JP6634197B2

JP6634197B2 - 固相レジンを用いた環状ペプチド化合物の製造方法

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Publication number: JP6634197B2
Application number: JP2013098834A
Authority: JP
Inventors: 関水　和久; 和久関水; 井上　将行; 将行井上; 健史倉永
Original assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Current assignee: University of Tokyo NUC; Genome Pharmaceuticals Institute Co Ltd
Priority date: 2013-05-08
Filing date: 2013-05-08
Publication date: 2020-01-22
Anticipated expiration: 2033-05-08
Also published as: JP2014217322A

Description

本発明は、固相レジンを用いた環状ペプチド化合物の製造方法に関する。

感染症の治療において、病原細菌に対する抗生物質は必要不可欠なものである。しかしながら、抗生物質を適正に使用しない場合には、耐性菌を生み出すこととなる。
抗生物質に耐性を有する耐性菌に対しては、当該抗生物質は治療上有効ではないため、別の抗生物質を使用する必要がある。
そのような使用実績において、複数の抗生物質に耐性を有する多剤耐性菌が出現し臨床上大きな問題となっている。

多剤耐性菌に対する新たな治療薬として、これまでに、完全化学合成による抗生物質であるリネゾリドが創出されている。
また、本発明者らのグループによって構築された、カイコ（カイコがの幼虫）を実験動物とする「カイコ黄色ブドウ球菌感染モデル」を用いて、従来の薬剤とは異なる化学構造を有する新規な環状ペプチド化合物が見いだされている（特許文献１）。

特開２０１２−６９１７号公報

特許文献１に開示される、式（１）で表される環状ペプチド化合物は、微生物の培養物から得られた化合物である。本発明者らは、化学合成によりかかる環状ぺプチド化合物を全合成するルートを提供することを目的とした。

本発明が解決しようとする課題は、環状ペプチド化合物の製造方法を提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、固相レジンを用いることにより、環状ペプチド化合物を製造することができることを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、以下のとおりである。
［１］
下記式（Ｉ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法。
式（Ｉ）：
（式（Ｉ）中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の少なくとも１つの基は、固相レジンに結合し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９のうち、固相レジンに結合していない基は、それぞれ独立して、酸により脱保護される保護基を示し、
Ｒ１０は、置換基を有していてもよい炭素数が７、９又は９のアシル基を示し、
Ｒ１１は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ１２は、エチル基又はメチル基を示す。）
式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）中、
Ｒ１３は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、
Ｒ１４は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ１５は、エチル基又はメチル基を示す。）
［２］
固相レジンが、Ｗａｎｇレジン又はトリチルレジンである、［１］に記載の方法。
［２−１］
固相レジンが、バルロス（Ｂａｒｌｏｓ）レジンである、［１］又は［２］に記載の方法。
以下、「［２］」には、上記［２］及び［２−１］を意味する。
［３］
Ｒ１が、固相レジンに結合している、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
Ｒ１０における置換基が、酸で脱保護される保護基で保護されたヒドロキシ基であり、Ｒ１３における置換基がヒドロキシ基である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
Ｒ１０が、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタノイル基、及び３−ヒドロキシ−７−メチルオクタノイル基からなる群から選択される基であり、ヒドロキシ基が酸で脱保護される保護基で保護される、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
酸で脱保護される保護基が、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、及びトリチル（Ｔｒ）基からなる群から選択される基である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］
下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を、溶媒中、酸と反応させることにより、下記式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法。
式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１は、固相レジンに結合する。）
式（ＩＶ）：
［８］
酸が、塩酸、硫酸、及びトリフルオロ酢酸から選択される群からなる少なくとも１種である、請求項［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、環状ペプチド化合物の製造方法を提供することができる。

以下、本発明を実施するための形態について以下詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本発明の固相レジンを用いた環状ペプチド化合物の製造方法は、下記式（Ｉ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法である。
式（Ｉ）：
（式（Ｉ）中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の少なくとも１つの基は、固相レジンに結合し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９のうち、固相レジンに結合していない基は、それぞれ独立して、酸により脱保護される保護基を示し、
Ｒ１０は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、
Ｒ１１は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ１２は、エチル基又はメチル基を示す。）
式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）中、
Ｒ１３は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、
Ｒ１４は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ１５は、エチル基又はメチル基を示す。）

「Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９の少なくとも１つの基は、固相レジンに結合し、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９のうち、固相レジンに結合していない基は、それぞれ独立して、酸により脱保護される保護基を示す」とは、例えば、Ｒ１が固相レジンに結合している場合、Ｒ１以外の、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が、固相レジンに結合していない基として、酸により脱保護される保護基であることを意味する。
固相レジンに結合する基は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９のうち特に限定されるものではないが、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ７であることが好ましく、Ｒ１であることがより好ましい。

酸で脱保護される保護基は、ペプチド合成において通常用いられる保護基を用いることができ、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis（4^th edition）に記載される保護基を用いることができる。
酸で脱保護される保護基としては、具体的には、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、及びトリチル（Ｔｒ，トリフェニルメチル）基等が挙げられ、Ｏ（酸素官能基）の保護基としては、例えば、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基等が挙げられ、Ｎ（窒素官能基）の保護基としては、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、トリチル（Ｔｒ）基等が挙げられる。
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８及びＲ９が、酸により脱保護される保護基である場合には、Ｒ１、Ｒ４及びＲ７は、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基であることが好ましく、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ８及びＲ９は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、トリチル（Ｔｒ）基であることが好ましい。

固相レジンに結合するとは、リンカーを介して、固相レジンに結合していてもよく、固相レジンに直接結合していてもよい。
固相レジンと、式（Ｉ）で表される化合物との結合は、共有結合であることが好ましく、固相レジンとしては、ペプチド合成において通常用いられる固相レジンを用いることができる。ペプチド合成に用いられる固相レジンとしては、ペプチド合成において通常用いられている、酸処理により、固相レジンと本化合物との共有結合が解離されるレジンを用いることができ、例えば、Houben-Weyl Synthesis of Peptides and Peptidomimeticsに記載されるWangレジン、トリチルレジン等が挙げられる。トリチルレジンとは、トリチル構造を解して共有結合しているレジンであって、２−クロロ−２−トリチルレジンであるバルロス（Ｂａｒｌｏｓ）レジンであることが好ましい。

Ｒ１０は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、該置換基としては、酸で脱保護される保護基で保護されたヒドロキシ基であることが好ましい。Ｒ１０におけるアシル基としては、炭素数７〜９のアシル基であれば特に限定されるものではないが、メチル置換されたアシル基であることが好ましく、置換基を有していてもよいメチルヘキサノイル基、メチルヘプタノイル基、メチルオクタノイル基等が挙げられる。
Ｒ１０としては、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタノイル基、及び３−ヒドロキシ−７−メチルオクタノイル基であって、ヒドロキシ基が酸で脱保護される保護基で保護されていることが好ましい。
ヒドロキシ基の酸で保護される保護基としては、ペプチド合成において通常用いられる保護基を用いることができ、例えば、Greene's Protective Groups in Organic Synthesis（4^th edition）に記載される保護基を用いることができ、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基等が挙げられる。

Ｒ１〜Ｒ９として、酸により脱保護される保護基である基については、酸処理により保護基は脱保護され、また、固相レジンに結合している基については、酸処理により固相レジンとの共有結合が解離される。
また、Ｒ１０が、酸で脱保護される保護基で保護されたヒドロキシ基である場合には、該ヒドロキシ基の保護基も酸処理によりＲ１〜Ｒ９の脱保護と同時に脱保護される。

Ｒ１３は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、Ｒ１０に由来する基である。Ｒ１０において置換基が酸により脱保護される保護基を有する場合、保護基が脱保護された基がＲ１３における置換基となる。例えば、Ｒ１０が、酸で脱保護される保護基で保護されたヒドロキシ基を有する場合、Ｒ１３における置換基は、ヒドロキシ基となる。

本発明の製造方法としては、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法をも提供する。
式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）中、
Ｒ１は、固相レジンに結合する。）
式（ＩＶ）：

上記式（Ｉ）で表わされる化合物としては、下記式（Ｖ）で表わされる化合物であってもよい。
式（Ｖ）：

式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（Ｖ）における各不斉炭素の立体については、各ビルディングブロックの立体に由来するが、Ｌ体及びＤ体あるいはＲ体及びＳ体のいずれかに由来する一方の異性体の立体構造であってもよく、Ｌ体とＤ体あるいはＲ体及びＳ体の任意の比率の立体構造であってもよく、ラセミ体であってもよい。
式（Ｉ）、式（ＩＩ）及び式（Ｖ）における各不正炭素の立体については、式（ＩＩＩ）又は式（ＩＶ）における立体に準じた構造であることが好ましい。

下記式（Ｉ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法においては、特に限定されるものではないが、ペプチド合成において通常用いられる酸が用いられ、また、反応温度、反応時間等の反応条件についても、ペプチド合成において通常行われる反応条件であれば特に限定されるものではない。
酸としては、特に限定されるものではないが、塩酸、硫酸、トリフルオロ酢酸等が挙げられ、トリフルオロ酢酸であることが好ましい。
酸としては、水を混合させた水溶液であってもよく、９０％酸水溶液、９５％酸水溶液、９７％酸水溶液、９８％酸水溶液などを用いることができる。

溶媒を用いてもよく、溶媒として特に限定されないが、水、メタノール、エタノール、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル、Ｎ−メチルピロリドン等が挙げられ、これらの混合溶媒であってもよい。

以下に、本発明の製造方法として、式（ＩＩＩ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法を例示して説明するが、当該例示する方法に基づいて、適宜必要な改編を行うことで、式（Ｉ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法としても実施することができる。

式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、Ｒ１〜Ｒ９として適切な保護基を有する環状ペプチド化合物を合成し、固相レジンに結合することもできるが、固相レジン上で、適切なビルディングブロックを用いて順次アミド結合及び／又はエステル結合を形成させ、次いで、固相レジン上で、マクロ環化して得ることができる。
ペプチド鎖を伸長させるアミノ酸残基の順次の結合は、Ｎ末端側へと伸長させてもよく、Ｃ末端側へと伸長させてもよい。

固相レジン上で酸により脱保護することにより、本発明における所望の環状ペプチド化合物とすることができるが、本発明の製造方法においては、全ての保護基及び固相レジンを一度の酸による脱保護反応により行うことができるため、効率的な製造方法を提供することができる。また、固相レジン上で合成することにより、全ての反応をオートメーション化して行うことができる点でも簡便な方法として実施することができる。

式（ＩＩＩ）で表される化合物を製造するためのビルディングブロックとしては、下記化合物（４）〜（１４）が挙げられる。

化合物１４以外の化合物については、市販品を入手することができ、また、適宜、公知の方法に準じて合成することもできる。なお、化合物（４）〜（１３）については、アミノ酸側鎖の保護基が、Ｂｏｃ基、Ｔｒ基、ｔ−Ｂｕ基で記載しているが、適宜他の保護基に置換して用いてもよい。アミノ酸主鎖のＮ保護基としては、特に限定されるものではなく、適宜適切な保護基を選択してもよいが、Ｆｍｏｃ基が好適な保護基として挙げられる。なお、Ｃ末端側へとペプチド鎖長を伸長させていく場合には、アミノ酸主鎖のカルボン酸が保護され、アミノ基がフリーである誘導体を用いることにより行ってもよい。

化合物１４については、具体的には、実施例において示すが、以下のスキーム１に従って合成することができる。
酢酸エチル（１５）をＬＤＡ（リチウムジイソプロピルアミド）で処理して応答するリチウムエノレートとした後に、ｉｎｓｉｔｕでイソバレリルクロリド（１６）と反応させて１，３−ジケトン（１７）を５０％収率で得る。化合物１７の野依触媒を用いた立体選択的なアシンメトリック水素添加反応により、（３Ｒ）−３−ヒドロキシエステル（１８）を得る。化合物１８の水酸化ナトリウム水溶液を用いた水和反応、続いての化合物２０との縮合反応により、アミド化合物２１へと導く。化合物２１のＴＢＳ保護、続いてのベンジル保護基の脱保護によって化合物１４を得ることができる。化合物２１においてＴＢＳ基により保護しているが、酸により脱保護される基であれば、他の保護基を用いてもよい。

スキーム１：

スキーム１中、３−メチルブタノイルクロライドである化合物１６に代えて、例えば、４−メチルペンタノイルクロライド、５−メチルヘキサノイルクロライドを用いることで、式（Ｉ）で表わされる化合物のＲ１０とすることができる。

式（ＩＩＩ）で表わされる化合物は、以下のスキーム２及びスキーム３に従って合成することができる。
グルタミン酸誘導体（４）の側鎖に、バルロスレジンを結合させる。バルロスレジン上で、順次アミノ酸残基を結合させて、直鎖のデプシペプチド（３）を与え、マクロ環化させることで、スキーム３において化合物２として示される式（ＩＩＩ）で表わされる化合物を合成することができる。なお、本明細書のスキームでは、バルロスレジンを球で示す。

スキーム２：

スキーム２において示されるように、Ｆｍｏｃ保護のアリルエステル化合物（４）をバルロスレジンに結合させ、次いで、Ｆｍｏｃ保護基の脱保護をピペリジンを用いて行い、バルロスレジン上にグルタミン酸の側鎖を介して結合されたグルタミン酸アリルエステル（２３）を得る。固相ペプチド合成については特に限定されるものではないが、マイクロ波支援ペプチド合成（micro-assisted solid phase peptide synthesis）により行うことができる。反応条件としては、各縮合・脱保護反応として、４０℃で３−１０分間反応を行うことが好ましい。化合物５−９及び化合物５を用いて、マイクロ波の照射下、ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ活性化法により６アミノ酸残基（ビルディングブロック）を順次縮合させて、固相レジンに結合したペプチド化合物２４を得る。化合物７を用いて縮合させる際に、化合物７に代えて、Ｍｅ保護基のないＦｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨをビルディングブロックとして用いることにより、Ｒ１１が水素原子である化合物を製造することができる。ぺプチド化合物２４と化合物１４の縮合は、室温で、マイクロ波を照射せずに行うことが、化合物１４のエピ化を防止する上で好適である。化合物１４を用いて縮合させる際に、Ｒ１０に相当する構造を有する化合物に代えて縮合反応を行うこともできる。該縮合により得られた化合物１０と２級アルコール化合物２５との反応は、２級アルコールの反応性から、１０当量の化合物１０を用いて、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）とジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を縮合剤として、４℃で２時間の反応を３回繰り返して行うことが好適である。得られる化合物２６に対しては、マイクロ波支援ペプチド合成を再度行って、化合物１１−１３を用いて、３アミノ酸残基を順次縮合させて、バルロスレジン上に結合した直鎖状のデプシペプチド化合物３を得る。化合物１１を用いて縮合させることで、Ｒ１２はエチル基となるが、化合物１１に代えて、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｖａｌ−ＯＨをビルディングブロックとして用いることにより、Ｒ１２がメチル基である化合物を製造することができる。

スキーム３：

スキーム３に示すように、化合物３のアリル保護基を、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４と過剰量のモルホリンを用いて脱保護して、マクロラクタム前駆体２７とする。環化前駆体２７のマクロ環化は、固相上で行う。
マクロ環化により得ることのできる化合物２は、式（ＩＩＩ）で表わされる化合物である。

式（ＩＩＩ）で表される化合物を、酸により、好ましくは、トリフルオロ酢酸により、より好ましくは、９５％トリフルオロ酢酸水溶液により脱保護を行う。酸による脱保護において、バルロスレジンと環状ペプチド化合物との結合が切れ、同時に、保護基の脱保護が行われ、式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物（化合物１）が、バルロスレジンから遊離する。
脱保護の反応条件としては、特に限定されるものではないが、氷冷〜５０℃の温度で、１０分から２４時間、行うことが挙げられ、室温で数時間、好ましくは１〜４時間、より好ましくは２〜３時間反応させることが好ましい。

バルロスレジンから遊離した式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物は、ペプチド合成における公知の手法により精製することができるが、逆相ＨＰＬＣカラムにより精製することが好ましい。
本発明においては、上記式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物の製造方法に基づいて、当業者が適宜改編することにより、式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を、式（Ｉ）で表される化合物を酸と反応させることによって製造することができる。
式（Ｉ）で表される化合物を酸と反応させることによって、固相レジンからの脱離と、脱保護を同時に行うことができ、簡便に、式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造することができる。

以下、本実施形態を実施例によってさらに具体的に説明するが、本実施形態はこれらの実施例のみに限定されるものではない。なお、本実施形態に用いられる測定方法は以下のとおりである。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）及び^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ）スペクトルは、ＪＥＯＬＥＣＳ４００スペクトロメーターを用いて測定した。化学シフトは、各溶媒（ＣＤＣｌ_３；^１Ｈ δ７．２６、^１３Ｃ δ７７．０、（ＣＤ_３）_２ＳＯ；^１Ｈ δ２．５０、^１３Ｃ δ３９．５）を内部標準として、δ（ｐｐｍ）で表した。
ＩＲは、ＪＡＳＣＯＦＴ／ＩＲ−４１００スペクトロメーターを用いて測定した。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ分析は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸をマトリックスとして、ＳｈｉｍａｄｚｕＢｉｏｔｅｃＡｘｉｍａ−ＴＯＦ^２質量分析器を用いて測定した。ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ分析は、ＪＥＯＬＴ１００ＬＰ質量分析器を用いて測定した。
旋光度は、ＪＡＳＣＯＰ−２２００旋光度計を用いて測定した。
ペプチド固相合成は、マイクロ波支援合成機ＥＹＥＬＡＭＷＳ−１０００で行った。
ＨＰＬＣは、送液ポンプ（ＰＵ−２０８９Ｐｌｕｓ）、ＵＶ検出器（ＵＶ−２０７０Ｐｌｕｓ）及びＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ４（１０×２５０ｍｍ）カラムを備えたＪａｓｃｏＨＰＬＣシステムを用いて、流速３．０ｍＬ・ｍｉｎで行った。溶出液を２８０ｎｍのＵＶで検出した。
全ての反応を、ＵＶ光（２５４ｎｍ）下、ＭＥＲＣＫＴＬＣｐｌａｔｅｓｓｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｆ_２５４上でモニターし、ホスホモリブデン酸（１０％エタノール溶液）か、ｐ−アニスアルデヒド（５０ｍＬ）、酢酸（１０ｍＬ）、エタノール（９００ｍＬ）及び濃硫酸（５０ｍＬ）で調整したアニスアルデヒド溶液で発色させた。
Ｆｌａｓｈカラムクロマトは、ＭＥＲＣＫＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０（４０−６３μｍ）又はＫＡＮＴＯＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｎ（４０−５０μｍ）を用いて行った。

製造例（seco acid 14の合成）
1,3-diketone 17

ジイソプロピルアミン（４．９５ｍＬ，３３ｍｍｏｌ）の乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ，１８．８ｍＬ）溶液を撹拌下、ｎ−ＢｕＬｉのヘキサン溶液（１．６Ｍ，２０．６ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を−２０℃にて滴下した。１０分後、反応液中に、酢酸エチル（２．９５ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）を−７８℃にて添加した。反応混合物を３０分間撹拌した後、該混合物中に、３−メチルブタノイルクロライド（３．６５ｍＬ，３０ｍｍｏｌ）の乾燥ＴＨＦ（５ｍＬ）溶液を滴下した。反応混合物をさらに３０分間撹拌した後、飽和塩化アンモニウム水（３０ｍＬ）でクエンチし、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィによる精製（ヘキサン／ジエチルエーテル＝１０／１）により、１，３−ジケトン（１７）を得た（２．６９ｇ，５０％，無色オイル）。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d0.93 (6H, d, J = 6.7 Hz), 1.28 (3H, t, J = 7.1 Hz), 2.16 (1H, sept, J = 6.7 Hz), 2.41 (1H, d, J = 6.7 Hz), 3.4 (2H, s), 4.2 (2H, q, J = 7.1 Hz); CAS 34036-16-3.

Alcohol 18

（Ｒ）−ＢＩＮＡＰ（５３ｍｇ，０．００８４ｍｍｏｌ）及び［（ｂｅｎｚｅｎｅ）ＲｕＣｌ_２］_２（２０ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１ｍＬ）に溶解した。反応混合物を１００℃で１０分間撹拌した後、減圧下、溶媒を留去して、オレンジ色のオイルとして触媒を得た。１，３−ジケトン（１７，１．１５ｍＬ，６．７ｍｍｏｌ）のメタノール（１ｍＬ）溶液中に、得られた触媒を添加し、得られた反応混合物をオートクレーブ中に移し、Ｈ_２（１０バール）パージした。Ｈ_２雰囲気下、反応混合物を５０℃で２日間撹拌した。室温にて、Ｈ_２を注意深くベントした後、溶媒を留去し、残渣を直接、シリカゲルのパッドにチャージした。シリカゲルクロマトグラフィによる精製（ヘキサン／ジエチルエーテル＝５／１）により、アルコール（１８）を得た（８２０ｍｇ，７０％，無色オイル）。

[a]_D ²⁰ = -13.6 (c 5.5, CHCl₃); ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 0.91 (6H, d, J = 6.8 Hz), 1.18 (1H, ddd, J = 10.6, 7.2, 2.8 Hz), 1.27 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.49 (1H, ddd, J = 11.4, 7.2, 4.8 Hz), 1.75-1.85 (1H, m), 2.38 (1H, dd, J = 13.2, 7.6 Hz), 2.48 (1H, dd, J = 13.2, 2.8 Hz), 2.89 (1H, d, J = 3.2 Hz), 4.08 (1H, s, br), 4.17 (2H, q, J = 7.3 Hz); CAS 159419-34-8.

Carboxylic acid 19

アルコール（１８，８１０ｍｇ，４．６５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２３ｍＬ）溶液を撹拌下、２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２３ｍＬ）を０℃にて添加した。４０℃で３時間撹拌した後、反応混合物は室温に冷却され、エテール（１０ｍＬ）で洗浄した。水層は、１Ｍ塩酸（ｐＨ＝１）で酸性化し、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮して、カルボン酸（１９）を得た（６１０ｍｇ，９０％，白色固体）。

[a]_D ²⁵ = -13.8 (c 9.0, CHCl₃); ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 0.92 (6H, d, J = 6.4 Hz), 1.22 (1H, ddd, J = 13.6, 8.6, 6.4 Hz), 1.51 (1H, ddd, J = 13.6, 8.7, 7.1 Hz), 1.80 (1H, m), 2.46 (1H, dd, J = 16.5, 8.7 Hz), 2.55 (1H, dd, J = 13.2, 3.2 Hz), 4.12 (1H, dddd, J = 8.6, 7.1, 4.1, 3.2 Hz), CAS 132328-50-8.

Alcohol 21

カルボン酸（１９，２１５ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を撹拌下、ＨＯＢｔ（１９８ｍｇ，１．４７ｍｍｏｌ）及びＥＤＣ・ＨＣｌ（４２３ｍｇ，２．２ｍｍｏｌ）を０℃にて添加した。５分後、反応混合物中に、２，４，６−コリジン（９６２μＬ，７．３５ｍｍｏｌ）を添加し、反応液をさらに５分間撹拌した。反応混合物中に、（２Ｓ，３Ｒ）−ｂｅｎｚｙｌ２−ａｍｉｎｏ−３−（ｂｅｎｚｙｌｏｘｙ）ｂｕｔａｎｏａｔｅｏｘａｌａｔｅ（６０１ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）を添加し、その後反応混合物は、４０℃で２時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し、酢酸エチル（２０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を０．１Ｍ塩酸（２０ｍＬ）で２回、１０％炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で３回、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィによる精製（ヘキサン／酢酸エチル＝３／１）により、アルコール（２１）を得た（４８３ｍｇ，７７％，無色オイル）。

[a]_D ²⁰ = -16.4 (c 1.5, CHCl₃); IR (film) 697, 739, 1090, 154, 1308, 1370, 1455, 1525, 1652, 1747, 2954, 3031, 3068, 3333 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 0.92 (6H, d, J = 6.4 Hz), 1.20 (1H, m), 1.21 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.46 (1H, m), 1.80 (1H, m), 2.30 (1H, dd, J = 15.1, 8.2 Hz), 2.43 (1H, dd, J = 15.1, 2.7 Hz), 3.77 (1H, d, J = 4.1 Hz), 4.06 (1H, m), 4.15 (1H, dq, J = 6.4, 2.3 Hz), 4.25 (1H, d, J = 11.9 Hz), 4.48 (1H, d, J = 11.9 Hz), 5.10 (2H, s), 6.81 (1H, d, J = 9.2 Hz), 7.17 (2H, m), 7.23-7.28 (8H, m), ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) d16.2, 21.9, 23.1, 24.3, 42.7, 45.5, 56.4, 66.4, 67.2, 70.7, 74.0, 127.5, 127.7, 128.2, 128.3, 128.38, 128.41,136.24, 137.5, 170.3, 172.8 ;HRMS (MALDI) calcd for C₂₅H₃₃NO₅Na [M+Na]⁺ 450.2256, found 450.2361.

TBS ether 22

アルコール（２１，４８３ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）の乾燥ＤＭＦ（５．６ｍＬ）溶液を撹拌下、ＴＢＳＣｌ（５１１ｍｇ，３．３９ｍｍｏｌ），トリエチルアミン（９５３μＬ，６．７８ｍｍｏｌ）及びジメチルアミノピリジン（１３８ｍｇ，１．１３ｍｍｏｌ）を室温で添加した。反応混合物を４０℃に昇温し、２時間撹拌した。反応混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液（１０ｍＬ）でクエンチし、ジエチルエーテル（１０ｍＬ）で３回抽出した。合わせた有機層を水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィによる精製（ヘキサン／ジエチルエーテル＝３／１）により、ＴＢＳエーテル（２２）を得た（５０７ｍｇ，９０％，無色オイル）。

[a]_D ²⁵ = -0.9 (c 5.0, CHCl₃); IR (film) 697, 724, 751, 776, 836, 1090, 1255, 1516, 1676, 1749, 2954, 3365 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 0.06 (3H, s), 0.07 (3H, s), 0.85 (9H, s), 0.87 (6H, d, J = 6.9 Hz), 1.20 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.53 (2H, sept, J = 6.8 Hz), 1.65 (1H, dq, J = 13.8, 6.9 Hz), 2.40 (1H, dd, J = 15.6, 4.6 Hz), 2.59 (1H, dd, J = 15.6, 5.0 Hz), 4.11 (2H, ddd, J = 11.4, 6.9, 4.6 Hz), 4.17 (2H, qd, J = 6.0, 2.0 Hz), 4.28 (1H, d, J = 11.9 Hz), 4.48 (1H, d, J = 11.9 Hz), 4.75 (1H, dd, J = 9.6, 2.0 Hz), 5.06 (1H, d, J = 12.4 Hz), 5.16 (1H, d, J = 12.4 Hz), 7.13 (2H, m), 7.25-7.30 (8H, m), ¹³C NMR (100 MHz, CDCl3) d -4.70, -4.60, 16.4, 18.0, 22.7, 23.0, 24.7, 25.8, 43.4, 45.1, 56.6, 66.9, 68.0, 70.8, 74.3, 127.6, 127.7, 128.25, 128.27, 128.34, 128.5, 135.5, 137.9, 170.5, 171.7; HRMS (MALDI) calcd for C₃₁H₄₇NO₅Si₅Na [M+Na]⁺ 564.3116, found 546.3068.

Amide 14

ＴＢＳエーテル（２２，５０７ｍｇ，０．９３６ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ（ＯＨ）_２／Ｃ（５１ｍｇ）を添加し、容器中の大気をＨ_２で置換した。Ｈ２雰囲気下、室温で２時間撹拌した後、反応混合物をセライトパッドを通してろ過し、ろ液を濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィによる精製（クロロホルム／メタノール＝３／１）により、アミド（１４）を得た（３３０ｍｇ，９７％，白色固体）。

[a]_D ²⁵ = -10.2 (c 1.2, CHCl₃); IR (film) 667, 776, 809, 836, 942, 1005, 1968, 1142, 255, 1387, 1471, 1539, 1651, 1732, 2858, 2956, 3340 cm^-1; ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) d 0.11 (6H, s) , 0.87 (6H, d, J = 6.9 Hz), 0.91 (9H, s), 1.23 (3H, d, J = 6.4 Hz), 1.43 (2H, dd, J = 7.3 Hz), 1.63 (1H, sept, J = 6.9 Hz), 2.44 (1H, dd, J = 15.2, 4.1 Hz), 2.63 (1H, dd, J = 15.2, 4.1 Hz), 4.13 (1H, m), 4.43 (1H, dd, J = 6.4, 2.3 Hz), 4.46 (1H, qd, J = 4.3, 2.3Hz), 7.40 (1H, d, J = 6.4 Hz), ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃) d -4.24, -4.12, 18.0, 19.3, 22.6, 22.9, 24.6, 25.8, 43.3, 45.6, 57.5, 67.2, 68.0, 173.0, 173.4; HRMS (MALDI) calcd for C₁₇H₃₅NO₅SiNa [M+Na]⁺384.2177, found 384.2050.

（固相ペプチド合成）
マイクロ波支援固相合成により固相ペプチドを合成した。ペプチドフラグメントは、マイクロ派支援ペプチド合成機EYELA MWS-1000上で調製した。標準的操作は以下のように行った。
ステップ１：固相担持ペプチドのＦｍｏｃ基は、２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液で脱保護した（マイクロ波（２００Ｗ）支援，３分，４０℃）。
ステップ２：レジンを含む反応容器は、ＤＭＦで５回洗浄した。
ステップ３：ジイソプロピルエチルアミン（６ｅｑ）のＤＭＦ溶液中に、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（３ｅｑ）、ＨＢＴＵ（３ｅｑ）及びＨＯＢｔ（３ｅｑ）を添加した。該溶液は、反応容器内にインジェクションされ、マイクロ波（２００Ｗ）で支援して、４０℃で１０分間撹拌した。
ステップ４：レジンを含む反応容器は、ＤＭＦで５回洗浄した。
ステップ５：ステップ１〜４を繰り返し、アミノ酸を固相合成により縮合した。

H-L-Glu(Barlos resin)-OAllyl 23

アミノ酸ローディングは、Ｌｉｂｒａチューブを用いて行った。Ｂａｒｌｏｓレジン（５００ｍｇ）を、ＣＨ_２Ｃｌ_２（５ｍＬ）中、膨潤させ、過剰の溶媒は、ろ過により除去した。Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌｙｌ（４，０．５ｍｍｏｌ，２０４ｍｇ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ，２．０ｍｍｏｌ，３５７μＬ）のジクロロメタン（５ｍＬ）溶液を撹拌下、レジンを添加し、４０分間撹拌した。該レジンを、ジクロロメタン（２．５ｍＬ）で２回、ＤＭＦ（２．５ｍＬ）で２回、メタノール（２．５ｍＬ）で洗浄し、減圧下、１時間濃縮して、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｂａｒｌｏｓレジン）−ＯＡｌｌｙｌ（６０４ｍｇ）を得た。なお、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ−ＯＡｌｌｙｌのローディング量は、以下の方法により決定した。乾燥させたＢａｒｌｏｓレジン（１１ｍｇ）に対して、２０％ピペリジンジメチルホルムアミド溶液（１ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌した。上清液をジメチルホルムアミド（５０ｍＬ）で希釈し、３０１ｎｍでＵＶ測定に供することにより、測定された吸光度（０．４７２）から、ローディング量は、０．２７０ｍｍｏｌ／ｇと決定した。
得られたＦｍｏｃ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｂａｒｌｏｓレジン）−ＯＡｌｌｙｌに対して、２０％ピペリジンジメチルホルムアミド溶液（５ｍＬ）を添加し、２０分間撹拌することで、Ｈ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｂａｒｌｏｓレジン）−ＯＡｌｌｙｌ（２３）を得た。

Peptide 24

Ｈ−Ｌ−Ｇｌｕ（Ｂａｒｌｏｓレジン）−ＯＡｌｌｙｌ（２３）は、６サイクルのマイクロ波支援固相ペプチド合成により、ペプチド化合物（２４）を得た。

Peptide 25

ペプチド化合物（２４）に、ＨＢＴＵ（３４２ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（１２１ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）、化合物（１４，３２５ｍｇ，０．９０ｍｍｏｌ）及びＤＩＥＡ（０．３２ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ＮＭＰの２／１混合溶液（２．７ｍＬ）を添加した。室温、４０分後に、レジンを含有する反応容器をＤＭＦで５度洗浄して、ペプチド化合物（２５）を得た。

Peptide 26

ペプチド化合物（２５）に、ＤＩＣ（０．４５７μＬ，２．９６ｍｍｏｌ）及びＦｍｏｃＴｈｒ（ｔＢｕ）ＯＨ（１０，１．１９ｇ，２．９９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／９の混合溶液（５ｍＬ）を添加した。０℃で５分後、反応混合物に、ＤＭＡＰ（３６．６ｍｇ，０．２９９ｍｍｏｌ）を添加した。２時間後、レジンを含有する反応容器をＤＭＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１／９で５度洗浄した。３度繰り返し行って反応を完了させた。

Peptide 3

ペプチド化合物（２６）に、３サイクルのマイクロ波支援固相ペプチド合成により、ペプチド化合物（３）を得た。

Peptide 27

ペプチド化合物（３）の脱気したＣＨ_２Ｃｌ_２溶液（５ｍＬ）に、Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４（８７ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）及びモルホリン（６２７μＬ，７．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応溶液を、アルゴンガスをバブリングしながら、室温で３０分間撹拌した。レジンを含有する反応容器をＣＨ_２Ｃｌ_２で５度洗浄して、ペプチド化合物（２７）を得た。

Lactam 2

ペプチド化合物（２７）のＤＭＦ／ＣＨ_２Ｃｌ_２＝１：９懸濁液（５ｍＬ）に、ＰｙＢＯＰ（７８０ｍｇ，１．５ｍｍｏｌ）及び２，４，６−コリジン（３９０μＬ，３．０ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１１時間撹拌した後、レジンを含有する反応容器をＣＨ_２Ｃｌ_２で２度、ＤＭＦで２度、再度ＣＨ_２Ｃｌ_２で２度洗浄して、ラクタム化合物（２）を得た。

Kaikosin E (1)

Ｌｉｂｒａチューブ中のラクタム化合物（２）に９５％ＴＦＡ水溶液を添加し、１時間撹拌した。反応混合物をろ過し、該ＴＦＡ水溶液で３度洗浄し、さらに２時間ろ過液を撹拌した。
反応溶液を濃縮して、未精製ペプチドを得た。エーテル（３ｍＬ）を添加後、５０００ｒｐｍで５分間遠心して、デカンテーションによりエーテル層を除去した。３度行い、凍結乾燥し、逆相ＨＰＬＣを下記の条件で行って、カイコシンＥ（１）を得た。カイコシンＥのＲＴは、７．６ｍｉｎであった。

ＨＰＬＣの条件
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ(R) ＳＩＬ１００Ａ１０×２５０ｍｍ
溶出液：Ｈ_２Ｏ／ＭｅＯＨ
検出：ＵＶ２８０ｎｍ

溶出液を濃縮して、凍結乾燥することにより、カイコシンＥ（１８ｍｇ，化合物１３から４．７％収率）を白色固体として得た。
HRMS (ESI) calcd for C₇₅H₁₁₇N₂₀O₂₀ [M+H]⁺1617.8748, found 1617.8737; [a]_D ²⁴29.4 (c 0.35, MeOH); IR (film) 669, 702, 721, 742, 801, 1026, 1078, 1137, 1202,1416, 1536, 1629, 2341, 2360, 2958, 3273 cm^-1.

本発明は、環状ペプチド化合物である抗生物質の製造方法を提供することができる。

Claims

下記式（Ｉ）で表される化合物におけるグルタミン酸残基のカルボキシル基と、下記式（Ｉ）で表される化合物におけるグルタミン残基のアミノ基との環化反応により、下記式（Ｉ）で表される化合物を製造し、
次いで、下記式（Ｉ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＩ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法。
式（Ｉ）：
（式（Ｉ）中、
Ｒ₁は、固相レジンに結合し、Ｒ₂、Ｒ₃、Ｒ₄、Ｒ₅、Ｒ₆、Ｒ₇、Ｒ₈及びＲ₉は、それぞれ独立して、酸により脱保護される保護基を示し、
Ｒ₁₀は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、
Ｒ₁₁は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ₁₂は、エチル基又はメチル基を示す。）
式（ＩＩ）：
（式（ＩＩ）中、
Ｒ₁₃は、置換基を有していてもよい炭素数が７、８又は９のアシル基を示し、
Ｒ₁₄は、メチル基又は水素原子を示し、
Ｒ₁₅は、エチル基又はメチル基を示す。）
固相レジンが、Ｗａｎｇレジン又はトリチルレジンである、請求項１に記載の方法。
Ｒ₁₀における置換基が、酸で脱保護される保護基で保護されたヒドロキシ基であり、Ｒ₁₃における置換基がヒドロキシ基である、請求項１又は２に記載の方法。
Ｒ₁₀が、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサノイル基、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタノイル基、及び３−ヒドロキシ−７−メチルオクタノイル基からなる群から選択される基であり、ヒドロキシ基が酸で脱保護される保護基で保護される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
酸で脱保護される保護基が、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）基、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、及びトリチル（Ｔｒ）基からなる群から選択される基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
下記式（ＩＩＩ）で表される化合物におけるグルタミン酸残基のカルボキシル基と、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物におけるグルタミン残基のアミノ基との環化反応により、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を製造し、
次いで、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物を、酸と反応させることにより、下記式（ＩＶ）で表される環状ペプチド化合物を製造する方法。
式（ＩＩＩ）：
（式（ＩＩＩ）中、
Ｒ₁は、固相レジンに結合する。）
式（ＩＶ）：
環化反応の前に、以下のビルディングブロックを用いて式（ＩＩＩ）で表される化合物を製造する、請求項６に記載の方法。
酸が、塩酸、硫酸、及びトリフルオロ酢酸から選択される群からなる少なくとも１種である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。