JPH04270300A

JPH04270300A - ホスホペプチド

Info

Publication number: JPH04270300A
Application number: JP3146477A
Authority: JP
Inventors: Kazunori Sato; 一紀佐藤; Masamitsu Tsukamoto; 正満塚本
Original assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Current assignee: Mitsubishi Kasei Corp
Priority date: 1991-02-25
Filing date: 1991-02-25
Publication date: 1992-09-25
Anticipated expiration: 2014-07-05
Also published as: JP2916297B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なホスホペプチドに
関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、老化した人の脳、とくにアルツハ
イマ−痴呆患者の脳には、ＰＨＦ（ｐａｉｒｅｄｈｅｌ
ｉｃａｌ　ｆｉｌａｍｅｎｔｓ）と称される繊維蛋白質
の蓄積が認められ、このＰＨＦ中に高度にリン酸化され
たタウ（τ）蛋白質が検出されることが明かにされてい
る［Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（
Ｔｏｋｙｏ），９９，１８０７〜１８１０（１９８６）
］。このリン酸化されたタウ蛋白質をプロテア−ゼで分
解すると種々のホスホペプチドが得られ、これらのホス
ホペプチドの検討が今後のアルツハイマ−疾患を解明す
る一助となることが期待される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明はタウ蛋白質の
リン酸化とアルツハイマ−疾患との関連を明らかにする
ことを目的とするものである。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記の課題を達成するた
めには、特定の部位がリン酸化されたペプチドを合成し
、それを用いて抗体を作製することが必要である。この
ため、本発明者等はタウ蛋白質中の特定のリン酸化部位
を含むいくつかのホスホペプチドの製造を試み本発明に
到達した。即ち、本発明の要旨は請求項１における式（
１）で表される新規なホスホペプチドに存する。

【０００５】以下、本発明を詳細に説明する。なお以下
の説明で用いる記号は、夫々次のものを示す。ＭＢＨＡ
樹脂：ｐ−メチルベンツヒドリルアミン樹脂；Ｂｏｃ：
ｔ−ブチルオキシカルボニル基；Ｂｚｌ：ベンジル基；
Ｒ：炭素数１〜４のアルキル基で置換されていてもよい
フェニル基；Ｔｏｓ：ｐ−トルエンスルホニル基；２−
ＣｌＺ：２−クロロベンジルオキシカルボニル基。

【０００６】本発明のホスホペプチドは、請求項１にお
ける式（１）に示す順序に配列された１２のアミノ酸か
らなり、該配列中１０番目のＬ−セリン（Ｓｅｒ）のＯ
Ｈ基にＰＯ（ＯＨ）２基が結合した構造を有する。本発
明のホスホペプチドを製造するには周知の固相法による
ペプチド合成法が適用される。例えば、ＭＢＨＡ樹脂を
自動ペプチド合成機にセットし、これに予め製造したＢ
ｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ
、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＨ、Ｂｏｃ−
Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ、Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ
−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ及び
Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）−ＯＨを供給して順次縮
合させる。次いで、得られる側鎖が保護されているＨ−
Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−Ｖ
ａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔ
ｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−Ｐｒｏ−
Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＭＢＨＡ樹脂をフツ化素と反応させ
てペプチドをＭＢＨＡ樹脂と切り離した後、加水素分解
してＰＯ（ＯＲ）２基をＰＯ（ＯＨ）２基に変えればよ
い。

【０００７】本発明で使用されるＢｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ
（ＯＲ）２］−ＯＨで示されるセリン誘導体は、例えば
、ＨＯ−Ｒで示されるフェノ−ル類にホスホリルクロラ
イド（ＰＯＣｌ３）を反応させてＣｌ−ＰＯ（ＯＲ）２
とし、これにＢｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＢｚｌを反応させた後
、ベンジル基を加水素分解により除去してＢｏｃ−Ｓｅ
ｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＨとすることにより容易に製
造することができる。

【０００８】

【発明の効果】本発明の新規なホスホペプチドは、これ
に対する抗体を用いてＰＨＦを検出することによりアル
ツハイマ−型老年痴呆症の診断薬としての用途が期待さ
れる。

【０００９】

【実施例】以下本発明を実施例について更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限りこれ等の実施
例に限定されるものではない。

【００１０】実施例１Ｃｌ−ＰＯ（ＯＲ）２の製造：（ａ）　ホスホリルクロライド１７．５　ｍｌ（１８８
　ｍｍｏｌ）、マグネシウム切屑０．１６　ｇ（６．６
ｍｍｏｌ）及び２−メチルフェノ−ル３１　ｍｌ（３０
０　ｍｍｏｌ）を混合して１２０℃の油浴中で還流下加
熱した。１２０℃で１時間加熱した後、油浴の温度を１
８０℃に上昇して３時間加熱を続行した。次いで得られ
た粘稠な油状物を蒸留して沸点１４５〜１５０℃／０．
０３　ｍｍＨｇのビス［（２−メチルフェニル）オキシ
］ホスホリルクロライドを６７％の収率で得た。

【００１１】（ｂ）上記実施例１の（ａ）において使用
した２−メチルフェノ−ルの代りに２−ｔ−ブチルフェ
ノ−ルを使用した以外は、（ａ）と同様に処理して沸点
１８５〜１９０℃／０．２　ｍｍＨｇのビス［（２−ｔ
−ブチルフェニル）オキシ］ホスホリルクロライドを４
３％の収率で得た。（ｃ）　上記実施例１の（ａ）において使用した２−メ
チルフェノ−ルの代りに２，６−ジメチルフェノ−ルを
使用した外は、（ａ）と同様に処理して沸点１７３℃／
０．２　ｍｍＨｇのビス［（２，６−ジメチルフェニル
）オキシ］ホスホリルクロライドを５３％の収率で得た
。

【００１２】実施例２Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＢｚｌの製造：
（ａ）　５　ｇ（１６．９　ｍｍｏｌ）のＢｏｃ−Ｓｅ
ｒ−ＯＢｚｌを含むピリジン溶液に、実施例１の（ａ）
で得たビス［（２−メチルフェニル）オキシ］ホスホリ
ルクロライド１．１当量を０℃で添加し室温で１２〜２
０時間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル２００　ｍｌ
で希釈した後、２Ｍ　塩酸（２００　ｍｌ×２）及び食
塩水（２００　ｍｌ×３）で逐次洗浄した。分液して有
機層を採取し無水芒硝で乾燥したのち溶媒を除去し、次
いで残留油を酢酸エチルを溶媒に用いてカラムクロマト
グラフィ−により精製し、ヘキサンで再結晶してＢｏｃ
−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＢｚｌ（Ｒ：２−メチ
ルフェニル）で示されるホスホアミノ酸誘導体を６９％
の収率で得た。この物質のマススペクトル（ＭＳ）及び
ＮＭＲは次の通りであった。ＭＳ　４５４（１００％）
，５５５（Ｍ＋，１７．９％）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ３），１．４２（ｓ，９Ｈ），２．２０（ｓ，６Ｈ）
，４．５４（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５，６．０，２．９　Ｈ
ｚ，１Ｈ），４．５８（ｄｔｄ，Ｊ＝８．０，２．９，
２．８　Ｈｚ，１Ｈ），４．６５（ｄｄｄ，Ｊ＝９．５
，６．０，２．９　Ｈｚ，１Ｈ），５．０５（ｄ，Ｊ＝
１２．２　Ｈｚ，１Ｈ），５．１５（ｄ，Ｊ＝１２．２
　Ｈｚ，１Ｈ），５．３５（ｄ，Ｊ＝８．０　Ｈｚ，１
Ｈ），７．０６−７．２７（ｍ，８Ｈ），７．３１（ｍ
，５Ｈ）

【００１３】（ｂ）　上記実施例２の（ａ）において使
用したビス［（２−メチルフェニル）オキシ］ホスホリ
ルクロライドの代りにビス［（２−ｔ−ブチルフェニル
）オキシ］ホスホリルクロライドを使用しかつ触媒量の
ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加した以外は
（ａ）と同様に処理して、油状のＢｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ
（ＯＲ）２］−ＯＢｚｌ（Ｒ：２−ｔ−ブチルフェニル
）で示されるセリン誘導体を６８％の収率で得た。この
物質のＭＳ及びＮＭＲは次の通りであった。ＭＳ　４８
２（１００％），５８３（Ｍ＋，０．３％）；１Ｈ−Ｎ
ＭＲ（ＣＤＣｌ３），１．３７（ｓ，９Ｈ），１．３８
（ｓ，９Ｈ），１．４０（ｓ，９Ｈ），４．５３（ｍ，
２Ｈ），４．６３（ｄｄｄ，Ｊ＝９．６，５．１，２．
６　Ｈｚ，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝１２．２　Ｈｚ
，１Ｈ），５．１１（ｄ，Ｊ＝１２．２　Ｈｚ，１Ｈ）
，５．２８（ｄ，Ｊ＝７．９　Ｈｚ，１Ｈ），７．１１
（ｄｄｄｄ，Ｊ＝７．９，６．２，５．０，１．８　Ｈ
ｚ，２Ｈ），７．１６（ｄｄｄｄ，Ｊ＝７．９，６．２
，６．２，１．８　Ｈｚ，２Ｈ），７．２３（ｍ，２Ｈ
），７．３（ｍ，３Ｈ），７．３６（ｄｄｄｄ，Ｊ＝７
．９，４．６，１．８，１．８　Ｈｚ，２Ｈ），７．５
０（ｄｄ，Ｊ＝１６．７，７．９　Ｈｚ，２Ｈ）

【００１４】（ｃ）　上記実施例２の（ａ）において使
用したビス［（２−メチルフェニル）オキシ］ホスホリ
ルクロライドの代りにビス［（２，６−ジメチルフェニ
ル）オキシ］ホスホリルクロライドを使用し、かつ触媒
量のＤＭＡＰを添加した外は（ａ）と同様に処理して、
油状のＢｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＢｚｌ（
Ｒ：２，６−ジメチルフェニル）で示されるセリン誘導
体を７６％の収率で得た。この物質のＭＳ及びＮＭＲは
次の通りであった。ＭＳ　４８２（１００％），５８３
（Ｍ＋，０．３％）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），１
．４２（ｓ，９Ｈ），２．２８（ｓ，６Ｈ），２．２９
（ｓ，６Ｈ），４．４６（ｍ，２Ｈ），４５５（ｄｄｄ
，Ｊ＝９．３，５．８，２．５　Ｈｚ，１Ｈ），５．０
２（ｄ，Ｊ＝１２．３　Ｈｚ，１Ｈ），５．０５（ｄ，
Ｊ＝８．６Ｈｚ，１Ｈ），５．１２（ｄ，Ｊ＝１２．３
　Ｈｚ，１Ｈ），７．０６（（ｍ，６Ｈ），７．３１（
ｍ，５Ｈ）

【００１５】実施例３Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＨの製造：（ａ
）　酢酸エチル中に実施例２の（ａ）で得たセリン誘導
体と、活性炭に担持したパラジウム触媒（Ｐｄ／Ｃ）を
加え水素気流中において室温で２時間攪拌した。反応混
合物をセライトを用いて濾過し、濾液を減圧下濃縮して
油状のＢｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］−ＯＨ（Ｒ：
２−メチルフェニル）で示されるセリン誘導体を定量的
収率で得た。本品のＭＳ及びＮＭＲは次の通りであった
。ＭＳ　２７６（１００％），４６５（Ｍ＋，２．８％
）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），１．４２（ｓ，９Ｈ
），２．１９（ｓ，３Ｈ），２．２１（ｓ，３Ｈ），４
．５５（ｍ，２Ｈ），４．６７（ｍ，１Ｈ），５．５４
（ｄ，Ｊ＝７．６　Ｈｚ，１Ｈ），６．３０（ｂｒ．ｓ
，１Ｈ），７．０７（ｍ，２Ｈ），７．１３（（ｔ，Ｊ
＝７．３　Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝７．３　
Ｈｚ，２Ｈ），７．２５（ｄ，Ｊ＝５．６　Ｈｚ，２Ｈ
）

【００１６】（ｂ）　上記実施例３の（ａ）で使用し
たセリン誘導体の代りに、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ
）２］−ＯＢｚｌ（Ｒ：２−ｔ−ブチルフェニル）で示
されるセリン誘導体を使用した以外は実施例３の（ａ）
と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２］
−ＯＨ（Ｒ：２−ｔ−ブチルフェニル）で示されるセリ
ン誘導体を定量的収率で得た。本品のＭＳ及びＮＭＲは
次の通りであった。ＭＳ４７５（１００％），５４９（
Ｍ＋，２．５％）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３），１．
３１（ｓ，９Ｈ），１．３６（ｓ，９Ｈ），１．３８（
ｓ，９Ｈ），４．２８（ｂｒ．ｓ，１Ｈ），４．３６（
ｍ，１Ｈ），４．６７（ｍ，１Ｈ），５．２０（ｂｒ．
ｓ，１Ｈ），５．５４（ｄ，Ｊ＝６．７　Ｈｚ，１Ｈ）
，７．０５（ｄｔ，Ｊ＝７．６，７．５　Ｈｚ，２Ｈ）
，７．１２（ｄｔ，Ｊ＝１４．０，７．５　Ｈｚ），７
．３２（ｄｄ，Ｊ＝１６．０，７．６　Ｈｚ，２Ｈ），
７．４６（ｄｄ，Ｊ＝２５．８，７．５　Ｈｚ，２Ｈ）

【００１７】（ｃ）　上記実施例３の（ａ）において使
用したセリン誘導体の代りに、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（
ＯＲ）２］−ＯＢｚｌ（Ｒ：２，６−ジメチルフェニル
）で示されるセリン誘導体を使用した以外は実施例３の
（ａ）と同様に処理して、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ
）２］−ＯＨ（Ｒ：２，６−ジメチルフェニル）で示さ
れるセリン誘導体を定量的収率で得た。本品のＭＳ及び
ＮＭＲは次の通りであった。ＭＳ　３９２（１００％）
，４９３（Ｍ＋，６％）；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）
，１．４２（ｓ，９Ｈ），２．２６（ｓ，３Ｈ），２．
２７（ｓ，３Ｈ），４．３７（ｍ，１Ｈ），４．４５（
ｍ，１Ｈ），４．５３（ｍ，１Ｈ），５．２３（ｄ，Ｊ
＝７．５　Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｍ，６Ｈ），７．
８９（ｂｒ．ｓ）

【００１８】実施例４（イ）　Ｈ−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）
−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２
］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）−ＭＢＨＡ樹脂の製造：
ＭＢＨＡ樹脂０．９４　ｇ（アミン含量０．６４　ｍｍ
ｏｌ／ｇ樹脂）をバイオサ−チ社製９５００型自動ペプ
チド合成機にセットし、これにＢｏｃ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ
）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ［Ｐ
Ｏ（ＯＲ）２］−ＯＨ（Ｒ：２−メチルフェニル）、Ｂ
ｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ−ＯＨ
、Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−
ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、
Ｂｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｏ
Ｈ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）−ＯＨを供給して
順次縮合させて上記の側鎖保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂
を得た。

【００１９】（ロ）　フツ化素処理：上記（イ）で得た
側鎖保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂中の１　ｇを採取し、
これを蛋白質研究奨励会ペプチド研究所製のフツ化素反
応装置にセットし、１．５　ｍｌのアニソ−ルの存在下
で１０　ｍｌのフツ化素と０℃で１時間反応させた。反
応終了後、フツ化素を減圧下留去し、残留物を酢酸エチ
ルで洗浄した後、２Ｍ酢酸１００　ｍｌで抽出処理して
、Ｈ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ［ＰＯ（ＯＲ）２
］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２で表されるリン酸基を保護
した粗ペプチド２８５　ｍｇを得た。

【００２０】これを３０％酢酸２０　ｍｌに溶解してセ
ファデックスＧ−２５のカラム（内径５　ｃｍ、長さ１
００　ｃｍ）にかけ、同じ溶媒を用いて溶出して目的物
を含む画分を集めた。次いでこれを小量の蒸留水に溶解
し、ＯＤＳ（オクタデシルシラン）をシリカに結合した
逆相系のカラム（内径２　ｃｍ、長さ２５　ｃｍ）を用
いたＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィ−）により精
製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中３０分で５
％から６５％までのアセトニトリルの濃度勾配をかける
ことにより行った。精製物の収量は１４４　ｍｇであっ
た。本物質のマススペクトル（ＦＡＢ−ＭＳ）及び酸加
水分解物中のアミノ酸比率は次の通りであった。ＦＡＢ
−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋１４８９，計算値（Ｃ６５Ｈ１０２
Ｎ１７Ｏ２１Ｐ＋Ｈ）　１４８９；　Ａｓｐ　０．９９
（１），Ｔｈｒ　０．９３　（１），　Ｓｅｒ　２．６
６　（３），　Ｐｒｏ　１．７１　（２），　Ｇｌｙ　
１．１０　（１），　Ｖａｌ　１．８９　（２），　Ｌ
ｙｓ　１．１０　（１），　Ａｒｇ　１．００　（１）

【００２１】（ハ）　加水素分解：上記（ロ）で得たリ
ン酸基を保護したペプチド６０　ｍｇ及び酸化白金１０
０　ｍｇ（触媒）を１　ｍｌの酢酸と混合して５〜６気
圧の水素圧下、室温で１２時間攪拌した後、触媒を濾去
した。濾液を凍結乾燥し、分取ＨＰＬＣにより精製して
最終目的物であるＨ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ
−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ［
ＰＯ（ＯＨ）２］−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＮＨ２で表される
ホスホペプチド３４　ｍｇを得た。本物質の構造は、以
下に示すＦＡＢ−ＭＳ、アミノ酸分析及び配列分析によ
り確認された。ＦＡＢ−ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］＋　１３０９，
計算値（Ｃ５１Ｈ９０Ｎ１７Ｏ２１Ｐ＋Ｈ）　１３０９
；　Ａｓｐ　０．９６　（１），　Ｔｈｒ　１．０８　
（１），　Ｓｅｒ　２．６０　（３），　Ｐｒｏ　１．
９８　（２），Ｇｌｙ　１．２１　（１），　Ｖａｌ　
２．１１　（２），　Ｌｙｓ　１．２４　（１），　Ａ
ｒｇ　１．００　（１）

【配列表】配列番号：１配列の長さ：１２配列の型：アミノ酸トポロジ−：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴：配列中１０番のＳｅｒはＰＯ（ＯＨ）２基
と結合している。配列：

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　下記の式（１）【化１】［式中、ＸはＰＯ（ＯＨ）２基を示す］で表される新規
ホスホペプチド。