JPH04340453A - バイオセンサーおよびそれを用いた分離定量方法 - Google Patents
バイオセンサーおよびそれを用いた分離定量方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
それを用いた分離定量方法に関し、更に詳しくは液体試
料中の特定物質と酵素等の生理活性物質とを反応させ、
反応に関与する物質を電気化学的に検出するバイオセン
サーおよび物質の分離定量方法に関する。
ーを使用して血液等の液体生体試料を測定する際、試料
中に共存するアスコルビン酸、尿酸等の還元性物質が電
気化学的あるいは化学的に与える妨害作用が常に問題と
なっている。特許および文献上見られる、妨害作用除去
あるいは回避策は極めて多数である。それらを分類する
と、以下の通りである: (1)妨害除去膜法(たとえば、米国特許第3,979
,274号、同第4,240,889号、特開昭57−
211542号公報、特開昭58−5643号公報など
)(2)電極酸化法(たとえば、米国特許第4,431
,507号、特開昭57−118152号公報、特開昭
57−211054号公報、特開昭58−5642号公
報、特開昭58−85148号公報、特開昭58−85
149号公報、特開昭58−146847号公報、ジ・
イレブンス・ケミカル・センサー・シンポジウム(Th
e 11th Chemical Sensor Sy
mposium),大川ら、24.「フロー型電気化学
バイオセンサシステムに対する電気活性妨害物質の電気
化学的オンライン除去」など)(3)複数作用電極法(
たとえば、米国特許第3,539,455号、特開昭5
8−146847号公報、特開平1−253648号公
報、ミヤハラら、センサー・アンド・アクチュエーター
ズ(Sensorand Actuators),第7
巻1頁(1985)など) (4)妨害物質酸化酵素添加法(特公昭58−1742
7号) (5)ダブル・ポテンシャル・ステップ法(たとえば、
日本化学会第58回春季年会、4IG06、松浦ら「微
小カーボンファイバー電極による過酸化水素の測定」)
ような欠点を有する。 (1)妨害除去膜法 電気化学的検出手段である電極を選択透過性の膜で被覆
し、測定対象物質は透過させ、妨害作用を有する共存物
質は阻止しようとする方法である。酸素分子、過酸化水
素のような極低分子を電気化学反応物質とする場合には
この方法を使えるが、フェリシアン化カリ、フェロセン
等のメディエータ(電荷仲介媒体)の場合は、妨害作用
を有する共存物質とメディエータとの分子サイズ上の区
別は不可能となりこの方法は使用できない。また、この
方法は、妨害除去膜の外部(試料液中)で起り得る共存
物質と電気化学反応物質との酸化還元反応に対する対策
とはならない。さらに、膜による感度および応答性の劣
化があり、それが膜厚により左右されるため、センサー
の個体差が拡大される。
電極系)の他に、試料中に共存する妨害物質を陽極酸化
するための電極系(電解電極系)を使用する。試料が供
給されると、妨害物質が酵素反応系や測定電極系に達す
る前に、それを電解電極系により陽極酸化する方法であ
る。
が本質的に必要であり、それらおよび酵素等生理活性物
質の反応系を空間的に分離するため、構造が複雑となる
。妨害物質電解効率を向上させるには、電解電極系の表
面積を大きくする、試料液を強制的に攪拌する、流動さ
せるなど種々の工夫がなされているが、いずれもセンサ
ー構造を複雑に大きく、応答性を低下させてしまう。 ことに使い捨て使用を目的としたセンサーへの応用が困
難となる。
の短縮・応答性の向上とは背反する要求である。両者を
満足するための極めて薄い一体化多孔質電極系が提案さ
れているが、構造的に弱く、不安定であるので、構造的
強化が必要であり、単純で安価なセンサーの実現は困難
である。
、電解電極系を有するので、電気回路や測定用ソフトウ
エアも複雑で高価となることは避けられない。
害物質を測定するための電極系(妨害物質測定系)を使
用する。試料が供給されると、測定電極系は目的物質と
妨害物質の両者を測定し、妨害物質測定系は妨害物質の
みを測定する。両測定値の差をとることにより目的物質
の濃度を測定する方法である。
測定系が本質的に必要である。測定電極系で生成された
反応生成物が妨害物質測定系へ影響を及ぼす危険性があ
り、充分な空間的分離が必要である。従って、それだけ
センサーのサイズが大きく、複雑化する。また、電極系
が2系統以上あるので、電流増幅用電気回路も2系統以
上必要となる。
定系の妨害物質に対する測定感度を釣り合わせる必要が
あるが、実際問題として、これが非常に困難である。く
り返し使用のセンサーでは両電極の妨害物質の測定感度
を校正する方法も考えられるが、一回使い捨てセンサー
では不可能である。
電極反応あるいは測定対象物質との酸化還元反応を行う
前に、アスコルビン酸、尿酸等の妨害物質を各々の酸化
酵素により酸化しておく方法である。この方法では妨害
物質を除去するために特異性の高い酵素を使用するため
、複数の妨害物質が存在する場合にはそれぞれに対応し
た複数の酵素を共存させる必要があり、バイオセンサー
のコストアップになる。また、妨害物質の前酸化が必要
条件であり、妨害物質酸化生成物が目的物質の測定を妨
害しない工夫も必要となるので構造的に複雑になるのは
避けられない。さらに、妨害物質は酸化により、測定に
はかかってこないように「除去」されてしまう。これは
測定すれば有効な情報を捨てることになる。
測定電極の測定対象物質に対する自然電位(E02とす
る)と、共存する妨害物質の自然電位(E01とする)
が異なる場合(E01<E02とする)、E01<E1
<E02を満足する電位E1で妨害物質濃度を測定し、
E02<E2を満足する電位E2で測定対象物質および
妨害物質の両者の和を測定し、その差を求めて、目的物
質の濃度を測定する方法である。
対する自然電位(E02)と妨害物質の自然電位(E0
1)が十分離れていなければ、分離測定することが不可
能となる。測定対象物質が過酸化水素の場合、この関係
は保たれることが多いが、電極材質やその表面状態によ
っては、E01とE02は接近することや、逆転するこ
とも観察されている。
を目的として、メディエータが使われることが多いが、
この場合は、測定対象物質も妨害物質もメディエータを
介して電極と電荷の受授を行なうので、E01=E02
となり、ダブル・ポテンシャル・ステップ法は使用でき
ない。
分離することなく、測定対象物質の信号を妨害物質の信
号から、簡単に安価に分離することのできるバイオセン
サーおよび分離定量方法を提供しようとするものである
。
ブル・ポテンシャル・ステップ法はメディエータを使用
したバイオセンサー系では適用できない。また、妨害除
去膜法や電極酸化法は、測定感度や応答速度を犠牲にせ
ざるを得ない。さらに、電極酸化法や複数作用電極法は
、バイオセンサーの構造が複雑になり、従って電気回路
系や測定系も複雑・高価になる。本発明は、これらの問
題を解決しようとするものである。
題は、液体試料中の特定物質と生理活性物質またはそれ
に関与する物質(以下、まとめて「生理活性物質」とい
う。)とを反応させ、反応に関与する物質を電気化学的
に検出するバイオセンサーにおいて、生理活性物質およ
び要すればメディエータを電気化学的検出手段である電
極から離れた部位に配置し、要すれば配置された生理活
性物質またはメディエータを高分子物質層により被覆し
たバイオセンサー、および上記バイオセンサーに試料供
給後、供給された試料について少なくとも2回、すなわ
ち、生理活性物質に関与しないが試料中に共存する電気
化学的活性物質に関与する試料供給当初の電気化学信号
、並びに生理活性物質および試料中に共存する電気化学
的活性物質の両者に関与する試料供給後十分な時間経過
後の電気化学信号を取り込み、両信号を演算することに
より、生理活性物質と特異的に反応する物質、並びに試
料中に共存する電気化学的活性物質を分離定量すること
を特徴とする分離定量方法により解決される。
うなものが包含される: (1)酸化還元酵素の基質(たとえば、乳酸、ブドウ糖
、尿酸、ピルビン酸、コレステロールなど)(2)酸化
還元酵素(たとえば、乳酸脱水素酵素、イソクエン酸脱
水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素、グルコース−6−
リン酸脱水素酵素など) (3)基質または酵素の反応を利用して最終的に酸化還
元反応を行う物質(たとえば、トリグリセリド、リン脂
質、GOT、GPT、CPKなど) (4)抗原抗体反応を活用して測定する物質(たとえば
、各種免疫グロブリン、T3、T4などの各種ホルモン
)
」するとは、所定の箇所に生理活性物質を、試料中の特
定物質と反応可能な状態で存在させておくことを意味し
、メディエータを「配置」するとは、所定の箇所にメデ
ィエータを、試料に溶解可能な状態で存在させておくこ
とを意味し、その状態は限定されない。たとえば、生理
活性物質を溶液の形で所定箇所に塗布し、乾燥して、生
理活性物質を乾燥残渣として配置することができる。あ
るいは、適当な含浸用基材(たとえば、濾紙、布片など
)に生理活性物質の溶液を含浸させ、乾燥して作成した
、生理活性物質を含む基材を所定箇所に固定してもよい
。また、生理活性物質のあるものは、グルタルアルデヒ
ドやジサクシニミジルスベレート等の架橋剤で固定して
もよい、あるいは基材と生理活性物質間の吸着力を利用
して吸着させてもよい。
は、測定電極上には必要に応じてメディエータを配置し
、酵素等の生理活性物質は配置しない。親水性高分子等
をメディエータと混合し、配置してもよい。
メディエータと共に測定電極から十分離れた位置に配置
する。その位置は、試料供給後、測定電極上に配置され
たメディエータが溶解し、電極反応の結果、その信号が
取り込まれる極めて短時間(通例0〜数秒)の間に、試
料中の目的物質と酵素等生理活性物質との反応の結果生
じたメディエータが測定電極へ拡散により到達しないよ
うな位置関係にあればよい。
極などを利用したバイオセンサーでは、測定電極上には
何ら配置しない。ただし、親水性高分子等は試料導入の
円滑化を図るため配置してもよい。一方、酵素等の生理
活性物質は測定電極から十分離れた位置に配置する。そ
の位置は試料供給後、試料中の妨害物質が直接的に電極
反応の結果、その信号が取り込まれる極めて短時間(通
例0〜数秒)の間に試料中の目的物質と酵素等生理活性
物質との反応の結果生じた過酸化水素等が測定電極へ拡
散により到達しないような位置関係にあればよい。
ら拡散したメディエータ、過酸化水素などの測定電極へ
の到達時間を適度に調節(延長)するため、配置する酵
素への親水性高分子添加量を増加することができる。あ
るいは、配置した酵素層を覆う形で、親水性高分子層を
形成することができる。
ーに試料供給当初(通例数秒以内)に第1の電流測定を
行い、試料供給後十分な時間経過後(通例数10秒以内
)に、第2の電流測定を行なう。第1の電流測定値は、
酵素等の生理活性物質と反応した目的物質からの生成物
が測定電極に到達する以前の値であり、これから試料中
に共存する妨害物質濃度が定量できる。第2の電流測定
値は、妨害物質および酵素等の生理活性物質と反応した
目的物質による生成物両者による値であり、これから、
目的物質および妨害物質の和の濃度が定量できる。従っ
て、第1の電流測定値から得られた妨害物質の濃度を第
2の電流測定値から得られた濃度値より差し引くことに
より目的物質の濃度を求めることができる。なお、第1
および第2の電流測定のタイミングは、各々妨害物質お
よび目的物質と妨害物質両者に起因する電流を正確に測
定できるタイミングであることが重要であり、上記通例
の時間に拘束されるものではない。
断面図を図1に示す。ポリエチレンテレフタレート(P
ET)製シート状基板1上に、シルク印刷により銀リー
ド線付カーボン電極2を形成した。その上に、被検液を
収容する空間3’を有するPET製スペーサ3を両面接
着テープにより貼付した。さらにスペーサ3の電極2と
反対側にも両面接着テープにより蓋4を貼付した。被検
液を開口7より空間3’内へ導入することにより測定が
行なわれる。次の(A)、(B)及び(C)の手順で配
置した。
電極上5の位置に、33mMのフェリシアン化カリ(3
0μl)を滴下し、乾燥することにより、電極上にフェ
リシアン化カリを固相として配置した。 (B)蓋4の内面上6の位置に、160mMフェリシア
ン化カリ及び400U/ml乳酸酸化酵素を含むpH6
.4の0.1Mクエン酸緩衝液5μlを滴下し、乾燥す
ることにより酵素およびフェリシアン化カリを固相とし
て配置した。 (C)電極2の5の位置に、3.3mMフェリシアン化
カリ(30μl)を滴下し、乾燥することにより、電極
上にフェリシアン化カリを固相として配置し、さらに蓋
4の内面上6の位置に160mMフェリシアン化カリ及
び400U/ml乳酸酸化酵素を含むpH6.4の0.
1Mクエン酸緩衝液5μlを滴下し、乾燥することによ
り酵素およびフェリシアン化カリを固相として配置した
。
コルビン酸水溶液,10μlを開口部7より導入すると
同時に、検知電極−対極間に一定電位+200mVを印
加し、陽極酸化電流を測定した。結果を図2(線A)に
示す。陽極電流は、電位+200mV印加で、0.5秒
後には最高値に達しており、アスコルビン酸によるフェ
リシアン化カリの還元反応は極めて速く、検出されるこ
とがわかった。
M乳酸水溶液10μlを被検試料として、実施例2と同
様に陽極電流の時間変化を測定した。結果を図2(線B
)に示す。陽極電流は、電位+200mM印加後も4秒
間ほとんど0μAを示し、第1図6の位置で乳酸の酵素
反応により生じたフェロシアン化カリの検出電極への到
達は約4秒遅延したことがわかった。
濃度0mg/dl、9.0mg/dl、18.0mg/
dl、45.0mg/dlに対し、アスコルビン酸0m
g/dl、17.6mg/dl、35.2mg/dl(
いずれも終濃度)を添加した水溶液を調製し、その10
μlを開口部7より導入すると同時に、検知電極−対極
間に第一の印加電位+200mVを4秒間印加し、その
間、陽極酸化電流を測定した。次に、被検液導入から3
0秒の酵素反応時間経過後、第二の印加電位+200m
Vを5秒間印加し、その間陽極酸化電流を測定した。
ルビン酸濃度0mg/dlにおける乳酸濃度0mg/d
l、9.0mg/dl、18.0mg/dl、45.0
mg/dlの被検液を測定した場合の時間経過に伴った
陽極電極電流の変化である。同様に図4はアスコルビン
酸濃度17.6mg/dl、図5はアスコルビン酸濃度
、35.2mg/dlにおける乳酸濃度0mg/dl、
9.0mg/dl、18.0mg/dl、45.0mg
/dlの被検液を測定した場合の陽極電流の変化を示す
。
応答電流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度
を横軸にとったアスコルビン酸に対する検量線である。 この検量線は乳酸濃度の幅広い変化にもかかわらず一本
の直線で近似することができる。すなわちアスコルビン
酸は乳酸から分離定量できた。
後の応答電流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸
濃度を横軸にとった乳酸に対する検量線である。この検
量線はアスコルビン酸の各濃度に対し、それに依存した
応答電流分だけ、縦軸正方向に移動した。これは、乳酸
測定に対してアスコルビン酸の正の妨害があることを示
している。図7の検量線を図6のアスコルビン酸の検量
線を使って補正した。すなわち、第1の印加電位時と第
2の印加電位時のアスコルビン酸に対する応答電流の感
度差を考慮し、図7のアスコルビン酸0mg/dlおよ
び35.2mg/dlに対する検量線が原点を通るよう
図6のアスコルビン酸の検量線を修正した後、その検量
線(直線)を使って図7のすべての測定点を補正した。 結果を図8に示す。この検量線はアスコルビン酸の幅広
い変化にもかかわらず一本の直線で近似することができ
た。すなわち乳酸はアスコルビン酸から分離できた。
ーの1例の模式断面図。
化電流の測定値を示すグラフ。
各種乳酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラフ。
おける各種乳酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラ
フ。
おける各種乳酸濃度での陽極酸化電流の変化を示すグラ
フ。
(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度を横軸に
とったアスコルビン酸に対する検量線。
電流(陽極電流)値を縦軸に、アスコルビン酸濃度を横
軸にとった乳酸に対する検量線。
量線を使って補正した検量線。
Claims (6)
- 【請求項1】 液体試料中の特定物質と生理活性物質
またはそれに関与する物質とを反応させ、反応に関与す
る物質を電気化学的に検出するバイオセンサーにおいて
、生理活性物質を含む物質を電気化学的検出手段である
電極から離れた部位に配置したことを特徴とするバイオ
センサー。 - 【請求項2】 生理活性物質またはそれに関与する物
質および少なくともメディエータを電気化学的検出手段
である電極から離れた部位に配置した請求項1記載のバ
イオセンサー。 - 【請求項3】 電極上にメディエータを配置した請求
項2記載のバイオセンサー。 - 【請求項4】 配置した生理活性物質またはそれに関
与する物質、あるいは少なくともメディエータが共存配
置された生理活性物質またはそれにに関与する物質と液
体試料が接する部位を高分子物質層で被覆した請求項1
〜3のいずれかに記載のバイオセンサー。 - 【請求項5】 生理活性物質が酵素である請求項1〜
4のいずれかに記載のバイオセンサー。 - 【請求項6】 請求項1〜5のいずれかに記載のバイ
オセンサーに試料供給後、供給された試料について少な
くとも2回、すなわち、生理活性物質に関与しないが試
料中に共存する電気化学的活性物質に関与する試料供給
当初の電気化学信号、並びに生理活性物質および試料中
に共存する電気化学的活性物質の両者に関与する試料供
給後十分な時間経過後の電気化学信号を取り込み、両信
号を演算することにより、生理活性物質と特異的に反応
する物質、並びに試料中に共存する電気化学的活性物質
を分離定量することを特徴とする分離定量方法。
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