JPH0423981A

JPH0423981A - 化学修飾エステラーゼ、その製造法及びこれを用いたエステルの加水分解法

Info

Publication number: JPH0423981A
Application number: JP2128632A
Authority: JP
Inventors: Mototake Murakami; 元威村上; Katsuhiro Kawasaki; 功博川崎; Masami Kawanari; 川成　真美
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1990-05-18
Filing date: 1990-05-18
Publication date: 1992-01-28

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】主粟上夏肌且分団本発明は、化学修飾されたエステラーゼ、その製造法お
よびそれを用いたエステルの加水分解法に関する。

尚、本発明により得られる化学修飾エステラーゼ中、特
に化学修飾リパーゼは有機溶媒耐性や親和性が付与され
バイオリアクター素材など多方面に利用することができ
る。

災来夏肢血エステラーゼはエステルの加水分解を触媒してその構成
分である酸とアルコールとに加水分解する酵素の総称で
ある。エステラーゼ中には、リパーゼや、プロテアーゼ
の一部を含み、産業上も非常に重要な酵素である。また
加水分解反応の触媒だけではなく、合成や、付加反応も
触媒しており、酵素反応も非常に興味深いものである。

基質のエステルとしては、通常のカルボン酸エステル、
トリグリセリドの脂肪酸エステル（いわゆる脂肪）など
が代表的なものである。特に脂肪の加水分解酵素はエス
テラーゼの中でもリパーゼとして総称され、脂肪の加水
分解、脂肪酸の単離、脂質の改質など特に注目されてい
る。

近年、酵素反応を利用した有用物質の生産についての研
究が盛んである。一般の化学反応に比べて、酵素反応は
、温和な条件（１！度、　ｐＨ）下で反応がすすむ点、
また立体特異性に冨む点、副反応の少ない点などで優れ
ているが、反面、コストが高い点、その特異性のために
利用が限定されてしまう点など問題もある。この様な酵
素反応のうち比較的汎用性が広く、また実際に用いられ
ることの多い反応にエステラーゼによるエステルの加水
分解反応がある。

例えば、エステルを立体選択的に加水分解し、光学活性
のある化合物を得るなどの研究がそれである。しかし、
この様な場合、しばしば問題になるのは酵素反応を受け
るべき目的の化合物（基質）が水に難溶であるというこ
とである。よって基質を溶かすために、やむおえず反応
系に有機溶媒を添加することになり、これは酵素の失活
ないし活性の低下を招くことになる。この問題を解決す
る手段として、酵素を化学修飾し、有機溶媒に親和性、
あるいは耐性を付与し、酵素活性を低下ないし失活させ
ることなく酵素反応を有機溶媒中でも行なわせようとす
る技術が試みられている。

このような酵素の化学修飾法として一般に用いられる方
法としては、■アシルハライド活性エステルを用いて酵
素蛋白をアシル化する方法（特開昭６２−９６０８４号
公報）■ゲルタールアルデヒドなどを用いて修飾試薬と
酵素を架橋する方法■塩化シアヌルを介してポリエチレ
ングリコール類を導入する方法（安島他、油化学、　３
７．１０９７〜１１０３゜１９８８年）などいくつかの
方法が捉案されている。

この内、■の方法は試薬の調製が容易であるなどの利点
も多いが、しばしばアシルハライドやＮ−ヒドロキシス
クシンイミドエステルに代表される活性エステル類が水
に難溶であり、酵素の修飾には不適当である。また、■
の方法は、酵素間の架橋など不用な反応が起るので好ま
しくはない。

■の方法は、近年、しばしば用いられるようになった化
学修飾法であるが、修飾剤の調製に手間がかかり、また
ポリエチレングリコールの重合度を変える以外に修飾剤
を自由に選択することができないなどの間ｎ点もある。

一方、本発明者らは、酵素の化学修飾法について、一般
式（但し、Ｒはベンジルオキシ基、第三ブトキシ基、９−
フルオレニルメトキシ基、ｐ−メトキシベンジルオキシ
基、炭素数ＣＩ−Ｃｚ　ａであるアルキル基のいずれか
を示す、）で表される活性エステル、パラヒドロキシフェニルジメ
チルスルホニオフヱニル（ＩＩＳＰ）エステルを使用す
ることにより、効率よく、エンドペプチダーゼを化学修
飾できることを見出してすでに特許出願している（特願
平１−５５０５３号）。

上記化合物は特開昭６３−８３６５号公報にアシル化試
薬として開示されている公知の化合物である。

上記化合物により、酵素蛋白質のアミノ基を化学修飾し
たエンドペプチダーゼは、水−有機溶媒系においても安
定であることが本発明者らによって確認されている。

又、上述した特開昭６２−９６０８４号公報には、酵素
蛋白質表面のアミノ基をアルキル基により化学修飾した
りボキシゲナーゼが開示されている。しかし本発明で開
示するようなアシル化剤によりアミ基、９−フルオレニ
ルメトキシ基、ｐ−メトキシベンジルオキシ基の場合に
は、温和な条件下で導入基を切断することが可能であり
、容易にもとの天然酵素へ再生できる。特に貴重なエス
テラーゼの場合は、酵素の利用範囲が広まることで用途
の拡大が期待できる。

か（して得られた酵素は、従来のエステラーゼと異なり
有機溶媒耐性、有機溶媒親和性を有しているため、ヘキ
サン、ベンゼン、エーテル、アセトン、シクロヘキサン
など有機溶媒中で酵素反応を行なうことができる。−船
釣には、本修飾酵素のいずれでも、リン酸緩衝液など中
性の緩衝液に０．１＠ｇ／ｄ〜１０■／ｄ程度の濃度に
溶解し、ついで目的とするエステルを１０〜２０％程度
の濃度になるように熔解し７、この溶液を上述の酵素液
量の１〜１０倍量採取し、酵素液と混合し、酵素反応を
行わせる。又、本エステラーゼを、樹脂に固定したり、
ゲルに封入したりした固定化酵素として酵素反応を行な
わせることもできる。

修飾エステラーゼは、通常は、凍結乾燥、噴霧乾燥した
酵素として保存できる。又必要に応じて修飾反応終了後
の溶液のまま、あるいは、凍結して保存もできる。

以下に実施例を示しさらに本発明の詳細な説明する。

実施例１本実施例においては、修飾エステラーゼの製法例を示す
。

（１）　　ラウロイルオキシフエニルジメチルスルホニ
ウム・メチルサルフェイト（Ｌａ−ＤＳＰ）を用いたリ
パーゼの化学修飾リパーゼＰＮ　（生化学工業）１（＋＋＋ｇを０．ＩＭ
　ＮａｔＢａＯｔ−１ＩＣｆｆｉ緩衝液（ｐＨ７，８）
　５ｍに溶解する。マグネティックスターラーにて氷冷
下ゆっくり撹拌しながら、目的量のＬａ−ＤＳＰを６０
分間に３回に分けて加えた。その後、４°Ｃで１６時間
ゆっくり撹拌しながら反応させた０反応終了後、反応液
を４°Ｃ１００ＯＯＧｌＯ分間遠心分離し、沈澱を除き
、その上清を、分画分子［１２０００の透析膜を用い、
４℃２００倍置の脱装オン水に対して７２時間透析を行
った。ｙｉ折に用いた脱イオン水は、１２時間ごとに新
しいものと交換した。透析後、目的物を含む溶液を凍結
乾燥し、目的の修飾酵素粉末を得た。

得られた凍結乾燥粉末について、ＴＮＢＳ法（ノボエン
ザイム　インフォメーション：１１月号ＡＦ７５／　１
−ＧＢ（１９７０））にて、修飾を受け　たアミノ基量
を定量し、これから修飾率を決定　した。加えた修飾削
の量、修飾酵素の収量、修飾　率を第１表に示す。

２．０２．５５．０１０．０１５．０１２．９３１２．８１１２．９０１２．８９１２．８７５０．５５６．４５７．８５６．９５７．５本ｌ原料リパーゼ１０ｍｇからの収量（２）パルミトイルオキシフエニルジメチルスルホニウ
ム・メメチルサルフエイト（Ｐａ−ＤＳＰ）を用いたリ
パーゼの化学修飾ブタ膵臓リパーゼ（エラスチンプロダクト社！り１０ｍ
ｇについて、実施例１（１）と同様に修飾を行った。

結果を第２表に示す。

１０．０　　　　　　　　１２．１１　　　　　　５５
．０＊１　原料リパーゼ１０ｍｇからの収量（３）４−
ペンジルオキシカルボニルオキシフェニルジメチルスル
ホニウムメチルサルフェイト（Ｚ−ＤＳＰ）を用いるリ
パーゼの化学修飾リパーゼＰＮ　（生化学工業社）ｌＯ■について実施例
１（１）と同様に修飾を行った。結果を第３表に示す。

関係）０．５　　　　　　　　１１．１０　　　　　３６．６
１０．０　　　　　　　　１１．２９　　　　　５８．
８＊ｌ　修飾に用いた酵素は１０１１１０１ｌ第三ブチルオキシカルボニルオキシフエニルジメ
チルスルホニウムメチルサルフエイト　（Ｂｏｃ−ＤＳ
Ｐ）を用いるリパーゼの化学修飾ブタ膵臓リパーゼ（エラスチンプロダクト社）１０Ｉ１
ｇについて実施例１（１）と同様に修飾を行った。

結果を第４表に示す。

寧１修飾に用いた酵素は１０ｍｇ（５）９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシフェ
ニルジメチルスルホニウムメチルサルフエイ）　（Ｆｍ
ｏｃ−ＤＳＰ）を用いるリパーゼの化学修飾リパーゼＰ
Ｎ　（生化学工業社）１０ｇについて実施例（１）と同
様に修飾を行った。結果を第５表に示す。

修飾率の関係）１０．０　　　　　　　　１２．６３　　　　　５２．
９＊ｌ　　修飾に用いた酵素は１０■ （６）修飾リパーゼの有機溶媒中での分散性前記（１）
〜（５）で得られた各化学修飾リパーゼについて、それ
らの有機溶媒に対する分散性を検討した。その方法は１
ｍｇの修飾酵素を溶媒１ｍｌによく懸濁した後、沈澱し
なかった酵素量をもって分散性のめやすとした。結果を
第６表に示す。

第６表（修飾酵素の有機溶媒に対する分散性）表中修飾剤の項
のＬａは、ラウロイルオキシフエニルジメチルスルホニウム・メチルサルフエイトを、Ｐａは、パルミトイルオキシフエニルジメチルスルホニウム・メチルサルフェイトを、２は、４ベンジ
ルオキシカルボニルオキシフエニルジメチルスルホニウ
ム・メチルサルフェイトを、Ｂｏｃは、第３ブチルオキ
シカルボニルオキシフエニルジメチルスルホニウム・メ
チルサルフェイトをそれぞれ化学修飾剤として用いたこ
とを示す。

実施例２本実施例においては実施例１で得た修飾エステラーゼに
よるエステル加水分解例を示す。

（１）化学修飾された酵素のエステラーゼ活性試験実施
例１により修飾されたリパーゼ１■をリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）　３　Ｉｄに溶解させ、その溶液に基質とし
てトリステアリンＩｇを２０Ｗ／Ｖ％有機溶剤溶液とし
て加え３７°Ｃで２０分インキュベートした。　滴定に
より遊離脂肪酸量を測定した。

エステル加水分解活性の結果を第７表に示す。

活性は未修飾酵素を１００として相対活性で示した。

第７表表中の略号は次のことを示す。

本発明の修飾リパーゼは、未修飾リパーゼに比べ有機溶
剤中で高い活性を示し、その活性を持続することが確認
され、耐有機溶剤性に優れることが判明した。

（２）修飾リパーゼによるエステル加水分解実施例１に
より修飾されたリパーゼ０．１■をリン酸緩衝液（ｐＨ
７、Ｏ）　０．５　ｄに溶解させ、その溶液に基質とし
て、ステアリン酸ステアリル５０■をシクロヘキサン０
．５ｄに溶解させたものを加えた。　　これを３７°Ｃ
で２０分インキュベートし、遊離するステアリン酸をＩ
ＩＰＬｃにより分離、定量し、分解率を求めた。

第８表酵　素　　　　　　分解率（％）ＰＭＬ−５０７９，７表中の略号は次のことを示す。

本発明の修飾リパーゼは、未修飾リパーゼに比べ２０％
以上高い分解率を示した。

光１１ＢＩ展本発明の実施により、Ｒ−Ｃ−基により、アミノ基を修
飾されたエステラーゼを得ることが可能となった。また
このエステラーゼを使用してエステルの酵素加水分解が
可能となる０本修飾エステラーゼは、有機溶媒耐性、有
機溶媒親和性にすぐれでおり、バイオリアクターなどに
も使用することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵素中のアミノ基総量の２０〜６０％に▲数式、
化学式、表等があります▼で表される基を導入したこと
を特徴とする化学修飾されたエステラーゼ（ただし、Ｒはベンジルオキシ基、第三ブトキシ基、９
−フルオレニルメトキシ基、ｐ−メトキシベンジルオキ
シ基、炭素数Ｃ＿１〜Ｃ＿２＿４、であるアルキル基の
いずれかを示す。）
（２）エステラーゼを、そのアミノ基総量の２０〜６０
％に式、▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物を化学修飾剤として使用して▲数式、
化学式、表等があります▼基を導入することを特徴とす
る化学修飾されたエステラーゼの製造法（ただし、式中、Ｒはベンジルオキシ基、第三ブトキシ
基、９−フルオレニルメトキシ基、ｐ−メトキシベンジ
ルオキシ基、炭素数Ｃ＿１〜Ｃ＿２＿４であるアルキル
基のいずれかを示す。）
（３）請求項（１）記載の化学修飾されたエステラーゼ
を使用してエステルを加水分解することを特徴とするエ
ステルの加水分解方法。