JPH0372272B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、最適作用PHをほぼ9.3附近に有し、
且つグリセロール（glycerol）に対し基質特異性
を有する新規グリセロール脱水素酵素Ｂ及びその
製造法に関するものである。

従来、ガラクタル酸を特異的に資化利用する微
生物を用いてグリセロールに対し基質特異性を有
する脱水素酵素を採取する方法及び該脱水素酵素
については全く知られていない。グリセロールデ
ヒドロゲナーゼは、NADの存在下でグリセロー
ルを酸化してジヒドロキシアセトンを生成し、又
還元型NADの存在下でグリセロールを生成せし
めるが、従来のグリセロールデヒドロゲナーゼ
は、上記酸化、還元における最適PH条件（PH域）
は全く異なる（例えば、酸化の場合PH９〜9.3、
還元の場合、PH５〜７程度である）。本発明者等
は、先にガラクタル酸を含む倍地で、バチルス
（Bacillus）属に属するガラクタル酸資化利用性
菌を培養し、その培養物より培養菌体を回収する
ことを特徴とする細菌菌体の製造法を完成したが
（特願昭56−73821号明細書参照）、その産生物質
について鋭意研究した結果、グリセロールに対す
る基質特異性が極めて高く、又、上記グリセロー
ル酸化、ジヒドロキシアセトンの還元の双方にお
ける最適PH条件が近似している新規なグリセロー
ル脱水素酵素を分離採取することに成功し、本発
明を完成するに至つた。

本発明において、「グリセロール脱水素酵素Ｂ」
とは、以下に記載する理化学的性質を有する酵素
で、特徴的な性質として最適作用PHをほぼ9.3附
近に有し、且つグリセロールに対する基質特異性
が極めて高いグリセロール脱水素酵素を指称する
ものとする。

以下に、本発明について詳述する。

ガラクタル酸（ムチン酸）は、ガラクトースの
糖酸であり、木材などに含まれるガラクタン、及
びガラクトース、ラクトース、ラフイノース、ガ
ラクトン酸、植物粘液質などガラクトース又はそ
の誘導体を含む物質を硝酸酸化することにより大
量に得られる物質である。

本発明方法に用いる微生物は、以下に詳述され
るように、ガラクタル酸を資化利用するものであ
り、バチルス属に属する菌種であつて、この菌種
として、前記バチルス・エスピー・Ｇ−１
（Bacillus sp.G−１）（以下、「Ｇ−１菌」と称す
る）が挙げられる。

なお、前記Ｇ−１菌の他にその自然的又は人為
的変異種もガラクタル酸の資化利用性を有する限
り、本発明方法に用い得ることは当然である。

前記Ｇ−１菌は、昭和56年３月19日、工業技術
院微生物工業技術研究所へ、微工研菌寄第5925号
として寄託された。前記Ｇ−１菌は、次の菌学的
性質を有する。

なお下記の菌学的諸性質の試験及び分類方法は
すべて「バージエーズ マニユアル オブ デタ
ミネイテイブ バクテリオロジー」（第８版、
1974年）〔Bergey′s Manual of Determinative
Bacteriology（8th edition，1974）〕に準拠して
行なわれた。

Γバチルス・エスピー・Ｇ−１菌の菌学的性質 (a) 形態（肉汁寒天斜面培地） (1) 細胞の大きさは、0.6〜0.8μ×2.0〜3.0μの
桿菌である。

(2) 細胞の多形性はない。

(3) 運動性があり鞭毛は周毛である。

(4) 胞子の大きさは0.7μ×0.7μで、胞子のうは
細胞の端に形成される。

(5) グラム染色性は変動性である。

(6) 抗酸性は陰性である。

(b) 倍地における生育状態 (1) 肉汁液体倍地 菌環を形成し、沈渣を生じる。菌体は灰白
色を呈する。

(2) 肉汁寒天平板倍地 発育は旺盛で、菌体は灰白色を呈するが、
色素は倍地中に拡散しない。表面は平滑で、
光沢があり、コロニーの周縁は全縁〜波上を
呈する。

(3) 肉汁寒天斜面倍地 (2)と同様の生育状態を示し、拡布状に生育
する。

(4) グルコース肉汁寒天平板倍地 (2)と同様である。

(5) 肉汁ゼラチン穿刺倍地 PH７において、ゼラチンを液化して、表面
で発育し、菌体は灰白色を呈する。PH10にお
いては、ゼラチンを液化しない。

(6) ペプトン水 PH７およびPH10においては表面に菌環を形
成して、沈渣を生じる。菌体は灰白色を呈す
るが、色素は倍地中に拡散しない。

(7) リトマスミルク リトマス色素を僅かに赤変し、凝固する。

(8) バレイシヨ倍地 菌体は灰白色を呈する。

(c) 生理的性質 (1) 硝酸塩の還元 還元する。

(2) 脱窒反応 陰 性 (3) メチルレツド（MR）試験 陰 性 (4) フオーゲス・プロスカウエル（VP）反応 陰 性 (5) インドールの生成 陰 性 (6) 硫化水素の生成 陽 性 (7) でんぷんの加水分解 陽 性 (8) クエン酸の利用性（Koser培地及び
Christensenの培地） いずれも利用しない。

(9) 無機窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩、尿
素等）の利用性 利用する。

(10) 色素の生成 色素は生成しない。

(11) リトマス、メチレンブルー、２，６−ジ
クロルフエノール、インドフエノールなどの
色素の還元 リトマスを僅かに赤色する他、変化なし。

(12) ウレアーゼ 陰 性 (13) オキシダーゼ 陽 性 (14) カタラーゼの生成 陽 性 (15) 生育の範囲 生育し得る条件は、PH7.0〜11.0、温度25
〜45℃で好気的であり、最適生育条件は、PH
9.5付近、温度37℃前後である。

(16) 酸素に対する態度 好気性 (17) Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法による） 酸化的並びに還元的に生育する。

好気的並びに還元的にガスの生成はない。

(18) 牛乳の凝固 凝固する。

(19) アンモニアの生成 陰 性 (20) ゼラチン、ガゼインの変化 液化する。

(21) 塩化ナトリウムの耐性 ５％塩化ナトリウム上で生育するが、10％
以上の塩化ナトリウム上では生育しない。

(d) 炭素源の利用性 (1) Ｌ−アラビノース − (2) Ｄ−キシロース − (3) Ｄ−グルコース ＋ (4) Ｄ−マンノース ＋ (5) Ｄ−フルクトース ＋ (6) Ｄ−ガラクトース ＋ (7) ラクトース − (8) マルトース ＋ (9) サツカロース ＋ (10) トレハロース ＋ (11) Ｄ−ソルビツト − (12) Ｄ−マンニツト ＋ (13) イノシツト − (14) グリセリン ＋ (15) デンプン ＋ (16) ラフイノース − (17) イヌリン − (18) デキストリン ＋ (19) 繊維素 − (20) サリシン ＋ 以上の炭素源より好気的並びに嫌気的にガスの
生成はおこなわない。

（注）：＋利用する。（酸を生成する） −殆んど利用しない（酸を生成しない） 以上の微生物の菌学的諸性質から前記文献の分
類方法に従つて使用微生物を検索するに当り、前
記のＧ−１菌をバチルス（Bacillus）属に属する
公知の菌種と比較した。

前記Ｇ−１菌は、バチルス・ズブチリス
（Bacillus subtilis）、バチルス・プミルス
（Bacillus pumilus）、バチルス・リヘニフオーミ
ス（Bacillus licheniformis）、バチルス・セレウ
ス（Bacillus cereus）、バチルス・アンソラシス
（Bacillus anthracis）、バチルス・スリンジエン
シス（Bacillus thuringiensis）、バチルス・メガ
テリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・
ステアロサーモフライス（Bacillus
stearothermophilus）及びバチルス・フイルマス
（Bacillus firmus）と類似している。

しかしながら、Ｇ−１菌は、アラビノーズ及び
キシロースから酸の生成をせず、且つグルコース
からのアセトインの生成がないのに対し、バチル
ス・ズブチリス及びバチルス・リヘニフオーミス
は共に、アラビノース及びキシロースからの酸の
生成があり、且つグルコースからのアセトンの生
成がある点、バチルス・フイルマスは、アラビノ
ース及びキシロースから酸の生成がある点、Ｇ−
１菌は、でんぷんの加水分解を行い、且つ硝酸塩
の還元を行うのに対し、バチルス・プミルスは、
いずれも行わない点にそれぞれ特徴的な差異を見
出すことができる。

又、Ｇ−１菌はバチルス・セレウス、バチル
ス・アンソラシス、バチルス・スリンジエンシ
ス、バチルス・ステアロサーモフイラス及びバチ
ルス・メガテリウムと比較して、菌体の大きさ、
内生胞子の形態及びその位置が異なり、更に、Ｇ
−１菌は、マンニツトからの酸の生成があるのに
対し、上記いずれの菌種も、共に酸の生成がない
点において特徴的な差異を見出すことができる。

以上の検索結果を総活すると、Ｇ−１菌は、形
態その他の諸性質から、バチルス属に属する微生
物とすることが妥当であるが、前記のとおり種々
の特徴的な菌学的性質及びPH7.0〜11.0の如き広
範囲のアルカリ性において生育する性質から判断
して、明らかにバチルス属に属する公知の菌種と
区別されるため、これらを新菌種として設定する
ことが適当であると結論された。

次に培養条件として重要な点は、培養液のPHで
ある。実験結果から前記Ｇ−１菌を培養するに当
つてその生育繁殖はPH条件によつて非常に影響を
受けるので、培地のPHは、ほぼ1.0〜11.0の範囲
から選ばれた値に調整することが必要であること
が確かめられた。

かくて上記の培養条件の下に前記微生物を接種
し、適当な条件、例えば、18時間、37℃で振盪培
養を行ない、次いで、10000r.p.mで10分間遠心分
離後、水洗し、再度遠心分離して菌体を集め、蒸
留水で洗浄後、１／10M、PH8.5のトリス緩衝液
（Tris buffer）で懸濁し、該懸濁液を超音波処理
して菌体内酵素系の抽出を行う。この抽出液を再
度、遠心分離法によつて上澄液を分離して該上澄
液を菌体内酵素液とし、次いで硫酸アンモニウム
による飽和分画を行い、さらにDEAE−セルロー
ス、DEAE−セフアデツクス（Sephadex）ウル
トロゲルAcA、ハイドロキシアパタイト
（hydroxyapatite）を用いてカラムクロマトグラ
フイー及びゲル過を行うことによつて脱水素酵
素の精製標品を得ることができる。

なお、菌体の破砕に当つては超音波処理方法の
みならず、通常知られている物理的方法が適用し
得ることは当然である。

このようにして得られた脱水素酵素Ｂ（以下、
「本酵素」という。）は、以下に記載する如く、最
適作用PHがほぼ9.3附近で、グリセロールに対す
る基質特異性が極めて高い性質を有する既知文献
未載の新規脱水素酵素（dehydrogenase）である
ことが証明された。

Γ本酵素の理化学的性質 １ 作用及び基質特異性 本酵素は、前記Ｇ−１菌が、基質のガラクタ
ル酸を炭素源として発育した菌体より得られる
脱水素酵素である。後述の酵素活性測定法(5)に
より、多数の糖類及びその誘導体に対する本酵
素の基質特異性を調べたところ、第１表のとお
りの結果が得られた。この結果、特にグリセロ
ールに対して基質特異性が極めて高いことが明
らかにされた。表中の数値は、酵素活性（％）
を示す（グリセロールを用いた場合を100％と
する）。

第１表 基 質 活性（％） グリセロール 100.0 エチレングリコール 4.7 １，２−プロパンジオール 72.5 １，３−プロパンジオール 40.5 １，３−ブタンジオール 13.5 ２，３−ブタンジオール 84.0 １，２，４−ブタントリオール 16.9 １，５−ペンタンジオール 6.0 エタノール ０ ２−プロパノール ０ メソイノシトール 3.7 ガラクチトール 2.2 ２ 最適PH及び安定PH範囲 10^-1Mピロリン酸緩衝液を用い、基質にグリ
セロールを用いて30℃のて各PHにおける相対活
性を調べたところ第１図の曲線ａ（○−○）の
とおりの結果が得られた。この結果、本酵素
の、グリセロールを用いた場合の最適PHは、ほ
ぼ9.3附近であることが明らかにされた。又同
様にして、基質にジヒドロキシアセトンを用い
て調べたところ、第１図のｂ（●−●）のとお
りの結果が得られ、本酵素の、ジヒドロキシア
セトンを用いた場合の最適PHは、ほぼ9.0附近
であることが明らかにされた。

又、本酵素の種々のPH溶液を25℃、60分間処
理した後、10^-1Mピロリン酸緩衝液でPH8.5と
し、本酵素の残存活性を調べたところ、第１図
の曲線ｃ（△−△）のとおりの結果が得られ、
PH7.0〜9.5の範囲に安定PHが存在することが明
らかにされた。

３ 作用適温の範囲 本酵素液を10^-1Mピロリン酸緩衝液によりPH
9.3とし、各温度における相対活性を調べたと
ころ、第２図の曲線ｄ（○−○）のとおりの結
果が得られ、本酵素の最適作用温度は、45℃附
近であることが明らかにされた。

４ 失活条件（温度安定性） 本酵素液を10^-1Mピロリン酸緩衝液によりPH
9.3に調整し、20〜70℃の各温度にて10分間処
理後、残存活性を測定したところ第２図の曲線
ｅ（△−△）のとおりの結果が得られ、本酵素
の温度安定性は50℃以下であることが明らかに
された。

５ 力価の測定法 本酵素の酵素活性は、５×10^-3MNAD0.3
ml；PH9.3、10^-1Mピロリン酸緩衝液0.5ml；水
2.0ml；酵素液0.1ml；3Mグリセロース溶液0.1
mlよりなる反応系を用いて、340nｍの吸光度
の増加を測定し、1nモルNADH₂生成／mg分を
１単位（1unit）とした。

６ 阻害、活性化および安定化 本酵素は、ピラゾール、Ｏ−フエナンスロリ
ン、ｐ−メルクリ安息香酸によつて阻害され、
NAD又はNADPを補酵素とし、Mgイオンに
より活性化される。安定化は硫酸アンモニウム
により行われる。

７ 酸素の精製法 前記Ｇ−１菌の培養菌体を、遠心分離法によ
り集め、これをトリス緩衝液（PH8.5）に懸濁
し、超音波処理により菌体内酵素抽出を行う。
再度遠心分離後、上澄液を硫酸アンモニウムに
よる飽和画分の分画を行い、DEAE−セルロー
スでカラムクロマトグラフイーを行い、得られ
た溶出液をゲル過することによつて最終酵素
標品とする。

８ 分子量 分子量の測定を行うために、Ultrogel
AcA34（IBF社製、オランダ）を、100ｍＭの
NaClを含む100ｍＭ KH₂PO₄−Na₂HPO₄緩
衝液（PH8.5）で平衡化して、２×70cmのカラ
ムに充填し、次いで、このカラムに酵素液をチ
ヤージして、同一の緩衝液を用いて溶出を行つ
た。

このゲル過法による測定では、酵素の分子
量は120000〜180000であつた。

９ 本酵素は結晶化されていないので、結晶構造
は明らかでない。

10 元素分析 本酵素の元素分析値は次のとおりである。

Ｃ：51.1％、Ｈ：7.2％、Ｎ：14.3％ 11 本酵素のミハエリス係数（km）は、グリセ
ロールに対して、km＝1.5×10^-2Mであり、
NAD⁺に対しては、km＝1.25×10^-4Mであつ
た。

以上のとおり、本発明は、前記Ｇ−１菌の如き
バチルス属に属するガラクタル酸資化利用性菌を
培養し、その培養液よりPH9.3附近に最適PHを有
し、且つグリセロールに対し極めて基質特異性の
高い新規なグリセロール脱水素酵素及びその製造
法を提供するものである。

このように本発明の酵素は、最適作用PHをほぼ
9.3附近を中心に８〜9.5の広い範囲に有し、PH８
近辺においても比較的高い活性を発現することか
ら、実用上極めて有効である。

すなわち、本発明の酵素はNADの化学的還元
を抑制する低いPH範囲（８〜9.5）でも活性を発
現するため、従来のグリセロールデハイドロゲナ
ーゼと異なり、非常に広範囲に適用できるという
利点がある。

さらに、通常のピロリン酸緩衝液中で十分に発
現するため、汎用性が大きいという利点もある。

以下、本発明を実施例により詳述する。

実施例 １ ガラクタル酸を炭素源とした場合の使用培地
は、次の通りである。

ガラクタル酸 10ｇ ポリペプトン １ｇ 酵母エキス １ｇ KH₂PO₄ １ｇ MgSO₄・7H₂O 0.3ｇ KNO₃ ３ｇ Na₂CO₃ 10ｇ 全容量 １ （培地のPHは10.0である。） 300ml容フラスコに上記の培地50mlをとり、こ
れを殺菌し、前記Ｇ−１菌（微工研菌寄第5925
号）を無菌的に接種して、37℃で18時間振盪培養
を行つた。得られた培養物を、10000r.p.mで10分
間遠心分離後、水洗し、10^-1Mトリス緩衝液に懸
濁した。この懸濁液を、10KC、10分間超音波処
理して菌体内酵素の抽出を行い、10000r.p.mで10
分間再度遠心分離して上澄液を分離した。この上
澄液を硫酸アンモニウムを用いて０〜0.5飽和画
分、次いで0.5〜0.7の飽和画分の分画を行い、後
者の画分をリン酸緩衝液（100ｍＭ KH₂PO₄−
Na₂HPO₄、PH8.5）で平衡化したDEAE−セルロ
ースカラムに吸着した後、０〜1M NaClの直線
濃度勾配で溶出した。次いで、前記リン酸緩衝液
（脱気したもの）で平衡化したDEAE−セフアデ
ツクスカラムに、前記DEAE−セルロースカラム
クロマトグラフイーで得られた活性画分を同一の
緩衝液で透析してカラムに吸着後、０〜1M
NaCl直線濃度勾配で溶出した。得られた活性画
分をウルトロゲルAcA34カラムに吸着後、100ｍ
Ｍ NaClを含む前記リン酸緩衝液で溶出した。
更に、続いてハイドロキシル・アパタイトを用
い、前記ウルトロゲルを用いた場合と同様の条件
で処理し、本酵素の精製標品を得た（収率12％）。

本酵素標品は、NAD⁺をコフアクターとして、
グリセロールをジヒドロキシアセトンに変換する
ことが薄層クロマトグラフイーで確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による酵素の最適PH及び安定
PHを示すグラフ、第２図は、本発明による酵素の
最適作用温度及び温度安定性（失活条件）を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 最適作用PHをほぼ9.3附近に有し、分子量が
   120000〜180000であつて、且つグリセロールに対
   し基質特異性を有するグリセロール脱水素酵素
   Ｂ。 ２ バチルス属に属するガラクタル酸資化利用性
   菌を培養し、その培養物より最適作用PHをほぼ
   9.3附近に有し、且つグリセロールに対し基質特
   異性を有するグリセロール脱水素酵素Ｂの製造
   法。 ３ バチルス属に属するガラクタル酸資化利用性
   菌がバチルス・エスピー・Ｇ−１（Bacillus sp・
   Ｇ−１）（微工研菌寄第5925号）である特許請求
   の範囲第２項記載の製造法。