JPS63502694A

JPS63502694A - アミノ酸残基の線状結合体合成をモニタ−する方法

Info

Publication number: JPS63502694A
Application number: JP62501024A
Authority: JP
Inventors: シェパード　ロバート; メルダ−ル　モ−テン
Original assignee: ノヴァビオヒェム　アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1986-02-03
Filing date: 1987-02-03
Publication date: 1988-10-06
Also published as: AU6930387A; WO1987004713A3; EP0257053B1; DE3771959D1; FI874330A; GB2187461A; DK518587D0; WO1987004713A2; NO874149D0; FI874330A0; AU597031B2; GB8602586D0; ATE66003T1; DK518587A; EP0257053A1; US5126273A; NO874149L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アミノ　の　七人　人　をモニ　−する　法孜止ｍ分団本発明はアミノ酸残基の線状結合体の、特に固相法（しかしこれに制限されない）による合成をモニターする方法に係り、更に詳しくいえば再循環流動合成法および合成法の自動化を容易にする光学的な監視法並びにこの光学的監視技術を包含する上記方法並びに手順に関するものである。

ペプチド結合を介して結合されるアミノ酸残基の線状結合体の固相合或は、一般に支持体に共有結合され、かっＮ−α−アミノ保護基で保護された一つのアミノ酸残基から出発し、以下の工程を含む。

（ａ）　Ｎ−α−アミノ保護基を脱離して、Ｎ−α−アミノ基を得る工程；山）ペプチド結合を介して、Ｎ−α−アミノ保護基で保護されたアミノ酸残基を、保護された反応性のアミノ酸誘導体および必要に応じて触媒を用いて上記工程１ａｌで得たＮ−α−アミノ基に付加する工程、および（ｅ）　所定の線状結合体が得られるまで上記工程（ａｌおよび山）を繰返す工程。

■量点星至技丘伝統的に、かかる固相ペプチド合成は、等量のジシクロへキシル−カルボジイミド（Ｄ　ＣＣＤ）によりその場で活性化されるｔ−ブトキシカルボニル（Ｂ　ｏｃ）アミノ酸を用いて実施されている０重大な進歩は、ポリスチレン−およびポリアミド−をベースとする固相合成両者における、予め形成したＢｏｃおよびフルオレニル−メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ　）アミノ酸無水物の導入であり、これにより反応性の樹脂に結合したアミノ基と活性化剤との接触を防止する。アシル化反応は、特に極性媒体、例えばジメチルホルムアミド中で迅速に進む。

活性化エステルもしばしば固相合成で使用されてきたが、反応速度は触媒の存在下においてさえも遅い恐れがある。この場合にも、特にポリアミド−をベースとする合成においては極性反応溶媒の使用が好ましい。というのは、この樹脂製支持体は−Ｓに広範囲の非プロトン系極性並びに非極性有機溶媒と相容性であるからである。特別な合成法が国際公開公報筒ＷＯ３６１０３４９４号に開示されており、この方法は活性化Ｆｍｏｃ　−アミノ酸誘導体の使用に係り、ここでペプチド結合を形成するのに用いられるアシル基はペンタフルオロフェニルエーテルとして活性化されている。

本出願人等はペプチド合成に別の活性化剤を使用することを検討したが、その一つは以下の式（１）で示される化合物である。

この化合物は、正しくは３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンと記され、そのｍ８体はケーニッヒおよびガイガー（Ｋｏｅｎｉｇ　ａｎｄ　Ｇｅｉｇｅｒ　）の文献〔ケミッシュ　ベリヒテ（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ　Ｂｅｒｉｃｈｔｅ　Ｈ９７０，１０３゜２０３４）に記載されている。これらの著者等は従来環に対し、いくつかの番号付は法を使用しており、そのためにこの化合物に対して数個の異る名称が使用されていた。例えば、ケーニッヒとガイガーの上記文献はこの化合物を３−ヒドロキシ−４−オキソ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベンゾトリアジンとして記載しており、本出願人等はその英国特許出願箱８．６０２，５８６号において１−オキソ−２−ヒドロキシ−ジヒドロベンゾトリアジン（ＤＨＢＴ）としてこの化合物を記載した。

引用の簡略化のために、以下この化合物を“ＤＨＢＴ”とする。

ペプチドなどの巨大分子を合成するための十分に自動化された装置を開発する必要がある。通常のいわゆる自動化もしくは半自動化された方法では、装置が使用され、そこでは必要な液体移送操作の制御およびその結果としての反応時間の制御を幾分汎用性に劣るコンピュータソフトウェアで行っている。この問題はペプチド合成における重要な問題の一つである。というのは、反応速度が合成操作の進行並びにペプチド鎖の長さの増大に伴って大巾に変動する可能性があるからである。立体的因子あるいはより厳密には固相合成における樹脂マトリックス内でのシーケンス依存凝集作用のために、反応速度の低下が起こり得る。この後者の凝集作用は一般にその初期においては予測し得ないものであり、かつ所定の合成反応を損う恐れがある。

これまでに、最適反応時間を、合成操作の途中で任意の与えられた反応段階について決定できる自動合成装置または自動合成法は開発できていない。このような決定の後に、かくして得た反応時間に従って操作するように該装置をプログラムすることが可能となる。

かくして、上記問題を克服するために、自動ペプチド合成において使用できる監視技術に対する要求がある。

溌遭舒１１斐本発明の目的は、光学的方法、例えば測光法によってアミノ酸残基の線状結合体合成の進行をモニターする方法を提供することである。この目的は本発明の方法によって達成され、本発明の方法ではＮ−α−アミノ保護基をもつアミノ酸、例えばＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体を該合成で使用し、かつ反応溶媒、例えば溶液相または固相もしくはこれらの一つの一部の色を該合成中モニターする。

第２の局面において、本発明は支持体に共存結合され、かっＮ−α−アミノ保護基により保護されたアミノ酸残基から出発する、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の線状結合体の固相合成法を提供する。この方法は以下の工程：（ａｌ　上記のＮ−α−アミノ保護基を脱離してＮ−α−アミノ基を得る工程；（ｂ）　反応性の保護されたアミノ酸誘導体および場合により触媒を用いて、上記工程（ａｌで得たＮ−α−アミノ基にペプチド結合を介して、Ｎ−α−アミノ保護基により保護されたアミノ酸残基を付加し；および（Ｃ１目的とする線状結合体が得られるまで上記工程＋ａｌおよび（ｂｌを繰返す、を含み、その特徴は該反応系が３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン −４（３Ｈ）−オンまたはその誘導体を含み、かつ、アシル化反応〔工程価）〕の進行が該反応系またはその成分の色を観察することによりモニターすることにある。

本発明のモニター法はペプチド合成における再循環流動条件の利用を容易にする。

本発明の第３の局面によれば、ペプチドの自動固相合成用の装置が提供され、該装置は反応溶液または固相もしくはこれらの一つの一部の色を、反応の進行中監視するための手段を含むことを特徴とする。−態様において、この装置は（ｉ）ポリアミド樹脂を含む粒子（その上で固相合成が起こる）を収容するためのカラム；（ｉｉ）該カラムの一方の側に設けられた光源；（ｉｉｉ　）該カラムに近接し、かつ該光源と対向する側に設けられた集光装置；（ｉｖ）該集光装置によって集光された光を受け取るように配置された光度計および（ｖ）該光度計の出力に応答し、かつそれに応じて合成工程を制御するようにプログラムされたマイクロプロセンサーを備えている。

本発明の方法で使用する好ましい溶媒は非プロトン系の極性溶媒であるが、場合によっては非プロトン系の非極性溶媒、例えばテトラヒドロフランおよびプロトン系極性溶媒も使用できる。

本発明の固相合成法では、ポリアミドが固相として好ましい。

Ｆｍｏｃ−アミノ酸のＤＨＢＴエステルは容易に調製され、一般に安定な結晶性固体であって、その殆どがそれ程分解することな（低温で長期に亘り貯蔵し得ることがわかった。

反応性の保護されたアミノ酸誘導体はアシル基を有していることが有利であり、該アシル基は３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンの誘導体（例えば、エステル、酸クロリドまたはアジド、好ましくはエステル）として活性化され、ペプチド結合（即ちＤＨＢＴエステル）を形成するのに用いられる。これらの誘導体は、ＤＨＢＴを反応媒質ステルはＤＨＢＴと保護アミノ酸とを用いたエステル交換反応により得ることができ、該アミノ酸においてアシル基はペプチド結合の形成に利用され、ペンタフルオロフェニルエステルとして存在する。

該保護アミノ酸誘導体としてＦｍｏｃ　−アミノ酸を使用することが一般に好ましい。同様に、好ましい非プロトン系溶媒はジメチルホルムアミドである。

反応系またはその成分の色は測光法で、好ましくは約４４０ｎｍで監視することが有利である６合成に用いる条件に応じて、固相または反応？８液の色を監視できる０反応溶液が塩基性である場合、液相には黄色の発色がみられ、さもなければこの発色は固相にみられる。一つの態様においては、３−ヒドロキシ−１、２，４−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンが、反応系から取出された固相支持体の一部に添加され、該取出された一部の固相支持体の色が監視される。

反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体が、ＤＨＢＴエステルとして活性化され、ペプチド結合を形成するのに利用されるアシル基をもつような、上で概説した固相合成反応シーケンスの工程（ト））においては、該ＤＨＢＴエステル残基は成長するペプチド鎖と反応し、かつＮ−ヒドロキシ化合物が溶液に放出される。

このアシル化反応中に、該樹脂上に一時的に鮮黄色の発色がみられるが、塩基が熔解していない状態では溶液は無色に保たれる。この黄色の発現はアシル化反応の進行に伴って消失し、塩基を含まない溶液では、樹脂はその初めの灰色がかった色合いに戻る。この黄色の発色は、樹脂に結合したアミノ基により遊離されたＤＨＢＴのイオン化に関連するものと思われる。このアミノ化反応の進行に伴い、樹脂に結合したアミノ基はもはや発色が残らなくなるまで反応する。塩基性の反応媒質が使用された場合、即ち例えば溶媒としてのジメチルホルムアミドと塩基、例えばＮ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン、ピペリジンまたはＮ−エチルモルホリンを含む反応溶液においては、黄色は固相ではなく溶液中で発現する。この発色は、塩基性溶液中で遊離されたＮ−ヒドロキシ化合物のイオン化によるものと思われる。このいずれの場合にも、発色の程度は４４０ｎｍ近傍での測光法により観察できる。この反応シーケンスの工程（ｂ）は最早色の変化がみられなくなった時点あるいは色の変化率（例えば測光法で観察して）が減少または零になった場合、例えば光度曲線がプラトーを形成するか、または緩やかに増大する曲線（即ち、痕跡量の残留ピペリジンはＵＶ吸光度を徐々に増大させる可能性がある）を与えた時点で完了したものとみなされるが、この“定常状態”に達するに要する以上に幾分長い時間、反応条件を維持することを推奨する。

図面の簡単な説明以下、本発明を実施例に従って更に詳細に記載する。実施例４では添付図面を参照する。該添付図において、第１図は樹脂の色強度を、Ｆｍ０Ｃ−ｖａｌ　・０ＤＨＢＴとイソロイシル−樹脂とのモデルとしてのカップリングの時間に対してプロットした図であり、ここでは１２秒間隔で３４５回読み取り、アナログデータをディジタル化して直接プロットした；第２図はアシル基担持タンパク、デカペプチド残基６５−７４（以下の化合物■）の合成の際のＦＬＩＩＯＣ−ＡＳｎ −ＯＤＨＢＴとグリシル−樹脂とのカップリングを示すものであり、この図において垂直線はコンピュータで決定した終点を示す；第３図はＦｍｏｃ　ｌｉｅ　 ’０ＤＨＢＴとアスパラギニルグリシル−樹脂とのカンプリングを説明する図であり、および第４図はデカペプチドの形成における最終工程（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ・０ＤＨＢＴとＮ−末端グルタミンとのカンプリング）を説明する図である。

■槻ｆ藍監ジシクロへキシルカルボジイミドによって調製したＤＨＢＴエステルは次式（ＩＩ）のアジドベンゾエート副生成物の形成を伴う。

痕跡量のこの生成物はｈｐｌｃによって容易に検出できる（例えば、Ｆｍｏｃ− Ｇｌｙ　・０ＤＨＢＴおよび上記生成物は、４０分間のθ〜１００％Ｂの勾配法を用いたアクアボア（Ａｑｕａｐｏｒｅ）　３００上で、夫々２６．８分および２４．３分に出現する）。従って、すべてのＦｍｏｃ−アミノ酸誘導体は、ペプチド合成で使用する前に厳密に精製すべきである。というのは、上記アジドベンゾエートは効果的な連鎖停止剤であるからである。いくつかの合成においては、痕跡量の混入アジドベンゾイルペプチドが検出されている。このアジドベンゾエートの形成は、極性のジメチルホルムアミド中ではなくむしろ非極性溶媒（テトラヒドロフラン）中で該活性エステルを調製することにより最小化されるが、溶解度の低い、側鎖反応性のアミノ酸、即ちアスパラギンおよびグルタミンに対しては極性溶媒が好ましい。上記アジドベンゾエートの形成のほぼ完全な抑制は、ＤＨＢＴを添加する４分前に予めＦｓｏｃ−アミノ酸−ＤＣＣＩ付加生成物を形成しておくことにより達成される。

テスト例として、以下の配列（■）：Ｈ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−１ｉｅ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−１１ｅ　・＾５ｎ−Ｇｌｙ　・０）１（Ｉ［［）をもつ極めて難しいアシル基担持タンパク６５−７４シーケンスを選択した。触媒、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在下でｐ−ニトロフェニルエステルを用いてこのシーケンスを組立てる初期の試みは対称な無水物を使用することにより達成された。また、国際公開第ＷＯ３６１０３４９４号公報に記載の方法に従って、ペンタフルオロフェニルエステルを用いることによっても良好な合成が実施された。以下の実施例の各々において利用した方法はＲ，Ｃ，シェパード（Ｓｈｅｐｐａｒｄ）の文献〔ケミッシュ　ベリヒテ（Ｃｈｅｗ、　Ｂｒ、）、　１９　Ｂ　３．１９，４０２）に記載されているようなＦｍｏｃ−ポリアミド法の連続流動による変法であった。

Ｆｍｏｃ−アミノ酸ＤＨＢＴエステルは公知の合成法に従って調製した。

尖丘斑−１ポリジメチルアクリルアミド樹脂：（ＩＴ）を剛性の大きな孔をもつ珪藻土粒子に担持させ、それ自体公知の酸−感受性ｐ− アルコキシベンジルアルコール結合剤および内部標準としてのノルロイシン残基で官能化した。

アシル化反応はジメチルホルムアミドに溶解した過剰量のアミノ酸ＤＨＢＴエステルを用いて行った。この溶液を上記樹脂上に再循環させた。Ｃ−末端ＦＭ。Ｃ −グリシン残基のエステル化では、４−ジメチルアミノ−ピリジン触媒の存在下で、ペンタフルオロフェニルエステル誘導体を使用した。４−ジメチルアミノヒリジン（１当量）の存在下で、Ｆｓ＋ｏｃ−グリシンペンタフルオロフェニルエステル（５当量）を用いると、エステル化ハ１〜２時間で完了した。すべてのペプチド結合形成反応において、適当なＦ＋ｗｏｃ−アミノ酸ＤＨＢＴエステル（４当量）のジメチルホルムアミド溶液を使用した。最後のバリン残基を組込むために、該反応混合物に尿素を添加した（以下の記載を参照のこと）、フルオレニルメトキシカルボニル基は２０％ピペリジン／ジメチルホルムアミドにより脱離した。

本例において、合成の進行はカラムの初めの黄色の発色の持続性を観測することにより追跡した。しかし、安全のために、アシル化時間はかなり長く設定した。

樹脂が退色してその本来の灰色がかった状態に移行するのに以下のようなおよその時間が記録された。また、括弧内には実際の全反応時間を与えた。

Ａｓｎ　−Ｇｌｙ　：　１５分（３５分）　Ｈｌｌｅ　−Ａｓｎ　：３０分（６５分）；Ｔｙｒ　−１１ｅ　：　１８分（６０分）　；Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　：　１０分（４０分）；ｌｉｅ　−Ａｓｐ　：　１５分（４０分）；＾ｌａ　−１１ｅ　：　１０分（４０分）；Ａｌａ　−Ａｌａ　：　１０分（４０分）　；Ｇｉｎ　−Ａｌａ：　３０分（１３０分）　ＨＶａｌ　−Ｇｉｎ　：　２０時間（２４時間）。最後のバリン残基について記録された例外的に長い反応時間は以前の経験と一致している。グルタミンの添加後には、脱保護工程中におけるゆっくりしたジベンゾフルベン−ピペリジン付加生成物の脱離によって、樹脂マトリックス内でペプチド鎖の強い会合が起こることが、光度測定により明らかとされた。

完成されたデカペプチドは９５％トリフルオロ酢酸により樹脂から分離され、残留樹脂のグリシン：ノルロイシン分析結果から分離度は９２％であった。未精製デカペプチドは以下のようなアミノ酸分析値を示した。即ち、ＧＩＹ　、　１．００　；Ａｓｐ　。

１．９１　；Ｉｌｅ、　１．８０；Ｔｙｒ、　０．９１；Ａｌａ、　１．８７；Ｇｌｕ。

０．９６　；Ｖａｌ　、　０．９４゜Ｅ、アサ−トンおよびＲ，Ｃ，シェパード（Ｅ、八ｔｈｅｒｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，５ｈｅｐｐａｒｄ　）の文献〔ジャーナル　オブ　ケミカル　ソザイアティー　ケミカル　コミュニケーションズ（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、Ｓａｃ、　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　）、　１９８５．１６５〕に記載されているようにｈｐｌｃで精製後、アミノ酸分析結果は以下の通りであった。即ち、Ｇｌｙ　ｓ　１．００　；Ａｓｐ　、　１．９６　；　Ｉｌｅ　。

１−９２　；　Ｔｙｒ　１０．９５　；　Ａｌａ　、２．０４　；　Ｇｌｕ　１０．９８　：　Ｖａｌ　。

０．９８゜同じシーケンスの第２回目の合成は、最後のバリン（４当量；尿素使用せず）を除き、２当量のみのＤ　ＨＢ　Ｔエステルを使用したことを除けば上記の合成手順と同様に実施され、同様に満足な結果が得られた。

実施例　２実施例１と類似の技術および反応条件を利用して、以下のようなペプチドシーケンスの満足な合成が達成された。

１１１ａｌ　・　Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　・　八ｓｎ　４ｒｏ　・八ｓｐ　−Ｇｌｙ　−ＧＩｕ　・　ｌ１ｅ−［１ｉｌｕ　−Ｌｙｓ　−Ｇｌｙ　・Ｏｉｌ　（Ｖ）Ｈｌｌｅ　−Ａｌａ　−ＧＩｕ　ｉｌｅ　−Ｇｌｙ　−ＡＩａ　−３ｅｒ　−Ｌｅｕ　１ｌｅ−Ｌｙｓ　−）１ｉｓ　−Ｔｒｐ　・Ｏｆ（（ＶＩ）１１Ｇ１ｙ　４．ｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）・Ｓｅｒ　−Ｇｌｕ　−５ｅｒ−５ｅｒ　−Ａｓｐ　−８ｅｒ　−Ｇｌｙ　−５ｅｒ　Ｔｙｒ　−ＧＩｙ　（ｉｎ　（■）ス［３実施例１のシーケンスの第２回目の合成において、アシル化反応の終点を、４４０ｎｍにおける樹脂の色を測光法で観察することにより測定した。この結果は概して肉眼的評価と一致したが、２つのイソロイシン残基については、完全な脱色に要する時間が殆ど等しかった（３６分；４０分二以下の記載参照）。

本質的に、低圧石英−ハロゲン光源からの光を厚さ約４ｆｉの半透明樹脂製支持体の床に集光し、拡散され透過した光を４４０ｎｍの狭帯域フィルタを通してフォトトランジスタ検出器上に再集光した。磁気的に操作されるシャンク機構を用いて、光源による樹脂の曝露を制限した。この検出器の出力をディジタル変換し、サンプリングしかつ制御用マイクロプロセッサで直接処理した。アシル化の進行に伴う、定常的ベースライン状態までの吸収量の降下の典型的な実時間ブロー／　トを添付第１図に示す。

第１図の下降する軌跡の揺ぎは、再循環されるアシル化種：および溶液中のイオン化されていないＤＨＢＴによる吸収に起因するものである。およその循環時間に対応する時間に亘すデータを平均することによって上記揺ぎを簡単に除くことができる。第２図〜第４図はＡ、ドライランドおよびＲ，Ｃ，シェパード（Ａ、　Ｄｒｙｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｒ，Ｃ，５ｈｅｐｐａｒｄ）のジャーナル　オブ　ザ　ケミカル　ソサイアティー、パーキントランスアクションズＩ（Ｊ、　Ｃｈｅ＋ｓ、　Ｓｏｃ、　Ｐｅｒｋｉｎ、　Ｉ　）、１９８６．１２５に記載の文献に従って、Ｆｍｏｃ−ポリアミド連続流動法を用いて、実際にペプチドの合成を行った際に得られた結果を示すものである。第２図の曲線（ａ）はサンプルの添加を示し、曲線（ｂ）はアシル化の進行に伴う吸収量の低下を示し、また曲線（Ｃ）は連続する読取り値開の差を示すものである。これらは著しく拡大された縦方向の尺度、−５〜＋５、でプロットし、−１と＋１における水平方向のデリミフタも併せて図示した０本例において、アシル化は５つの連続する差の読みがこれらの範囲内となった時点で完了したものと考えた。このアシル化工程を更に十分量経過後に自動的に終了させた。

合成したデカペプチドシーケンス（Ｉ［［）は線状の立体的障碍を受けている残基を含み、その合成は内部凝集による大きな障碍を起こす一工程を含んでいる。

最終工程を除き、各ペプチド結合形成工程に対して、２倍過剰のＦｍｏｃ−アミノ酸エステル（■）を用いた。（以下の記載を参照のこと、）制御用マイクロコンピュータをプログラムして、２０秒間隔で最大１３５回の読取りを行った。第２図は最初のペプチド結合（アスパラギンとグリシンとの結合）の形成を記録したものである。終点はイソロイシン残基（第３図）は予想通り４０分と遅かった。後の連続する残基は夫々１９．４分（Ｔｙｒ　）　、１７．４分（Ａｓｐ　）、３５．８分（Ｉｌｅ　）　、１７．８分（Ａｌａ　）　、１７．８分（Ａｌａ　）　、および２１，８分（Ｇｉｎ　）に終点を示した。最後のアシル化工程（バリンとグルタミンとの結合）は、上述の実験から、樹脂マトリックス内での内部凝集に大きく影響されて、例外的に遅いことがわかる。４倍過剰の活性化エステルを用いた。データ集収のために設定した時間（４５分）の終了時点でこのアシル化は明らかに不完全であった（第４図）。経過時間の読みは人為的に行い、反応を一夜行った。脱保護および樹脂からの分離（９２％）後、得られた粗製デカペプチド（実測値：Ｖａｌ、０．９３　：Ｇｌｕ、　０．９９　；Ａｌａ、　１．９２　；ｌｌｅ、　１．６４　；Ａｓｐ。

２．０１　；Ｔｙｒ　、０．９３　；Ｇｌｙ　、　１．００）は、従前の人為的に制御して合成したものに匹敵するｈｐｌｃプロフィールをもつ高品位のものであった。同様にして、カルシウム結合タンパクエンドプラスミンの部分配列である以下の１９残基の合成も同様に満足すべき結果を達成した。

１ＩＡｓｐ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｕ　−Ｖａｌ　・Ａｓｐ　−Ｖａｔ　−Ａｓｐ　 −ＧＩｙ　４ｈｒ−Ｖａｔ　・ＧＩｕ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　−ＧＩｕ　−ＧＩｙ　−Ｌｙｓ　−３ｅｒ　４ｙｒ　−Ｇｌｙ　・Ｏ１！　（ＩＸ）実施例　４本発明の方法を利用した、いくつかの他のペプチドの合成につき以下に記載する。

（ａ）　エシェリヒア　コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　Ｋ　８８　ａｄ厨房状縁ンパク断片９４−１０５の組立てこのペプチド、Ｈ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ −Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＯＨは実施例１に記載の方法で組立てたが、ジイソプロピル　エチルアミンの１．５％ＤＭＦ溶液の存在下で実施した（Ａｒｇｗ６およびＡｓｎｑｔでのアシル化を除（全工程）。溶液中での発色は４６０ｎｍで測定し、結果を反応時間の決定のために利用した。このアシル化時間は以下の通りであった（括弧内におよその観測された反応時間を与えた）　：Ｌｙｓｌ。４．４０分（１５分）　ｉ　Ｇｌｙ＋ｏｓ、４０分（１５分）　ｉ　Ｉｌｅ＋ｏｚ、４０分（２０分）　；Ｇ１ｕ＋ｏイ３０分（１５分）　：　ＧＩＶ＋ｏｏ、３０分（１２分）；ＡＳＩＰ＊ｑ　、４０分（２０分）　１Ｐｒｏ＊ｓ　、４０分（１２分）；＾５ｎｑｌ　、９０分（９０分）　ｉＡｒｇｑｈ、２１０分（１２０分）；Ｌｅｕ、ｓ、７５分（１５分）　；Ｖａｌｅ４．５０分（２０分）、かくしてＨ−Ｇｕｙ−ハンドル（Ｈａｎｄｌｅ）−Ｎｌｅ−樹脂（２ｇ、０．２０ｇｌ１ｏｌ）を、自動ペプチド合成装置内で０．５％のＤＩＰＥＡを含むＤＭＦ溶液（８［０中に溶解したＦｓｏｃ−アミノ酸−ＤＨＢＴエステル（０，６２ｍｍｏｌ、３当量）でアシル化した。各アシル化の終了後、カラムを１５分間洗浄し、ピペリジンの２０％ＤＭＦ溶液と共に１０分間流すことによりＦ＋ｗｏｃ−基を脱離した。流出液の吸収を３３０　ｎｍで監視した。樹脂上のペプチドを加水分解し、アミノ酸分析にかけた（実測値：Ｇｌｙ　、２．００　；Ａｓｐ、１．９０；Ｇｌｕ、、２．００；Ｐｒｏ、　１．０１；Ｖａｌ、０．９１；ｌｉｅ。

０．９４　；Ｌｅｕ　ｓ　Ｏ，９２１Ｎ１ｅ　、１．０２　；Ｌｙｓ　、１．０２　；Ａｒｇ　。

０．９３）。このペプチドを、５％のフェノールを含むＴＦＡ（１０＋／りで２４時間処理することによって、樹脂から分離した。この生成物を濾過し、真空中で蒸発させ、ジエチルエーテルで３回抽出し、水（３ｍＡりから凍結乾燥することにより単離した。

このペプチドをｈｐｌｃで分析し、ピーク部分を集め、Ｏ％バッファーＢで等方的（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）に溶出し、次いで３８分かけてＯ％〜５０％バッファーＢの線形勾配法で溶出した。観測されたピークの中で１８分および１９．２分におけるピークのみがペプチドを含み、従って正確にこれら両者を解析した。

山）　ベニシリナーゼ断片１−１２の組立てＨＯ−ハンドル（Ｈａｎｄｌｅ）− Ｎｌｅ−樹脂（１，４ｇ、　０．１５１１１１１０１）を、自動連続流動ペプチド合成装置に再循環することにより、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ　−０−ＤＨＢＴ　（３４２ｙｒｇ、０．６　ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰ（２０■、０．１６　ｓ＋ａｏｌ）のＤＭＦ　（７＋ｍｊり溶液によりアシル化した。１．３時間後に、この混合物を洗い流し、残留するヒドロキシル基を無水酢酸（１００μｊ！　−、１ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３０ｑ、０．２５　ｍｍｏｌ）で末端キャンプした。この樹脂をＤＭＦで洗浄し、Ｆｍｏｃ−基を２０％ピペリジンで除去した。３１２ｎｎ＋でのこの流出液の吸収の監視により、Ｔｒｐの組込みがわずかに２０％に過ぎないことが示された。この組立ては実施例１に記載されているように実施し、一方で反応を流動セル中の樹脂の薄い層（１，５ｎ）を通して４４０　ｎｍの光を透過させ、かつ樹脂上の残留アミノ基により脱プロトン化されたＤ　ＨＢ　Ｔ ’−ＯＨによる吸収を測定することにより監視した。これらの反応は、読みが最大吸収の１％を越える変化を示さなくなった時点で完結したものと考えた。アシル化時間は以下の通りであり、括弧内には観測された反応時間を与えた：Ｈ４ｓ、　、５０分（１２分）；Ｌｙｓ＋ｏ　、４５分（１２分）；Ｉｌｅｇ、５０分（２０分）；Ｌｅｕ＠、２５分（１０分）　；Ｓｅｒ＋、２５分゛（１０分）　；Ａｌａイ２７分（１０分）　１Ｇｌｙｓ、２５分（１０分）；ｌ１ｅ４．９０分（３０分）；Ｇｌｕ、、７０分（２０分）　；Ａｌａ、、８０分（２５分）；Ｉｌｅ。

１５０分。最後の４つのアシル化において、反応は１％の尿素の存在下で行った。各アシル化に次いで、１５分間ＤＭＦにより洗浄し、更に２０％のピペリジンを含むＤＭＦ溶液と共に１０分間流動させた。このサイクルは２５分間ＤＭＦで洗浄することにより完了させた。　Ｆ＋ｉｏｃの脱離中に、流出液を３１２ｎｍにおける吸収につき監視した。最終生成物はＡｃｐ断片について記載したように洗浄し、乾燥し、樹脂のアリコートを加水分解し、アミノ酸分析にかけた（実測値：　Ｇｌｙ　％　１−００　；　Ｓｅｒ　ｓＯ，８２；Ｇｌｕ、　１．０２；Ａｌａ、　２．０１；　ｒｌｅ、　２．８１　；Ｌｅｕ。

０．９７　；Ｎｌｅ　、　４．３０　；Ｈｉｓ　、　０．９９　；Ｌｙｓ　、　０．９９）。

このペプチドは、３％アニソールと１％のエタンジオールとを含むＴＦＡ　（３！ｌり）と共に１．５時間窒素でパージングすることにより樹脂（７０■）から分離した。この樹脂を濾別し、純ＴＦＡで洗浄した。溶媒を真空下で蒸発することにより除去し、ジエチルエーテルで３回抽出した後、生成物を窒素気流で乾燥し、２０％パンファーＢで２分等方的ｈｐｌｃ溶出し、３０分間の２０〜５０％バッファーＢによる線形勾配法でのｈｐｌｃ溶出により分析した。・１？３．３および１５．５分における２つの溶出ピークを正確な配列につき分析した。しかし、１５．５分におけるピークは、ｐ　ｒｐエステル法で前に調製されたｆｌｉ製ペニシリナーゼ断片ニー１２と一致した。

＜Ｃ）　タンパクＰ　１．６断片ｌｆｆ−２７の組立てこのペプチド、）ｌ　− Ｇｌｙ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｃｙｃ（Ａｃｍ）　−５ｅｒ　−Ｇｌｕ　−５ｅｒ　−５ｅｒ　−Ａｓｐ　−Ｇｌｙ　−３ｅｒ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｙ　−ＩＩＩを、４倍過剰のＦｍｏｃ−アミノ酸−ＤＨＢＴｍステル（０，６１ｎｍｍｏｌ）を用いて、ＩＩ　Ｇｌｙ−ハンドル−Ｎｌｅ−樹脂（１，４ｇ、０、１５４　ｍｍｏ＋）上に組立てた。アシル化反応の進行中、カラム底部の樹脂層（１ｍｍ）を通して４４０ｎｍの光の吸収を測定した。これら反応の終点は吸収量の変化がなくなった時点とした。

アシル化時間（括弧内は観測された反応時間である）は以下の通りであった：　Ｔｒｙ２ｇ　、５０分（１０分）　；５ｅｒ２ｓ　、５０分（１０分）　；Ｇｌｙｚａ　、５０分（５分）　；　５ｅｒｘｓ　、５０分（１５分）　；　ＡＳｐ２２．５０分（１０分）　；　５ｅｒ２＋ｓ　５０分（１０分）；５ｅｒ２ａ　、５０分（１５分）；Ｇｌｕｔｓ　、５０分（１０分）　；　Ｓｅｒ　１１ｌｓ５０分（１７分）；６ｙＳＩ７．５０分（１４分）　；ＬＹＳ＋ｓ　、５０分（２０分）　；ＬｙＳ＋ｓ　、６０分（５０分）：Ｌｙｓ＋ｎ、２４０分（９０分）　；ＧＩｙ＋ｓ　、６０分（３０分）。各アシル化サイクル完了後、樹脂をＤＭＦと共に１５分間流し、Ｆｍｏｃ−基を２０％のピペリジンを含むＤＭＦと共に１０分間流すことにより除去した。これらのサイクルはＤＭＦと共に２５分間流すこきにより完了した。最終生成物を連続的にＤＭＦ、ｔ−アミルアルコール、氷酢酸、ｔ〜ルアミルアルコールＤＭＦおよびジエチルエーテルで洗い、樹脂を真空下で乾燥した。この樹脂を加水分解し、アミノ酸分析にかけた（実測値：Ｇｌｙ　、　３．００　；八ｓｐ　。

１．０２；Ｓｅｒ、４．１７；Ｇｌｕ％１．００；Ｃｙｓ　（積分されず）；Ｎｌｅ　、１．０９　；Ｔｙｒ　、０．９０　；Ｌｙｓ　、２．９６）。

９５％の水性ＴＦＡ　（１ｃａｌ＞で１．６時間処理することにより、このペプチドを樹脂から分離した（４０■）。この樹脂を除去し、ＴＦＡを蒸発させた。

残金をジエチルエーテル（２５ｍ７２）で３回抽出し、真空下で乾燥した′。

この生成物を５％のバッファーＢで２分間等方的ｈｐｌｃ溶出し、次いで５％〜２５％のバッファーＢの濃度勾配の下で１８分間ｈｐｌｃ溶出することにより分析した。９分における主ピークおよび１０．８分における小ピークを集め、アミノ酸分析にかけた。

前者はこの分析によりタンパクＰ１６断片１３〜２７であり、一方後者ではリジンが欠損していることがわかった。

上記実施例は、連続流動条件の下で操作される固相合成の真の自動化のための基礎を与える。何隻追加の試薬、樹脂の除去、あるいは合成手順による他の妨害もないし、必要とされない。

反応が進行するにつれて、かつ補修作用が自動的にあるいは必要ならば手動で行い得る時点で、データが作成されオペレータに表示され、コンピュータで解析できる。合成の実質的な迅速化が可能であるが、主な重要性は特に遅い工程の検出にあり、これが行えないと、予め設定した反応時間では合成は失敗に帰することになる。

浄書（内容に変更なし）０　２−、点　３４５浄書（内容に変更なし）手続補正書（方式）特許庁長官　吉　１）文　夫　殿 ■、事件の表示　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１０００７８３、補正をする者事件との関係　出願人名　称　メディカル　リサーチ　力ランシル５、補正命令の日付　昭和６３年６月２８日国際調査報告１ｇ−１−１１４−＋ｍ＋＋ａｌＡ−１両−１１−−Ｎｏ、ＰＣＴノＧＢ８７７０００７ＢＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔ’？ｗ　ｒＮＴＥＲＮＡτ工０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣ！（ＲＥＰＯＲＴ　０ＮＥＰ−Ａ−００９７９９４１１１０１／８４　ＮｏｎｅＩＮＴＥＲＮＡＴ工０ＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１０Ｏ０７８（ＳＡ　１６００９）

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｎ−α−アミノ保護基で保護されたアミノ酸残基から出発し、以下の諸工程：（ａ）該Ｎ−α−アミノ保護基を脱離して、Ｎ−α−アミノ基を得、（ｂ）反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体および必要に応じて触媒を使用して、上記工程（ａ）で得たＮ−α−アミノ基に、ペプチド結合を介してＮ−α−アミノ保護基で保護されたアミノ酸残基を付加し、（ｃ）所定のアミノ酸残基の線状結合体が得られるまで上記工程（ａ）および（ｂ）を繰返すを包含する、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基の線状結合体の合成に際して、該反応系が３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンまたはその誘導体を含み、かつ該反応系またはその成分の色を該合成中モニターすることを特徴とする上記合成の進行をモニターする方法。
２．共有結合により固体支持体に結合され、かつＮ−α−アミノ保護基で保護されたアミノ酸残基から出発し、以下の諸工程；（ａ）該Ｎ−α−アミノ保護基を除去して、Ｎ−α−アミノ基を得、（ｂ）反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体および必要ならば触媒を使用して、上記工程（ａ）で得たＮ−α−アミノ基に、ペプチド結合を介して、Ｎ−α−アミノ保護基で保護されたアミノ酸残基を付加し、（ｃ）上記工程（ａ）および（ｂ）を、ペプチド結合を介して結合されたアミノ酸残基の線状結合体が得られるまで繰返す、を包含する該線状結合体の固相合成法において、上記反応系が３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンまたはその誘導体を含み、かつアシル化反応（工程（ｂ））の進行を、該反応系またはその成分の色を観察することによりモニターすることを特徴とする上記固相合成法。
３．上記固体支持体がポリアミド支持体である請求の範囲第２項記載の方法。
４．合成中、反応溶液に非プロトン系溶媒を用いる請求の範囲第１、２または３項記載の方法。
５．上記アシル化反応（工程（ｂ））が該反応溶液を再循環することにより行われる請求の範囲第１、２、３または４項に記載の方法。
６．上記工程（ｂ）において、上記反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体が、３ −ヒドロキシ−１，２，３，−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンの誘導体として活性化されるペプチド結合を形成するのに利用されるアシル基をもつ、請求の範囲第１、２、３、４または５項に記載の方法。
７．上記３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンの誘導体がエステルである請求の範囲第６項記載の方法。
８．上記３−ヒドロキシ−１，２，３−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンの誘導体がアジドまたは酸クロリドである請求の範囲第６項記載の方法。
９．上記工程（ｂ）において、上記３−ヒドロキシ−１，２，４−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンの誘導体が、反応媒質に３−ヒドロキシ−１，２，３− ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンを添加することにより、その場で生成される請求の範囲第６項記載の方法。
１０．該反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体が、３−ヒドロキシ−１，２，４ −ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンのエステルであり、該エステルが、ペプチド結合を形成するのに利用されるアシル基がべンタフルオロフェニルエステル状態にある保護アミノ酸を使用するエステル交換反応により得られる請求の範囲第９項記載の方法。
１１．上記の反応性かつ保護されたアミノ酸誘導体がＦｍｏｃ−アミノ酸のエステルである請求の範囲第６項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。
１２．上記非プロトン系溶媒が極性溶媒である請求の範囲第３項記載の方法。
１３．該溶媒がジメチルホルムアミドである請求の範囲第１２項に記載の方法。
１４．上記非プロトン系溶媒が非極性溶媒である請求の範囲第３項記載の方法。
１５．該溶媒がテトラヒドロフランである請求の範囲第１４項記載の方法。
１６．上記反応系またはその成分の色を測光法でモニターする請求の範囲第１〜１５項のいずれか１項記載の方法。
１７．上記色を約４４０ｎｍにて測光法でモニターする請求の範囲第１６項記載の方法。
１８．固相の色をモニターする請求の範囲第２項または第２項に従属している第３〜１７項のいずれか１項に記載の方法。
１９．３−ヒドロキシ−１，２，４−ベンゾトリアジン−４（３Ｈ）−オンを、上記反応系から取出される固相支持体の一部に加え、該取出された固相支持体の色をモニターする請求の範囲第１８項記載の方法。
２０．上記反応溶液が塩基性であり、該反応溶液の色をモニターする請求の範囲第１〜１７項のいずれか１項に記載の方法。
２１．上記反応溶液がＮ−メチルモルホリン、ジイソプロピルエチルアミン、ピペリジンまたはＮ−エチルモルホリンを含む請求の範囲第２０項記載の方法。
２２．ペプチドの固相合成反応の進行中に、反応溶液または固相の色をモニターする手段を含むことを特徴とするペプチドの自動固相合成用装置。
２３．該モニター手段が光度モニタを含む請求の範囲第２２項記載の装置。
２４．該光度モニタが４４０ｎｍでの観測に適したものである請求の範囲第２３項記載の装置。
２５．（ｉ）上記固相合成が起こるポリアミド樹脂を含む粒子を収容するカラムと、（ｉｉ）該カラムの一方の側に設けられた光源と、（ｉｉｉ）該カラムに隣接しかつ該光源と対向する位置に設けられた集光集成装置と、（ｉｖ）該集光集成装置により集光された光を受け取るように配置された光度計と、（ｖ）該光検出器の出力に応答し、かつこれに応じて合成手順を制御するようにプログラムされたマイクロプロセッサとを含む請求の範囲第２３または２４項記載の装置。
２６．更に、上記光源と上記カラムとの間に設けられたシャッタ集成装置を含む請求の範囲第２５項記載の装置。