DE4201930A1

DE4201930A1 - Nadh-kinase und ein verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE4201930A1
Application number: DE4201930A
Authority: DE
Inventors: Tsuyoshi Ohno; Masaru Suzuki; Tatsuo Horiuchi
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1991-01-25
Filing date: 1992-01-24
Publication date: 1992-07-30
Also published as: JPH04252182A; JP2818695B2; US5227299A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue NADH-Kinase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Zur Zeit wird ein diagnostisches Verfahren weit verbreitet eingesetzt, bei dem in einer enzymatischen Reaktion die Menge einer Substanz bestimmt wird, die als Marker für eine Krankheit dienen kann. Es gibt jedoch eine Reihe von Spurenmarkern, die nach konventionellen Methoden schwierig zu messen sind, und in manchen Fällen ist die Testflüssigkeit auf eine kleine Menge beschränkt, zum Beispiel bei der medizinischen Untersuchung von neugeborenen Säuglingen. Es sind daher hochempfindliche analytische Methoden zur Lösung solcher Probleme erforderlich.

Eine solche Methode ist ein photosensibles analytisches Verfahren unter Verwendung einer Zyklisierungs-Reaktion. Als Zyklisierungs-Reaktionen sind die

beta-NAD⁺ ⇄ beta-NADH-Zyklisierungsreaktion,

die

beta-NADP⁺ ⇄ beta-NADPH-Zyklisierungsreaktion usw.

bekannt ["Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiments"), Bd. 5, Seiten 121-131]. Zum Beispiel kann, wie in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Nr. 59-2 13 400 beschrieben, beta-NAD⁺ mit hoher Empfindlichkeit nur durch Phosphorylierung von beta-NAD⁺ in einer beta-NADH und beta-NAD⁺ enthaltenden Lösung unter Verwendung einer für beta-NAD⁺-spezifischen Kinase und Zyklisierung des beta-NADP⁺ nachgewiesen werden.

Wenn jedoch eine kleine Menge NADH in einer NAD⁺ und NADH enthaltenden Mischung vorliegt, kann es nicht nach der obigen in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. 59-2 13 400 nachgewiesen werden. Daher wurde bislang eine Flußinjektionsuntersuchung unter Verwendung von HPLC und einer eine Kochstufe enthaltenden Methode durchgeführt (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 58-1 29 994), aber diese Verfahren weisen die Nachteile auf, daß sie eine teure Apparatur, ein umständliches Verfahren und lange Zeit erfordern. Es gibt ebenfalls ein hochempfindliches Verfahren, bei dem man beta-NADH zur Lumineszenz unter Verwendung von Luiferase veranlaßt und ein Verfahren, nach dem man beta-NADH zur Chemilumineszenz veranlaßt, diese Verfahren erfordern jedoch einen speziellen und teuren Detektor und zeigen Probleme bei der Stabilität der Reagentien.

Die obige Bestimmung von NADH wird möglich, sobald eine Kinase vorliegt, die stabil und für NADH hochspezifisch ist. Es ist jedoch keine NADH-Kinase von praktischer Verwendung bekannt. Im einzelnen wurden eine Reihe NADH-Kinasen beschrieben, von denen manche keine bemerkenswerte Spezifität aufweisen, andere gar keine Spezifität besitzen und wieder andere spezifisch sind, aber dafür sehr instabil. Sie können daher nicht praktisch in Kombination mit verschiedenen enzymatischen Reaktionen zur Durchführung einer hochempfindlichen Messung verwendet werden.

In anbetracht dieser Umstände haben die Erfinder intensiv nach einer stabilen NADH-Kinase gesucht, die zur praktischen Verwendung geeignet und spezifisch für NADH ist. Als Ergebnis wurde eine zum Stamm Pichia gehörende Hefe gefunden, die die erwünschte NADH-Kinase produzieren kann, wodurch die Vollendung der vorliegenden Erfindung möglich war.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine neue NADH-Kinase zur Verfügung zu stellen mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften (im folgenden als "das erfindungsgemäße Enzym" bezeichnet).

1) Wirkung

Das erfindungsgemäße Enzym katalysiert wie in der unten stehenden Reaktionsgleichung gezeigt eine Reaktion, durch die aus den Substraten NADH und XTP (wobei X A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin), C (Cytidin), I (Inosin), dT (Deoxythymidin), dA( Deoxyadenosin), dU (Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin), dC (Deoxycytidin), dI (Deoxyinosin) ist), NADPH und XDP (worin X dieselbe Bedeutung wie oben hat) durch Phosphorylierung von NADH in Gegenwart von mindestens einem Ion ausgewählt aus Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺ und Co²⁺ hergestellt wird:

worin X dieselbe Bedeutung wie oben hat.

2) Substratspezifität

Das erfindungsgemäße Enzym ist sehr spezifisch für NADH und reagiert kaum mit NAD⁺.

Die Substratspezifität des erfindungsgemäßen Enzyms wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen getestet.

Tabelle 1

Substratlösung

Zu 0,9 ml einer jeden der obigen Substratlösungen mit NADH oder NAD⁺ wurden 0,1 ml des erfindungsgemäßen Enzyms (23 Einheiten/ml) gegeben und die Reaktion bei 30°C 20 min durchgeführt. Anschließend wurde die Reaktion durch Hitzebehandlung bei 100°C für 2 min abgebrochen und das denaturierte Protein entfernt, worauf die Menge an NADPH oder NADP⁺ aus der Reaktion der entsprechenden Substrate wie folgt gemessen wurde. Zur Kontrolle wurde eine Mischung von jeder Substratlösung mit dem vorliegenden Enzym verwendet, bei der die Reaktion unmittelbar nach dem Mischen abgebrochen worden war.

1 ml von jeder der oben erhaltenen Reaktionslösungen wurde mit 1 ml einer farbproduzierenden Lösung, bestehend aus 10 mM G-6-P, 50 mM HEPPS-Puffer (pH 8,0), 10 mM Magnesiumchlorid, 0,1% Rinderserumalbumin, 2,5 IU/ml G-6-P Dehydrogenase (NADP⁺-abhängig), 5 IU/ml Diaphorase und 250 µM 2,6-Dichlorphenolindophenol gemischt. Die erhaltene Mischung wurde sofort in eine temperaturkonstante Küvette des STASAR III-Spektrophotometers von Gilford eingeführt und einer Reaktion bei 30°C unterworfen. Gleichzeitig mit der Reaktion wurde die Veränderung der Absorption bei 600 nm in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit gemessen, und der Unterschied (ΔOD_{600 nm}/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Eintritt der Farbreaktion als Meßwerte genommen. Als relative Aktivität (%) wurde ein bei Verwendung von NAD⁺ als Substrat gemessener Wert (ΔOD_{600 nm}/min) als Prozentwert des bei Verwendung von NADH als Substrat gemessenen Wertes (ΔOD_{600 nm}/min) angegeben. Die Ergebnisse sind wie folgt.

Substrat
Relative Aktivität (%)
NADH
100
NAD⁺	0,9

(3) Methode der Titerbestimmung

Substratlösung
10 mM NADH\|0,2 ml
0,5 mM HEPPS*-Puffer (pH 8,5)	0,1 ml
10 mM ATP	0,3 ml
0,1 M Magnesiumchlorid	0,1 ml
2,0 M Natriumacetat	0,1 ml
destilliertes Wasser	0,1 ml
	0,9 ml

0,9 ml der obigen NADH enthaltenden Substratlösungen wurden auf 30° vorerwärmt, danach wurden 0,1 ml einer Lösung des erfindungsgemäßen Enzyms mit einer entsprechenden Konzentration zugegeben und die Reaktion bei 30°C 20 min durchgeführt. Anschließend wurde die Reaktion durch Hitzebehandlung bei 100°C für 2 min abgebrochen und das denaturierte Protein entfernt. Anschließend wurde die Menge des durch die Reaktion aus dem Substrat produzierten NADPH wie folgt gemessen. Zur Kontrolle wurde eine Mischung der Substratlösung mit dem erfindungsgemäßen Enzym verwendet, bei der die Reaktion unmittelbar nach Vermischen abgebrochen worden war.

1 ml von jeder der oben erhaltenen Reaktionslösungen wurde mit 1 ml einer farbproduzierenden Lösung mit derselben Zusammensetzung wie die im obigen Punkt "Substratspezifität" beschrieben gemischt. Die erhaltene Mischung wurde sofort in eine temperaturkonstante Küvette des STASAR III-Spektrophotometers von Gilford eingeführt und einer Reaktion bei 30°C unterworfen. Gleichzeitig mit der Reaktion wurde die Absorptionsänderung bei 600 nm in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit gemessen, und der Unterschied (ΔOD_{600 nm}/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Eintritt der Farbreaktion als Meßwerte genommen. Über die Kalibrierungskurve aus dem Auftrag von ΔOD_{600 nm}/min in Abhängigkeit von der zuvor hergestellten NADPH-Konzentration unter Verwendung von NADH-Lösungen von bekannter Konzentration wurde die Menge des produzierten NADPH aus dem gemessenen Wert berechnet.

Die Menge des Enzyms, bei der NADPH in einer Menge von 1 nmol/min bei 30°C produziert wird, wird als 1 Einheit bezeichnet.

Der Km-Wert (Michaelis-Konstante) des erfindungsgemäßen Enzyms für NADH ist 27 µmol bei 30°C und einem pH von 7,8 (Tris-Puffer).

4) pH-Optimum

Das pH-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms liegt wie in Fig. 1 gezeigt bei pH 8,0 bis 9,0 bei Verwendung von NADH als Substrat.

5) Stabiler pH-Bereich

Das erfindungsgemäße Enzym wurde in Pufferlösungen mit verschiedenem pH gelöst und nach einer Standzeit von 16 h bei 4°C wurde die Restaktivität gemessen, wobei gefunden wurde, daß das Enzym bei einem pH von 7,0 bis 9,0 wie in Fig. 2 gezeigt stabil war.

6) Für die Reaktion geeigneter Temperaturbereich

Der für die Reaktion geeignete Temperaturbereich des erfindungsgemäßen Enzyms liegt bei 30 bis 45°C wie in Fig. 3 gezeigt.

7) Thermische Stabilität

Das erfindungsgemäße Enzym wurde in einer Pufferlösung gelöst und dessen Restaktivität nach 10-minütigem Stehenlassen bei jeder Temperatur gemessen, wobei die thermische Stabilität bestimmt wurde. Demzufolge zeigte das erfindungsgemäße Enzym eine Restaktivität wie in Fig. 4 gezeigt von 83% bei 35°C, 60% bei 40°C und 30% bei 45°C.

8) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

Das erfindungsgemäße Enzym wird stark durch SDS (Natriumlaurylsulfat) p-CMB; (p-Chlormercuribenzoesäure), Pb²⁺, Zn²⁺, Cd²⁺, Cu²⁺, Hg²⁺ usw. inhibiert und wird durch Natriumacetat usw. aktiviert. Zusätzlich wird es durch Saccharose, Mg²⁺, Mn²⁺, DTT (Dithiothreitol), Ammoniumsulfat usw. stabilisiert.

9) Reinigungsverfahren

Das erfindungsgemäße Enzym kann unter Einsatz konventioneller Verfahren zur Reinigung von Enzymen gereinigt werden, wie Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration usw., einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren dieser Verfahren.

10) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms ist ca. 160 000, gemessen nach dem Verfahren von Andrews (Biochem. J. 96, 595 (1965)) durch Gelfiltration unter Verwendung einer Superose 6 HR10/30 Säule (hergestellt von Pharmacia AB (Schweden)).

11) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Enzyms ist pI = 6,40, gemessen nach Elektrophorese unter Verwendung eines einen Ampholyten enthaltenden Agarosegels.

Ein Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Enzym und NADH-Kinasen wie in bekannten Referenzen beschrieben, z. B. NADH-Kinase A (J. Biochem. 105, 588-593, 1989) und NADH-Kinase B (J. Biochem. 247, 1473-1478, 1972) wird in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, unterscheidet sich das erfindungsgemäße Enzym von bekannten NADH-Kinasen in seinen enzymologischen und physikochemischen Eigenschaften und ist ihnen insbesondere bei der thermischen Stabilität überlegen. Daher kann das erfindungsgemäße Enzym zur praktischen Verwendung, z. B. zur hochempfindlichen Analyse unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms in Kombination mit anderen verschiedenen Enzymen eingesetzt werden und ist daher sehr vorteilhaft.

Die anliegenden Zeichnungen bedeuten:

Fig. 1 ist eine graphische Darstellung des pH-Optimums des erfindungsgemäßen Enzyms (⚫-⚫: Phosphatpuffer, o-o: Tris-HCl-Puffer, ▲┌▲: Glycin-Natriumhydroxidpuffer);

Fig. 2 ist eine graphische Darstellung des pH-Wert-Bereichs für die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms (⚫-⚫: Phosphatpuffer, o-o: Tris-HCl-Puffer, ▲┌▲: Glycin-Natriumhydroxidpuffer);

Fig. 3 ist eine graphische Darstellung des für die Reaktion geeigneten Temperaturbereichs des erfindungsgemäßen Enzyms;

Fig. 4 ist eine graphische Darstellung der thermischen Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms;

Fig. 5 ist eine experimentell erhaltene Kalibrierungskurve durch Auftragen von ΔOD_{600 nm}/min gegen die NADH-Konzentration.

Ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Enzyms wird wie im folgenden beschrieben.

In der vorliegenden Erfindung kann als Hefe jeder Stamm verwendet werden, sofern er zur Gattung Pichia gehört, und NADH-Kinase-produzierende Eigenschaften besitzt. Ein spezifisches Beispiel für eine solche Hefe ist der Stamm Pichia membranaefaciens YS27. Varietäten und Varianten dieses Stammes können ebenfalls verwendet werden.

Der Stamm Pichia membranaefaciens YS27 ist ein Stamm, der kürzlich aus Erdboden in Utsunomiya City, Präfektur Tochigi, Japan, von den Erfindern isoliert wurde, und seine mykologischen Eigenschaften sind wie folgt.

Bei Kultur des Stammes in YM-Agarmedium 25°C über 5 Tage zeigen die Kolonien eine schwachglänzende gelbliche Färbung. Bei Beobachtung unter einem Mikroskop sind ovoidale vegetative Zellen zu beobachten, und der Stamm vermehrt sich durch multipolares Knospen. Bei Koloniebildung durch Kultivierung des Stammes in modifizierten Gorodkowa Agaramedium bei 25°C über 5 Tage beobachtet man im allgemeinen unter dem Mikroskop sphäroidale oder ellipsoidale Asci, die vier Ascosporen enthalten. Die Ascosporen sind zirkular und neigen dazu, sich von den Asci abzulösen. Man beobachtet keine echten Hyphen, aber Pseudohyphen wachsen gut. Der Stamm bildet aufsteigende Pellices auf der Oberfläche des Kulturmediums und ist aerob. Der Stamm produziert keinen Farbstoff vom Karotenoidtyp.

Der Stamm kann keine Nitrate verwenden, keine Glukose fermentieren und zeigt keine ausgeprägte Bildung von Säure. Darüber hinaus kann dieser Stamm keine Maltose, Galactose, Trehalose, Mannitol, Salicin und Natriumglukonat verwenden.

Der Stamm wurde als Pichia membranaefaciens aufgrund der obigen mykologischen Eigenschaften unter Bezugnahme auf "The Yeasts, A Taxonomic Study the third edition" bestimmt.

Der Stamm wurde Pichia membranaefaciens YS27 genannt und als Bikoken Joki No 3.208 (FERM BP-3208) nach dem Budapester Vertrag im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology (Bikoken), Ministry of International Trade and Industry hinterlegt.

Als Kulturmedium zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können entweder synthetische Medien oder natürliche Medien, die Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Substanzen und andere Nährstoffe enthalten, eingesetzt werden. Als Kohlenstoffquellen können geeigneterweise z. B. Glukose, Zitronensäure und Glycerin verwendet werden. Als Stickstoffquellen können geeigneterweise z. B. Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, Fleischextrakt und Ammoniumsulfat eingesetzt werden. Als anorganische Substanzen können, falls notwendig, Salze von Natrium, Mangan, Magnesium, Kalzium usw. Phosphate und Ähnliches eingesetzt werden. Für die Kultur wird eine Schüttelkultur oder Kultivierung unter Rühren und Belüftung normalerweise bei 20 bis 40°C, vorzugsweise bei ca 30°C über 4 bis 48 h durchgeführt. Der pH bei Beginn der Kultivierung ist normalerweise 5,0 bis 7,5, vorzugsweise ca. 6,0.

Das erfindungsgemäße Enzym kann sich in den Zellen in einer größeren Menge nach Zusatz einer Substanz aus dem Zitronensäurezyklus oder einer hierzu engverwandten Substanz, z. B. Succinsäure, Milchsäure oder Zitronensäure akkumulieren. Diese Substanzen können dem Medium entweder in der ersten Stufe oder wahlweise im Verlauf der Kultivierung zugesetzt werden.

Die Kultivierung kann zu einer Zeit beendet werden, bei der der Titer des erfindungsgemäßen Enzyms das Maximum im Verlauf der Kultivierung erreicht.

Da das erfindungsgemäße Enzym normalerweise intrazellulär vorliegt, werden die Zellen aus der Kulturmischung durch Filtration, Zentrifikation oder Ähnlichem gewonnen und aufgeschlossen z. B. durch mechanische Aufschlußverfahren wie Glasperlenbehandlung oder Behandlung mit der French-Presse, oder durch enzymatischen Aufschluß unter Verwendung eines für Hefe lytischen Enzyms oder Ähnlichem. In diesem Fall kann, falls notwendig, das Enzym in die Lösung durch Solubilisieren desselben durch Zusatz eines Solubilisierungsmittels wie z. B. Triton X-100 freigesetzt werden. Die so gewonnene, das Enzym enthaltende Lösung wird von Nukleinsäuren und Zellwänden nach üblichen Methoden befreit, und die unlöslichen Materialien werden aus dem Rückstand durch Filtration, Zentrifugation oder Ähnlichem abgetrennt, wodurch das erfindungsgemäße Enzym erhalten werden kann.

Das erfindungsgemäße Enzym kann nach üblichen Methoden zur Reinigung von Enzymen wie z. B. Ionenaustauschchromatographie, Ammoniumsulfatfraktionierung, hydrophobe Chromatographie oder Gelfiltration einzeln oder in Kombination von einem oder mehreren dieser Schritte gereinigt werden.

Experimentelles Beispiel Bestimmung von NADH unter Verwendung der erfindungsgemäßen NADH-Kinase

Zur Bestimmung einer kleinen Menge von in einem System vorliegendem NADH, welches eine große Menge von NAD⁺ enthielt, wurden 0,4 ml einer Probenlösung, die 2 mM NAD⁺ enthielt und jeweils eine Konzentration (von 0 bis 10 µM) NADH zu 0,8 ml einer Reagenslösung mit einer Zusammensetzung der unten gezeigten Reagenslösung I zugegeben und die Reaktion bei 35°C über 20 min durchgeführt. Nach Abbruch der Reaktion wurden 0,8 ml der Reagenslösung mit der Zusammensetzung der unten gezeigten Reagenslösung II mit der Reaktionslösung gemischt und die erhaltene Mischung wurde sofort in eine temperaturkonstante Küvette des STASAR III-Spektrophotometers von Gilford eingeführt und einer Reaktion bei 30°C unterworfen. Gleichzeitig mit dieser Reaktion wurde die Änderung der Absorption bei 600 nm in Abhängigkeit von der verstrichenen Zeit gemessen, wobei der Unterschied (ΔOD_{600 nm}/min) zwischen den Absorptionswerten bei 1 min und 2 min nach Beginn der Farbreaktion als Meßwerte erhalten wurden. Demzufolge konnte, wie in Fig. 5 gezeigt, eine gute Linearität zwischen der NADH-Konzentration und ΔOD_{600 nm}/min mit hoher Empfindlichkeit erreicht werden.

Zusammensetzung der Reagenslösung I:
100 mM HEPPS-Puffer (pH 8,5)
7,5 mM ATP
15 mM Magnesiumchlorid
0,3 M Natriumacetat
10 Einheiten/ml NADH-Kinase

Zusammensetzung der Reagenslösung II:
10 mM G-6-P
50 mM HEPPS-Puffer (pH 8,0)
10 mM Magnesiumchlorid
0,1% Rinderserumalbumin
2,5 IU/ml G-6-P-Dehydrogenase (NADP⁺-abhängig)
5 IU/ml Diaphorase
300 µM 2,6-Dichlorphenolindophenol

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue NADH-Kinase mit einer hohen Stabilität zur Verfügung, die spezifisch für NADH ist. Sie stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung der NADH-Kinase zur Kultur einer zur Gattung Pichia gehörenden Hefe zur Verfügung. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms kann eine geringe Menge von NADH allein mit hoher Empfindlichkeit auch in einer NAD⁺ und NADH enthaltenden Mischung bestimmt werden. Daher ist die NADH-Kinase industriell im Bereich der klinischen Medizin usw. von großem Nutzen.

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden im einzelnen unter Bezug auf das Beispiel dargestellt.

Beispiel: Herstellung von NADH-Kinase

Pichia membranaefaciens YS27 (FERM BP-3208) wurde in 50 ml eines Kulturmediums A (pH 5,5) geimpft, bestehend aus 2% Glukose, 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,9% Monokaliumhydrogenphosphat, 0,6% Ammoniumsulfat, 0,05% Kalziumchlorid und 0,05% Magnesiumsulfat in einen 500 ml-Sakaguchi-Kolben, und wurde einer Schüttelkultur bei 30°C über 24 h unterzogen. Die so erhaltene Stammkultur wurde in 20 l eines Kulturmediums A geimpft und bei 30°C über 18 h in einem 30 l-Fermenter unter Luftzutritt mit einer Rate von 20 l/min und einer Schüttelgeschwindigkeit von 300 Upm kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation geerntet, wobei 1406 g Zellen gewonnen wurden. Alle Zellen wurden in 20 l eines Kulturmediums B (pH 5,5), bestehend aus 0,5% Glukose, 1% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,9% Monokaliumhydrogenphosphat, 0,6% Ammoniumsulfat, 0,05% Kalziumchlorid, 0,05% Magnesiumsulfat und 2% Natriumsuccinat überführt und bei 30°C über 6 h in einen 30 l-Fermenter bei einer Belüftung von 20 l/min und einer Schüttelgeschwindigkeit von 300 Upm kultiviert. Die erhaltene Kultur wurde durch Zentrifugation unter Erhalt von 1428 g Zellen geerntet. Alle Zellen wurden in 50 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) der 0,1 M Sacharose und 0,5% Triton X-100 in einem Gesamtvolumen von 5 l dispergiert, und die erhaltene Dispersion wurde unter Verwendung von Glasperlen mit einer DYNO-Mühle (WAB (Switzerland)) aufgeschlossen.

Anschließend wurden 5280 ml des aufgeschlossenen flüssigen Produkts vom Präzipitat durch Zentrifugation abgetrennt, worauf der Puffer im Rückstand durch 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,05 M Natriumchlorid enthielt, mit einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschluß-Molekulargewicht 6000) ausgetauscht.

Anschließend ließ man 5260 ml der so erhaltenen Enzymlösung zur Adsorption durch eine CM-Sephadex C-50-Säule (Pharmacia AB) treten, die zuvor mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,0) equilibriert worden war, der 0,05 M Natriumchlorid enthielt, und die Säule wurde mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 6,0), der 0,1 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen. Anschließend wurde mittels eines Natriumchloridkonzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,4 M eluiert, wobei eine aktive Fraktion aufgefangen wurde.

Der Puffer in 455 ml des Eluats wurde durch 10 mM HEPPS-Puffer (pH 7,5), der 10% Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl₂ enthielt, mit einer Ultrafiltrationsmembran (Ausschluß-Molekulargewicht: 6000) ausgetauscht. Die so erhaltene Lösung wurde zur Adsorption über eine Phenyl-Toyopearl 650-Säule (Tosoh Ltd.), welche zuvor mit demselben Puffer wie oben equilibriert worden war, gegeben, und die Säule wurde mit 10 mM HEPPS-Puffer (pH 7,5), der 10% Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl₂ enthielt, gewaschen. Anschließend wurde mittels eines Ammoniumsulfatkonzentrationsgradienten von 10 bis 0% eluiert, wobei eine aktive Fraktion aufgefangen wurde.

Anschließend wurden 372 ml des Eluats auf ein Volumen von 25 ml mit einer Ultrafiltrationsapparatur (Ausschluß-Molekulargewicht: 10 000), hergestellt von Amicon, konzentriert, und auf eine Sephacryl S-300 HR-Säule (hergestellt von Pharmacia AB), die zuvor mit 10 mM HEPPS-Puffer (pH 7,5), equilibriert worden war, der 0,2 M Ammoniumsulfat und 5 mM MgCl₂ enthielt, gegeben und eine Gelfiltration durchgeführt. Die so erhaltene aktive Fraktion wurde konzentriert und unter Erhalt von 117,3 mg (Ausbeute: 34%) einer Präparation des erfindungsgemäßen Enzyms gefriergetrocknet. Die spezifische Aktivität dieser Präparation war 102 Einheiten/mg.

Claims

1. NADH-Kinase mit den folgenden physikochemischen Eigenschaften:

a) Wirkung und Substratspezifität
Die NADH-Kinase katalysiert eine Reaktion, durch die aus den Substraten NADH und XTP (worin X A (Adenosin), U (Uridin), G (Guanosin), C (Cytidin), I (Inosin), dT (Deoxythymidin), dA (Deoxyadenosin), dU (Deoxyuridin), dG (Deoxyguanosin), dC (deoxycytidin), dI (Deoxyinosin) ist), NADPH und XDP (worin X dieselbe Bedeutung wie oben hat) durch Phosphorylierung von NADH in Gegenwart von mindestens einer Ionensorte, ausgewählt aus Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺ und Co²⁺ hergestellt wird. Die NADH-Kinase ist hochspezifisch für NADH und reagiert nicht mit NAD⁺.
b) pH-Optimum und pH-Stabilitätsbereich
Das pH-Optimum ist 8,0 bis 9,0 bei Verwendung von NADH als Substrat. Der pH-Stabilitätsbereich ist 7,0 bis 9,0.
c) Für die Reaktion geeigneter Temperaturbereich:
30°C bis 45°C.
d) Thermische Stabilität
Die NADH-Kinase zeigt die Restaktivität in Prozent von 83% nach Hitzebehandlung bei 35°C von 10 min, 60% nach Hitzebehandlung bei 40°C von 10 min und 30% nach Hitzebehandlung bei 45°C von 10 min.
e) Molekulargewicht:
ca. 160 000.

2. Verfahren zur Herstellung von NADH-Kinase, umfassend die Kultur einer zur Gattung Pichia gehörenden Hefe mit NADH-Kinase-produzierenden Eigenschaften in einem Kulturmedium und Gewinnung der NADH-Kinase aus der Kultur.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin der zur Gattung Pichia gehörenden Mikroorganismus Pichia membranaefaciens YS27 (FERM BP-3208) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, worin eine Schüttelkultur oder belüftete Kultur bei einer Temperatur von 20 bis 40°C für 4 bis 48 h durchgeführt wird.