JPH03251548A - メグスリノキの組織を利用したロドデンドロールの生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 主粟上生Ｕ分互 本発明は、薬用植物として有用なメグスリノキの生組織
から誘導して得られるカルスを利用してロドデンドロー
ルの前駆体をロドデンドロールに変換する方法に関する
。ロドデンドロールは医薬としてその利用が期待される
物質である。

災米勿肢歪 メグスリノキは、日本特産の落葉樹でカエデ科の植物で
あって、北海道と沖縄を除く日本全土に広く分布してい
るが、標高７００ｍ前後の山中に限定して自生しその生
育が遅いため、資源的に制限されている。

而して、メグスリノキの樹皮は、古くからそれを煎じて
洗眼剤として用いられているほか、メグスリノキ成分の
肝臓病に対する薬効が報告されている。〔篠田氏等、「
生薬学雑誌Ｊ４０（２）、１７７〜１８１　（１９８６
））。したがって、今後のメグスリノキ成分の肝障害に
対する薬効についての研究進展に伴い、メグスリノキ及
びその成分に対する需要の増大が予想される。

しかしながら、前述したとおり、メグスリノキの生育環
境が限定されているため、それを大量に収集することは
実際上不可能である。また、その成分を大量に得ること
も不可能である。

如上の状況に鑑み、本発明者らは、さきにメグスリノキ
の生組織から誘導されたカルスを培養して増殖すること
によりメグスリノキを大量に生産する方法を開発した（
特開平１−９５７７１）。

しかし、メグスリノキ樹皮抽出物中の有用成分であるロ
ドデンドロールについては、通常のカルス培養で大量に
得るためには大量にカルスを培養し、大量のカルスから
分離精製しなければならない。このため通常のカルスの
培養によっては上記物質を大量に得ることは難しいとい
う問題がある。

しよ゛と　る 本発明は、薬用植物として注目されてきているメグスリ
ノキの有用成分であるロドデンドロールをメグスリノキ
の生組織から誘導されるカルスを利用してロドデンドロ
ールの前駆体から効率的に生産するための方法を提供す
ることを課題とする。

ｆ　　　゛　るための 本発明の特徴は、メグスリノキの生組織からカルスを誘
導し、得られたカルスの酵素系を利用してロドデンドロ
ールの前駆体をロドデンドロールに変換することにある
。

ここでいうロドデンドロールとは下記の構造式で示され
、メグスリノキ樹皮から四塩化炭素肝障害に対して防護
作用を有する成分として単離、同定された化合物である
。

Ｈ この化合物は合成により（±）一体として得られるが（
＋）一体を分離するのが困難である。

メグスリノキのカルスの変換能を利用した場合、（＋）
一体のみが生成するか、或は（＋）一体が多く生成する
可能性が高いと考えられる。

本発明で用いるロドデンドロールの前駆体としては、４
−（Ｐ−ヒドロキシフェニル）−２−ブタノン、ｐ−フ
マル酸及びジヒドロ−ｐ−フマル酸等を例示し得る。

本発明では、これらの各化合物を、メグスリノキの生組
織から誘導して得られたカルスの培養、増殖液中に添加
してロドデンドロールに変換させる。

メグスリノキの生組織からカルスを誘導するには、茎、
葉の生組織、特に好ましくは葉柄の切片を、寒天或はジ
ェランガムを添加した固形培地上で培養して行う。

ここでカルスの誘導に用いる固形培地としては、植物の
組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（Ｍｕｒ
ａｓｈｉｇｅ　＆　Ｓｋｏｏｇ、１９６２）培地、ホワ
イト（Ｗｈｉｔｅ、　１９６３）培地、リンスマイヤー
・スクーグ（Ｌｉｎｓｓ＋ａｆｅｒ　＆　Ｓｋｏｏｇ、
、　１９６５）培地、ガンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ、１
９６８）培地等を例示できる。これらのうち、特にムラ
シゲ・スクーグ培地が好ましい。

また、カルスの誘導を促進させるために、これらの培地
に植物ホルモンとしてオーキシン類並びにサイトカイニ
ン類等を添加してもよい。なお、オーキシン類としては
２．４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、イン
ドール酢酸（ＩＡＡ）、α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）
等を例示し得、サイトカイニン類としてはカイネチン、
ベンジルアデニン（ＢＡ）等が挙げられる。

これらの植物ホルモンは、１０−７〜１０−５Ｍの濃度
で培地に添加するのがカルスの誘導促進上好適である。

カルスの誘導は、通常、暗所で１５〜２５°Ｃの温度で
３０日前後培養することにより行い、この培養により組
織切断面にカルスが形成される。

なお、カルスの誘導に用いる組織切片としては、葉柄が
好ましく、葉柄を用いて上述のようにして培養して得ら
れるカルスの湿重量は、葉並びに茎由来のものに比し、
２〜４倍になる。

このようにして形成されたカルスは、ついで新鮮培地に
移植して培養し、増殖する。

二〇カルスの増殖培養は、固体培地に継代して行っても
よいが、大量生産には液体培養が好ましい。すなわち、
上言己誘導により形成されたカルスを液体培養により振
とう或は撹拌しながら培養を行うと、カルスは１〜５閣
程度の塊りになって培養液中に分散して増殖する。この
ため、比較的大きさの揃ったカルスが得られ、培養液か
らの分離、その後の乾燥が容易となる利点がある。

なお、上記培養を大量方式で行うには、エアーリフトタ
イプのファーメンタ−を用いることもできる。

上述のごとくして固形培地上に生育したカルスを液体培
地に移植し、振とう或は撹拌しながら培養を行う。

次いで、上述のようにして培養して増殖させたカルスに
、前述したごときロドデンドロールの前駆物質を培地当
り２５〜２００ｐｐｍ、好ましくは５０〜１００ｐｐｎ
＋添加し、さらに数時間乃至数日間培養を継続して上記
前駆物質をロドデンドロールに変換する。また、得られ
たカルスを液体培地中で粉砕し、ロドデンドロールの前
駆物質を加えて同様に培養しても上記前駆物質をロドデ
ンドロールに変換することができる。

このような変換により生成したロドデンドロールは全て
培地中に放出されるので、その後の回収、精製が容易で
ある。このことは、培養後の培地と細胞を分離し、培地
を有機溶媒で抽出するだけで比較的高純度のロドデンド
ロールが得られることを意味する。なお、細胞について
は、無菌的に培地と分離し、新鮮培地へ移植・継代する
ことにより、繰り返し使用することができるという利点
がある。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例 互止久■誘■ メグスリノキの若い葉柄を適当な大きさに切断し、これ
を７０％エタノール水溶液に３分間浸漬して殺菌処理を
行った。次いで、無菌水で３回洗浄後、この切断葉柄を
剥皮し、５閣前後に輪切りして下記組成の培地に置床し
、２５°Ｃの温度で、暗所にて２０日間培養を行った。

培地としては、ムラシゲ・スクーグ培地（シュクロース
３ｗｔ％、寒天０．９智ｔ％、ｐ）１５．８〜５．９）
に植物ホルモンとしてα−ナフタレン酢酸とベンジルア
デニンを種々の量添加したものを用いた。

上記培養の結果得られたカルスのうち、α−ナフタレン
酢酸１０−’Ｍ、ベンジルアデニン１０−５Ｍをそれぞ
れ添加した培地で形成されたカルスを以下に用いた。

誘盪友火ムｑ看ｌ 上記により形成されたカルスを上記同様な新鮮培地に移
植して同条件で培養して増殖させた。さらに、ムラシゲ
・スクーグ培地１００ｄを、５０〇−容三角フラスコに
入れ、これに上記増殖させたカルス（乾燥重量として０
．３　ｇ　）を加え、２５°Ｃの温度で暗所にて往復式
振とう培養（８０往復／分）を行った。

ロ゛−゛ン′ロールへの゛ 上記により誘導したカルスをムラシゲ・スターダ液体培
地中に移植して培養し、その培養１日目に４−（ｐ−ヒ
ドロキシフェニル）−２−ブタノン（以下、ＨＰＢと略
する）を培地あたり５０ｐｐｍとなるように、少量のエ
タノールに溶解して無菌的に、上記カルスの細胞懸濁液
に添加した。さらに、５日間培養を継続した。

次いで、このようにして変換によって得られたロドデン
ドロールを下記により測定した。

によ　　　したロドデンドロールの 培養終了後培地と細胞を分け、培地をジエチルエーテル
で３回抽出した。これを無水硫酸ナトリウムで乾燥した
のち、減圧濃縮した。次に、この濃縮物に一定量のエタ
ノールを加えて溶解し、高速液体クロマトグラフィー（
ＨＰＬＣ）分析に供した。分析条件は以下のとおり。

カラム：　ＣＡＰＣＥＬＬ　ＰＡＫ　Ｃ１８ＡＧ１２０
　　（■資生堂製）（φ４．６　Ｘ２５０　ｍ） 移動相：　　ＭｅＯＨ−ＨｚＯ（４０：６０）流速：　
　１　ｄ／ｗｉｎ 温度：２７°Ｃ 検　出：　　Ｕ￥　２７７ｎ＊ 培養１〜５日の変換率の推移（ＨＰＢの変換率で表示）
を図１に示す。

図にみられるように、培養１日間が最も変換率が高く４
９％であった。

この条件で変換を行い、その後の回収・精製によりロド
デンドロール８５ｇ（ＨＰＢ　　２００■を添加）を得
た。

によ　　　したロ゛−゛ン　ロールの 上記により得たロドデンドロールの比旋光度を測定した
。測定値は以下のとおりである。

［α］　！Ｓ＋１４．０＠（Ｃ＝１．０．エタノール）
（分献値＊［αコ”＋２０°（Ｃ・１．０．エタノール
））＊弁上ら、薬学雑誌、９８．４１　（１９７８）次
に、光学異性体分割用カラムを用いたＨＰＬＣ分析に供
し、（＋）一体、（−）一体の存在比を調べた０分析条
件は以下のとおりである。

カラム：　ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ　００　（ダイセル化学
工業■製）（φ４．６Ｘ２５０閣） 移動相：　　ｎ−ｈｅｘａｎｅ−２−ｐｒｏｐａｎｏｌ
（９：１）流速：　　ｌｄ／ｗｉｎ 温度：２０°Ｃ 検出：　　ＬＩＶ　２７７＋＋＋ｗ 測定結果を図２に示す。面積比から存在比は、（＋）一
体：（−）一体＝８７：１３であった。

以上より、カルスによる変換で（＋）一体の存在比の高
いロドデンドロールが得られた。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例に示した誘導カルスの培養液にロドデンド
ロールの前駆体を添加して培養した場合のロドデンドロ
ールへの変換率（％）の経時的推移を示したものである
。図２は変換により生成したロドデンドロールのＨＰＬ
Ｃによる分離状態を示したものである。 図１ Ｄ Ｏ ｚｏ　　　３．。 ４．０ Ｄ 時　　間（日）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）メグスリノキの生組織から誘導して得られたカル
   スを利用してロドデンドロールの前駆体をロドデンドロ
   ールに変換することを特徴とするロドデンドロールの生
   産方法。
2. （２）カルスを培養して増殖させたものの懸濁液にロド
   デンドロールの前駆体を添加し、培養することによりロ
   ドデンドロールの該前駆体をロドデンドロールに変換す
   る請求項（１）に記載のロドデンドロールの生産方法。