JPH0376587A

JPH0376587A - デスメトキシシザンドリンの製造法及びこれに用いる微生物

Info

Publication number: JPH0376587A
Application number: JP1211490A
Authority: JP
Inventors: Hirotoshi Kanetani; 裕敏金谷; Chiaki Kamata; 鎌田　千秋; Hiroshi Mihashi; 博三橋
Original assignee: Tsumura and Co
Current assignee: Tsumura and Co
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1989-08-18
Publication date: 1991-04-02

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、肝疾患の治療薬として有用なゴミジンＡを製
造するための合成中間体であるデスメトキシシザンドリ
ンの有利な製造法及びこれに用いる微生物に関する。

［従来の技術］次の式（Ｉ）で表されるゴミジンｈは肝機能改善作用を有する化金物
であり、現在肝炎治療剤ヒして開発が進められている。

この化合物は、主ヒして五味子からの抽出分離により得
られているが、その収率が悪く、工業的生産を行なう上
で問題ヒなっていた。

〔発明が解決しようとする課題］ゴミジンＡを医薬こして開発するに当っては、これを収
率良く、経済的に製造することが必要であり、工業的に
有利なゴミジンＡの製造法の開発が求められていた。

Ｃ課題を解決するための手段〕本発明者らは、工業的なゴミジンＡの製造法について、
種々検討を行なっていたところ、五味子の抽出の［二大
量に得られ、現在のεころ全く利用価値のない、式（Ｉ
Ｉ　）で表されるシザンドリンは、特定の微生物の作用
により高変換率でゴミジンＡ製造の中間体である式（ｍ
）Ｈで表されるモノデスメトキシシザンドリンに転化され、
これを利用すればゴミジンＡが有利は製造されるこヒを
見出した。

すなわち本発明は、シザンドリン（ＩＩ　）　Ｇこモル
ティニラ属に属する微生物を作用させるここを特徴こす
るモノデスメト卑シシザンドリン（ｍ）の製造方法及び
これに用いる微生物を提供するものである。

本発明方法において用いられるモルティエレラ属（Ｍｏ
ｒｔｉｅｒｅｌｌａ　）微生物の例としては、本発明者
らが茨城県稲敷郡の土壌中から分離した、モルティエレ
ラ　ｓｐ、ＴＭ−Ｉ０５０１、同ｓｐ、ＴＭ−Ｉ０７０
２、同ｓｐ、　ＴＭ−Ｉ０７０３、同Ｓｐ、　ＴＭ−１
１０４、同　ｓｐ、ＴＭ−１１１０５等が挙げられるが
、このうちの代表的なものであるモルティエレラ　ｓｐ
、ＴＭ−１１１０４についての菌学的性質を示せばっぎ
のとおりである。

（１）形態菌　糸：　通常の培地で容易に純粋培養が可能である。

なお、若い菌糸は隔膜を欠く。

胞子のう：　胞子のう柄は主として気生菌糸量に形成さ
れる。胞子のうは亜球形で直径１７〜２８Ｘ１２〜２０μである。胞子のう膜は平滑で、溶けて胞子を放出する。

胞　子：　無色で表面は平滑である。形状は腎臓形〜ま
が玉型のものが多く、時には二等辺三角形のような不整形の胞子が認められる。

大きさは５〜１２×１〜５μである。

（２）各培地における生育状態バレイショ寒天培地（ＰＤＡ）：栄養菌糸は良く発達、気生菌糸量を形成し、コロニーは明確な舌状紋を示す。

オートミール寒天培地（ＯＭＡ）：ＰＤＡより気生菌糸量は少ないが、コロニーの舌状紋は認められる。

ツアペック寒天培地：気生菌糸量はＰＤＡおよびＯＭＡに比べ、極端に少ない。またコロニーの舌状紋もわずかに認められる程度である。

（３）生理学的性質生育温度　２３〜３０℃ （最適温度　２８〜２９℃）生育ｐＨ４，０〜９．０（最適ｐＨ５，０〜６．０）叙上の各性質から、本発明で用いる微生物ＴＭ−１１１
０４は、モルティエレラ属する菌株と判断された。そこ
で、この菌株を１９８９年８月１８日付で、通産省工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託した（微工研菌寄第
１０９６７号）。

また、本発明の出発原料であるシザンドリンは、公知化
合物であり、例えば文献［Ｙ。

Ｉｋｅｙａ、　Ｈ，Ｔａｇｕｃｈｉ、１．Ｙｏｓｈｉｄ
ａおよびＨ９Ｋｏｂａｙａｓｈｉら；Ｃｈｅｗ、　Ｐｈ
ａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、、　２７（６）。

１３８３（１９７９）　］に記載の方法により得ること
ができる。

すなわち、北五味子を石油エーテル、ｎ−ヘキサン、ベ
ンゼン等の低級炭化水素類で温時抽出し、この抽出液の
溶媒を除去した残漬を水に溶かし、水蒸気蒸留して精油
を除去した非精油部分をシリカゲルを用いたクロマトグ
ラフィに付し、ｎ−ヘキサン、ベンゼン、アセトンまた
はこれらの混合溶媒を用いて展開することにより得るこ
とができる。

本発明方法を実施するには、まず、液体培地中でＴＭ−
１１１０４等のモルティエレラ属微生物をシード培養し
、得られたシードを炭素源、窒素源等を含有する培地中
でシザンドリンと共に培養を行なえば良い。シザンドリ
ンの添加は、対数増殖期の前期以前、特に対数増殖期前
期に添加することが望ましい。

培養は、２３〜３０℃、特に２８〜２９℃の温度で、５
〜１５日程度、好ましくは８〜１２日間行なわれる。培
地の至適ｐＨは５〜６であり、好気性条件下で、撹拌し
ながら培養することが好ましい。

シザンドリンの培地への添加濃度があまり高くなると微
生物の増殖が阻害されるので、一般にはシザンドリンの
濃度として１ｇ／ｌ程度以下、特に０．５ｇ７１程度以
下とすることが好ましい。

また、培養に用いる培地としては、炭素源としての可溶
性デンプン、フルクトース、マルトース、ガラクトース
、グルコース等や窒素源としてのペプトン、酵母エキス
、カゼイン、カシトン等およびビタミン類、ミネラル類
等を含有するものが好ましく、市販のポテト−デキスト
ロース培地（ＤＩＦＣＯＩり、ツアペック寒天培地（Ｄ
ＩＦＣＯＩり等に窒素源を添加した培地を用いることが
出来る。

上記培Ｉ！物中からモノデスメトキシシザンドリンを得
るには、培養後、オートクレーブ処理で滅菌し、濾過し
た徨、濾過液を有機溶媒で抽出し、この抽出液をシリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーおよび／またはＯＤＳカ
ラムクロマトグラフィー等に付してｔ’＊ａすれば良い
。

このようにして得たモノデスメトキシシザンドリンの１
３位アルコキシ基のみを選択的に脱メチル化してジデス
メトキシシザンドリンを得る。

この選択的脱メチル化は、塩基の存在下でルイス酸を作
用きせることにより行なわれる。

より具体的には、モノデスシザンドリンを無水ジクロロ
メタン等の溶媒に十分溶解させた後、塩基を加え１０分
程度撹拌する。次いでルイス酸を加え反応を行なう。反
応はＯ°Ｃ〜室温の温度で実施され、約２４〜１２０時
間を要して終了する。この選択的脱メチル化反応に用い
られる塩基こしては、トリエチルアミン、Ｎ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、１，８−
ビス（Ｎ。

Ｎ−ジメチルアミノ〉ナフタレン、ピリジン、２．６−
シメチルビリジン、２，６−シーｔｅｒｔ−プチルー４
−メチルピリジン、２，２，６゜６−チトラメチルビベ
リジン、１．　、１　、　］、　、　３　。

３．３−ヘキサメチルジシラザン等が例示され、また、
ルイス酸εしては、三塩化ホウ素、三臭化ホウ素、三塩
化アルζニウム、塩化ジエチルアルミニウム、臭化ジメ
チルホウ素等が例示される。

脱メチル化に上り生成したジデスメトキシシザンドリン
は、酢酸エチル等の溶媒で抽出し、例えば酢酸エチル−
ヘキサンの混合溶媒を溶出溶媒とするシリカゲルカラ広
クロマトグラフィーに付し精製するここができる。

［発明の効果Ｊ本発明の方法により得られるジデスメトキシシザンドリ
ンは、公知の有機合成法によって、１２および１３位の
水酸基を容易にメチレンジオキシ化してゴミジンＡヘヒ
導くことができる。このメチレンジオキシ化反応は、ヨ
ウ化メチレン、臭化メチレン、塩化臭化メチレン等を使
用し、５０〜７０　’Ｃ程度の温度で、１．５時間程度
を要して実施される。

メチレンジオキシ化が終了した後、例えば、酢酸エチル
−ヘキサン混液を溶出溶媒こするシリカゲルカラムクロ
マトグラフィー等により精製してゴミジンＡを得ること
ができる。

したがって、本発明方法によれば、従来、はこんどモの
用途の見出されていなかったシザンドリンを出発原料と
して有用なゴミジンＡを製造するここができるので、ゴ
ミジンＡの工業的製適法こして有用なものである。

【実施例］次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説
明するが、本発明はこれら実施例になんら制約きれるも
のではない。

参考例　１シザンドリンの調製：北五味子　１．３８ｋｇを粉砕し、これを石油エーテル
３１で８時間抽出した。抽出操作を４回繰り返し、得ら
れた抽出液を合併し、石油エーテルを減圧下で留去し、
石油エーテルエキス　１８８ｇを得た。　このエキスを
水４５０ｍ］に懸濁きせ、水蒸気蒸留を３時間行ない、
精油を除去した。残留物をエーテル２００ｎｎｌで４回
抽出した後、エーテル抽出液を合併し、エーテルを留去
して石油エーテル可溶の非精油部分　１７９ｇ（以下、
Ａ画分こ称する）を得た。

次に、石油エーテルで抽出した徨の北五味子をメタノー
ル３１を用いて８時間ずつ３回、温時抽出した後、メタ
ノール抽出液を合併、溝線し、メタノール性エキス３８
３ｇを得た。

このエキスを水５８０ｍ１に溶解し、酢酸エチル８５０
ｍ１で３回振盪抽出した。酢酸エチル抽出液を合併、減
圧下濡縮し、７８ｇのエキスを得た。このエキスをメタ
ノールに溶解し、セライト５３５　（ＪｏｈｎｓＭａｎ
ｖｉｌｌｅ社製）３００ｇにまぶし、カラムクロマトグ
ラフ４−に付した。ｎ−へキサン２１で展開し、溶出液
を減圧下濃縮し、２０．８ｇのエキス（以下、３画分と
称する〉を得た。

Ａ画分（１７９ｇ）とＢ画分（２０，８ｇ）とを合併し
、シリカゲル１２００ｇを用いたカラムクロマトグラフ
ィーに付し、ベンゼン−アセトン（７：３）とベンゼン
−アセトン（３：　２）の抽出部を合併、濃縮し、８．
３ｇの残漬を得た。該残漬を１８０ｇのシリカゲルを用
いて再びカラムクロマトグラフィーに付し、ｎ−ヘキサ
ン−アセトン混合溶剤で展開した。ｎ−ヘキサン−アセ
トン（２２：３）の溶出部をｎ−ヘキサン−エーテルで
結晶化し、シザンドリン　３．５ｇ　　（収車０．２５
％）を得た。

実施例　１モルティエレラ　ｓｐ、ＴＭ−Ｉｌｌｏ４のスクリーニング茨城県稲敷郡阿見町で採取した土壌の少量を、クロラム
フェニコールを添加した栄養培地に希釈したのちまいた
。この培地上に生育してきたコロニー約り００株全てを
各々栄養培地を加えたエレンマイヤーフラスコに移し、
更に増殖させた。次いで、このフラスコ中に、エタノー
ルに溶解させたシザンドリンを０．５鳳ｇ　／　ｓ　１
となるように加えた。更に、１週間振盪培養した後、培
地の一定量を取り、有機溶媒で抽出し、ＴＬＣによるス
ポットを標準品のそれと比較し、シザンドリンをモノデ
スメトキシシザンドリンに変換する菌株を選択した。

このようにして得られる菌株のうち、最も高いモノデス
メトキシシザンドリン変換効率を有するものをＴＭ−１
１１０４とした。

実施例２シザンドリンからモノデスメトキシシザンドリン［（６Ｓ、７Ｓ、８Ｓ、５−ｂｉａｒ）　
−５，６，７，８−テトラヒドロ−１，２，１０，１１
，１２−ペンタメトキシ−６，７−シメチルー３．８ −ジペンゾ［ａ、ｃｌシクロオクテンジオール］への変換ニゲルコース　２５ｇ１ペプトン　Ｌｏｇ、リン酸−水素
カリウム０．５ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ
／ｌ、ｐＨ６，５に調整した培地１０ｍ１をエレンマイ
ヤーフラスコに入れ、オートクレーブを用いて１２１℃
、１５分間滅菌した。これに、ＴＭ−Ｉｌｌｏ　４　（
ＦＥＲＮ　Ｐ−１０９６７）を接種して３日間種菌培養
を行なった。

種菌培養した１部の菌体を、上記の培地に接種し、２６
℃、１２Ｏｒｐｍで培養し、２４時間後にシザンドリン
を５ｍｇ添加し、更に９日間培養を行なった。　培養後
、オートクレーブ処理して滅菌し、濾過した濾液をクロ
ロホルムで抽出し、得られた抽出液をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーに付し、ヘキサン−アセトン混液（
７５：　２５）で溶出するフラクションをＯＤＳカラム
クロマトグラフィーに付し、水−メタノール−テトラヒ
ドロプラン−アセトニトリル（１００：３５：８：３５
）で溶出するフラクションよりモノデスメトキシシザン
ドリンを得た（生成率７５％）。

実施例３シザンドリンからモノデスメトキシシザンドリンへの変換ニゲルコース　１５ｇ、ペプトン４ｇ、リン酸−水素カリ
ウム　１ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ／ｌ、
ｐＨ６，５に調整した培地１０ｍ１をエレンマイヤーフ
ラスコに入れ、オートクレーブを用いて１２１°Ｃ１１
５分間滅菌した。これに、ＴＭ−Ｉｌｌｏ４を接種して
３日間種菌培養を行なった。

種菌培養した１部の菌体を、グルコース５４ｇ、ペプト
ン　２４．２ｇ、リン酸−水素カリウム　１．６ｇ、硫
酸マグネシウム７水和物０．４ｇ／ｌ、ｐＨ４，６に調
整した培地に接種し、２６℃、１２０ｒｐｍで培養した
。

培養開始２４時間後に、シザンドリンを５ｍｇ添加し、
更に９日間培養を行なった。

培養後、実施例１と同様にしてモノデスメトキシシザン
ドリンを得た（生成率５３％）。

実施例４シザンドリンを加えて培養する際の培地の条ｆ牛を、グ
ルコース　２５ｇ、ペプトン９．５ｇ、リン酸−水素カ
リウム　２．７ｇ、硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇ
／ｌ、ｐＨ６゜５εする以外は実施例２こ同様にしてモ
ノデスメトキシシザンドリンを得たく生成率　５２％）
。

実施例５シザンドリンを加えて培養する培地の条件を、グルコー
ス、２５Ｅ、ペプトン　１０ｇ、リン酸−水素カリウム
　２．７ｇ、硫酸マグネシウム７水和物Ｏ，５ｇ／ｌ、
ｐＨ５ヒする以外は実施例２七同様にしてモノデスメト
キシシザンドリンを得た（生成率５２％）。

実施ｆ１６モノデスメトキシシザンドリンからジデスメトキシシザンドリン［（６８，７Ｓ、Ｒ−ｂｉａｒ）−５，６，７゜８−テ
トラヒドロ−１，１０，１１，１２−テトラメトキシ−
６，７−シメチルー２．３．７−ジベンゾ［ａ、ｃｌシクロオクテント
リオール〕の合成：アルゴン気流下、モノデスメト斗シシザンドリン　１．
０　ｇ　（２，４ｍ１ｏｌ）を無水ジクロロメタン　１
０ｍ１に溶解し、２，２，６．６−テトラメチルビベリ
ジン　Ｃ０８９ｉ１　（５，２８−１１）を加えＯ″Ｃ
に冷却し、１０分間撹拌した。０°Ｃで三塩化ホウ素４
．８ｉ１　（４，８ｓｌａｌ　）の１．０Ｍジクロロメ
タン溶液を加え、室温に戻して２４時間撹拌した。　反
応液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍ１を加え、酢
酸エチルエステルで抽出した（４０ｍｌＸＳ回）。　酢
酸エチルエステル抽出液は、ＩＮ塩酸で洗い、飽和食塩
水で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ通接
ろ液を濃縮すると、黄色油状物が９５０９得られ、？−
６これをシリカゲル６０ｇを用いるカラムクロマトグラ
フィー（酢酸エチルエステル：ヘキサン＝２：３）に付
し、ジデスメＬキシシザンドリン［（６Ｓ、７　Ｓ、Ｒ
−ｂｉａｒ）　−５゜６．７．８−テトラヒドロ−１，
１０，１１，１２−テトラメトキシ−６，７−シメチル
ー２゜３．７−ジベンゾ［ａ、ｃｌシクロオクテントリ
オ−ルア　　６８５．３ｍｇ（収率７１．０％）を得た
。これを酢酸エチルエステル：ヘキサンで再結晶すると
無色プリズム晶が得られた。

融点８　１９４．４−１９５．６℃ ’Ｈ−ＮＭＲδ　（ＣＤＣ１３：２００ＭＨｚ）　　：
６．６６　　（ＩＨ，、Ｓ）、６　　。　６２（ＩＨ。

Ｓ）、３．９１　（６Ｈ，Ｓ）、３．４７（３Ｈ，Ｓ）
、３．２９　（３Ｈ，Ｓ）。

１．２７　（３Ｈ，Ｓ）、０．８４　（３Ｈ。

ｄ）工Ｒ（ＫＢｒ）ａｍ−’：　　３３８４，１５９０Ｍ５
　：　　ｍ／ｚ　　４０４　［Ｍ冨］参考例２ジデスメトキシシザンドリンからゴミジンＡの合成：アルゴン気流下、ジデスメトキシシザンドリン　１００
ｍｇ（０，２５ｓ＋ｍｏｌ）　、炭酸カリウム　２４７
．５　ｇｍｇ　（２，５ｓｌａｌ）を室温でＮ、Ｎ−ジ
メチルホルムアミド　１ｍｌに溶解し、ジブロモメタン
０．１８ｍｌ　（２，５ｓｌａｌ）を加え、全溶液を６
０　’Ｃで１時間３０分撹拌した。

この反応液を冷却した後、水２０ａ＋１を加え、酢酸エ
チルエステルで抽出した（２０ａｌｘ３回）。この酢酸
エチルエステル抽出液を飽和食塩水で洗い、無水硫酸マ
グネシウムで乾燥した。ろ通接ろ液を濃縮するヒ、黄色
油状物を１４１．４１１ｇ得た。これをシリカゲルｓ、
ｏｇを用いるカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルエ
ステル：ヘキサン＝２　：　５）で分離精製し、ゴミジ
ンＡ　９３．４１１ｇ（９０゜７％）を得た。これをメ
タノールがら再結晶するこ無色針状晶が得られた。

融点：　　８８．３−８９．４℃ 得られたゴミジンＡの物理化学的性状は文献［Ｈ，Ｔａ
ｇｕｅｈｉ　ａｎｄ　Ｙ、Ｉｋｅｙａ、　Ｃｈｅｗ。

Ｐｈａｒｍ、Ｂｕｌｌ、、２３．３２９６　　（１９７
５）］記載のゴミジンＡ（ｇｏ■１ｓｉｎＡ）の物理化
学的性状に一致した。

’Ｈ−ＮＭＲ６（ＣＤＣＩｓ：２００ＭＨｚ）：６．６
２　（ＩＨ，Ｓ）、６．４８　（ＩＨ。

Ｓ）、５．９６　（２Ｈ，Ｓ）、３．９０（６Ｈ，Ｓ）
、３．８４　（３Ｈ，Ｓ）。

３．５２　（３Ｈ，Ｓ）、１．２５　（３Ｈ。

Ｓ）、０．８２　（３Ｈ，ｄ）工Ｒ（ＫＢｒ）ｃｍ−’：３５１２．１６００．１５０２Ｍ５：　　ｍ／ｚ　　４１６　［Ｍ寞］参考例３モノデスメトキシシザンドリンからゴミジンＡの合成：アルゴン気流下、モノデスメトキシシザンドリン４８０
ＪＩ１ｇ（１、１ｍ５ｏｌ）を無水ジクロロメタン　５
ｍｌに溶解し、２，２，６．６−テトラメチルビベリジ
ン　０．４１厘１（２，４２５−ｏｌ　）を加え０℃に
冷却し、１ｏ分間撹拌した。０℃で三塩化ホウ素　２．
２ａ＋ｌ　（２，２■ａｌ　）の１．０Ｍジクロロメタ
ン溶液を加え、室温に戻して２４時間撹拌した。反応液
に飽和炭酸水素ナトリウム溶液３０ｍ１を加え、酢酸エ
チルエステルで抽出した（２０■１×４回〉。この酢酸
エチルエステル抽出液は、ＩＮ塩酸で洗い、飽和食塩水
で洗った後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ通接
、ろ液を濃縮すると、黄色油状物４３７．９Ｍが得られ
た。

アルゴン気流下、得られた黄色油状物４３７．９［（１，１ｍｉ＋ｏｌ）　、炭酸カリウム１
．０８９　ｇ　（１１ｍｍｏｌ）を室温でＮ、Ｎ−ジメ
チルホルムアミド　５ｍｌに溶解し、ジブロモメタン０
．７７ｍｌ　（１１ｍｍｏｌ）を加え、全溶液を６０℃
で１時間３０分撹拌した。冷却した徨、反応液に水８０
ｍ１を加え、酢酸エチルエステルで抽出した（６０ｍｌ
ＸＳ回）。

酢酸エチルエステル抽出液を飽和食塩水で洗い、無水硫
酸マグネシウムで乾燥し、ろ通接ろ液を濃縮すると、黄
色油状物　５４０Ｂｇが得られた。これをシリカゲル３
５ｇを用いるカラムクロマトグラフィー（酢酸エチルエ
ステル：ヘキサン＝２　：　５）に付して分離Ｎ製を行
い、ゴミジンＡ　２３５．ＯＩＩｇ（５２，１％〉を得
た。

以　　　上

Claims

【特許請求の範囲】

（１）次の式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるシザンドリンに、モルテイエレラ属に属する
微生物を作用させることを特徴とする次の式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるモノデスメトキシシザンドリンの製造方法。
（２）次の式（II） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるシザンドリンに、モルティエレラ属に属する
微生物を作用させて式（III） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるモノデスメトキシシザンドリンを得、次いで
これに塩基の存在下、ルイス酸を作用させることを特徴
とする次の式（IV） ▲数式、化学式、表等があります▼ で表されるジデスメトキシシザンドリンの製造方法。
（３）モルティエレラ属に属し、選択的脱メチル化作用
を有する微生物。