JPH03287071A - フィブリノペプタイドＢβ↓１↓５‐↓４↓２の測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＦＰＢβ１５−４２を特異的に認識するモノク
ローナル抗体を利用した試料中のＦＰＢβ１゜４２の測
定方法に関するものである。

（従来の技術） 血栓症や血栓症を伴い易い病態の患者では、血液はいわ
ゆる凝固亢進状態にあることが指摘されており、血液凝
固亢進状態は何等かの原因による血管向凝固系の活性化
によると考えられている。

血液凝固はカスケード反応により進行するが、その中に
フィブリノゲンーフィプリン系があり、フィブリノゲン
の分解に関与するトロンビン等の酵素活性の上昇は、す
なわち血管向凝固系の活性化を意味する。

フィブリノゲンは分子量約３４００００の糖タンパク質
で、Ａα、Ｂβおよびγ鎖の各ポリペブタイド鎖が一対
ずつ計６本の２量体の形をとり、Ｓ−８結合で連結され
ている。血液凝固系が活性化されると、フィブリノゲン
はトロンビンによりフィブリ〉に転換されるが、この過
程は一連の血液凝固過程のうち最終段階に位置する中心
的反応である。まずトロンビンがフィブリノゲンに作用
するとＡ　ａ　＠　Ｎ末端近傍のＡｒｇｌＢとｃｌｙｉ
ｙの間が切断され、Ａｌａｌ−ＡｒｇｌＢというフィブ
リノペプタイドＡ　（ＦＰＡ）が生じる。ＦＰＡを遊離
したものはｄｅｓフィブリンモノマーとなり、フィブリ
ンの結合を担う部分が露出される。さらに、トロンビン
が作用することによりフィブリンに転換されるが、Ｂβ
鎖Ｎ末端近傍のＡｒｇ１４とＣ１ｙ１５の間が切断され
１４個のアミノ酸からなるフィブリノペブタイドＢ　（
ＦＰＢ）が遊離し、これによりフィブリンの結合に関与
する部分が露出する。フィブリンはモノマーからポリマ
ーへと重合し、さらに活性化Ｘ■因子による架橋形成を
経て安定化フィブリンとなる。

一方、線溶系の活性化により生じたプラスミンは、Ｂβ
鎖Ｎ末端側のＡｒｇ４２−Ａ］ａ４３の結合を切断する
ため、フィブリノゲンあるいはｄｅｓＡフィブリンモノ
マーにプラスミンが作用するとＢβ鎖からはフィブリノ
ペブタイドＢβ１〜４２を生じ、ＦＰＢを放出したのち
のフィブリンにプラスミンが作用すると、フィブリノペ
プタイドＢβ０．−４２が遊離することになる。ＦＰＢ
β１−４２とＦＰＢβ１５４２はいずれもプラスミンに
より遊離したベブタイドであるため、ＦＰＢβ、−４２
は一次線溶を、ＦＰＢβ１５−４２は二次線溶を反映し
ていることになる。

現時点では、ＦＰＢβ１５−４２は放射免疫測定法（Ｒ
Ｉ　Ａ）あるいは酵素免疫測定法（ＥＩＡ）により測定
されているが、両者とも競争法と呼ばれるタイプの測定
法である。しかし、ＲＩＡはそれに使用される試薬の取
扱いに多大な注意を要するだけでなく、特別な施設も必
要とされる。また、競争法でのＥＩＡは感度が比較的低
いという欠点を有している。

（発明が解決しようとする課題） 上述したように従来の方法は諸問題を有しており、本発
明の目的はその様な問題点を解決し、簡便な測定法を提
出することにある。すなわち、難しいとされてきたアミ
ノ酸２８残基のペプチドであるＦＰＢβ１５−４２に対
するサンドウィッチ系を確立し、検出感度に支障をきた
すことなく上記問題を解決することである。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは従来技術の問題点を解決すべく、操作が簡
便で測定精度の高いＦＰＢβ１５−４２の測定方法につ
いて鋭意検討したところ、これらの問題点を解決できる
ことを見出だし、本発明を完成させた。即ち、本発明は
試料中のフィブリノペプタイドＢβ１９−４２を測定す
る方法において、（ａ）　　・フィブリノペプタイドＢ
β０．−４２を特異的に認識する、固相に固定化された
モノクローナル抗体 ・試料 及び ・固定化モノクローナル抗体とは異なる部位でフィブリ
ノペプタイドＢβ１５−４２を特異的に認識する、標識
されたまたは標識されていないモノクローナル抗体 とを接触させ、 （ｂ）　（ａ）で標識されていないモノクローナル抗体
を使用した場合には、そのモノクローナル抗体又はａで
生じる免疫反応生成物を特異的に認識する標識された抗
体を接触させ （ｅ）　Ｒ離の標識された抗体を除去し、（ｄ）標識を
直接的または間接的に検出して、免疫反応生成物を定量
する 工程からなることを特徴とする試料中のフィブリノペプ
タイドＢβ１５−４２の測定法を提供するものであり、
以下その詳細について説明する。

本発明は、抗原であるＦＰＢβ１５−４２の上において
、認識部位の異なる２種類のモノクローナル抗体を用い
て、サンドウィッチ法による免疫測定法により、ＦＰＢ
β１５−４２を定量することを特徴とするＦＰＢβ１５
−４２の測定法である。具体的には、例えばモノクロー
ナル抗体はＦＰＢβ３５−４２のアミノ末端側を認識す
るものとカルボキシル末端側を認識するものとを作製し
て免疫測定法に供すればよい。本発明方法において、用
いられるモノクローナル抗体は、それ自体公知である方
法（Ｇ、ケーラー＆Ｃ，ミルシュタイン、キーチャ第２
５６巻、４９５頁、１９７５年）に準じて製造すること
ができる。以下、本発明に使用するモノクローナル抗体
の製造法について詳細に説明する。

（Ａ）ＦＰＢβ１５−４２のハブテン化ＦＰＢβ１５−
４２は比較的分子量の小さいものであるので、ハブテン
にして免疫用抗原とする。その方法についてはＮ−ヒド
ロキシサクシイミド法、カルボジイミド法、ＭＢＳ法（
北用法）等、公知の種々の方法を用いることができ特に
限定されない。また、担体として用いるタンパク質もウ
シアルブミン、ウシオブアルブミン、キーホールリンペ
ッド・ヘモシアニン等、一般にハブテン用担体として使
われているものを使用できる。

（Ｂ）抗原感作動物細胞の調製 上記Ａ項で調製した免疫用抗原−タンパク質複合体を動
物に免疫する。免疫動物はマウス、ウサギ、ヤギ等、一
般に免疫用動物として用いられているものが用いられ、
好ましくはＢ　ａ　１　ｂ　／　ｃマウスのように後述
の骨髄腫細胞がセル・ラインとして確立している種類の
ものが使用されるが、特に限定されない。免疫方法につ
いても何ら限定されるものではない。

（Ｃ）腫瘍細胞の調製 上記Ｂ項で用いた免疫用動物に対応する腫瘍細胞を必要
量培養する。腫瘍細胞は例えば５Ｐ２１０／Ａｇ１４の
ような８−アザグアニンを含む培養液にて成育し、ヒポ
キサンチン、アミノプテリン、チミジンを含む培養液に
て成育できないなどの性質を有するもの、すなわち培養
液成分によって選択可能なセル・ラインとして確立され
たものを用いる。

（Ｄ）細胞融合 細胞融合は公知である方法（Ｇ、ケーラー＆Ｃ。

ミルシュタイン、ネーチャー、第２５６巻。

４９５頁、１９７５年）に準じて行なうことができる。

ただし、電気的に融合する方法も用いられ、特に限定さ
れない。

（Ｅ）抗ＦＰＢβ１５−４２抗体の精製上記方法により
得られたハイブリドーマの産生ずるモノクローナル抗体
を、通常タンパク質の精製に用いられる方法により精製
する。

（Ｆ）抗ＦＰＢβ１５−４２抗体の固定化本発明方法に
用いられる抗体を固相に固定化する方法は、公知の方法
を採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、セファ
ロース粒子、ラテックス、アガロース、セルロース、ポ
リメタアクリレートなどが使用される。

（Ｇ）標識抗体の調製 抗ＦＰＢβ１５−４２抗体を標識する場合、その標識化
の方法とその検出方法もなんら限定されるものでなく、
公知の方法により標識化および検出することができる。

標識として間接的に検出されるもの、例えば酵素を用い
る場合、標識物質としては例えば、ペルオキシダーゼ、
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、
ウレアーゼ、カタラーゼ、β−グルクロニダーゼなどの
酵素が使われる。標識として直接的に検出されるもの、
例えば放射性物質としては、３に、　　”Ｉ、　または
　１３１１等か、蛍光物質を使用する方法としては、例
えば、フルオレスカミン、フルオレラセンチオシアネー
ト、テトラローダミンイソチオシアネート等が常法によ
りモノクローナル抗体に結合される。しかしながら、標
識物質は上記物質に何ら限定されるべきものではない。

また標識されていない抗ＦＰＢβ１５−４２抗体を用い
た場合には、その抗体又はその免疫反応生成物を特異的
に認識する標識された抗体を用いる。

その際の標識も前述と同様のものが用いられる。

以上のような固定化抗ＦＰＢβ１５−４２抗体及び標識
化抗体を用いて、試料中のＦＰＢβ１５−４２をサンド
イッチ測定法で測定することができる。このとき、固定
化抗体、標識化抗体、及び試料を接触させる順序には特
に限定はない。そして生成した免疫反応生成物を遊離の
標識化抗体と分離し、標識を直接的又は間接的に検出す
ればよい。

（発明の効果） （１）試料中のＦＰＢβ１５−４２濃度は、０．１〜２
００ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定することができ、（２）
従来法に比べて、極めて簡便な操作で短時間に、かつ感
度よく多数の検体の測定が可能である。

（実施例） 以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし本発明
は、これら実施例のみに限定されるものではない。

実施例１ 酵素標識法によるＦＰＢβ１５−４２の測定（１）ＦＰ
Ｂβ１５−４２の７＼ブテン化ウシ血清アルブミン（Ｂ
　Ｓ　Ａ）　６．６Ｂをバイアルびんにとり０．１Ｍ　
　Ｎ　ａ　ＣＩ含有０．ＩＭ　　リン酸緩衝液（ｐＨ７
，５）ｌ＋Ｉに溶解させ、２０ＩＩＩＭＳ　Ｐ　ＤＰ　
（Ｎ−サクシイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロ
ピオネート）エタノール溶液１００　μｍを添加し、室
温で３０分攪拌した。その後、０，１ＭＮａＣ１含有０
．１Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ４，５）に透析した。さ
らに、０．５ＭＤＴＴ　（ジチオスレイトール）水溶液
を加え室温にて２０分間放置し、その後、０．１ｍＭ　
Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ含有０．１Ｍ　　リン酸緩衝液（ｐＨ６
，０）に、４℃にて一晩透析を行い、ＢＳＡにＳＨ基を
導入した。

つぎにＦＰＢβ１５−４２のＩＢをバイアルびんにとり
、０．１Ｈリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）に溶解した。さ
らに、２５．３ｍｇ／ＩＩＩ　ＭＢ　Ｓ　（ｍ−マレイ
ミドベンゾイル−Ｎ−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル）ジメチルホルムアミド溶液（６２，５μｍ）を加
え室温に３０分間、攪拌後０．３ＩＩｌ　ジクロロメタ
ンを添加し３０００ｒｐａ＋　５分間遠心後、上清をと
りＦＰＢβ１５−４２にマレイミド基を導入した。

最後に上記２つの溶液を４℃にて一晩反応しカップリン
グしＦＰＢβ１５−４２−ＢＳＡを作製した。

（ＩＩ）抗原感作動物細胞の調製 Ｂａ１ｂ／Ｃマウス（♀）を上記（Ｉ）で調製したＦＰ
Ｂβ＋、−ａ２Ｂ　Ｓ　Ａで免疫した。免疫は、マウス
の腹腔にフロイントの完全アジュバントとＦＰＢβ１５
−４２　　Ｂ５Ａ１０○μｇ／匹とを乳化させた試料１
００μｍを投与した。２週間後に追加免疫としてＦＰＢ
β１５−４２−ＢＳＡ１００μｇ／匹をフロイントの不
完全アジュバントと乳化させたもの１００μｌをマウス
腹腔に投与した。１週間後最終免疫としてＦＰＢβ１５
−４２−ＢＳＡ１００μｇ／匹をリン酸緩衝化生理食塩
水（０，８５％ＮａＣ１含有０．０１％リン酸緩衝液、
ｐＨ７，２：以下ＰＢＳ）に溶解したちの１００μｍを
腹腔内に投与した。３日後この処置マウスの膵臓を無菌
的に取出した。１５％子牛脂児血清（以下１５％ＦＣＳ
と省略する）を含むＤＭＥＭＩ　Ｏｍ　ｌを注射器で吸
い取り２７ゲージの注射針をつけた。膵臓を氷冷してお
いたデイツシュに入れ、注射針で数か新式をあけた。注
射針を差し込み還流し膵臓細胞をデイツシュに流出させ
た。流出液をナイロンメツシュで濾過し遠心チューブに
入れ、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離して上澄をす
てた。細胞ベレ・ソト中の赤血球を０．１５Ｍ塩化アン
モニウム溶液（ｌ　ｍ　Ｍエチレンジアミン４酢酸−２
ナトリウム塩（以下ＥＤＴＡと省略する）を含む０．０
１Ｍ炭酸緩衝液、ｐＨ７，２）で溶血させ遠心分離し、
さらに細胞ペレットをＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍで２回同様に遠心
洗浄して肺細胞とした。

（ｍ）骨髄腫細胞の調製 骨髄腫細胞としてはＢａ１ｂ＋／ｃマウス由来の８−ア
ザグアニン耐性株として、ＳＰ２／Ｃ）−Ａｇ１４（以
下Ｓ　Ｐ　２１０と省略する）を使用した。

細胞融合を行う１週間前まで２０μｇ　／　ｍ　１の８
−アザグアニン、１５９ｏＦＣＳを含むＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ
で培養し、その後細胞融合口まで１５％ＦＣ５を含むＤ
ＭＥＭを使用した。細胞融合直前に、５Ｐ２１０は無菌
的にＤＭＥＭで１１００Ｏｒｐで１０分間遠心洗浄を２
回繰り返し調製した。

（ＩＶ）細胞融合 上記（ＩＩ）項で調製した肺臓細胞と上記（ＩＩＩ）項
で調製した骨髄腫細胞を５＝１の割合で混合遠心（１０
００ｒｐｍ、１０分）し細胞ベレットを集めた。遠心チ
ューブを軽くたたいて細胞ベレットを壁面にうずく広げ
た。その中に３７℃に暖めておいた５０％ＰＥＧ　（Ｍ
ＥＲＫ社製ポリエチレングリコール４０００）を含むＤ
ＭＥＭ溶液０．５ｍｌを遠心チューブを回しながら少し
ずつ滴下した。１分間ゆっくりと遠心チューブを回転さ
せ混合した後、３０秒に１ｍｌの割合で遠心チューブを
回転しながら３７℃１３加温しておいたＤＭ　Ｅ　Ｍを
１０回加えた。つぎにＦＣＳを２ｍｌゆっくりと入れ、
１１０００ｒｐ、１０分間遠心した。細胞ベレットを１
５％ＦＣ３とＩ　Ｘ　１０−’Ｍヒポキサンチン、４　
Ｘ　１０−’Ｍアミノプテリン、１５６Ｘ１０−５Ｍチ
ミジンを含むＤＭＥＭ　（以下ＨＡＴ培地と省略する）
で２回遠心洗浄（１０００ｒｐｍ、１０分間）した。こ
の培養液を９６ウエルプレート（Ｆａ　１ｃｏｎ＃３０
４２）に５Ｘ１０５細胞個／ウェルになるように２００
μｍずつ分注した。３日日ごとにＨＡＴ培地を１００μ
ｍ／ウェル交換した。３週間後からは、Ｉ　Ｘ　１０−
’Ｍヒボキサンチン、１５６Ｘ１０−５Ｍチミジンと１
５％ＦＣ８を含むＤＭＥＭ　（以下ＨＴ培地と省略する
）を培地交換に用いた。

（Ｖ）ハイブリドーマの選択 ９６ウエルプレートに細胞コロニーが認められる１００
日日後から固相酵素免疫測定法を行い、培養上清に抗Ｆ
ＰＢβ１５−４２抗体が存在するかどうか調べた。

９６ウエルイムノプレート平底（インターメッド社製）
に、ＦＰＢβ１５−４２２　ｕ　ｇ　／　ｍ　１を５０
μｌ／ウェル分注し、３７℃で１５５時間静置した。ウ
ェルに残っている溶液を除去し、ＰＢＳに０．０４％ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ
−Ｔ）で３同洗浄した後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰ
ＢＳ−Ｔ溶液３００μ】を各ウェルに加えて、３７℃で
１，５時間ブロッキング処理した。つぎに各ウェルに上
記培養上〆ｎを１００μｍずつ分注し３７℃で１５５時
間静置した。これらのウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗
浄した後、ペルオキシダーゼ標識ラビット抗マウスＩｇ
Ｇ抗体（ジャクソン社製）４０００倍希釈を５０μｌ／
ウェルずつ分注し、３７℃で１５５時間静置した。ＰＢ
Ｓ−Ｔ溶液で３回洗浄したのち、基質溶液（１，２％　
２，２−アジノジー（３−エチルベンズチアゾリン硫酸
）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸
化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ５，１））を各ウェルに１００μｍ添加した。３
０分間室温で放置し、２００ｍＭシュウ酸溶液を１００
μｍを加えて酵素反応を停止させた。４１５ｎｍでの吸
光度を測定し、酵素活性か認められたウェルに抗ＦＰＢ
β１５−４２抗体を産生ずるハイブリドーマが存在する
ことがわかる。

以上のようにして、抗体価の強い抗体産生ハイブリドー
マを取得した。

ｃ、　ＶＴ　）コンデショニングメデウムの調製２６ゲ
ージの注射針をつけた注射器に１０ｍ１の冷蔵しておい
た０、３４〜１サツカロース溶液を吸い取った。Ｂ　ａ
　１　ｂ　／　ｃマウス（♂）をを椎脱臼させ、無菌的
に腹腔内に上記溶液を注入した。

注入後５分以内に左側腹部にコ８ゲージの注射針をつけ
氷冷しておいた注射器にて腹腔内溶液を回収した。水冷
しておいた遠心チューブに上記回収液を流し込み、１１
０００ｒｐで５分間遠心分離した。遠心後上清を廃棄し
、細胞ベレットに１５％Ｆ　ＣＳ　−Ｄ　ＭＥ　Ｍを加
え攪拌しデッンユに入れた。３７℃、５％炭酸ガス濃度
、９５％湿度で一晩培養した。培養上清を集め、０．２
２μｍのメンブレンフィルターで濾過し、これをコンデ
ショニングメデウムとした。

（■）クローニング 抗体産生を認めるハイブリドーマについて限界希釈法を
用いて単一クローンにした。上記（Ｖｌ）項で作製した
コンデンヨニングメデウムを１ｍｌ含むＨＡＴ培地２０
ｍ１を用意した。クローニングしたいハイブリドーマ細
胞を各ウェルに１個になるように上記培養液中に調整し
、２００μｍ／ウェルずつ９６ウエルプレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ＃３０４２）に分注した。培養１０日目前後から
細胞コロニーが認められるウェルについて、上記（Ｖ）
項に記載した同相酵素免疫測定法に準じて抗ＦＰＢβ１
５−１２抗体産生バイプリドーマを選択し、さらに再度
クローニングを繰り返し単一ハイブリドーマを樹立した
。最終的に７クローンのハイブリドーマを確立した。

（■）抗ＦＰＢβ１５−４２抗体の精製Ｂ　ａ　ｌ　ｂ
　／　ｃマウス（♂）６〜１０週令の腹腔にブリスタン
（２，６，１０，ユ４−テトラメチルペンタデカン）を
０．５ｍｌ／匹投与した。２週間後上記（■）項で得ら
れた抗ＦＰＢβ１５−４゜抗体産生ハイブリドーマ株を
マウス腹腔内に各クローンについて２Ｘ１０’細胞個／
匹移植した。

１０日目前後に生成した腹水を、１８ゲージの注射針を
腹腔に差し込み、ｌ／２０量の０．２Ｍ・ＥＤＴＡをい
れた遠心チューブに滴下させた。遠心チューブを４００
Ｏｒｐｍで１０分間遠心し、上清を集めた。採取した上
清を５０％硫酸アンモニウム沈殿分画法にしたがって粗
精製し、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ溶液
に透析後、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過を
おこない精製した。メルカプトエタノール還元下での５
ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（１２％Ｔ）で１本
の重鎮と１本の軽鎖の２本のバンドになったことで抗体
の純度を確認した。

以上の方法により、ＦＰＢβ１５−４２を特異的に認識
する複数種のモノクローナル抗体を得た。それぞれの抗
体の結合定数は、１０７〜１５０”Ｍの範囲内であった
。

（ＩＸ）抗ＦＰＢβ０．−４２抗体の固定化未処理マイ
クロタイタープレート（９６ウエル・タンクプレート、
インターメッド社製）の各ウェルに０，１Ｍ炭酸ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した３μｇ　／　ｍ　
ｌのマウス由来の抗ＦＰＢβ１９−４２抗体（名称Ａ）
の溶液２００μ】を加えて、４℃−夜インキユベートし
た。次に、各ウェルの溶液を除去し、ＰＢＳ−Ｔで３回
洗浄した後、０．１％ＢＳＡを溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液
３００μｌを各ウェルに加えて、４℃でブロッキング処
理しそのまま保存した。

（Ｘ）西洋ワサビペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰ）標識
抗体の調製 ０．３Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，１）に溶解
したＨＲＰ溶！（５ｍｇ／ｍｌ）に１９゜１−フルオロ
−２，４−ジニトロベンゼンのエタノール溶液０．１ｍ
ｌを加え、室温にて１時間反応させた。その溶液に０．
０６Ｍ過ヨウ素酸ナトリウム１５０ｍｌを添加し３０分
反応させた。未反応の過ヨウ素酸ナトリウムを０．１６
Ｍのエチレングリコール１５０ｍｌを加えて除去した後
、０．０１５Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，５）で
透析した。次に、マウス由来抗ＦＰＢβ１５−４２モノ
クローナル抗体（名称Ｂ０モノクローナル抗体Ａとは異
なる抗原部位を認識するもの）５ｍｇを加えて５〜６時
間反応させた。水素化ホウ素ナトリウム５ｍｇを添加し
て４℃中で一夜放置した。

この後、未反応の水素化ホウ素ナトリウムを除去するた
め、０．８５％塩化ナトリウムを含む１０ｍ　Ｍリン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，１）に対して４℃で一夜攪
拌しながら透析した。上記反応物ヲＴ　Ｓ　Ｋ　−’ｆ
　ルＧ　−３０００Ｓ　Ｗ　（東ソー株式会社製、商品
名）を用いて高速液体クロマトグラフィーにて精製し、
ＨＲＰ標識抗体とした。

（ＸＩ）試料中のＦＰＢβ１５−４２の定量本実施例中
の（ＩＸ）で記述した方法で作製したマイクロタイター
プレートを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後
、ＦＰＢβｌ　Ｓ　−４２を含む標＄試料を各ウェルに
それぞれ２０μｍ加えた。

つぎに本実施例（Ｘ）で得たＨＲＰ標識抗体をＰＢＳ−
Ｔ溶液で希釈し、各ウェルに２００μｍずつ添加した。

そのまま室温で３時間インキュベートした後、溶液を除
去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、１５２％
　２，２−アジノジ（３−エチルベンズチアゾリン硫酸
）−ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び０．０１％過酸
化水素（Ｈ２Ｏ２）を含有する０、１Ｍクエン酸緩衝液
（ｐＨ４，１）から成る基質溶成を各ウェルに２００μ
ｌ添加し、室温で３０分間酵素反応させた後、２００ｍ
Ｍシュウ酸溶液を１００μｍ加えて酵素反応を停止させ
た。上記マイクロタイタープレートを各ウェルについて
、波長４１５ｎｍ。

対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイター
プレートリーダー（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、
商品名）で測定した結果を表１に示す。表１から明らか
なように、試料中のＦＰＢβ１、−４２は０，１〜２０
０ｎｇ／ｍｌの範囲で定量できることが確認された。

表１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 試料中のフィブリノペプタイドＢβ＿１＿５＿−＿４＿
   ２を測定する方法において、 （ａ）・フィブリノペプタイドＢβ＿１＿５−＿４＿２
   を特異的に認識する、固相に固定化されたモノクロ ーナル抗体 ・試料 及び ・固定化モノクローナル抗体とは異なる部位でフィブリ
   ノペプタイドＢβ＿１＿５＿−＿４＿２を特異的に認識
   する、標識されたまたは標識され ていないモノクローナル抗体 とを接触させ、 （ｂ）（ａ）で標識されていないモノクローナル抗体を
   使用した場合には、そのモノクローナル抗体又はａで生
   じる免疫反応生成物を特異的に認識する標識された抗体
   を接触させ、 （ｃ）遊離の標識された抗体を除去し、 （ｄ）標識を直接的または間接的に検出して、免疫反応
   生成物を定量する 工程からなることを特徴とする試料中のフィブリノペプ
   タイドＢβ＿１＿５＿−＿４＿２の測定法。