JPH04270962A - フローイメージサイトメータ - Google Patents

フローイメージサイトメータ

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JPH04270962A
JPH04270962A JP3033138A JP3313891A JPH04270962A JP H04270962 A JPH04270962 A JP H04270962A JP 3033138 A JP3033138 A JP 3033138A JP 3313891 A JP3313891 A JP 3313891A JP H04270962 A JPH04270962 A JP H04270962A
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    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、フローイメージサイトメータに
関するものであり、対象に応じて適当に蛍光染色された
細胞をフローセルに導いて平面シースを形成し、白色光
（ストロボ光）を照射して得られる自然画像とともに、
レーザ光で励起して得られる蛍光画像とを効率良く、か
つ１台のビデオカメラで同時に撮像し、解析することの
できるフロー画像分析装置を提供する。
【０００２】
【従来の技術】スライドガラス上に染色，塗抹された細
胞に対して、顕微鏡下において可視光，紫外光等を照射
し、対象とする細胞の蛍光画像を撮像し、その画像を解
析して細胞の生理学的情報を得ようとする試みは既に行
なわれている。ただこの方法では、多数個の細胞を単時
間で分析処理するには不向きであり、蛍光画像を用いて
の分析は、その用途が限られていた。
【０００３】また、従来のフローイメージサイトメータ
においては、蛍光染色された細胞から発せられる蛍光を
グロスとして、すなわち細胞の各部から発せられる蛍光
の細胞全体の積分値として、その情報を得ていた。この
方法では、単時間に多数個の細胞を分析することができ
るが、個々の細胞のどの部分が染色されて蛍光を発して
いるかの詳細な情報は得ることができないため、分析能
力の点で限りがあった。
【０００４】一方、対象に応じて適当に染色された細胞
をフローセルに導いて平面シースを形成し、ストロボ光
を照射し、ビデオカメラで静止画像を得て画像処理する
という方式を用いての細胞分類装置が既に実用化されて
いる。ただし、この方式を用いての個々の細胞の蛍光画
像の撮像、解析は蛍光撮像感度の問題でまだ実用化に至
っていないのが現状である。本発明は、既に提出されて
いる高撮像効率型のフローイメージサイトメータのアイ
デア（特願平２−１８５７９４）を利用するものである
。
【０００５】
【解決すべき課題】撮像エリアを通過する細胞を検知し
、その細胞に対して励起光を集中させて照射することに
よって、必要な蛍光強度を確保し、蛍光画像を得ようと
いうものであり、さらに従来の白色光源による自然画像
と蛍光画像を、１台のビデオカメラで効率良く撮像し解
析するためのフロー画像分析装置は実現されていなかっ
た。
【０００６】
【解決手段】本発明は既出の高撮像効率型フローイメー
ジサイトメーター（特願平２−１８５７９４以後先願と
いう）をベースとし、このシステムを更に発展させたも
のである。従来のストロボ光（白色光）照射による自然
光画像に加えて、蛍光染色された細胞にレーザー光を照
射して発せられる蛍光を２次元の画像として１台のカメ
ラで同時にとらえるシステムとして構成したものである
。このため、本発明は、被検出粒子成分を含む試料液を
扁平な流れにするための扁平な流路が形成されたフロー
セルと、フローセルの一方の側に配置され、フローセル
中の試料液に光を照射する光源と、フローセルの他方の
側に配置され、光源により照射された試料液中の被検出
粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、撮像手段からの
画像データに基づいて所望の分析を行う処理手段と、を
含むフローイメージサイトメータにおいて、フローセル
の一方の側に配置され光量を切り換えてフローセル中の
試料液を照射する第１の光源と、フローセルの一方の側
に配置されフローセル中の試料液をパルス照射する第３
の光源と、フローセルの他方の側に配置され第１の光源
により高輝度パルス照射された粒子および第２の光源に
より照射された粒子を撮像する第１の撮像手段と、フロ
ーセルの他方の側に配置され第１の光源により低輝度連
続照射された粒子を撮像する第２の撮像手段と、第２の
撮像手段の撮像データに基づき被検出粒子を検出しこの
検出に基づき第１の撮像手段の撮像期間にまず第１の光
源の高輝度照射への切換動作を行いさらに所定時間ずら
して第３の光源の動作をさせる制御手段と、を備え、第
１の光源が蛍光励起用の光源であり、第１の光源による
画像と第２の光源による画像とを第１の撮像手段の受光
面上の異なる領域にそれぞれ撮像するフローイメージサ
イトメータ、を特色とするものである。さらに、本発明
は、第１の撮像手段が試料液の流れ上に２次元の撮像領
域を有し、第２の撮像手段が試料液の流れ上にライン状
の撮像領域を有し、第２の撮像手段の撮像領域が第１の
撮像手段の撮像領域内で試料液の流れを横切るように形
成され、第１の撮像手段による撮像領域を、第２の撮像
手段の撮像領域を含む領域と含まない領域とに２分し、
第１の光源の高輝度照射による上記一方の撮像領域の画
像と第３の光源の照射による上記他方の撮像領域の画像
とを、第１の撮像手段で撮像するフローイメージサイト
メータ、を特色とするものである。本発明ではまた、上
記２つの画像を第１の撮像手段の受光面上で重複させな
いための手段として、光路上に光を遮断するマスクを設
けたフローイメージサイトメータ、を特色とするもので
ある。
【０００７】本発明はさらにまた、上記第１の光源から
の照射光を長楕円にするための手段を設けたり、上記蛍
光画像受光系にイメージインテンシファイアを設けこの
蛍光画像撮像時にのみこのイメージインテンシファイア
を動作させるフローイメージサイトメータを特色とする
ものである。
【０００８】
【実施例】図１に示す本発明の実施例について以下詳述
する。
【０００９】光源として自然光像撮影用のストロボ２と
、細胞通過監視用を兼ねた蛍光励起用レーザー光源１（
例えばＨｅ−Ｃｄレーザー）を使用する。レーザー光源
１はストロボ光源２と異なり、細胞の通過を監視するた
め撮像エリアを常時照射するようになっている。また、
レーザー１からの光はシリンドリカルレンズ３及びコン
デンサレンズ５によって、撮像エリアにおいて粒子の進
行方向に対して横長に細長く絞られてラインセンサ１４
の撮像エリアに照射するようにしている。これは撮像エ
リアにおいて、光強度の均一化を図ると共に、蛍光撮像
時のＳ／Ｎ比を向上させるためである。本例では、ライ
ンセンス１４の撮像エリアは図２に示すようにビデオカ
メラ２４のほぼ四角形の撮像エリアの上半分の内の真ん
中より少し上に設けてある。
【００１０】レーザー光の撮像エリアからの透過光は、
対物レンズ８を介してビームスプリッタ１１、ダイクロ
イックミラー１２を通過し、投影レンズ１３によりライ
ンセンサ１４に結像される。ラインセンサ１４からは１
ライン分の走査周期時間（数１０μｓｅｃ）だけ露光さ
れた各画素の光電変換累積量に応じた電圧が順次出力さ
れる。先願で述べたのと同様の信号処理を行うことによ
って、ビデオカメラ２４の偶数フィールド期間中に細胞
がラインセンサ１４の撮像エリアを横切ったことが判定
されると、励起光照射及び蛍光画像撮像の為のトリガが
かかる。
【００１１】ラインセンサ１４の撮像エリアを細胞が横
切ってから励起光照射されるまでの時間はこのラインセ
ンサ１４の走査周期を５０μｓｅｃとした場合、１００
〜２００μｓｅｃであり、フローセル６での細胞の流速
を３０ｍｍ／ｓｅｃとすると、この間に細胞は３〜６μ
ｍ移動する。従って、励起光を照射してから得られる細
胞画像は１枚の撮像画面の上半分のエリア内に確実に捕
らえることができる。レーザー１は通常その出力は小さ
くして細胞の通過監視を行い、蛍光画像撮像時には高輝
度パルスを発生させるという技法をとる。
【００１２】励起光の照射によって細胞から発せられた
蛍光は、対物レンズ８を介してビームスプリッタ１１を
通過し、ダイクロイックミラー１２で反射される。撮像
エリアを通過した励起光はビームストッパ７で遮られ、
更にフィルター２０で迷光もカットされる。
【００１３】フィルター２０を通過した蛍光は投影レン
ズ２１によりイメージインテンシファイア２２の光電面
に結像される。この時イメージインテンシファイア２２
には高電圧がかけられており、内部のＭＣＰ（マイクロ
チャンネルプレート）により蛍光像は１０３　〜１０６
　倍に増幅され蛍光両側に像を結ぶ。
【００１４】半円マスク２３で半分カットされた像は、
投影レンズ２７によりハーフミラー１９を介してビデオ
カメラ２４のＣＣＤエリアセンサの半分だけに結像され
る。一方、この時ビームスプリッタ１１で反射された蛍
光は投影レンズ１５で半円マスク１６に結像するがここ
で遮られる。
【００１５】励起光照射トリガの発信後、適当な時間遅
れてストロボ照射トリガをかける。この遅延時間は、目
的とする細胞がビデオカメラ２４の撮像エリアの下半分
に来たときに、ストロボ照射トリガがかかるように選べ
ば良い。この光源用電源２６へのストロボトリガ信号は
光源コントロール部２８で作られる。
【００１６】
【作用】ストロボ光源２の光はコリメータレンズ１０に
より平行光にされ、コンデンサレンズ９、ダイクロイッ
クミラー４を介してさらにコンデンサレンズ５により、
フローセル６のビデオカメラの撮像エリアのほぼ全域に
均一に照射される。その透過光は対物レンズ８を介して
ビームスプリッタ１１で反射され、投影レンズ１５で半
円マスク１６に結像し、このマスク１６で上半分がカッ
トされ投影レンズ１７、ミラー１８を介してハーフミラ
ー１９を通過して、ビデオカメラ２４のＣＣＤエリアセ
ンサの半分にだけ結像される。
【００１７】この時、ビームスプリッタ１１を通過して
ダイクロイックミラー１２で反射された透過光はフィル
ター２０、投影レンズ２１を介してイメージインテンシ
ファイア２２の光電面に結像するが、この時点ではイメ
ージインテンシファイア２２に負電圧をかけるようにゲ
ートをかけてあるので、イメージインテンシファイア２
２の蛍光面には像は現れない。（つまりシャッタを閉じ
た状態である）このためのゲート信号は細胞通過判定／
光源コントロール部２８で作られる。
【００１８】図３は撮像エリアを細胞が通過するのを検
知してから、励起光照射、ストロボ光照射及びイメージ
インテンシファイア用ゲート信号のタイミングを示す例
であり、これらを制御する信号は図１の細胞通過判定／
光源コントロール部２８で作られる。
【００１９】以上のようなシーケンスで撮像エリアを通
過する細胞を検知してからその細胞の蛍光画像と自然光
画像を一台のビデオカメラで撮像できる。図４に撮像画
面の例を示す。
【００２０】細胞がライセンサ１４の撮像エリアを通過
してからストロボ照射までの遅延時間は、細胞の流速を
一定に制御できれば一定でよい。細胞の流速が変動する
恐れがある場合は、細胞の自然光画像が撮像エリアのど
の位置に写っているか画像解析装置２５における画像処
理によって容易に判断できるので、その位置が期待する
位置よりずれていればストロボ２の照射までの遅延時間
を補正するようにフィードバック制御すれば良い。
【００２１】
【他の実施例】図１において自然光画像受光系と蛍光画
像受光系を左右逆に配置することもできる。
【００２２】
【発明の効果】１．撮像エリアを細胞が通過するのを常
時監視しているので、目的とする細胞濃度が小さい試料
でも効率よく、選択的に細胞の画像をとらえることがで
きる。
【００２３】２．細胞の蛍光画像をとらえるための照射
光は、ビデオカメラの撮像エリア全体を照射する必要が
なく、特定のエリアに絞ることができる。よって単位面
積あたりの照射強度を上げることができるので、露光時
間が短くても良い。
【００２４】３．１台のビデオカメラで、１枚の撮像画
面に自然光画像と蛍光画像の２つの画像を同時に撮るこ
とができるので画像解析処理が簡単になり、さらにコス
トの面でも有利である。
【００２５】４．細胞通過監視用と蛍光励起用に同じレ
ーザーを使用しているので、光学系の設計が簡単になり
コスト面でも有利になる。
【００２６】５．フローイメージサイトメータの技法に
より、従来の顕微鏡測定では不可能であった高い処理能
力を得られる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるフローイメージサイトメータの構
成を示す。
【図２】図１におけるフローセル部の各撮像エリアおよ
び各照射エリアの例を示す。
【図３】光照射タイミングとインテンシファイア用ゲー
ト信号タイミングチャートを示す。
【図４】ビデオカメラによる細胞の撮像画面の例を示す
。
【図５】図１に関連した半円マスクの例を示す。
【符号の説明】
１　　　　第１の光源 ２　　　　第２の光源 ６　　　　フローセル ２５　　画像処理手段

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　被検出粒子成分を含む試料液を扁平な
    流れにするための扁平な流路が形成されたフローセルと
    、フローセルの一方の側に配置され、フローセル中の試
    料液に光を照射する光源と、フローセルの他方の側に配
    置され、上記光源により照射された試料液中の被検出粒
    子の静止画像を撮像する撮像手段と、上記撮像手段から
    の画像データに基づいて所望の分析を行う画像処理手段
    と、を含むフローイメージサイトメータにおいて、上記
    フローセルの一方の側に配置され、光量を切り換えてフ
    ローセル中の試料液を照射する第１の光源と、上記フロ
    ーセルの一方の側に配置され、フローセル中の試料液を
    パルス照射する第２の光源と、上記フローセルの他方の
    側に配置され、第１の光源により高輝度パルス照射され
    た粒子および第２の光源により照射された粒子を撮像す
    る第１の撮像手段と、上記フローセルの他方の側に配置
    され、第１の光源により低輝度連続照射された粒子を撮
    像する第２の撮像手段と、第２の撮像手段の撮像データ
    に基づき被検出粒子を検出し、この検出に基づき第１の
    撮像手段の撮像期間にまず第１の光源の高輝度照射への
    切換動作を行いさらに所定時間ずらして第２の光源の動
    作をさせる制御手段と、を備え、第１の光源が蛍光励起
    用の光源であり、第１の光源による画像と第２の光源に
    よる画像とを第１の撮像手段の受光面上の異なる領域に
    それぞれ撮像すること、を特徴とするフローイメージサ
    イトメータ。
  2. 【請求項２】　　請求項１記載のフローイメージサイト
    メータにおいて、第１の撮像手段が試料液の流れ上に２
    次元の撮像領域を有し、第２の撮像手段が試料液の流れ
    上にライン状の撮像領域を有し、第２の撮像手段の撮像
    領域が第１の撮像手段の撮像領域内で試料液の流れを横
    切るように形成され、第１の撮像手段による撮像領域を
    、第２の撮像手段の撮像領域を含む領域と含まない領域
    とに２分し、第１の光源の高輝度照射による上記一方の
    撮像領域の画像と第２の光源の照射による上記他方の撮
    像領域の画像とを、第１の撮像手段で撮像すること、を
    特徴とするフローイメージサイトメータ。
  3. 【請求項３】　　請求項２記載のフローイメージサイト
    メータにおいて、上記２つの画像を第１の撮像手段の受
    光面上で重複させないための手段として、光路上に光を
    遮断するマスクを設けたこと、を特徴とするフローイメ
    ージサイトメータ。
  4. 【請求項４】　　請求項２記載のフローイメージサイト
    メータにおいて、第１の光源からの照射光を長楕円にす
    るための手段を設けたこと、を特徴とするフローイメー
    ジサイトメータ。
  5. 【請求項５】　　請求項１ないし４のいずれかに記載の
    フローイメージサイトメータにおいて、蛍光画像受光系
    にイメージインテンシファイアを設け、蛍光画像撮像時
    にのみこのイメージインテンシファイアを動作させるよ
    うにしたこと、を特徴とするフローイメージサイトメー
    タ。
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