 出できない。

Ｃａｎｎｅｌｌらの米国特許第４．１７４．９５２号には、２つの異なる角度で 散乱された光の強度の比率を測定し、既知濃度の標準測定値と比較する凝集免疫 検定システムが記載されている。このシステムも感度が不満足なものであること が分かっており、個人の医院もしくは小さな実験室で使用するのには高価すぎる 。

発明の開示 この発明は、流体試料中の、モノクローナルもしくはポリクローナルの抗体と抗 原、癌標識、タンパク質、細菌、ウィルス、治療医薬、乱用医薬、および食品と 水の汚染物のような生物学的活性物質の、１０−６〜１０４２ｇ／ａｌのような 極端な低濃度を、正確に測定するのに、高感度かつ有効であり、水性試料として 試料調製する必要がな（、信頼性が高く、使用しやすく、医院、小実験室などの 小容量の施設で容易に使用できるほど充分低価格であるが病院と大容量の用途に も適した、改良された共重合体に基づいた免疫検定システム、方法および装置で ある。

この発明は、凝集免疫検定システムに用いる新規な方法、装置およびシステムか らなり、これには、担体粒子技術、光の照射と測定および化学の新規な組合せが 含まれ、共働して、使用時の単純性と精度および定量免疫検定に用いた場合の非 常に高い感度のような多くの利点が提供される。

この発明では、新規な試薬組成物によって、試験試料中の極端に低い濃度の抗体 もしくは抗原を、簡単で高い効率の方法で検出・測定することができる。この新 規な試薬組成物には、粒径が非常に均一で（例えば０．１８±０．０１ミクロン ）、全粒子が非常に狭い粒径分布の範囲内（すなわち、Ｃ，Ｖ、　、＝±２％） にある。その上に、その新規な共重合体の粒子は、体液とは非特異的に容易に相 互反応せず、新規な光照射測定システムと共働する新規な組成物で構成されてい る。

すなわち、その新規な粒子は、特異的な生物学的活性物質に応答して凝集するよ う製造され、光を有効に散乱することができる。またその粒子は、充分な量の抗 原もしくは抗体が、確実に、その表面に非可逆的に結合されて粒子に免疫反応性 がもたらされ、かつ確実に、非特異的凝集反応が起こらず目的とする特異的凝縮 反応が過度には阻害されないように処理されている。この発明のシステムにおい て上記の新規な共重合体粒子を用い、光と共働させると、反応の最も初期の段階 で生物学的活性物質の濃度が非常に低い時の凝集反応を検出することができろ。

従って、この発明のシステムには、体液に対する非特異的な反応には耐性で、そ の表面に官能基を結合させることによって感作させて、抗原もしくは抗体などの 生物学的活性物質が、凝集反応中に共有結合できるようにして優れた光散乱性を 与えるように構築された新規で粒径が均一な高分子粒子の緩衝懸濁液を含有する 試薬が含まれている。

さらにこの発明のシステムは、高強度の光で、透明容器を通じて上記凝縮反応を 照射し、その凝集反応中、前記高分子粒子によって散乱される光を検出する新し い手段を備えている。検出器が、照射光路に対して約ｌθ″′〜２０°の鋭角で 前方に向かって、前記混合物によって散乱された光を検出し、検出された散乱光 の強度に比例する出力信号を発する。さらにこの発明のシステムは、前記検出器 の出力信号をデジタル化する手段；試験中、単一もしくは複数の特定の時間にお いて検出された散乱光の強度を表すデジタルデータを受信して記憶し、試験中、 単一もしくは複数の特定の時間において検出された光の強度の関数として、対象 物質の濃度を表す標準曲線のデータを記憶し、およびシステム作動プログラムを 記憶するメモリ手段；前記メモリ手段に記憶された試験データを、前記メモリ手 段の標準曲線データと比較する手段：ならびに流体試料中の対象物質の濃度の定 量測定を行う、前記比較手段に連結された出力手段を備えている。またこの発明 のシステムは、試験中の色々な時間における、上記の試験データと標準曲線デー タとの変化率を記憶し比較することができる。

この発明の現在の好ましい態様では、新しい光照射測定システムは、約６６０ナ ノメートルの波長の光を発生する、制御された強度の光を発するダイオード、コ リメータと孔あきシステム、およびシリコンホトダイオードのようなホトダイオ ードを備えた検出器を備えている。従来のシステムのようなレーザーと光電子増 倍管もしくは光電セルではな（て、新しい光照射測定システムを使用すると、光 散乱免疫検定システムのなかで“誤りのない”　（すなわち、望ましくない、重 要でない出力の変動がない）より高感度のシステムで、しかも大きさが小さく費 用が少なくて信頼性が一層高いシステムが得られる。この発明のシステムは、光 源と透明容器の間に位置し、平行化された光と共働して反応によって散乱された 光のばらつきの少ない正確な検出を行う通孔を備えた、新規な配列の孔あきプレ ートを備えている。その上に、新しい好ましいシステムには、光の強度を一定の レベルに維持するために適切なソフトウェアが設けられ、検出器からの信号のゲ インは、以下に説明するように、異なる試験に対して変えることができる。

現在の好ましい態様において、その処理・制御システムは、このシステムを各種 の試験を行うのに利用できるように柔軟性を増大させる第１ランダムアクセスメ モリ、操作システムのための第２の電気的にプログラム可能なメモリ、ならびに このシステムが対象の生物学的活性物質に対する各種の試験法とデータを記憶し かつ新しい改良試験法で更新できるようにする第３の置換可能なメモリ手段を備 えたメモリ手段を備え；その比較手段は、試験試料中の対象物質の濃度を計算し 、そのシステムを校正し、および一般にシステムの作動を監視し制御するマイク ロコントローラーを備えている。

この発明の免疫検定法には、体液との非特異的な反応に対する耐性と光を散乱す る特性を増大させるために選択された高分子材料製の均一な大きさの粒子を製造 する工程；対象の生物学的活性物質を試験するために、抗体もしくは抗原を捕捉 するのに適合した官能基を表面に付与することによって上記の粒子を感作する工 程：および対象の生物学的活性物質を試験するための抗体もしくは抗原を上記官 能基に結合させる工程が含まれる。

その他の工程は、試験中の対象の生物学的活性物質と、試験が直接法もしくは間 接法で行われるかによってきまる。例えば、この発明の方法でテオフィリンすな わち広（処方されている気管支ダイアレータ（抗喘息剤）を試験する場合、好ま しい方法は間接法であり、その方法には好ましくは、少な（とも緩衝液と抗テオ フィリン抗体を含有する試薬溶液を準備する工程；結合されたチオリフイン抗原 、好ましくテオフィリン−８−ヒドロキシプロピルアミンで感作された均一な大 きさの共重合体粒子の緩衝懸濁液で構成される試薬懸濁液を準備する工程；前記 試薬溶液を血清試験試料と混合する工程；前記試薬懸濁液を、第１試薬溶液と試 験試料との混合物と混合する工程；試験試料、試薬溶液および試薬懸濁液の混合 物に高強度の光力ラムを通過させる工程；光力ラムに対して鋭角で、時間の関数 として、混合物によって散乱される光の強度を測定する工程；前記散乱光の強度 に関するデータを時間の関数として記憶する工程；ならびに前記の記憶されたデ ータを試験データと比較して流体試料中の対象物質を決定する工程が含まれてい る。

この発明のシステムと方法で現在可能な多数の他の新規な試験法には、最も重要 な甲状腺ホルモンであるチロキシン（Ｔ４）　；　ｌ’リョードチロニン（Ｔｓ ）　すなわち生物学的に最も活性の高い甲状腺ホルモン；チロトピンすなわち甲 状腺の機能を調節する甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；およびジコキシンすなわ ち広く処方されている抗心臓不整脈剤に対する試験法が含まれる。この発明のシ ステムと方法は、その感度が一層高いので、この発明のシステムと方法には、上 記の生物学的に活性物質とその他の例えば、ＨＣＧＳＬＨ。

フェリチン、フェノバルビトールおよびフェニトイン、ならびに癌標識、タンパ ク質、細菌、ウィルス、治療医薬、乱用医薬、ならびに食品と水汚染物の簡単な 免疫検定試験法が含まれる。

この発明の方法を実施する場合、測定される各物質に、実施される試験の感度が 最大になるよう特別に処方された試験組成物が使用される。種々の試薬組成物は 、最初、対象の各種の生物学的活性物質の標準量と混合され、次いでこの発明の システムで試験され、対象の各種物質について、対象物質の濃度を示す標準曲線 データ、例えば特定の単一もしくは複数の時間における反応速度を示すデータ、 単−もしくは複数の時間における反応の変化率を示すデータ、またはこれらを組 み合わせたデータが提供される。これらの標準曲線を示すデータは、メモリ手段 に入力されて記憶され、未知の試験試料を用いて凝集反応を監視することによっ て得られた強度の試験データと比較される。このメモリ手段は、システム校正と 試料分析のプログラムを記憶し、システムが未知の試験試料中の対象物質の濃度 を示す出力を与える。

一般にこの発明は、流体試料中の抗体もしくは抗原のような生物学的活性物質の 濃度の正確な定量測定を、比較的少ない費用で、１゜−６〜１０”１２ｇ／ｍｌ の範囲にまで高信頼度で行うのに有効な、高感度のシステム、方法および装置を 提供するものである。この発明は、現在使用中の病院用の大形凝集試験システム のｉ、　ｏｏｏ〜１．０００．０００倍の感度を提供する。すなわち、この発明 によれば、現在使用されている他のシステムよりも０．００１〜０．０００００ １倍の小さい濃度を迅速かつ正確に測定することができる。

この発明のその他の利点と詳細は、好ましい態様の以下に示す詳細な説明によっ て明らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１および図２は、この発明をより明確に理解するのに役立つように、直接法の 凝集反応を示す概略図である：図３および図４は、この発明をより明確に理解す るのに役立つように、間接法の凝集反応を示す概略図である；図５は、凝集反応 を促進もしくは阻害できる生物学的活性物質の濃度を定量測定する、この発明の 好ましい態様の免疫検定システムの装置の概略図である； 図６は、図５の光照射測定システムのより詳細な概略図である；図７は、図５の システムの作動を示すフローチャートである一図８は、この発明のシステム、方 法および装置の実質的に誤りのない作動を示すグラフである； 図９．１０および１１は、対象の生物学的活性物質の代表的な標準曲線データを 示す。具体的にいえば、図９．１０および１１は、血清もしくは体液中のテオフ ィリンの未知濃度を計算するのに用いる標準曲線データである。

この発明を実施する最良の態様 この発明は、流体試料と試薬からなる混合物に凝集反応を開始させ、時間経過に よる凝集反応の程度を測定することによって、血液、血清、尿もしくは血漿のよ うな体液中の抗原もしくは抗体の生物学的活性物質の濃度を定量測定する新規な 免疫検定システム、方法および装置である。この発明をより明確に理解するため に、凝集反応の性質と、凝集反応の物理作用が対象物質の濃度を示す情報を提供 する仕方とを簡単に説明することは有用である。

先に述べたように、凝集反応は、２つの方法すなわち直接法もしくは間接法で起 こすことができる。直接法は図１および図２に示す。

図１において、試薬懸濁液１Ｃは、多数の担体粒子１１を含有しているが、その 粒子は、その表面に抗体１２を結合することによって感作されている。次にこの 試験懸濁液を流体試料と混合する。流体試料が抗体１２に対する抗原１４を含有 する場合、感作粒子１３は、１６で示す抗体−抗原結合反応によって凝集する。

あるいは図２に示すように、担体粒子１１は、その表面に抗原１４を結合させる ことによって感作され感作粒子１７を提供する。次にこの試薬懸濁液を流体試料 と混合する。そして試料が対応する抗体１２を含有している場合は、感作粒子１ ７は１８で示すように凝集する。

図１および図２に示す直接法のいずれかにおいて、凝集の度合が、流体試料中の 抗原１４（図１）もしくは抗体１２（図２）の濃度の尺度である。

間接法を図３および図４に示し、簡略にするために、この発明のシステムで実施 できる１つの特定の試験を参照して記載する。特に、妊娠期間中、ホルモンのヒ ト絨毛膜ゴナドトロピン（ＨＣＧ）が妊婦の尿に現れ、その濃度は妊娠の最初の ３力月に数百倍増加する。

このホルモンが尿中に存在していることは妊娠の明確な指標であり、間接法の凝 集反応を利用することによって容易に検出できる。図４において、ラテックス１ １の表面に固定されたＨＣＧ２０は、尿中に存在するＨ　ＣＧ　２０’と競合し て、第２試薬として与えられた抗体２２と反応する。図３に示すように、ＨＣＧ ２０’　が尿中に全く存在しない場合、抗体２２は、粒子１１上のＨＣＨ２０と 反応して、２４で示す凝集反応を起こすことができる。一方、ｒＩ！Ｊ４に示す ようにＨＣＧ２０’が尿中に存在する場合、尿中のＨＣＧ２０°は、粒子１１上 のＨＣＧ２０と競合して、２６で示すように、感作粒子の凝集量を著しく制限す る。それ故に間接法では、凝集の度合が大きいほど、流体試料中の対象物質の濃 度が小さい。

先に述べたように、凝集試験は伝統的にスライドグラス上で行われ、凝集の度合 は技術者が眼で読み取っていた。ＨＣＧを検出する特定の間接性試験では、試験 結果が陽性の場合（ＨＣＧが存在している）、実質的に凝集は起こらず、ラテッ クス懸濁液は均一でミルク状を呈している。試験結果が陰性の場合（ＨＣＧは存 在していない）、感作されたラテックス粒子が著しく凝集を起こし、懸濁液が顆 粒状になり、時間の経過とともに全体が凝集する。

凝集試験の結果を読み取るということは主観的なものであるから、ラテックスの 凝集の外観から高度の定量を引き出すことは困難であった。その試験結果は、特 定の物質が試料中に存在しているか否かという質問に対し“イエス”か“ノー” の返事しか与えない基本的に定性的な試験結果である。このような試験は妊娠試 験に用いる場合には満足すべきものであるとはいえ、対象の多数の抗体と抗原を 定量するには不満足なものである。

この発明は、凝集反応で起こる凝集の度合を、高精度と高感度で定量測定を行い 、このような情報を、対象の生物学的活性物質の濃度を示すデータに自動的に変 換するシステム、方法および装置を提供するものである。

図５は、この発明の好ましい態様の凝集免疫検定システムの装置の概略図である 。この発明のシステムは、参照番号３０で示され、透明容器４４に入った試薬懸 濁液と流体試料からなる流体混合物を照射し、流体混合物の凝集を検出して凝集 の度合に比例する信号を発信する誤りのない光照射測定システム３２と、前記の 光照射測定システムの作動を監視制御し、光照射測定システムからデータを受取 り、受は取ったデータを処理して、流体試料中の対象物質の濃度の定量測定を行 う制御処理システム３３とを備えている。この発明の好ましいシステムでは、前 記制御処理システムも前記光照射測定システムを監視し制御する。

光照射測定システム３２は図６により詳細に示しである。一般に光照射測定シス テムは、容器４４に入った試薬と流体試料の混合物９７を照射する照射手段４２ 、コリメータ９６、および照射光の軸に対して選択された鋭角θで前方向に前記 混合物で散乱された光を検出し、検出器４８が受けた散乱光の強度を示す誤りの ない信号を発する検出器４８を備えている。

この新規な光照射測定システムにおいて、照射手段４２は高強度の光を生成する 光源８２を備えている。光源８２は好ましくは、光放射用の直径０．２００イン チの通孔９２が形成されている孔あきプレート９２を有する箱体９０内に保持さ れている。孔あきプレート９２から放射された光は、レンズ９６で平行化され、 円筒柱の試験管、好ましくは四角柱のように側面が実質的に平行なプラスチック キュベツトのような透明容器４４に入った試薬／試験試料混合物９７を通過する よう誘導される。光源８２は、可変強度で約６６０ナノメートル（赤色光）の波 長の光を発することができる５ｔａｎｌｅｙ　＃Ｈ２Ｏ００もしくは＄１１１３ ０００　Ｌ　Ｅ　Ｄのような発光ダイオードを備えている。ＬＥＤ光源８２と孔 あきプレート９２との距離ｄ１は１．３２０インチ：孔あきプレート９２と光平 行化レンズ９６の発光面９６ａの距離ｄ２は０．７９０インチ；および光平行化 レンズの発光面９６ａとキュベツト４４の中心の距離ｄ３は１．４５９インチで ある。

光照射測定システムに用いられる光は、偏光させず、フィルターして単色光にす ることはない。光源８２は、光強度制御器８６に含まれている制御された電源（ 図示せず）に連結されている。

この発明の好ましいシステムでは、光強度制御器８６は、前記の制御処理システ ム３３のマイクロコントローラー６２（図５）と、Ｄ−Ａ変換器８４と接続線８ ４ａによって接続されている。システムを調製し校正する際は、光源８２からの 光を、既知の一定の散乱光を与える粒子懸濁液の入ったキュベツトを通って投射 され、得られた散乱光の強度を検出し、システムメモリに記憶された標準データ と比較され、光強度の標準からの偏差を、相互連結されたＤ−Ａ信号変換器８４ を介して、マイクロコントローラー６２による前記の光強度制御器の作動によっ て修正することができる。光源８２の強度を修正する必要があると決定した場合 は、マイクロコントローラーは、強度を修正するデジタル信号を発する。このデ ジタル信号は、Ｄ−Ａ変換器８４によってアナログ信号に変換され、そのアナロ グ信号は、接続線８４ａを通じて光強度制御器８６に与えられ、その制御器８６ が光源８２を通る電流を増減し、その強度を修正する。制御器出力センサ８８は 、アナログマルチプレクサ５２とＡ−Ｄ変換器５６を通って接続線８８ａを通じ て、光強度制御器８６の出力（すなわち光源８２を通る電流）を指示するマイク ロコントローラー６２を備えている。マイクロコントローラー６２は、このよう な情報を利用して、システムとその光源の誤動作を診断することができる。マイ クロコントローラー６２は、ソフトウェアの装置診断試験部のこのような方法に ついての命令をもっている。

この発明のその他の態様では、光強度制御器８６は、光照射測定システム内に位 置し、光源８２から光を受ける（例えば、箱体９０の別の開口を通じて）光強度 検出器（図示せず）に直接接続してもよく、そうすればその光強度制御器８６は 、前記強度検出器の出力を使用して、光の強度を、システムが最初に校正される 時に設定されるほぼ一定のレベルに自動的に維持することができる。

光照射測定システムにおいて、光検出器４８は、試薬／試験試料混合物９７を通 過させた光力ラムの軸８２ａに対して斜めに位置している。

検出器４８としては、直径が０．１５２インチの通孔１１０を形成した光バリヤ −１０８で散乱光から遮蔽された光検出器が好ましい。光検出器手段４８、光バ リヤ−１０８、および通孔１１０は、光を捕捉する光検出器４８を、混合物９７ に誘導される光の軸８２ａに対して角度θ傾斜している軸４８ａに沿って散乱さ れる光に限定するよう配置されている。キュベツト４４と光検出器４８の距離は 重要ではない。

従って、混合物９７によって散乱された光は、散乱光の強度に比例する電気信号 を発する光検出器４８によって、特定の角度θの位置で検出される。光検出器４ ８として好ましいものとしてＢａｍａｍａｔｓｕ　５ｉｌｉｅｏｎ光検出器＃Ｓ 〜１１３３−０１がある。上記のように、光検出器は、例えば直径０．１５２イ ンチの通孔１１０を有する光バリヤ−１０８の背後に保持され、迷光が光検出器 に到達するのを防止する。

一定の角度θで前方に、混合物によって散乱される光の強度は、混合物９７中の 一定の大きさの粒子の数に比例する。従って、混合物中で起こった凝集反応の程 度に比例する。凝集反応開始時には、混合物は大部分が小粒径の単分散粒子を含 有しているので、前方への散乱光の強度は初期には小さい。しかし凝集反応が進 行するにつれて、単量体が集まり、大きさがより大きな凝集物を形成する。これ らの凝集物は光を散乱し、その光は、前方に角度θで散乱される光の強度の増大 量として測定することができる。強度の変化は、混合物中の凝集物の数の変化に 比例し、前方への散乱光の強度の変化率は凝集率に比例し、さらに、試験試料中 の対象の生物学的活性物質の濃度を示す。

この発明において、光検出器４８は、入射光の方向８２ａに対して約１０°〜２ ０°、最も好ましくは約１７°の前方鋭角方向の散乱光の強度を測定するよう位 置することが好ましいことが分かった。光検出器４８は検出された光の強度に比 例する電流を発生し、角度θで散乱された光を示す電流はミリボルトで測定され るが、可変ゲイン増幅器５４を通じて制御処理システム３３に送られる。可変ゲ イン増幅器５４は、接続線５４ａを通じてアナログマルチプレクサ５２とＡ−Ｄ 可変器５６によってマイクロコントローラー６２と接続されている。アナログマ ルチプレクサ５２は、可変ゲイン増幅器５４で増幅された光検出器４８の出力を Ａ−Ｄ変換器５６に送り、この変換器５６は、前記増幅出力を、マイクロコント ローラー６２とその作動ソフトウェアが使用できるデジタル信号に変更する。さ らに、アナログマルチプレクサ５２は、マイクロコントローラー６２から接続線 ５２ａを通じて信号を受取り、可変ゲイン増幅器５４のゲインを変更もしくは設 定することができる。マイクロコントローラー６２は、システムのソフトウェア の命令に応答して信号を発し、可変ゲイン増幅器５４のゲインを設定し、および 異なる試験を行うために、可変ゲイン増幅器５４のゲインを変更することができ る。

この発明の光照射測定システムは、このシステムによって行う強度測定で得られ る精度を著しく増大できる、出力に実質的に誤りのないシステムを提供するもの である。図８は、この発明のシステムの装置出力と、レーザー光源を利用する凝 集免疫検定システムの代表的な出力とを比較するグラフである。図８に示すよう に、この発明のシステムの出力１３０には、レーザー源を用いる代表的なシステ ムの出力１４０に比べて、望ましくなく重要でない出力の変動とスロープの増大 が実質的にない。

この発明の光照射測定システムには、混合物容器４４と自動ピペット４６の支持 体６０が付随している。試料容器支持体６０には、混合物９７をいくぶん高い温 度に加温し維持するための加熱器（図示せず）と、内容器４４の内容物を攪拌す る電気手段とが収納されている。

処理制御システム３３は、光照射測定システム３２に、図５に示すように節蔵さ れている。処理制御システム３３は、光照射測定システム３２のアナログの入力 と出力、および処理制御システム３３のデジタルデータ処理制御システム間を通 過することができる回路３６を備えているものが好ましい。回路３６は、先に述 べたように、Ａ−Ｄ変換器５６、Ｄ−Ａ変換器８４およびアナログマルチプレク サ５２を備えている。

アナログマルチプレクサ５２は、接続線５４ａと８８ａによって光照射測定シス テムに接続され、さらに接続線５８ａによって、容器４４内の混合物９７を加温 する加熱器の温度制御回路５８に接続されている。アナログマルチプレクサ５２ は、接続線５４ａを通る光検出器４８の増幅出力、接続線８８ａを通じて光源８ ２を通る電流、および容器支持体６０の加熱器への入力を含む入力をサンプリン グする。またアナログマルチプレクサ５２は、接続線５２ａによるマイクロコン トローラー６２からの信号に応答して可変ゲイン増幅器５４を作動させて増幅器 のゲインを変える。図５に示すように、光源８２の強度は、接続線８４ａにより Ｄ−Ａ変換器８４を通ってマイクロコントローラー６２によって制御し変えるこ とができ、光検出器４８の出力を示す信号は、接続線５２ａによりマイクロコン トローラー６２で制御されて、システムの構成を保持しかつ処理制御システム３ ３で種々の試験を行うために増幅を変えることができる。

また処理制御システム３３は、容器４４の電気加熱器を備えた容器支持手段６０ と接続された温度制御回路５８を備えている。温度制御回路は、試薬／試験試料 を試験する前に加温するために支持体６０の電気加熱器を加熱する電気エネルギ ーを与えるため接続されたサーミスタとダイオードを備えている。またこのシス テムは、キュベツト支持手段６０内の磁気運動手段によって運動させられる、キ ュベツト４４内に位置する磁気バーを含む磁気攪拌手段、または攪拌を行うノ（ イブレータを備えている。攪拌手段は、攪拌器インターフェース６８を通じてマ イクロコントローラー６２で作動される。自動ピペット４６はピペットインター フェース５０を通じてマイクロコントローラー６２で作動される。

制御処理システム３３は、マイクロコントローラー６２のような８ビツトの中央 処理装置（Ｉｎｔｅｌ　８０３１がこのようなマイクロコントローラーの好まし い１例である）、標準曲線データ、および強度測定と時間のデータに関する試験 データを記録するのに充分なアドレス空間、例えば少な（とも２キロバイトを有 するランダムアクセスメモリ可変メモリ６４、ならびにシステムの作動と校正の プログラムを記録するのに充分なメモリ、例えば少な（とも２キロバイトを有す るＥＦＲＯＭプログラムメモリ６６を備えている。また制御処理システム３３は 好ましくは、置換可能な試験メモリ１０６、すなわちＧｅｎｅｒａｌ　Ｉｎｓｔ ｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが販売している“Ｓ＋＋＋ａｒｔ　ｃａ ｒｄｓ”のようなカード状メモリ装置を備えているが、このメモリは、対象の各 種の生物学的活性物質の試料を試験する試験法を記憶することができる。このよ うな置換可能な試験メモリによって、この発明の装置は、対象の生物学的活性物 質の新規な改良試験法が開発された時に、この方法を行うために間便に更新する ことができる。

この発明の好ましい態様において、ＥＦＲＯＭプログラムメモリ６６に記憶され た作動プログラムが、ＣＰＵ６２を作動させて、置換可能な試験メモリ１０６に 記憶された試験プログラムを選択してこれを実行する。ＲＡＭ可変メモリ６４は 、ＥＦＲＯＭ６６の作動プログラムまたは置換可能な試験メモ１月０６の試験プ ログラムによって決定されたアドレスに、光照射測定システム３２からのデータ を受け取って記憶する。このようなデータによって、検出器４８が検出した散乱 光の強度と、光測定が行われた時間とを示すことができる。前記ＥＦＲＯＭプロ グラムメモリは、システムを作動させ校正するためのソフトウェアに加えて、各 種試験法に対するデータ処理ソフトウェアを入れることができ、このようなデー タを検索し、被検対象の物質の濃度を示す出力を計算することができる。しかし この発明の好ましい制御処理システムは、置換可能な試験メモリ装置内で、試験 データを検索し、対象物質の濃度を示す出力を計算するソフトウェアを提供する ものである。

制御処理システム３３へのアクセスはキーボードインターフェース７２と磁気カ ードインターフェース７４を経由して行われ、好ましいシステムでは、置換可能 な試験メモリ１０６を経由して行われる。磁気カードインターフェース７４によ って、各種試験用の標準曲線データを必要に応じてＲＡＭプログラムメモリに容 易に記憶させることができ、キーボードインターフェースによって、オペレータ はシステムに対して対話と制御を行うことができる。さらにこのシステムは、制 御処理システム３３に対する１つ以上の出力インターフェースを備えており、こ れらのインターフェースには、感熱式プリンタ出力インターフェース７６．２× ２０ドツトマトリックスＬＣＤ表示器出力インターフェース７８、およびシリア ルポート８０で表され、試験結果などの情報をオペレータに提供し使用できるよ うにする１つ以上の追加の出力インターフェースが含まれている。

この発明の好ましい装置は、自動ピペット４６を備え、試験手順プログラムに応 答して、測定量の試料と試薬を、自動的に取り出し、その試料と試薬を放出して 試験の開始と試験データ収集の信号を送る。

上記のように、光検出器４８からのアナログ強度信号は、Ａ−Ｄ変換器５６でデ ジタル信号に変換され、次いでマイクロコントローラー６２に送られ、このマイ クロコントローラーは、検出された角度θ方向の散乱光の強度を好ましくは時間 の関数として示すデータを、ＲＡＭメモリ６４に記憶させる。次いでこの試験デ ータは処理されて標準曲線データと比較され、対象物質の濃度を提示する。その データは、処理されて、反応の“終点”のデータ（すなわち指定された時間にお けるデータ）および／または反応の変化率および／または反応の最大変化率から 濃度が決定されるが、これらのデータは、時間経過とともに散乱光の強度を測定 することによって決定された。ＲＡＭメモリは、上記の決定のいずれか１つまた は全部についての標準曲線データを、磁気カードインターフェース７４もしくは 置換可能な試験メモリ１０６から与えられる。上記の比較と必要な全ての計算は 、ＥＰＲＯＭ６６および／または好ましくは置換可能な試験メモリ１０６に記憶 されたプログラムを用いてマイクロコントローラー６２で行われ、次に、それぞ れ感熱式プリンタインターフェース７６を通じてプリンタ１２０に出力されるか 、またはＬＣＤ標準器インターフェース７８を通じてＬＣＤ表示器１２２に出力 される。

従って、上記のように、特定の対象物質についての１つ以上の試験手順のソフト ウェアを、好ましい態様の装置に、置換可能な試験メモリ１０６で挿入すること ができ、特定の対象物質および関連する特定試薬の標準曲線データは、オペレー タが、試験を行う前に磁気カードインターフェース７４を介してＲＡＭメモリ６ ４に挿入することができる。従ってこの発明のシステムは、開発される新しい免 疫検定試験に使用することができる。標準曲線データが試験用に開発される仕方 は以下に詳細に述べる。

凝集免疫検定を行って対象の生物学的活性物質の濃度を測定するシステムと方法 を、さらに、図７のフローチャートで説明する。

オペレータは、マイクロコントローラー６２の初期設定を行った後、例えば、機 器診断試験、校正試験または実際の凝集試験を、キーボード７２を用いて、ＬＣ Ｄ表示器１２２に提示されたメニューから選択する。マイクロコントローラー６ ２の作動のプログラムはＥＰＲＯＭ６６に記憶されている。

機器診断試験を選択した場合、マイクロコントローラー６２は、光照射測定シス テム３２を作動させて、光源８２が適正に作動し続けているかを確認する。機器 診断試験の場合は、主として、光源８２は機器に挿入された標準試験キュベツト に対して作動される。この標準試験キュベツトには、散乱光が既知で予想可能な 粒子懸濁液が入っている。機器診断試験中、標準試験キュベツトで散乱された光 が検出され、その強度が、システムを製造している工場で調節され、測定されて 、システムに記憶された、標準試験キュベツトを通過した光の“標準”光強度と 比較される。その上に、光源８２を流れる電流を検出し、その値を、“標準”も しくは初期の値と比較して、光強度制御器８６の適正な作動を確認しかつ照射手 段４２に何らかの誤動作があるか否かを確認することができる。このような試験 によって、光照射測定システムが適正に作動していることが確認される。生成し た光の強度または光源８２の光強度がその標準強度からはずれた場合は、マイク ロコントローラー６２は、接続線５２ａを通じて作動信号をプログラムは、比較 −命令のデータと、訂正調節のデータを持っており、デジタル信号を発信し、Ｄ −Ａ変換器８４を駆動して光強度制御器８６に修正出力を与える。

校正曲線試験では、標準試験液が入ったキュベツトがシステム内に置かれるが、 この標準試験液は、表面が抗体もしくは抗原で感作され既知の予想可能な仕方で 凝集する感作粒子を含有している。既知濃度の標準試験液の凝集剤をこの試験液 と混合し、起こった凝集反応の試験が行われる。ＥＰＲＯＭ６６と置換可能な試 験メモ１月０６に記憶されている作動プログラムと試験手順プログラムは、散乱 光の強度を、好ましくは時系列の測定で読取りを開始する。すなわちシステムオ ペレータが校正試験を選択すると、メニューがシステムオペレータに校正試験の パラメータの入力を促す。システムオペレータがキーボード７２で入力したパラ メータは、システムにデータを与えて、システムに校正試験を実行させ適切な校 正試験手順と比較のための“標準”を回復させる。

図７に示すように、試験パラメータがシステムに入力された後、ＥＰＲＯＭ６６ のプログラムが、試験流体中で起こっている粒子の凝集によって角度θ方向に散 乱された光を示すデジタル化された信号と測定時間を読取り、散乱光強度に対す る第１散乱値のデータとその測定時間をＲＡＭ６４に記憶させる。システムオペ レータが入力した試験パラメータで可変時間遅延が測定された後、マイクロコン トローラー６２が再び、光照射測定システム３２の散乱光出力と測定が行われる 時間とを測定して、第２散乱値データをＲＡＭ６４に記憶させる。試験手順に必 要な散乱光のすべての値が測定されなかった場合は、可変時間遅延の後側の散乱 光値が測定され、その想定値と測定が行われた時間が記憶される。そしてこのプ ロセスは、試験手順が必要とする散乱光のすべての値が測定され、その測定時間 とともに記憶されるまで繰り返される。試験パラメータ中の速度試験が選択され た場合、マイクロコントローラー６２は、単一もしくは複数の凝集速度を研さん し、その速度をＲＡＭ可変メモリ６４に記憶させる。

校正曲線が選択されると、散乱光の第１と第２の値、および第１と第２の測定を 行った時間の間の凝集速度が、ＲＡＭ６４に記憶されている適当な標準曲線デー タと比較される。マイクロプロセッサ６２は、校正試験データと標準曲線データ 間に差があるか否かを測定し、差がある場合には、その差異に対して、ＲＡＭ６ ４に記憶されている標準曲線を示すデータを調節し、ＬＣＤ表示器１２２で“エ ラー”を表示する。このようにして、校正曲線試験によって、システムを、環境 の変化とエージングが原因のドリフト、およびオペレータの操作法による差異に 対して毎日調節することができる。

オペレータが実際の試験を選択したならば、ＥＰＲＯＭ６６からのメニューがＬ ＣＤ表示器１２２に表示され、オペレータに、実行される試験の識別を入力する よう促す。マイクロコントローラー６２は、キーボード７２でシステムオペレー タが入力したデータを用いて、実行される試験を識別し、試験手順プログラムを 好ましくは置換可能な試験メモリ１０６から回復し、置換可能な試験メモリ１０ ６から選択した試験に対して特定の試験パラメータのメニューを表示する。シス テムは、実行されるデータがシステムに存在しない場合、必要に応じてそのデー タを入力するようシステムオペレータを促す。システムオペレータは、このよう なデータを、キーボード７２または磁気カードインターフェース７４で入力でき る。

このようなデータを入力した後、マイクロコントローラー６２は、自動ピペット を作動させ、キュベツト４４内で起こっている凝集反応により角度θの方向に散 乱された光と好ましくは試験の時間を測定することによって試験を開始し、散乱 光値と時間に関する第１データをＲＡＭ６４に記憶させる。実施される特定の試 験とその試験に対して特定のパラメータによって可変巡延が決定された後、マイ クロコントローラー６２は、ＥＰＲＯＭ６６の作動プログラムによって、キュベ ツト４４内で起こっている凝集反応による、角度θ方向からの散乱光値を再び読 み取るよう催促される。散乱光値とその読取り時間の第２読取りに関するデータ もＲＡＭ６４に記憶される。試験手順に必要な全散乱光値が測定されなかった場 合は、可変時間遅延の後、その次の散乱光が測定され、その散乱光値と、散乱が 起こった時間がＲＡＭ６４に記憶される。そしてこのプロセスは、試験手順に必 要な全散乱光値が測定されるまで続（。

速度試験が、実施される特定の試験に含まれている場合は、ＥＰＲＯＭ６６に記 憶されている作動プログラムが、マイクロプロセッサ６２に、散乱光値の記憶デ ータと、各散乱光値の時間の記憶データを回復させ、各散乱光測定の間の変化率 を計算する。これらの変化率は、ＥＰＲＯＭ６６もしくは置換可能な試験メモリ １０６に記憶されている作動プログラムに従って、ＲＡＭ６４に記憶される。こ のプロセスは実施される試験に特定の試験パラメータに対応して何回も繰り返さ れる。

この作動モードでは、マイクロコントローラー６２は、ＥＰＲＯＭ６６もしくは 置換可能な試験メモリ１０６に記憶されている作動プログラムに従つて、実際の 試験から記憶したデータを、ＲＡＭ６４に記憶されているその試験に関する標準 の校正曲線データと比較し、その比較から、キュベツト４４内の試験されている 試験試料に含有されている対象の生物学的活性物質の濃度を決定する。マイクロ プロセッサ６２はこの濃度をＲＡＭ６４に記憶し、結果をＬＣＤ表示器１２２に 表示し、選択された場合、結果をプリンタ１２０で印刷する。濃度の決定は、試 験中の特定の時間、例えば反応の“終点”におけるデータを比較するか、試験中 のこのようなデータの変化率、例えば、最大変化率を比較するか、もしくは、色 々な時間におけるこのようなデータの変化率を比較するか、または所望によりこ れらを組み合わせて行うことによって達成することができる。

機器によって実行できる試験の数は、そのメモリの記憶容量によってのみ限定さ れる。この発明の免疫検定システムが、より特異的な試験を追加することによっ てさらに開発された場合は、メモリは、開発される特異的試験の各々に対応する データを記憶するのに充分なアドレス空間を提供するように拡大できる。その上 に、この発明では、そのシステムで用いられる試薬は、磁気カードもしくはその 他の情報で達成され、試薬の各製造ロフトに対する標準曲線データをシステムに 入力し、製造の差異による重合体粒子および試薬の違いのためにシステムが不正 確にならないようにすることができる。

この発明のシステムによれば、試験を迅速かつ正確に実行することができる。こ の発明の装置はコンピューターで作動され、一部手動であるが一般に使いやす（ 、操作するのに高度の熟練を必要としない。またこの発明の装置は、比較的低価 格で小型なので、医院、小実験室もしくは他の小さな操業で、経費面で有効に、 容易に使用できる。

この発明の免疫検定システムの重要な要素は、システムに、担体粒子として用い られる重合体粒子である。この発明の注目すべき予想外の感度は、感作粒子が、 これを結合もしくは凝縮させる特定の試薬の存在下で、結合もしくは凝集するこ とによって起こり、所定の検定法で利用される、平均粒子径の小さな変化を迅速 に検出できるこの発明の性能によってもたらされるものである。このような結合 を早い段階で検出するには、粒子は粒子径が例えば０．１８８ミフロン±０．０ ミクロンのようにできるだけ均一で、光源からの光と相互作用するのに適してい なければならない。特に、粒子の粒径の分散は、慎重に制御し、非常に狭い粒径 分布の範囲におさめ（すなわち使用される各粒子径についてＣ，Ｖ、　＝±２％ ）、正確な強度の読取りができるようにしなければならない。粒子は、光を散乱 することが可能で、体液内で非特異的に反応しない物質で製造することが重要で ある。

このような重合体粒子の主要成分は、例えばビニル芳香族単量体およびビニルア クリレートエステル単量体である。ビニル芳香族単量体はスチレン、ビニルトル エンもしくはｔ−ブチルスチレンまたはその混合物でもよい。ビニル芳香族単量 体としてはスチレンが好ましい。ビニルアクリレートエステル単量体は、１〜６ の炭素原子のペンダントアルキルエステル基を有する単量体でもよい。ビニルア クリレートエステル単量体として好ましいのは、アクリレート単量体のメチル、 エチル、プロピル、ｎ−ブチル、Ｓ−ブチルなどの変形またはメタクリレートビ ニル単位の変形の例えばメタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル 酸プロピルなどである。

ビニルアクリレートエステル単量体として最も好ましいのはアクリル酸ｎ−ブチ ルである。

この発明の重合体粒子は、バッチもしくは連続添加の重合法、または多段重合法 を含む通常の乳化重合法で製造される。任意に、油溶性もしくは水溶性の開始剤 、および乳化剤、またはｐＨを制御する緩衝剤系を添加してもよい。この発明の 粒子を安定化するのに適した乳化剤としてはイオン乳化剤もしくは非イオン乳化 剤がある。イオン界面活性剤の中の、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、 ジフェニルオキシドジスルホン酸アルキル、およびジヘキシルスルホコハク酸ナ トリウムが適切である。これらの系では、水が分散媒であるが、合成の乳化剤は 粒子を安定化するのに使用することができる。

ひとつの方法では、乳化剤は、所定量の単量体を可溶化するミセルが生成するよ うな濃度で用いられ、その場合単量体の大部分は小さな液滴となって分散される 。開始剤を添加すると、さらに多くの単量体を吸収するこれらのミセル内での重 合が容易になる。単量体はこれらミセルの部位に拡散するのでミセルはより多く の単量体の重合場所として働き、その結果単量体液滴は上記目的のための溜め場 所として作用する。

任意に播種乳化重合反応が利用される。この場合、ある濃度の小さな種粒子が、 その他のモノマーを加えて別の成長をさせる部位として使用されその結果共重合 体が形成される。この重合反応の温度は約７０°〜約９５°である。

変性単量体の重合を誘発して共重合体を生成するのに適切な水溶性開始剤として は、特に限定はないが、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウムのようなある種の無機 酸化剤が含まれ、各種の過硫酸塩、例えば過硫酸ナトリウムもしくは過硫酸カリ ウム、好ましくは過硫酸ナトリウムが用いられる。過硫酸ナトリウムは、好まし くは共重合体の約０．１〜１．０重量％の量で用いられ、さらに好ましくは約０ ．２〜約０，５重量％である。

一般に、ビニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体とを、前者の 単量体対後者の単量体の重量比を約１：３〜３：１で結合させて共重合体が形成 される。ビニル芳香族単量体対ビニルアクリレートエステル単量体の好ましい重 量比は、この２つの単量体の重量比に基づいて１：１である。

これらの粒子はタンパク質結合性変性単量体で感作させることができ、この単量 体は、重合体粒子を含有する他の単量体のバルクと共重合させるか、または例え ば粒子の表面のコーティングとして全単量体投入量の小部分と共重合させること によって粒子に結合させることができる。

タンパク質結合性変性単量体の重量分率は、これがタンパク質を捕捉する効率に よって決定される。一般にタンパク質結合性変性単量体は、共重合体に、その約 ０．５〜約１０重量％の範囲の量で添加される。タンパク質結合性変性単量体と してはアクリル酸を使用することが好ましく、共重合体の約１〜約３重量％の範 囲で用いるのが好ましい。

重合工程において、粒径は、使用される乳化剤の量または種粒子の濃度によつて 決定することができる。種の濃度は、好ましい粒径を生成するのに必要な量とし て計算される。一般に粒子は約０．１〜１ミクロンであるが、この発明の光散乱 システム用に好ましい粒径は０．１８ミクロンである。

この発明のシステムでは、対象の生物学的活性物質の濃度は、粒子が凝集する際 のその光散乱特性で決定される。重合体粒子が凝集する際に光を散乱する性質は 、その屈折率に関連がある。しかし重合体粒子は体液と非特異的に反応してはい けない。従ってこの発明に用いるのに適した重合体粒子はこれらの特性を兼ね備 えていなければならない。

粒子のビニル芳香族単量体含量が高いと、屈折率が好ましいので、凝集反応を最 も早く検出することが証明されたが、その時粒子が、体液と非特異的に相互に反 応した。逆に粒子のビニルアクリレートエステル単量体の含量が高いと、粒子は 体液と非特異的に容易に反応することはなかったが、ビニルアクリレート単量体 の屈折率が低いために凝集反応の検出が困難であった。従うて、凝集反応を早期 に検出する必要があることと、粒子が体液との非特異的相互反応に対して不活性 である必要があることの釣合をとって、ビニルアクリレートエステル単量体対ビ ニル芳香族単量体の１＝１の重量比がこの発明に大きな予想外の利点をもたらす ことが見出された。

また重合体粒子は、抗原もしくは抗体のような対象の生物学的活性物質の充分な 量が粒子の表面に不可逆的に、確実に結合するように処理されなければならない 。

重合体粒子が製造された後、所望の抗体もしくは抗原を、カルボジイミド法とし て知られている中間ルートを通じて重合体粒子に結合することができる。カルボ ジイミド法の方が好ましいが、タンパク質の粒子への結合を容易にする当該技術 分野で公知のいずれの結合法も使用することができる。カルボジイミドは、ＨＮ −Ｃ＝ＮＩＩの組成を有する尿素の対称無水物を含む一群の化合物である。その 水素原子を他の置換基で置換してＮ、　Ｎ’−ジ置換カルボジイミド類を得るこ とができる。これらのカルボジイミドに対する水の酸触媒付加反応、すなわち水 和反応を行うと尿素を形成し、アミド結合とペプチド結合を合、成することがで きる。ペプチド結合は、水の脱離反応、すなわち一方が一つだけ遊離カルボキシ ル基を有し、他方が一つだけ遊離アミノ基を有する２つの適切に保護されたアミ ノ酸の縮合反応によって生成され、合成は特異的なアミド結合の生成に制限され る。

Ｎｉｌ、−Ｘ−ＣＯＯＲ＋　Ｒ’　ＮＥＩ−Ｙ−ＣＯＯｔｌ　−Ｒ’　？ＪＲ− Ｙ−ＣＯＮＨ−Ｘ−ＣＯＯＲ＋　ｎ２゜この縮合反応は、Ｊ、Ａｍｅｒ、　Ｃｈ ｅＩＩｌ、　Ｓｏｃ、、７７巻、１０６７−１０６８頁、１９５５年、５ｈｅｅ ｈａｎ、　Ｊ、Ｃ，，１ｅｓｓ、　Ｇ、Ｐ、の“Ａ　Ｎｅｗ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆ ｏｒ　ＦｏｒｍｉｎｇＰｅｐｔｉｄｅ　Ｂｏｎｄｓ”およびＣｈｅｗ、　Ｉｎｄ 、　（Ｌｏｎｄｏｎ）、１０８７−１０８８頁、１９５５年、Ｋｈｏｒａｎａ、 　Ｈ，Ｇ、の“Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｌｃａｒｂｏｄ ｉｉｍｉｄｅ　１ｎＴｈｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ″に 教示されているようにして、ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）によっ て行うことができる。

この反応は以下のように表される： ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ＋　Ｒ’Ｃ０ＯＨ＋　Ｒ”Ｎ１３−　Ｒ’Ｃ０ＮｆｌＲ″＋ＲＮ ｔｌＣＯＮＨＲ但し、Ｒ＝Ｃ，Ｈ，、。

Ｒ’＝保持体； Ｒ”＝タンパク質の主鎖；および Ｃ０Ｎ＝支持体とタンパク質問の共有結合部。

この方法は、水分に対して敏感ではないので水性媒体中で実施することができる が、一方、混成無水物が生成する方法は無水の条件下で実施しなければならない 。温度と、アミンおよび溶剤の性質は、アミドの収率に影響するが、酸の収率に はほとんど影響しない。

ＤＣＣが縮合の手段として最初に用いられたが、その他のカルボジイミドも広（ 用いられている。例えばＥＤＣすなわち１−エチル−３−（３−ジメチル−アミ ノプロピル）カルボジイミド塩酸塩およびＣＭＣすなわち１−シクロへキシル− ３−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホナート が成功裡に使用されている。

Ｎ、　Ｎ’−ジシクロヘキシル尿素はＤＣＣから製造される尿素であるが、はと んどの有機溶媒と水性溶剤に対する溶解度が非常に低く、通常結晶化して分離す る。しかし、ＥＤＣとＣＭＣの対応する尿素誘導体は水溶性であり、ペプチドか ら容易に分離される。それ故にＥＤＣとＣＭＣは、合成が水性媒体中で担体に固 定化された１つの反応試薬と行われるときに好ましいものである。この合成法は 結晶化と未反応の出発物質がない簡便な一般の方法であり、反応副生物は簡単に 洗浄除去され、支持体にもしくはこの場合に利用できるように粒子に結合された アミドによって捕捉された抗体／抗原が残る。

重合体粒子の表面は、実施される特定の試験によって、特定の仕方で化学的にさ らに処理されるが、これについては、この発明の特異的免疫検定法の下記実施例 で詳細に説明する。

また重合体粒子は、所望の特異的凝集反応が著しく阻害されることなく、自発的 な非特異的凝集が起こらないことが保証されるように処理されねばならない。こ の処理は、血清の試験試料の場合、米国特許第４．５３６．４７８号に記載され ているように、反応混合物に、ハロゲン置換カルボン酸を添加することによって 達成された。その開示事項は本願に援用する。

この発明は、この発明が提供するテオフィリンの新規な試験法の下記実施例を参 照することによって、より完全に理解されるであろう。下記のテオフィリンの試 験法はこの発明の１用途を例示したものであってこの発明を限定するものではな い。

上記のように、この発明は、流体試料中の対象の多くの生物学的活性物質の濃度 の正確な定量測定を高信頼度でかつ比較的低価格で行うのに有効な高感度のシス テムと方法を提供するものである。この発明は、現在用いられている凝集試験シ ステムより１，０００〜１．０００゜０００倍の感度である。

上記のように、テオフィリンの凝集試験は、直接法で行うのが好ましく、少なく とも１つの緩衝剤と１つの抗テオフィリン抗体とを含有する試薬溶液と、結合さ れたテオフィリン抗原で感作された均一な大きさの共重合体粒子の緩衝懸濁液を 含有する試薬懸濁液とが準備される。

上記の試薬溶液は以下のようにして準備される。

Ａ、凝集反応緩衝液の調製 １、緩衝液中の原料（最終濃度で示す）ａ、Ｎａｌ■／ＮａＨ２ＰＯ４：　Ｏ， ＩＭ、　ｐＨ７，４ｂ、　ＮａＣ１：　０．１５１１ ｃ、ＢＳＡ：０．１％ ｄ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　８０００：２．７％ｅ、　ＮａＮ３： ０．１％ ｆ、モノクローナル抗テオフィリン抗体：緩衝液ＩＬ当り約３２０μＬ ２、手順 ａ、　１０　Ｗ／Ｖ％の脱イオン水溶液として（ＰＥＧ）８０００溶液を調製す る。

ｂ、ＮａＪ／ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＣ１、ＢＳＡおよびＮａＮ３を５００ｍ１の 脱イオン水に入れ次いで脱イオン水を添加して７３０ｍ１に調製する。

ｐＨを正確に７．４に調製する。

Ｃ８上記すの調製液に、攪拌しながら上記の１０％（ＰＥＧ）８０００溶液を２ ７０ｍ１適下する。

ｄ、モノクローナル抗テオフィリン抗体を添加する。緩衝液ＩＬ当り約３２０μ Ｌの抗体が必要であるが、正確な量は、以下のＤ項で述べるようにして調製した 個々のテオフィリン粒子試薬（Ｔ　Ｐ　Ｒ）のバッチの活性に合わせるために滴 定しなければならない。得られた反応緩衝液はＴＰＲの活性に合致し、定量凝集 免疫検定システムにおける所望の標準曲線データを提供する。

上記のようにして作製した直径が０．１８ミクロンのカルボキシ変性共重合体粒 子を下記のようにして洗浄して脱イオン水による９％懸濁液を調製した。

Ｂ、洗浄した９％粒子懸濁液の調製 １、原料 ａ、ＣＭＬ粒子、直径０．１８μｍ ｂ、洗浄用のカチオン／アニオン混合イオン交換樹脂（ＢｉｏＲａｄＡＧ　５０ １−Ｘ８） Ｃ１脱イオン濾過水 ｄ、ガラス濾過器、５ｈｌガラスビーカー、２５０ｍ１枝付きガラスフラスコ、 撹拌棒、攪拌板、時計皿 ２、手順 ａ、ＣＭＬ粒子を、脱イオン水で、約９％固形分の懸濁液に希釈する。

ｂ、ＣＭＬ粒子懸濁液をイオン交換樹脂と混合する。５ｈｌガラスビーカー中、 単位重量の樹脂当り１／２重量のＣＭＬ固体。

Ｃ，マグネチックスターラー棒を入れて時計皿で蓋をし、室温で２時間縁やかに 攪拌する。

ｄ、　２５０ｍ１の枝付きガラスフラスコ上に取り付けたガラス濾過器に入れて 、懸濁液がフラスコに濾過器を通じてちょうど移動するまで、フラスコに対する 真空ラインを徐々に開くことによってフラスコにゆっくり濾過する。

ｅ、濾液を褐色のガラス容器に移し、しっかりと密封し、使用するまで室温で保 存する。

９％の粒子懸濁液の作製に続いて試薬懸濁液が次のようにして準備される。

ＰＡ）成分の製造 １、原料 ａ、１．３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン（ＤＡＰ）ｂ、テオフィリン− ８−酪酸ラクタム（ＴＢＡＬ）Ｃ，ジオキサン、分光光度法用グレードｄ、緩衝 液、Ｎａ２ＣＯ３０４墓、ｐＨ８，５゜緩衝液を製造してｐｉｌｌを８．５に調 節した後、容器を窒素ガスで置換し、しっかり蓋をして、大気中のＣＯ２によっ てｐＨが低下するのを防止する。上記のことにかかわらず、Ｎａ２ＣＯ３緩衝液 のｐｎは、使用する前にそれぞれ検査して必要なように再調節しなければならな い。

ｅ、水浴、しっかりしたシール付きで褐色のガラス製反応容器、および反応容器 の大きさに適合したマグネチックスターラーと撹拌棒。

２、手順 ａ、２０ｂｇのＤＡＰを４５ｍ１の緩衝液に溶解する（ＤＡＰ溶液）。

ｂ、１ｍｌジオキサン当り１ｍｇのＴＢＡＬを溶解する。

Ｃ１反応容器中でＩＱ＋＋１のＤＡＰ溶液を１８．５ａ＋１のＮａ２ＣＯｓ緩衝 液と混合し、撹拌棒を入れ、混合物をマグネチックスターシー上で、水浴中４℃ に冷却する。

ｄ、混合物を迅速に攪拌し１．５＋ａｌのＴＢＡＬを反応混合物に滴下する。

ｅ、攪拌速度を下げて、最小限４時間、ゆっくり攪拌しながら４℃の温度に保持 する。

ｆ、最小限４時間経過後、反応混合物を冷緩衝液で１：４に希釈し使用するまで ４℃で保存する。この生成物は、４℃に保持して少なくとも６力月間は次の反応 に対して使用できる。

ｇ１反応生成物（ＴＨＰＡ）は、緩衝液のブランクに対して２７４ｎｍの波長光 の光学濃度を読み取ることによってテオフィリンの存在を検査することができる 。ＯＤ２フ４の範囲＝０．６５−ｏ、ｇｏ。

Ｄ、テオフィリン粒子試薬（ＴＰＲ）の調製１、原料 ａ、洗浄されたＣＭＬ粒子、上記の手順Ｂ、２．によって得た９％の脱イオン水 懸濁液。

ｂ、ＴＨＰＡ、上記の手順Ｃ８２，によるもの。

ｃ、ＥＤＣ，１−エチル−３−（３−ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミ ド。

ｄ１反応緩衝液、Ｎａ２ＣＯｓ　Ｏ，ＬＭ、　ｐＨ８，５゜ｅ、洗浄緩衝液、Ｎ ａ２Ｂ／ＮａＨ２ＰＯ，Ｏ，ＩＭ、　ｐＨ７，４；　ＮａＣ１０，１５Ｍ　；ツ イーン２８０．０５％；　ＮａＮ５　Ｏ，１％。

ｆ、撹拌棒が入ったキャップ付き５０１１容量の褐色ガラスびん。

ｇ、使い捨てシリンジフィルター、０．２２μｍ１酢酸セルロース、５ｍｌプラ スチック製シリンジ。

２、手順 ａ、ＣＭＬ粒子の約９％の懸濁液５ｍｌを０．２２μｍのシリンジフィルターで 清浄なガラス容器に濾過して均一な単一粒子分散液を保証する。

ｂ、５ｈｌ褐色ガラスびん中で、１２ｍ１のＮａ２ＣＯｓ緩衝液、４ｍｌの濾過 した９％ＣＭＬ粒子および２ｍｌのＴＨＰＡを混合する。

マグネチックスターシー上に置いて中程度の攪拌を行う。

Ｃ，３３６ｍｇのＥＤＣを３ｍｌの脱イオン水に溶解する。

ｄ、マグネチックスクーラーを反応容器の下で回転させて高速攪拌を行い、ＥＤ Ｃ溶液を容器に滴下する。添加した後、高速攪拌を６０秒間続は次いで回転を下 げてゆっくり攪拌する。

ｅ１反応を室温（２２〜２５℃）で１８時間続けさせる。

ｆ、１８時間後、反応容器を攪拌器から取外す。１０．５ｍｌずつの反応混合物 を２本の５０ｍ１ポリプロピレン製丸底遠心分離管に入れ、４℃〜１２℃に設定 した遠心分離冷却を行い、２６．８９０ｘｇで３０分間遠心分離する。

ｇ、ｌｈｌの洗浄緩衝液に再懸濁させる。

ｈ、最初の２１ｍ１の合計体積に対して最終の再懸濁を３回繰り返し、清浄な褐 色ガラスびんに移す。洗浄緩衝液は保存緩衝液でもある。

ｉ、シっかり蓋をして４℃で２〜３日間保存し、使用する前に安定化させる。

テオフィリン粒子試薬を調製する場合、反応混合物の好ましい最終体積は上記の ように２１１１１である。しかし有効性は低下するが１５〜２６Ｉｌｌの最終体 積を利用することができる。同じ比率の試薬を製造する限り、この混合物の倍量 （例えば１／３ｘ、　２ｘ、　４ｘ）を同じ有効性で製造できる。さらに、１０ ｍｇ／ｍｌを越えるＥＤＣの濃度が有効であるが、１６＋ｎｇ／ｍｌの濃度が、 検定中、最大活性のＴＰＲを与える。その上、上記のＴＨＰＡの比率は最適であ ると考えられるが、ＴＨＰＡの比率は、上記比率の１／１０以下〜１０倍の範囲 で有効である。

二の発明のシステムでの試験では、血清の試験試料と試薬溶液と試薬懸濁液とが 混合され、試験試料中のテオフィリンの濃度が次のようにして決定される。１． ２５ｍ１の凝集反応緩衝液（上記の手順Ａ。

２、によって調製された第１試薬）を４＋１のポリスチレン製の四角形キュベツ ト（図５の４４）に入れて３７℃に加温する（このキュベツトがこの発明の好ま しい装置内にあればこの発明の装置によって自動的に３７℃に加温される）。１ ０μＬのヒト血清の試験試料を凝集反応緩衝液に添加し、例えばキュベツトを振 盪して、徹底的かつ迅速に混合する（キュベツトがこの発明の好ましい装置内に あれば、マグネチック攪拌手段もしくは振動器によつて自動的に攪拌される）。

次に上記混合物を、２５μＬのテオフィリン粒子試薬（上記手順り。

２、で調製した第２試薬）に添加して混合する。次いで凝集反応が進行し、散乱 光を測定するよう構成されたいずれかの装置で測定することができ、試験試料中 のテオフィリンの濃度を決定するのに利用することができる。このような装置は 好ましくは、試料中のテオフィリンの濃度を測定するために、温度を制御し、反 応速度もしくは反応終点を測定し、標準曲線データを内部記憶し、その標準曲線 を内部で校正し、そのデータをアクセスできなければならない。

この試験は、最適の感度と速度で行うため、この発明の装置で、第１試薬すなわ ち凝集反応緩衝液とヒト血清試験試料をキュベツト中で混合した後、装置内に置 くことによって行われる。この装置には、図９．１０および／または１１に示す データに相当する標準曲線データがそのメモリに記憶されていることは分かって いる。この標準曲線データは、血清１ｍｌ当り１〜４０μｇのテオフィリンを含 有する血清試料をこの発明のシステム、方法および装置で試験することによって 得られたものである。その上に、この装置は、記憶されているプログラムによっ て予め校正されて、精度に影響する変数に対し、記憶されている標準曲線データ を調節されていることが好ましい。

次いでオペレータは、装置に命令し、装置から提示されるメニューから実際のテ オフィリン試験を選択し、装置が要求する試験についてのあらゆる情報を入力す る。　、− テオフィリン粒子試薬すなわち試薬懸濁液を自動ピペットで採取して装置のキュ ベツトに添加し、そのマグネチック混合手段で徹底的にかつ迅速に混合する。装 置は自動的１；試験を“開始し”、中に記憶されたプログラムに従って作動し、 光検出器の出力をｌｌ１ｖで読み取りかつ測定した時間を読み取る。例えば、装 置は、試験に入って９０秒後の光検出器の出力を読み取って、そのｍＶ値を、図 ９の校正標定することができる。例えば光検出器のｍＶの出力が１４００ｍＶな らば、試験試料中のテオフィリンの濃度は１ｍｌ当り２２μｇである。速度試験 が測定もしくは測定の確認に用いられる場合、装置は例えば光検出器のｍＶの出 力を５秒間隔で測定し、その勾配を計算し１．その勾配を図１０の標準曲線デー タと比較して試験試料中のテオフィリンの濃度が決定される。この発明のテオフ ィリンの試験によれば、最大反応速度のデータによって、試験試料中のテオフィ リンの濃度の非常に信頼性の高い測定を行うこと牟できる。従って、データの最 大変化率（すなわち勾配）を計算し、図１１の最大比率のデータと比較して試験 試料中のテオフィリンの濃度が測定される。

この装置では、パラメータとしてｔｉＶ／ｈを使う場合、反応とその後の標準曲 線が、通常３０秒〜５分間の反応時間について測定され記憶される。反応中の期 間内で、装置のいずれかの２つの読取り値開の数学的勾配は、いずれの時間間隔 でも起こるが、５秒間隔で起こったものが好ましく、ａ＋Ｖ／ｗｉｎに正規化し て濃度に対してプロットすることができて、有用な標準曲線（図１０）が得られ る。このようなデータから決定される最大勾配も、この発明の結果として、テオ フィリンの濃度の特に信頼性の高い尺度である（図１１）。

先に述べてきたことは、この発明の好ましい態様を構成するものであるが、この 発明はその他の多くの形態をとることができることは認識されるべきである。例 えば、この発明のシステムと方法は本願明細書に記載されたテオフィリンの特定 の試験を実施することに限定されるものではなく、開発中もしくは将来開発され る他の多くの試験を実施するのに利用することができる。従って、この発明は、 以下の特許請求の範囲の範囲でのみ限定されるべきであることは理解されるであ ろう。

国際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．被検流体試料の容器を収納し、高強度の実質的に単色光の非レーザー光のカ ラムを流体試料容器に導入し、光のカラムの外側に散乱され、光のカラムに対し て鋭角の前方向に流体試料容器から走行する光の強度を検出し、非常に低い散乱 光強度で、誤りのない高い出力を提供するよう構成された光照射測定システムと ；上記の誤りのない出力を用いて、上記の光照射測定システムの出力と流体試料 容器中の対象の物質の濃度とを関連付けるデータを生成し記憶し、対象の物質の 標準曲線データを記憶し、光照射測定システムの出力から生成したデータと記憶 された標準曲線データとから流体試料容器中の対象の生物学的活性物質の濃度を 決定するように構成された処理制御システムと； からなる凝集免疫検定試験を行う装置。
2. ２．光照射測定システムが： 前記流体試料と１つ以上の試薬の混合物とを保持する透明な容器であって、その 試薬が、優れた屈折性と、対象の物質の抗原もしくは抗体と結合できる表面の官 能基で感作された表面とを提供する均一な大きさの重合体粒子の緩衝懸濁液を少 なくとも含有している上記透明容器と； 高強度の光の前記カラムで前記透明容器を通じて前記混合物を照射する手段であ って、光源と、光をこの光源から前記容器中の前記混合物に導く手段を備えた照 射手段と；前記照射光経路に対して約１０°〜約２０°の鋭角の前方方向に混合 物によって散乱された光を検出する検出器とからなり；前記処理制御システムが ； 前記の検出された散乱光の強度に比例するデジタル試験データを生成する手段と ； 検出された散乱光の強度を示すデジタル試験データを記憶し、散乱光の強度の関 数として対象の物質の濃度を示す他のデータを記憶するメモリと； 記憶された試験データを、メモリ中の他のデータと比較して対象の物質の濃度を 決定するデータ処理手段と；前記の試験試料中の前記対数物質の濃度の定量測定 を行う前記データ処理手段に連結された出力手段とからなる、請求項１記載の装 置。
3. ３．前記照射手段が、高強度の発光ダイオードと、前記発光ダイオードの強皮を 制御する制御手段とを備えている請求項２記載の装置。
4. ４．前記照射手段が、さらに、前記発光ダイオードからの光を前記透明容器内の 前記混合物に導くコリメータと、前記光源と前記コリメータ間に位置する孔あき 板とを備えている請求項３記載の装置。
5. ５．前記光の波長が約６６０ナノメートルである請求項３記載の装置。
6. ６．前記制御手段が、前記発光ダイオードに連結する、制御された電源、前記光 源の電源を制御する手段、および前記光源の強度を監視し、前記電源を制御して 前記光の強度を選択されたレベルに維持する手段を備えている請求項３記載の装 置。
7. ７．前記光源の強度を監視し前記電源を制御する前記手段が、前記光源からの光 を受ける位置にありかつ電源を制御する信号を与えて前記光の弧度を前記の選択 されたレベルに維持するよう構成された光強度検出器を備えている請求項６記載 の装置。
8. ８．前記検出器が光検出器を備えている請求項２記載の装置。
9. ９．前記検出器が、さらに前記容器と前記光検出器との間に孔あき板を備え、光 検出器に到達する光を、前記コリメータの光の方向に対して鋭角をなして走行す る光に限定する請求項８記載の装置。
10. １０．前記メモリがランダムアクセスメモリを備え、前記データ処理手段が、マ イクロコントローラーと、前記システムに対する作動プログラムを記憶する第２ メモリとを備えている請求項２記載の装置。
11. １１．さらに、複数の対象物質のいずれかの標準曲線データを前記ランダムアク セスメモリに入力する手段を備えている請求項１０記載の装置。
12. １２．前記重合体粒子の粒径が約０．１０ミクロン〜約０．４０ミクロンである 請求項２記載の装置。
13. １３．前記重合体粒子の粒径が０．１８ミクロン±０．０１ミクロンである請求 項１２記載の装置。
14. １４．前記メモリが、デジタル試験データ値の時間に対する変化率とそのデジタ ル試験データの測定時間を示す別のデータを記憶し、データ処理手段が、上記の 記憶されたデジタル試験データと時間から、そのデジタル試験データの変化率を 計算し、別の記憶データと比較して対象物質の濃度を決定する請求項２記載の装 置。
15. １５．前記の光照射測定システムが、第１孔あき板の背後に約１．３２０インチ の間隔をおいて光源を備え、前記第１孔あき板が約０．２００インチの直径のオ リフィスを形成し、前記第１孔あき板がコリメーティングレンズから０．７９０ インチの間隔をおいて位置し、直径が約０．２００インチの光のカラムを提供し 、前記コリメーティングレンズが前記流体試料容器の中心部から約１．４５９イ ンチの間隔を置いて位置している請求項１記載の装置。
16. １６．前記の光照射測定システムが、直径が約０．１５２インチの１つの孔を形 成している光遮断板の背後に光検出器を備え、前記光遮断板の孔と前記光検出器 とが、光のカラムに対して約１０°〜約２０°の鋭角で光のカラムの経路からは ずれた軸上にある請求項１記載の装置。
17. １７．前記処理制御システムが、光照射測定システムから光の強度に関するデー タを生成し、光照射測定システムの校正された出力に関するデータを記憶し、お よび前記の光照射測定システムの可変電流供給を制御して光源の強度を保持して 校正された出力を与えるよう校正されている請求項１記載の装置。
18. １８．前記システムが、前記光検出器の出力と接続された可変ゲイン増幅器を備 え、前記処理制御システムが、異なる試験に対して、可変ゲイン増幅器のゲイン を変える請求項１６記載の装置。
19. １９．前記処理制御システムが； 散乱光の強度に関するデジタル情報を生成する光照射測定システムの誤りのない 出力に対するＡ−Ｄ変換器と；上記Ａ−Ｄ変換器に接続され、散乱光の強度に関 するデジタル情報を受けて装置を作動させる中央処理装置と；対象の生物学的活 性物質の複数の濃度に関連する散乱光強度に関するデータを記憶し、かつ光照射 測定システムの作動に由来する複数のデジタルデータと時間のデータを記憶する のに充分なアドレス指定可能の情報記憶容量を有するランダムアクセスメモリ、 装置を作動させるプログラムを記憶し、上記ランダムアクセスメモリからの情報 を記憶し検索し、そこに記憶されたデータと装置の作動から得られるデータとか ら対象の生物学的活性物質の濃度を決定する、電気的にプログラム可能なＲＯＭ と； 少なくとも１つの情報入力装置と１つの情報出力装置と；からなる請求項１記載 の装置。
20. ２０．前記の処理制御システムが、１以上の対象物質に関する試験プログラムと 標準曲線データを記憶するのに充分なメモリを有する装置へ挿入しかつこの装置 から取り出すよう構成された置換可能な試験メモリを備えている請求項１記載の 装置。
21. ２１．前記流体試料容器が、実質的に平行な側面を有する透明な試料容器で構成 されている請求項１記載の装置。
22. ２２．光照射測定システムとＡ−Ｄ変換器を相互連結して、中央処理装置に光照 射測定システムからの複数の入力を与えるアナログマルチプレクサを備えている 請求項１９記載の装置。
23. ２３．少なくとも、均一な大きさの小粒子の懸濁液を含む１つ以上の試薬であっ て、その小粒子が、高屈折率を与えるよう選択された１つの単量体と、上記小粒 子が生体の血清と非特異的に反応するのを阻害するよう選択されたもう１つの単 量体との共重合体で構成され、前記粒子は、その表面が対象の生物学的活性物質 に対して感作されている１つ以上の試薬を準備し； 前記１つ以上の試薬を、対象の生物学的活性物資の被検流体と混合して、前記粒 子と反応を起こさせて前記粒子を凝集させ；光のカラムを生成して、これを中心 光軸に沿って混合された１つ以上の試薬と生体血清の凝集反応混合物に導き；中 心光軸から鋭角ではずれた方向に、前記凝集反応によって粒子が散乱した光の強 度を測定し； 前記散乱光の強度の測定値から、流体中の対象の生物学的活性物質の濃度を決定 する； ことからなる凝集免疫検定法。
24. ２４．前記準備段階が、対象の生物学的活性物質に対する抗原もしくは抗体を結 合させて感作された粒子の緩行懸濁液からなる試薬懸濁液を準備し； その試薬懸濁液を被検粒体と混合し凝集反応を行わせることからなる； 請求項２３記載の凝集免疫検定法。
25. ２５．粒子が約０，１０ミクロン〜約０．３５ミクロンの粒径を有し、光が約６ ６０ナノメートルの波長の光を含有し、その光の強度が、約１０°〜約２０°の 鋭角方向で測定される請求項２３記載の方法。
26. ２６．前記の均一な大きさの小粒子が約０．１０〜約０．４０ミクロンの粒径範 囲内にあり、前記の１つの単量体が芳書族ビニル単量体で、前記の他の単量体が ビニルアクリレートエステルの単量体であり、前記鋭角が中心光軸から約１０° 〜約２０°傾斜している請求項２３記載の方法。
27. ２７．前記の均一な大きさの小粒子が、０．１８ミクロン±０．１ミクロンの粒 径範囲内にあり、前記鋭角が約１７°である請求項２６記載の方法。
28. ２８．凝集した粒子によって、中心光軸から傾斜した鋭角方向に散乱された光の 強度を複数の既知の時間に測定し、その測定した強度と時間を記憶させて、各種 濃度の対象の生物学的活性物質の光強度と時間を予め測定し記憶しておいた数値 と比較し、前記生体血清中の生物学的活性物質の濃度を決定する請求項２３記載 の方法。
29. ２９．複数の既知の時間に散乱された光の強度の複数の前記記憶値を強度の変化 率を計算するのに用い、その強度の変化率を記憶し、対象の生物学的活性物質の 散乱光の強度の変化率の予め測定された値と比較して、前記生体血清中の生物学 的活性物質の濃度を決定する請求項２８記載の方法。
30. ３０．前記準備段階が、少なくとも緩衝剤と対象の生物学的活性物質に対する抗 体とを含有する第１試薬を準備し、ついで対象の生物学的活性物質に対する上記 抗体に対する抗原を結合された、前記の均一な大きさの小さな共重合体粒子の緩 衝懸濁液を含有する第２試薬を準備することからなる請求項２３記載の方法。
31. ３１．対象の生物学的活性物質がテオフィリンであり、第１試薬の抗体がモノク ローナル抗テオフィリン抗体であり、第２試薬の抗原がテオフィリン−８−ヒド ロキシプロピルアミンであり、テオフィリンの濃度が凝集反応の阻害程度から決 定される請求項３０記載の方法。
32. ３２．体液と感作ラテックス粒子とを接触させることからなる体液の処理法であ って； ラテックス粒子が、ビニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体と を約１：３〜３：１のビニルアクリレートエステル単量体対ビニル芳香族単量体 比率で含有し、感作されたラテックス粒子と、体液とを接触させて抗体／抗原反 応を起こして抗体／抗原／ラテックス粒子複合体を形成することからなる体液を 処理する方法。
33. ３３．スチレン、ビニルトルエン、ｔ−ブチルスチレンおよびその混合物からな る群から選択されるビニル芳香族単量体と、１〜６の炭素原子のペンダントアル キルエステル基を有するビニルアクリレートエステル単量体とを含有し、そのビ ニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体が、約１：３〜３：１の 重量比のビニルアクリレートエステル単量体対ビニル芳書族単量体で用いられ、 さらに、ビニルカルボン酸であるタンパク質結合性変性単量体を、ビニル芳香族 単量体およびビニルアクリレートエステル単量体の約０．５〜約１０重量％含有 するラテックス粒子。
34. ３４．ビニル芳香族単量体とビニルアクリレートエステル単量体が約１：１の比 率で用いられる請求項３３記載のラテックス粒子。
35. ３５．ビニルアクリレートエステルが、メタクリレート、ｎ−ブチルアクリレー ト、Ｓ−ブチルアクリレートおよびその混合物からなる群から選択される請求項 ３３記載のラテックス粒子。
36. ３６．ビニルカルボン酸が、アクリル酸、メチルアクリル酸およびその混合物か らなる群から選択される請求項３３記載のラテックス粒子。
37. ３７．タンパク質結合性変性単量体が、共重合体の約１．０〜３．０重量％の濃 度で用いられる請求項３３記載のラテックス粒子。
38. ３８．前記ラテックス粒子が約０．１〜１．０ミクロンである請求項３３記載の ラテックス粒子。
39. ３９．前記ラテックス粒子が約０．１８ミクロン〜約０．２ミクロンである請求 項３３記載のラテックス粒子。
40. ４０．ｎ−ブチルアクリレート単量体とスチレン単量体を、約１：３〜３：１の 比率のｎ−ブチルアクリレート単量体対スチレン単量体の比率で含有し、共重合 体を形成し、診断免疫検定法の用途に用いられるラテックス粒子。
41. ４１．ｎ−ブチルアクリレート単量体とスチレン単量体が、約１：１の重量比で 結合している請求項４０記載のラテックス粒子。
42. ４２．ラテックス粒子がさらに、連結法によってタンパク質をラテックス粒子に 結合させるタンパク質結合性変性単量体で変性され、このようにしてラテックス 粒子が感作され、その感作されたラテックス粒子が診断免疫検定法の用途に用い られる請求項４１記載のラテックス粒子。
43. ４３．タンパク質結合性変性単量体がカルボン酸である請求項４２記載のラテッ クス粒子。
44. ４４．タンパク質結合性変性単量体が、共重合体の約０．５〜１０．０重量％の 濃度で使用される請求項４２記載のラテックス粒子。
45. ４５．タンパク質結合性変性単量体が、共重合体の約１．０〜３．０重量％の濃 度で使用される請求項４４記載のラテックス粒子。
46. ４６．前記ラテックス粒子が、約０．１〜１．０ミクロンである請求項４２記載 のラテックス粒子。
47. ４７．前記ラテックス粒子が約０．１８〜０．２０ミクロンである請求項４６記 載のラテックス粒子。
48. ４８．ビニル芳香族単量体、ビニルアクリレート単量体およびタンパク質結合性 変性単量体からなり、ビニルカルボン酸である前記タンパク質結合性変性単量体 がタンパク質を前記ラテックス粒子に結合させ、このようにしてラテックス粒子 を感作させて、前記ラテックス粒子が診断免疫検定の用途で使用されるラテック ス粒子。
49. ４９．タンパク質が、カルボジイミド法によって、ラテックス粒子に結合される 請求項４８記載の感作されたラテッグス。