JP3218108B2

JP3218108B2 - イメージングフローサイトメータ

Info

Publication number: JP3218108B2
Application number: JP02280993A
Authority: JP
Inventors: 泰範前川
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1993-02-10
Filing date: 1993-02-10
Publication date: 2001-10-15
Anticipated expiration: 2016-10-15
Also published as: JPH06235691A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血液や尿などの粒子成
分を含む試料液をシースフローにして流し、その試料液
流に光を照射して静止画像を得、画像処理により試料液
中の粒子成分の分類や計数などの分析を行う装置に関
し、さらに詳しくは、連続発光の光を用いて粒子の静止
画像を撮像するようにした粒子画像分析装置（イメージ
ングフローサイトメータ）に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】染色された細胞などの粒子に励起光を当
て、その粒子から発せられる蛍光を検出することにより
粒子の分類などの分析を行うことは従来より行われてお
り、具体例としてはフローサイトメータや蛍光顕微鏡な
どが知られている。

【０００３】フローサイトメータでは個々の粒子から発
せられる蛍光量を検出することができる。

【０００４】蛍光顕微鏡ではより詳細な蛍光画像を観察
することができる。また、得られた蛍光像を画像処理す
るものである。さらに、特開昭６３−２６９８７５号公
報には紫外、可視、赤外の３種の光像をとらえることが
できる撮像装置が開示されている。

【０００５】一方、フローにして流した粒子の画像を撮
像し、画像処理により粒子の分析をする装置が特開昭５
７−５００９９５号公報及び米国特許第４３３８０２４
号に開示されている。

【０００６】さらに、撮像領域を常時監視しておき、フ
ロー中の粒子がその領域に到来したことを検出し、効率
よく粒子画像を撮像するようにした装置も公知である。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】高速で流れる粒子に対
して充分な光量の蛍光静止画像を得るために、従来は、
励起用に光量の大きなパルスレーザ（例えばアルゴンパ
ルスレーザ）を用いていた。このようなパルスレーザは
大型で高価である。これに対してさらに安価な光源（例
えば連続発光のアルゴンレーザ）を用いることができれ
ば結果として装置を小型で安価にすることができる。本
発明は常時発光の光源を用いても良好な蛍光静止画像を
得ることができるイメージングフローサイトメータを提
供することを目的とする。

【０００８】

【課題の解決手段】本発明は上記目的を達成するために
ゲート機能付きのイメージインテンシファイタを用いて
蛍光静止画像を得るようにしたものであり、その構成は
被検出粒子成分を含む試料液を流すための流路が形成さ
れたフローセルと、フローセル中の試料液に光を照射す
る光源と、この光源により照射された試料液中の被検出
粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、この撮像手段か
らの画像データに基づいて所望の分析を行う処理手段
と、を含むイメージングフローサイトメータにおいて、
フローセル中の試料液に光を照射するための第１の光源
と、第１の光源により得られた粒子画像を光増幅するた
めの画像増幅手段と、その増幅された粒子画像を撮像す
るための第１の撮像手段と、フローセル中の試料液に光
を常時照射するための第２の光源と、第２の光源により
結像された粒子像をスキャニングするための第２の撮像
手段と、上記各手段の動作を制御する制御手段と、を備
え、第１の光源は連続発光の蛍光励起用光源であり、第
１の光源による画像は粒子蛍光画像であり、上記制御手
段は上記第２の撮像手段からの信号に基づき粒子を検出
し、この検出に基づき第１の撮像手段の撮像可能期間中
に画像増幅手段を動作させ、これにより、第１の撮像手
段で粒子の蛍光静止画像を撮像するイメージングフロー
サイトメータを特色とするものである。

【０００９】

【実施例】図１に本発明の実施例を示す。本発明のイメ
ージングフローサイトメータでは、細胞通過監視用の第
２の光源（例では近赤外半導体レーザ）４５と第２の撮
像手段であるラインセンサ１４に加えて、螢光画像をと
らえるための第１の光源である励起用光源（パルス発光
光源ではなく連続発光光源）３５と微弱な螢光を増倍す
るためのゲート機能付きのイメージインテンシファイア
２２を付加している。さらに、透過光画像と螢光画像の
要部を結合させ１枚の画面として得るためのビデオシグ
ナルスイッチャー（画像信号選択手段）を付加してい
る。

【００１０】以下順を追って説明する。螢光染色された
細胞を含む試料液を平面シース用フローセル６に導い
て、その細胞がビデオカメラ２４の撮像エリアを通過す
るのを常時監視するために、第２の光源である近赤外半
導体レーザ４５は常時撮像エリアを照射している。この
半導体レーザ４５からの光は、コリメータレンズ４６に
より平行光にされ、シリンドリカルレンズ４７を介して
ダイクロイックミラー４で反射され、さらにコンデンサ
レンズ５により細胞進行方向に対して垂直に細長く絞ら
れて、一次元イメージセンサであるラインセンサ１４の
撮像エリアに照射される。本例では、ラインセンサ１４
の撮像エリアＡ２は、図２に示すように、第１の撮像手
段であるモノクロビデオカメラ２４Ａの撮像エリアＡ１
及び第３の撮像手段であるカラービデオカメラ２４Ｂの
撮像エリアＡ３の上半分（点線で区分されている）の内
のまん中より少し上に設けている。Ｂ２は第２の光源４
５の光の照射領域である。

【００１１】半導体レーザ４５の光による撮像エリアＡ
１，Ａ３からの透過光は、対物レンズ８を介して、ダイ
クロイックミラー４Ａを通過しダイクロイックミラー１
２で反射されてラインセンサ１４に結像される。ライン
センサ１４からは、１ライン分の走査周期時間（数十μ
ｓｅｃ）だけ露光された各画素の光電変換累積量に応じ
た電圧が順次出力される。この電圧信号を信号処理をす
ることによって、ビデオカメラ２４の偶数フィールド期
間中に、細胞７がラインセンサ１４の撮像エリアＡ２を
横切ったことが判定されると、フラッシュランプ光（白
色光）照射のためのトリガがかかり、第３の光源である
フラッシュランプ１が発光する。詳しくは、特開平２−
１８５７９４号、特開平２−１８５７９５号、特開平４
−２７０９６１号公報等に記載されているので説明は省
略する。

【００１２】ラインセンサ１４の撮像エリアＡ２を細胞
７が横切ってから、フラッシュランプ１に対するトリガ
をかけるまでの処理時間は、ラインセンサ１４の走査周
期を、５０μｓｅｃとした場合、１００〜２００μｓｅ
ｃであり、フローセル６での細胞の流速を仮りに５０ｍ
ｍ／ｓｅｃとすると、この間に細胞は５〜１０μｍ移動
する。従って、フラッシュランプ光を照射して得られる
細胞の透過光像は、１枚の撮像画面Ａ１，Ａ３の上半分
のエリア内に確実にとらえられることになる。

【００１３】フラッシュランプ光は、コリメータレンズ
９により平行光にされ、ダイクロイックミラー４、コン
デンサレンズ５を介して、ビデオカメラ２４Ｂの撮像エ
リアＡ３全体にわたってほぼ均一に照射される。その細
胞の透過光像は、対物レンズ８、ダイクロイックミラー
４Ａ，１２を透過しビームスプリッタ１１を一部が透過
し第３の撮像手段であるビデオカメラ２４ＢのＣＣＤエ
リアセンサに結像される。

【００１４】この時、ビームスプリッタ１１で大部分反
射された透過光像は、フィルタ２０、イメージインテン
シファイア２２の光電面に結像される。しかし、イメー
ジインテンシファイア２２が動作しないようにゲート信
号をＯＦＦにしているので、イメージインテンシファイ
ア２２の出力面には像は現われない。なお、このゲート
をＯＮにする信号Ｓ２は、細胞通過判定／光源コントロ
ール部２８で作られる。

【００１５】細胞７が撮像エリアＡ１の下半分（点線の
下側）の位置まで移動する際、螢光励起用光源である第
１の光源３５からのレーザ光が、照射される。このレー
ザ光は、シリンドリカルレンズ３６により横長にされ、
ダイクロイックミラー４Ａで反射され、さらに対物レン
ズ８により、細胞進行方向に対して細長く垂直に絞られ
て、ビデオカメラ２４Ａの撮像エリアＡ１の下半分の内
のまん中あたりに照射されている（図２参照）。この
時、この照射エリアＢ１に細胞７が移動していることに
なる。なお、前述の如く、この第１の光源３５は連続発
光している。

【００１６】細胞７が螢光励起光の照射エリアＢ１に到
達すると、細胞は螢光を発する。この螢光は対物レンズ
８を介してダイクロイックミラー１２を透過し、ビーム
スプリッタ１１で大部分が反射されて、励起光カットフ
ィルター２０を透過し、イメージインテンシファイア２
２の光電面に結像する。その時にイメージインテンシフ
ァイア２２へのゲート信号をＯＮにして数μｓｅｃの間
動作させる。このゲート信号は細胞通過判定／光源コン
トロールユニット２８で作られる。例えば、フローセル
中を細胞の流速を５０ｍｍ／ｓｅｃ、ビデオカメラ２４
Ａの撮像エリアＡ１を１５０×１５０μｍとした場合に
は、透過光像撮像用のフラッシュランプ１を照射してか
ら約１．５ｍｓｅｃ後にイメージインテンシファイア２
２のゲートをＯＮするようにコントロールすれば良い。
動作させている時間は細胞の流速によって異なるが、螢
光画像が大きく振れない程度の時間である。例えば、流
速が５０ｍｍ／ｓｅｃの場合は１０μｓｅｃ以下に設定
すれば良い。

【００１７】イメージインテンシファイア２２にゲート
信号が供給されると、その内部のＭＣＰ（マイクロチャ
ンネルプレート）に高電圧が印加され、光電面に結像さ
れた微弱な螢光画像が数万倍に増倍されて螢光面に出力
される。螢光面の像はリレーレンズ１８によってモノク
ロカメラ２４ＡのＣＣＤに結像される。

【００１８】このようにイメージインテンシファイア２
２を短時間だけ作動させるのは、静止した螢光画像を得
るためだけではない。透過光像撮像時にビームスプリッ
タ１１で反射された強烈な光がイメージインテンシファ
イア２２の光電面に結像するが、この時点では図３に示
すように、イメージインテンシファイア２２はゲート信
号Ｓ２がＯＦＦであるので、像の増幅は行われずイメー
ジインテンシファイア２２を過大入力から保護すること
が出来る。また細胞通過監視用の第２の光源からのレー
ザー光も常時イメージインテンシファイア２２の光電面
に結像しているが、通常はゲート信号はＯＦＦで必要な
ときに短時間だけＯＮにして露光時間を短くすることに
よりその影響を最小限に抑えることができる。

【００１９】図３は、撮像エリアＡ２を通過する細胞を
検知してからのフラッシュランプ光の照射、イメージイ
ンテンシファイア２２のゲート信号Ｓ２のタイミングを
示す例であり、これらを制御する為の信号は図１の細胞
通過判定／光源コントロールユニット２８で作られる。
Ｓ１は粒子検出信号、Ｓ３はフラッシュランプの照射の
ための信号である。

【００２０】以上のようにシーケンスで、図４に示すよ
うに、カラービデオカメラ２４Ｂにより細胞の透過光像
Ｃ３が画面の上部に写っている画像Ｄ３が得られ、また
モノクロビデオカメラ２４Ａにより細胞の蛍光像Ｃ１が
画面の下部に写っている画像Ｄ１が得られる。これらの
画像Ｄ３，Ｄ１の画像信号は画像信号選択手段であるビ
デオシグナルスイッチャー３０に送られる。ビデオシグ
ナルスイッチャー３０により画像信号の切換えが行われ
る。すなわち、画像の上部をスキャニングするときは、
カラービデオカメラ２４Ｂからの画像信号を選択し、画
面の下部をスキャニングするときはモノクロビデオカメ
ラ２４Ａからの画像信号を選択することにより、画像Ｄ
３の上半分と画像Ｄ１の下半分とを結合させた画像Ｄ４
を得る。細胞の透過光像Ｃ３と蛍光像Ｃ１とを１枚の画
面に結合させた画像Ｄ４は画像処理装置２５に送られ、
その細胞について種々の画像処理、画像解析が行われ
る。

【００２１】

【作用】第２の光源（粒子監視用の近赤外線光源）４５
及び第１の光源（蛍光励起用のフラッシュランプ光源）
３５はいずれも常時発光している。粒子が第２の撮像手
段１４の撮像エリアＡ２に到達すると、制御手段２８は
第２の撮像手段１４からの信号に基づき粒子検出する。
一方、粒子は第１の光源３５の照射エリアに到達すると
蛍光を発する。粒子の蛍光像は増幅手段２２に結像す
る。そこで、上記粒子検出した際に制御手段２８に画像
増幅手段２２を短時間のみ動作させることにより増幅さ
れた蛍光静止画像が得られる。この蛍光静止画像を第１
の撮像手段２４Ａで撮像する。

【００２２】また、第１の撮像手段２４Ａによる画像と
第３の撮像手段２４Ｂによる画像は、画像信号選択手段
３０によりスキャニングの途中で切り換えられたうえ結
合され、同一粒子の蛍光画像と透過光画像の両方が写っ
た一枚の画面としての画像が得られる。

【００２３】

【効果】粒子の到来を監視し、粒子が蛍光励起光の照射
エリア内にある状態で、画像増幅手段にゲートをかけて
短時間のみ動作させているので、蛍光励起用光源が連続
発光タイプの光源であっても、また、蛍光光量が小さく
ても良好な蛍光静止画像を得ることができる。連続発光
タイプの光源は小型で安価であるので、結果として小型
で安価なイメージングフローサイトメータを実現するこ
とができる。

【００２４】また、画像信号選択手段を用いて複数の画
像の中から必要な部分（粒子の写っている部分）を集め
て、１枚の画像を集成することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明によるイメージングフローサイトメータ
の構成を示す。

【図２】フローセル部の光照射エリアと撮像エリアの例
を示す説明図である。

【図３】光照射タイミングとインテンシファイアＯＮ用
ゲート信号のタイミングチャートを示す。

【図４】画像信号選択手段の説明図を示す。

【符号の説明】

６…フローセル、１…第３の光源、４５
…第２の光源、３５…第１の光源、２４Ａ
…第１の撮像手段、１４…第２の撮像手段、２８
…制御手段、２４Ｂ…第３の撮像手段、
２２…画像増幅手段。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】被検出粒子成分を含む試料液を流すため
の流路が形成されたフローセルと、フローセル中の試料
液に光を照射する光源と、上記光源により照射された試
料液中の被検出粒子の静止画像を撮像する撮像手段と、
上記撮像手段からの画像データに基づいて所望の分析を
行う処理手段と、を含むイメージングフローサイトメー
タにおいて、上記フローセル（６）中の試料液に光を照
射するための第１の光源（３５）と、上記第１の光源に
より得られた粒子画像を光増幅するための画像増幅手段
（２２）と、その増幅された粒子画像を撮像するための
第１の撮像手段（２４Ａ）と、フローセル中の試料液に
光を常時照射するための第２の光源（４５）と、第２の
光源（４５）により結像された粒子像をスキャニングす
るための第２の撮像手段（１４）と、上記各手段の動作
を制御する制御手段（２８）と、を備え、上記第１の光
源（３５）は連続発光の蛍光励起用光源であり、第１の
光源による画像は粒子蛍光画像であり、上記制御手段
（２８）は、上記第２の撮像手段からの信号に基づき粒
子を検出し、この検出に基づき第１の撮像手段の撮像可
能期間中に上記画像増幅手段を動作させ、これにより、
第１の撮像手段で粒子の蛍光静止画像を撮像することを
特徴とする、イメージングフローサイトメータ。
【請求項２】請求項１に記載のイメージングフローサ
イトメータにおいて、フローセル中の試料液に光をパル
ス照射するための第３の光源（１）と、上記第３の光源
により得られた粒子の静止画像を撮像するための第３の
撮像手段（２４Ｂ）と、第１の撮像手段の第１の画像信
号および第３の撮像手段の第３の画像信号を選択する画
像信号選択手段（３０）と、をさらに付加して設け、さ
らに、制御手段が上記第２の撮像手段の撮像信号に基づ
いて被検出粒子を検出し、この検出に基づき上記第１、
第３の撮像で粒子画像を撮像し撮像画面のスキャニング
途中で画像信号選択手段（３０）を切り換えることによ
り、第１の画像内の粒子像が写っている部分と第３の画
像内の粒子像が写っている部分とを結合させ１枚の画面
とした画像を得ることを特徴とするイメージングフロー
サイトメータ。
【請求項３】請求項１に記載のイメージングフローサ
イトメータにおいて、上記第１の撮像手段が試料液の流
れ上に２次元の撮像領域を有し、上記第２の撮像手段が
試料液の流れ上にライン状の撮像領域を有し、上記第２
の撮像手段の撮像領域が試料液の流れを横切るように形
成されたことを特徴とするイメージングフローサイトメ
ータ。
【請求項４】請求項２に記載のイメージングフローサ
イトメータにおいて、上記第１、第３の撮像手段が試料
液の流れ上にそれぞれ２次元の撮像領域を有し、上記第
２の撮像手段が試料液の流れ上にライン上の撮像領域を
有し、上記第２の撮像手段の撮像領域が第１、又は第３
の撮像手段の撮像領域内で上記試料液の流れを横切るよ
うに形成されたことを特徴とするイメージングフローサ
イトメータ。
【請求項５】請求項３又は４に記載のイメージングフ
ローサイトメータにおいて、上記第２の光源からの照射
光を長楕円にする手段が設けられたことを特徴とするイ
メージングフローサイトメータ。