JPH04252182A - Ｎａｄｈキナーゼ及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なＮＡＤＨキナーゼ
及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】現在、酵素反応を用いて、病態のマーカ
ーとなる物質を定量する診断法が広く行われている。し
かし、現行法では、測定の困難な極く微量のマーカーも
あり、また、新生児検診のように被検液量が微量に限ら
れる場合もあって、これに対応しうる高感度な分析法が
求められている。

【０００３】それらの方法のひとつとして、サイクリン
グ反応による増感分析法があり、β−ＮＡＤ＋　⇔β−
ＮＡＤＨ系のサイクリング反応やβ−ＮＡＤＰ＋　⇔β
−ＮＡＤＰＨ系のサイクリング反応等が知られている。 　（東京化学同人社刊　　生化学実験講座　　第５巻、
　１２１〜１３１　ページ）　。そして例えば、特開昭
５９−２１３４００　号公報に記載されている如く、β
−ＮＡＤ＋　に特異的なキナーゼを用いてβ−ＮＡＤＨ
とβ−ＮＡＤ＋　を含有する溶液中のβ−ＮＡＤ＋　の
みをリン酸化してβ−ＮＡＤＰ＋　とし、サイクリング
反応に導くことによって高感度に定量することができる
。

【０００４】しかしながら、ＮＡＤ＋　とＮＡＤＨを含
有する混合系において、ＮＡＤＨが微量に存在している
場合は、そのＮＡＤＨを定量する方法として前述の特開
昭５９−２１３４００　号公報で記載されている方法で
は、定量が不可能である。そのため従来は、ＨＰＬＣを
使ったフローインジェクションアッセイや煮沸する方法
　（特開昭５８−１２９９９４　号）　を用いていたが
、高価な装置が必要だったり、操作が煩雑で時間がかか
ったりするという欠点があった。また、β−ＮＡＤＨを
ルシフェラーゼで発光に導く高感度な方法や、化学発光
に導く方法もあるが、特殊で高価な検出器が必要となり
、また試薬の安定性も問題になってくる。

【０００５】ここで、安定でＮＡＤＨに非常に特異的な
キナーゼがあれば、上記ＮＡＤＨの定量が可能となるが
、実際、実用に耐え得るＮＡＤＨキナーゼは知られてい
ない。即ち、いくつかのＮＡＤＨキナーゼについての報
告はあるものの、特異性が明らかでなかったり、特異性
がなかったり、特異性があっても非常に不安定であった
りするため、各種の酵素反応と組み合わせて高感度測定
を行う上で、実用には使用し得ないものであった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明者等は上記した
事実に鑑み、実用に適する、安定でＮＡＤＨに特異的な
ＮＡＤＨキナーゼを得べく、鋭意研究を重ねた結果、ピ
ヒア属に属する酵母が目的とするＮＡＤＨキナーゼを生
産することを見出し、本発明を完成させた。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、以下の理化学
的性質を有する新規なＮＡＤＨキナーゼ（以下、“本酵
素”という）にある。 （１）　作用 本酵素は下記の反応式に示す通り、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋
、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋のうち少なくとも１種のイオンの
存在下で、ＮＡＤＨとＸＴＰ〔式中、ＸはＡ　（アデノ
シン），Ｕ　（ウリジン），Ｇ　（グアノシン），Ｃ　
（シチジン），Ｉ　（イノシン），ｄＴ　（チミジン）
，ｄＡ　（デオキシアデノシン），ｄＵ　（デオキシウ
リジン），ｄＧ　（デオキシグアノシン），ｄＣ　（デ
オキシシチジン）　又はｄＩ　（デオキシイノシン）　
を示す〕を基質としてＮＡＤＨをリン酸化し、ＮＡＤＰ
ＨとＸＤＰ〔式中、Ｘは前記と同じ〕を生成する反応を
触媒する。

【０００８】 　（２）　基質特異性 本酵素は、ＮＡＤＨに対して非常に特異的であって、Ｎ
ＡＤ＋　には殆ど作用しない。

【０００９】本酵素の基質特異性を以下の反応条件で調
べた。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　第１表　　　　
基質溶液　　───────────────────
───────　　１０ｍＭ　　ＮＡＤＨまたは　ＮＡ
Ｄ＋　のいずれか　　　　　　　　　０．２ｍｌ　　０
．５Ｍ　　ＨＥＰＰＳ　＊　緩衝液　　（ｐＨ８．５）
　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ　　１０ｍＭ　　Ａ
ＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０．３ｍｌ　　０．１Ｍ　　塩化マ
グネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０
．１ｍｌ　　２．０Ｍ　　酢酸ナトリウム　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ　　　　　
　　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．１ｍｌ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　───────　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．９ｍｌ　　─────────────
─────────────＊　ＨＥＰＰＳ：Ｎ−２−
Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ−Ｎ’
−３−ｐｒｏ　ｐａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　
上記のＮＡＤＨを含む基質溶液　０．９ｍｌ及びＮＡＤ
＋　を含む基質溶液　０．９ｍｌに、それぞれ　２３Ｕ
／ｍｌの本酵素を　０．１ｍｌずつ加え、３０℃で２０
分間反応させた。その後、　１００℃、２分間の処理で
反応を停止して変性タンパクを除去し、次いでそれぞれ
の基質の反応によって生成したＮＡＤＰＨまたはＮＡＤ
Ｐ＋　の量を以下の通り測定した。なお対照としては、
基質溶液と本酵素を混合後、直ちに反応を停止したもの
を用いた。

【００１０】すなわち上記反応液各１ｍｌに、１０ｍＭ
　Ｇ−６−Ｐ５０ｍＭ　ＨＥＰＰＳ　緩衝液（ｐＨ８．
０）−１０ｍＭ塩化マグネシウム−０．１％牛血清アル
ブミン　２．５ＩＵ／ｍｌ　Ｇ−６−Ｐデヒドロゲナー
ゼ　（ＮＡＤＰ＋　依存性）　５ＩＵ／ｍｌジアホラー
ゼ−２５０μＭ　　２，　６−ジクロロフェノールイン
ドフェノール、なる組成の発色液１ｍｌをそれぞれ加え
て混合し、直ちにギルフォード社ステーサー　ＩＩＩ型
分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で反応さ
せた。この際、反応と同時に　６００ｎｍにおける吸光
度の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後の吸光度
値と２分後の吸光度値との差　（ΔＯＤ６００ｎｍ　／
ｍｉｎ）　を測定値とした。相対活性（％）は、ＮＡＤ
Ｈを基質として得られた測定値（ΔＯＤ６００ｎｍ　／
ｍｉｎ）　を１００　％として、ＮＡＤ＋　を基質とし
て得られた測定値（ΔＯＤ６００ｎｍ　／ｍｉｎ）を比
較値（％）　で示した。

【００１１】結果は次の通りである。 基　　質　　　　　　　　相対活性　（％）ＮＡＤＨ　
　　　　　　　　　　１００ＮＡＤ＋　　　　　　　　
　　　　０．９（３）　力価の測定法 　　　　　　　　　　　　　　　　　　第２表　　　　
基質溶液　　───────────────────
───────　　１０ｍＭ　ＮＡＤＨ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．２ｍｌ　　０．５Ｍ　ＨＥＰＰＳ＊　緩衝液　　（
ｐＨ８．５）　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ　
　１０ｍＭ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．３ｍｌ　　０
．１Ｍ　塩化マグネシウム　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　０．１ｍｌ　　２．０Ｍ　酢酸ナトリウム
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍ
ｌ　　　　　　　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　───────　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　０．９ｍｌ　　───────
───────────────────　　上記の組
成のＮＡＤＨを含む基質溶液　０．９ｍｌを３０℃に予
備加温し、これに所定の濃度の本酵素液　０．１ｍｌを
加えて、３０℃で２０分間反応させた。その後、　１０
０℃、２分間の処理で反応を停止して変性タンパクを除
去し、次いでそれぞれの基質の反応によって生成したＮ
ＡＤＰＨまたはＮＡＤＰ＋　の量を以下の通り測定した
。なお対照としては、基質溶液と本酵素を混合後、直ち
に反応を停止したものを用いた。

【００１２】すなわち上記反応液各１ｍｌに、前記“基
質特異性”の項に記載したものと同じ組成の発色液１ｍ
ｌを加えて混合し、直ちにギルフォード社ステーサー　
ＩＩＩ型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０℃
で反応させた。この際、反応と同時に６００ｎｍ　にお
ける吸光度の変化を経時的に測定し、発色反応後１分後
の吸光度値と２分後の吸光度値との差　（ΔＯＤ６００
ｎｍ　／ｍｉｎ）　を測定値として得た。予め、濃度既
知のＮＡＤＰＨ溶液を用いて、ΔＯＤ６００ｎｍ　／ｍ
ｉｎとＮＡＤＰＨ濃度との検量線を作成しておき、これ
によって測定値から、生成したＮＡＤＰＨの量を算出し
た。

【００１３】なお、３０℃において１分間当り、１ナノ
モル量のＮＡＤＰＨを生成する酵素量を１単位とする。 本酵素のＮＡＤＨに対するＫｍ値〔ミカエリス定数〕は
、３０℃，　　ｐＨ７．８（トリス緩衝液）　において
、２７マイクロモルである。 （４）　至適　ｐＨ 本酵素の至適　ｐＨは、ＮＡＤＨを基質とした場合、第
１図に示すように　ｐＨ８．０〜９．０である。

【００１４】（５）　安定　ｐＨ範囲 本酵素を、各種　ｐＨの緩衝液に溶解し、４℃，１６時
間放置した後、残存活性を調べたところ、第２図に示す
ように　ｐＨ７．０〜９．０で安定であった。 （６）　作用適温の範囲 本酵素の作用適温の範囲は、第３図に示すように３０〜
４５℃にある。

【００１５】（７）　熱安定性 本酵素を、緩衝液中に溶解し、各温度で１０分間放置し
て、残存する酵素活性を測定し、熱安定性を調べた。そ
の結果、第４図に示すように、本酵素は３５℃で８３％
、４０℃で６０％、４５℃で３０％の残存活性を示した
。 （８）　阻害、活性化及び安定化 本酵素はＳＤＳ　（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｌａｕｒｙｌ　Ｓｕ
ｌｆａｔｅ）、ｐ−ＣＭＢ　（ｐ−Ｃｈｌｏｒｏｍｅｒ
ｃｕｒｉｂｅｎｚｏｉｃ　ａｃｉｄ）、Ｐｂ２＋、Ｚｎ
２＋、Ｃｄ２＋、Ｃｕ２＋、Ｈｇ２＋等により強く阻害
され、また酢酸ナトリウム等により活性化される。さら
に、サッカロース、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、ＤＴＴ　（Ｄ
ｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）　、硫酸アンモニウム等
により安定化される。

【００１６】（９）　精製方法 本酵素は、常法の酵素精製方法、例えばイオン交換クロ
マトグラフィー、硫安分画、疎水クロマトグラフィー、
ゲル濾過等の方法を、単独または組合わせて用いること
により精製できる。 （１０）　分子量 本酵素の分子量を、アンドリウスの方法〔Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．　Ｊ．　９６，　５９５（１９６５）　〕に基づき
、セファクリルＳ−３００ＨＲ〔ファルマシア社　（ス
ウェーデン）　製〕を用いたゲル濾過法で測定すると約
２７０，０００　である。

【００１７】（１１）　等電点 本酵素の等電点を、アンフォライトを含むアガロースゲ
ルを用いて電気泳動法によって測定した結果、ｐＩ＝６
．４０である。本酵素を公知文献に記載のＮＡＤＨキナ
ーゼＡ（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　１０５，　５８８−
５９３，　１９８９）及びＢ（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．
　２４７，　１４７３−１４７８，　１９７２）と比較
すると第３表の通りである。

【００１８】 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　第３表　　　　　　　　　　　　　　本
酵素　　　　　　　　　　　　　　　　Ａ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　Ｂ　　　　　　由　　来　　
　　ピヒア・　　　　　　　　　　　　　　　　サッカ
ロマイセス・　　サッカロマイセス・　　　　　　　　
　　メンブラニファシエンス　　セレビシエ　　　　　
　　　　　セレビシエ　　　　　　　　至適ｐＨ　　　
　　　　　　８．５　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８．５　　　　　　　　　　　　　　　８．
０〜８．５　　　　　　　熱安定性　　３５℃５分で、
　　　　　　　　　　　　３５℃５分で、　　　　　　
　　非常に不安定　　　　　　　　　　　　　　　　１
０％失活、　　　　　　　　　　　　　　６５％失活　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　３５℃１０分で、　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１７％失活　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　特異性　　　　　Ｎ
ＡＤＨ＝１００　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＡ
ＤＨ＝１００　　　　　　　　　　　　ＮＡＤＨ＝１０
０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＡＤ＋
　＝０．９　　　　　　　　　　　　　　　ＮＡＤ＋　
＝１．７　　　　　　　　　　　ＮＡＤ＋　＝１．６　
　　　　　　　分子量　　　　２７０，０００　　　　
　　　　　　　　　　　　　１６０，０００　　　　　
　　　　　　　　　　　　　？　　　　　　　　　　　
　第３表から明らかなように、本酵素は公知のＮＡＤＨ
キナーゼとは酵素化学的、物理化学的性質が異なり、特
に熱安定性の点において優れているため、他の各種酵素
と組み合わせて使用して高感度分析を行ったりする上で
、実用に耐え得るため大変有利である。

【００１９】次に、本酵素の製造法について詳述する。 本発明において使用される酵母はピヒア属に属し、ＮＡ
ＤＨキナーゼ生産能を有する菌株であればいずれもよく
、その具体例としてはピヒア・メンブラニファシエンス
ＹＳ２７株を挙げることができ、その変種あるいは変異
株も用いることができる。

【００２０】ピヒア・メンブラニファシエンスＹＳ２７
株は、本発明者等が栃木県宇都宮市内の土壌中より新た
に分離した菌株であり、その菌学的性質は以下の通りで
ある。ＹＭ寒天培地上において２５℃で５日間培養した
時の集落は鈍い光沢のあるクリーム色を呈する。光学顕
微鏡観察によれば、亜球形あるいは長楕円形の栄養細胞
が認められ、多極出芽によって増殖する。改良ゴロドコ
ーワ寒天培地上で２５℃、５日間培養した集落を光学顕
微鏡で観察すると通常４個の子のう胞子を内在する楕円
形あるいは長楕円形の子のうが認められる。子のう胞子
は球形を呈し、子のうから離脱しやすい。真性菌糸は認
められないが、偽菌糸はよく発育する。培養液の表面に
皮膜を形成し、好気性である。カロチノイド系色素の生
成は認められない。

【００２１】本菌株は硝酸塩を資化できず、グルコース
の発酵能はなく強い生酸性も観察されない。また、本菌
株はマルトース、ガラクトース、トレハロース、マンニ
トール、サリシン、グルコン酸カリウムを資化できない
。本菌株を「ザ・イースツ・ア・タキソノミック・スタ
ディー　　第３版」に従って検索した結果、上記の菌学
的性質からピヒア・メンブラニファシエンス（Ｐｉ−　
ｃｈｉａ　　ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）　と
同定した。

【００２２】本菌株はピヒア・メンブラニファシエンス
ＹＳ２７と命名し、通商産業省工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研条寄第３２０８号　（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−３２０８）　として寄託している。次に、本発明で使
用する培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他
の栄養素を含む培地であれば合成培地、天然培地のいず
れでも良い。炭素源としては、例えばグルコース、クエ
ン酸、グリセリン等を、窒素源としては、例えばペプト
ン、酵母エキス、麦芽エキス、肉エキス、硫酸アンモニ
ウム等が、好適に使用できる。無機物としては、ナトリ
ウム、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の塩類、
リン酸塩等が必要に応じて使用される。培養条件は通常
２０〜４０℃、好ましくは、３０℃近辺で、１６〜４８
時間振盪または通気攪拌培養する。培養開始の　ｐＨは
通常５．０〜７．５、好ましくは６．０前後である。

【００２３】また本酵素は、クエン酸回路にあるか、ま
たはその近傍に存在する物質、例えばコハク酸、乳酸、
クエン酸等を培地に添加する事によって、より多量に菌
体内に蓄積させることができる。こうして、培養する過
程で本酵素が最高力価に達する時期を選んで、培養を停
止すればよい。

【００２４】本酵素は通常、菌体内に存在するので、培
養物から濾過あるいは遠心分離等によって、菌体を集め
、これをガラスビーズ処理やフレンチプレス処理等の機
械的破壊手段や、酵母溶菌酵素等による酵素的破壊手段
等で破壊し、またこの際必要に応じてトリトンＸ−１０
０　等の可溶化剤を添加して、酵素を可溶化することに
より溶液中に遊離させる。こうして得られた酵素含有液
より核酸と菌体細胞壁を常法により除去し、濾過または
遠心分離等によって不溶化物を除いて、本酵素を得る。

【００２５】また、本酵素は常法、例えばイオン交換ク
ロマトグラフィー、硫安分画、疎水クロマトグラフィー
、ゲル濾過等の酵素精製方法を、単独または適宜選択し
て組み合わせて用いることにより精製酵素とすることが
できる。実験例：本発明のＮＡＤＨキナーゼによるＮＡ
ＤＨの定量多量のＮＡＤ＋　を含む系に混在する微量の
ＮＡＤＨを定量する目的で、下記反応液Ｉ組成を持つ反
応液０．８ｍｌ　に２ｍＭ　　ＮＡＤ＋　と各濃度（０
〜１０μＭ）のＮＡＤＨを含有する試料液０．４ｍｌ　
を添加し、３５℃で２０分間反応させた。反応停止後、
これに下記反応液ＩＩ組成を持つ反応液０．８ｍｌ　を
添加して混合し、直ちにギルフォード社ステーサーＩＩ
Ｉ　型分光光度計の恒温キュベット内に導き、３０℃で
反応させて、同時に６００ｎｍ　における吸光度の変化
を経時的に測定し、発色反応後１分後の吸光度値と２分
後の吸光度値との差（△ＯＤ　６００ｎｍ／ｍｉｎ）　
を測定値として得た。その結果、第５図に示すように、
ＮＡＤＨ量と△ＯＤ　６００ｎｍ／　ｍｉｎ　値との間
に、良好な直線性が感度良く得られた。

【００２６】

【発明の効果】本発明は、安定性に優れ、ＮＡＤＨに対
して特異的な新規なＮＡＤＨキナーゼを提供する。更に
このＮＡＤＨキナーゼを、ピヒア属に属する酵母を培養
することにより製造する方法を提供する。本酵素を用い
れば、ＮＡＤ＋　とＮＡＤＨを含有する混合系において
も、微量のＮＡＤＨのみを高感度に定量することが可能
となり、臨床・医療等の分野で、産業上極めて有意義で
ある。

【００２７】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。 実施例：ＮＡＤＨキナーゼの調製 ピヒア・メンブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅ
ｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ）　ＹＳ２７　（微工研
条寄第３２０８号）を、５００ｍｌ　坂口フラスコ中の
、グルコース２％、酵母エキス１％、ポリペプトン１％
、リン酸水素一カリウム０．９　％、硫酸アンモニウム
０．６　％、塩化カルシウム０．０５％、硫酸マグネシ
ウム０．０５％なる組成の培地Ａ（ｐＨ５．５　）５０
ｍｌに植菌し、３０℃で２４時間振盪培養した。この種
培養物を、培地Ａ２０リットルに接種し、３０リットル
のジャーファーメンターで、通気量２０Ｌ／ｍｉｎ　、
攪拌速度３００ｒｐｍの条件下で、３０℃で１８時間培
養し、培養物を遠心分離により集菌し、菌体１４０６ｇ
　を得た。この全量を、グルコース０．５　％、酵母エ
キス１％、ポリペプトン１％、リン酸水素一カリウム０
．９　％、硫酸アンモニウム０．６　％、塩化カルシム
０．０５％、硫酸マグネシウム０．０５％、コハク酸ナ
トリウム２％なる組成の、培地Ｂ（ｐＨ５．５　）２０
リットルに接種し、３０リットルのジャーファーメンタ
ーで、通気量２０Ｌ／ｍｉｎ　、攪拌速度３００ｒｐｍ
の条件下で、３０℃で６時間培養し、培養物を遠心分離
により集菌し、菌体１４２８ｇ　を得た。この全量を、
０．１Ｍサッカロース、０．５　％トリトンＸ−１００
　、５０ｍＭリン酸バッファー（　ｐＨ６．０）に分散
させて、総量を５リットルとし、これをダイノミル（ス
イス国　ＷＡＢ社）を用いてガラスビーズ破砕した。

【００２８】回収した破砕液５２８０ｍｌは、遠心分離
によって沈澱物を除去した後、限外濾過膜（分画分子量
６，０００）を用いてバッファー交換を行い、０．０５
Ｍ　塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
６．０　）の状態とした。次にこの酵素液５２６０ｍｌ
を、予め０．０５Ｍ　塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸
バッファー（ｐＨ６．０）で緩衝化したＣＭ−セファデ
ックスＣ−５０カラム（ファルマシア社）に通液して吸
着させ、０．１Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン酸バッ
ファー（ｐＨ６．０）で洗浄した後、塩化ナトリウム濃
度０．１　〜０．４Ｍの濃度勾配で溶出を行い、活性画
分を集めた。

【００２９】溶出液４５５ｍｌ　は限外濾過膜（分画分
子量６，０００）を用いてバッファー交換を行い、１０
％硫酸アンモニウム、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ
　ＨＥＰＰＳ　バッファー（ｐＨ７．５）として、予め
同じバッファーで緩衝化した、フェニル−トヨパール６
５０　カラム（東ソー社）に通液して吸着させ、１０％
硫酸アンモニウム、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，　１０ｍＭ　
ＨＥＰＰＳ　バッファー（ｐＨ７．５　）で洗浄した後
、硫酸アンモニウム濃度１０％〜０％の濃度勾配で溶出
を行い、活性画分を集めた。

【００３０】続いて、この溶出液３７２ｍｌ　を、アミ
コン社製限外濾過装置（分画分子量１０，０００）を用
いて濃縮して２５ｍｌとし、予め０．２Ｍ硫酸アンモニ
ウム、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ　ＨＥ−ＰＰＳ　
バッファー（ｐＨ７．５）で緩衝化した、セファクリル
Ｓ−３００　ＨＲカラム（ファルマシア社製）にかけて
、ゲル濾過を行った。得られた活性画分を濃縮後、凍結
乾燥して本酵素標品１１７．３ｍｇ　（回収率３４％）
を得た。本標品の比活性は１０２Ｕ／ｍｇ　であった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本酵素の至適ｐＨ（●−●はリン酸緩衝液；○
−○はトリス塩酸緩衝液；▲−▲は、グリシン水酸化ナ
トリウム緩衝液）を示した図。

【図２】安定ｐＨ範囲（●−●はリン酸緩衝液；○−○
はトリス塩酸緩衝液；▲−▲は、グリシン水酸化ナトリ
ウム緩衝液）を示した図。

【図３】作用適温の範囲を示した図。

【図４】熱安定性を示した図。

【図５】実験例における検量線を、ＮＡＤＨ量と△ＯＤ
　６００ｎｍ／ｍｉｎ値との関係で示した図。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　以下の理化学的性質を有するＮＡＤＨ
   キナーゼ。 （ａ）　作用及び基質特異性：Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃ
   ａ２＋、Ｃｏ２＋のうち少なくとも１種のイオンの存在
   下で、ＮＡＤＨとＸＴＰ〔式中、ＸはＡ　（アデノシン
   ），Ｕ　（ウリジン），Ｇ　（グアノシン），Ｃ　（シ
   チジン），Ｉ　（イノシン），ｄＴ　（チミジン），ｄ
   Ｉ（デオキシアデノシン），ｄＵ　（デオキシウリジン
   ），ｄＧ　（デオキシグアノシン），ｄＣ　（デオキシ
   シチジン）　又はｄＩ　（デオキシイノシン）　を示す
   〕を基質としてＮＡＤＨをリン酸化し、ＮＡＤＰＨとＸ
   ＤＰ〔式中、Ｘは前記と同じ〕を生成する反応を触媒す
   る。ＮＡＤＨに対して非常に特異的であってＮＡＤ＋　
   には作用しない。 （ｂ）　至適　ｐＨ及び安定　ｐＨ範囲：至適　ｐＨは
   、ＮＡＤＨを基質とした場合、　ｐＨ８．０〜９．０で
   あり、安定　ｐＨ範囲は、　ｐＨ７．０〜９．０である
   。 （ｃ）　作用適温の範囲：３０℃〜４５℃（ｄ）　熱安
   定性：３５℃，　１０分間の処理で８３％、４０℃，　
   １０分間の処理で６０％、４５℃，１０分間の処理で３
   ０％の残存活性を示す。 （ｅ）　分子量：約２７０，０００
2. 【請求項２】　　ピヒア属に属しＮＡＤＨキナーゼ生産
   能を有する酵母を培地に培養し、培養物よりＮＡＤＨキ
   ナーゼを採取することを特徴とするＮＡＤＨキナーゼの
   製造法。