JPH0324629B2 - - Google Patents
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Description
ビリルビンはヒトの生体中で主にヘモグロビン
の非常に重要な分解生成物として産出される。ビ
リルビンは肝臓中では部分的にグルクロン酸と共
役する。グルクロン酸共役したビリルビンを“直
接型”ビリルビンと表わす。グルクロン酸と共役
しなかつたものを“間接型”ビリルビンと表わ
す。正常濃度は次の通りである： 直接型ビリルビン：0.25mg／100ml（血清）ま
で （∧＝4.3μモル／） 間接型ビリルビン：0.75mg／100ml（血清）ま
で （∧＝12.7μモル／） 健康な生体では、胆汁のビリルビンは胆液と共
に腸中に分泌される。この機構が種々の疾病で妨
害される。例えばヘモグロビン分解が増大する場
合グルクロニド化系の負担が大きく、直接型／間
接型ビリルビンの比が変化する。新合成でもグル
クロニド化容量は不完全で、同様に直接型／間接
型ビリルビンの比の移動が惹起される。肝細胞疾
患、胆細管中への流出の妨害又は輸胆管閉塞の場
合、胆汁を介するビリルビンの腸中への分泌が減
少するか又は完全に遮断される。これにより血中
ビリルビン濃度が上昇する。その際に、ビリルビ
ンの絶対濃度も直接型／間接型−ビリルビンの比
も影響を受けることがある。それ故、両方の数値
を測定することにより肝臓−胆汁−腸路の一定の
疾病の種類及び部位に関して重要な診断の決定を
することができる。従つて、両方のビリルビン画
分の測定は医学的診断において特に重要になつ
た。この際一般に、初めに全ビリルビンを測定す
る。その後で直接型ビリルビンの含量を測定す
る。間接型ビリルビンの割合は両方の数値の差か
ら明らかである。 最も頻繁に行なわれたビリルビン検出反応はビ
リルビンとジアゾニウム塩との結合に基く。ジエ
ドラシツク及びクレホルン〔Jendrassik及び
Cleghorn共著、“Biochem.Z.”、289巻、１頁
（1937年）〕によれば、直接型ビリルビンの測定の
ためには、水中のスルフアニル酸５ｇ、濃塩酸15
ml及び0.5％−亜硝酸ナトリウム溶液0.25mlから
成るジアゾ混合物0.5mlを血清に加える。この測
定方法では、反応を強酸性媒体中で実施しなけれ
ばならないということが特に欠点である。 全ビリルビンの測定に当つては、初めに試料に
カフエイン及び安息香酸ナトリウムを添加し、次
いでジアゾ化スルフアニル酸と結合させる。カフ
エインと安息香酸ナトリウムの添加は、間接型ビ
リルビンをアルブミンへのその結合から解放しか
つこれらを添加しないと起る蛋白質沈殿による妨
害を排除するという目的を有する。しかし、これ
らの添加物を用いてこの測定反応を直接型ビリル
ビンの測定のように強酸性媒体中で実施すること
はできず、中性もしくは弱酸性範囲で作業しなけ
ればならない。しかしこれらの反応条件は、試料
中の他の内容物質（例えばフエノール）で、多く
の場合試験を妨害する褐色の副生成物が生じると
いう欠点を有する。反応溶液自体も長時間安定で
はない。試料が存在しなくても酸性媒体中で無色
であるが、中性範囲では既に黄色でありかつアル
カリ性では赤色である物質が生じる。この妨害に
基いて起り得る誤差を小さくしておくために、
時々非常に複雑な工程が提案される。例えば、ジ
エドラシツク及びクレホルンにより２種の異なる
波長で作業するか、又は弱酸性乃至中性範囲でジ
アゾ化反応の終結後固有の試験バツチの測定前に
アルカリ性媒体に移す〔Jendrassik及びGrof共
著、“Biochem.Z.”、297巻、81〜89頁（1938
年）〕。 すべてこれらの測定法は実施においてやつかい
で非実用的である。その上、多数の工程の為常に
大きな正確さと誤差が伴なう。それ故、直接型ビ
リルビンと全ビリルビンの測定法を改良する実験
は常に行なわれた。 例えば、全ビリルビンの測定を強酸性媒体中に
移し変えることも実験された。このため、とりわ
け、強酸性媒体中で蛋白質結合を遮断することの
できる助剤をさがすことが必要であつた。例え
ば、バーテルズ及びベーマー〔Bartels及び
Boehmer共著、“Ｚ，Clin.Chem.Clin.
Biochem.”、７巻、444頁（1969年）〕により分散
剤が、及びウインステン及びシエリク〔Winsten
及びCehelyk共著、“Clin.Chem.Acta”、25巻、
441頁（1969年）〕によりジメチルスルホキシドが
間接型ビリルビンの溶解助剤として使用され、そ
れにより次いで直接型ビリルビンを測定するため
の測定と同じようにして全ビリルビンを強酸性媒
体中で実施することができる。 数多くの別形にもかかわらず、文献中に従来記
載された直接型ビリルビン及び全ビリルビンの試
験法は当業界をなお満足させるものではなく、例
えば種々の方法の結果の一致は不良である
〔Jacobs及びその他共著、“Clin.Chem.”、10巻、
433〜439頁（1964年）〕。 とりわけ、ある程度有用な鑑別を達成するため従
来公知の測定法をその中で実施しなければならな
い強酸性の腐食性媒体（前記文献引用中）は試験
を実際に実施するには有利ではない。 それ故、本発明の課題は、弱酸性乃至ほぼ中性
のPH範囲で実施することができ、簡単かつ容易に
実施することができかつ信頼できる数値を与える
直接型ビリルビン及び全ビリルビンの測定法を開
示することであつた。 ビリルビンとの結合に、一定の置換されたジア
ゾニウム塩、例えばジアゾ化２−アミノ−５−ク
ロル−トルエン（Fast Red TR）又はジアゾ化
２−メトキシ−５−クロル−アニリン（Fast
Red RC）を使用する場合に、直接型ビリルビン
及び全ビリルビンの測定が弱酸性乃至ほぼ中性の
範囲で可能であることが判明し驚異的であつた。 それ故、本発明の目的は、ビリルビンをジアゾ
ニウム塩と結合させかつそれにより生じた吸光度
変化を公知方法で測定することにより体液中の直
接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する方法
であり、これは結合を、試験溶液を3.5〜8.0のPH
値に調節する緩衝剤の存在において実施しかつカ
ツプリング成分として一般式： 〔式中 R1は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
アルコキシ基又はベンゾイルアミノ基を表わし、 R2は水素、低級アルキル基又は低級アルコキ
シ基を表わし、 R3は水素、ハロゲン、低級アルキル基又は低
級アルコキシ基を表わし、 その際R1とR3が同時にハロゲンを表わしては
ならず、かつ Ｘはジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形
成するアニオンを表わす〕のジアゾニウム塩を使
用することを特徴とする。 置換基R1，R2及びR3の定義における低級アル
キル基又は低級アルコキシ基としてはＣ原子１〜
５個、殊に１〜３個の基が挙げられる。メチル
基、エチル基、あるいはメトキシ基及びエトキシ
基が特に優れている。 ハロゲンでは弗素、塩素、臭素及び沃素が挙げ
られ、塩素及び臭素が特に優れている。 ジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形成す
るアニオンとしてはテトラフルオロボレート又は
テトラクロロチンケートが該当する。 本発明で使用されるジアゾニウム塩は公知の化
合物であるか又は公知化合物と同様に容易に製造
することができる。これらのジアゾニウム塩の一
部はビリルビンの測定に強酸性媒体中で使用され
ていた。しかし、ビリルビンと一般式のジアゾ
ニウム塩との間で弱酸性乃至ほぼ中性の媒体中で
も結合が行なわれことは当業者にとつて驚異的で
あつた。例えば、“ツアイトシユリフト・フユ
ア・クニリツシエ・ヒエミー・ウント・クリニツ
シエ・ビオヒエミ−（Z.Clin.Chem.Clin.
Biochem.）”〔９巻、273頁（1971年）〕には、本
発明で特に優れているジアゾニウム塩、ジアゾ化
２−アミノ−５−クロロトルエン（Fast Red
TR）がビリルビンとはPH5.2では反応しないと明
記されている。 本発明の他の目的は、直接型ビリルビン及び全
ビリルビンを測定する本発明方法を実施するため
の剤であり、これは測定に必要な成分のジアゾニ
ウム塩及び緩衝剤を溶液、粉末混合物、試薬錠
剤、凍結乾燥体又は成分を含浸させた吸収担体の
形で含有する。 全ビリルビン及び直接型ビリルビンの測定のた
め剤は付加的に溶解助剤を含有してよい。 直接型ビリルビンの測定には、PH範囲3.5〜
6.0、殊に4.3〜5.7で有効である緩衝剤を使用する
と有利である。全ビリルビンの測定にはPH範囲
5.5〜８、殊に６〜７で有効な緩衝剤を使用する
と有利である。 緩衝剤としては、前記のPH範囲で十分な緩衝能
を有するものを使用することができる。例えば直
接型ビリルビンの測定にはクエン酸／トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、クエン酸／
カセイソーダ、酢酸／カセイソーダ、フタル酸水
素カリウム／カセイソーダ又はリン酸塩緩衝剤の
ような緩衝系が特に有用であると明らかとなり、
最初に挙げた３種の緩衝系が特に優れている。全
ビリルビンの測定にはクエン酸／トリスー（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン、塩酸／トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタンが特に優れて
いる。塩酸／イミダゾール緩衝剤を使用すること
もできる。 全ビリルビン及び直接型ビリルビンを測定する
に当り、付加的に溶解助剤を添加することができ
る。この目的にはジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン又は種々のグリコールが特に好適であることが
明らかになつた。ジメチルホルムアミドが特に優
れている。直接型ビリルビンの測定には、非イオ
ン型清浄剤、殊にトリトン（Triton）×100
（Rohm＆Haas社、フイラデルフイア在）を添加
することができ、その際トリトン×100の濃度は
約0.1〜1.0％である。非イオン型清浄剤の他の例
はトウイーン（Tween）21又は40（製造者ICI）、
タージトール（Tergitol）15−Ｓ−12（Union
Carbide Corp.）、BRIJ 78（ICI）である。 直接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する
ため、測定すべき試料をジアゾニウム塩、緩衝剤
及び場合により溶解助剤と接触させる。添加され
る物質は溶液、粉末混合物、試薬錠剤、凍結乾燥
体として又はそれを含浸させた吸収性担体の形で
存在してよい。種々の形状を組合せることができ
る。例えば、緩衝剤を好適な溶剤中の溶液とし
て、ジアゾニウム塩を錠剤の形で使用することが
できる。 試験バツチ中の測定すべきビリルビンの濃度は
0.5〜25μモル／であるべきである。場合により
出発試料を相応して稀釈すべきである。 ジアゾニウム塩、緩衝剤及び場合により溶解助
剤の使用量は、最終試験溶液中で次の濃度が達成
されるように選択する： ジアゾニウム塩：0.5〜30モリモル／、殊に
５〜15ミリモル／ 緩衝剤：0.02〜1.0モル／、殊に0.05〜0.3モ
ル／ 場合により添加する溶解助剤：全ビリルビン測
定では0.1〜４モル／、殊に１〜３モル／及
び直接型ビリルビンでは0.01〜0.1モル／ 本発明による直接型ビリルビン及び全ビリルビ
ンの測定法の重要な利点は、その都度の反応条件
が試験溶液のPH値の僅かな差によつて異なるとい
うことである。従つて、両方の測定をほぼ同一の
試薬を用いて相互に実施することができる。直接
型ビリルビン及び全ビリルビンの測定には同じジ
アゾニウム塩を使用すると有利である。必要なPH
値の差はPH値を決める緩衝物質の組成を若干変動
することにより達成される。 実際には、直接型ビリルビンと全ビリルビンを
測定するため、同じジアゾニウム塩を含有する
が、緩衝剤成分の組成は異なるそれぞれ別個の試
薬組成物を調製するように行なうことができる。
両方の測定のために、ジアゾニウム塩と、それぞ
れの測定パラメータのためのPH値を調節するため
の緩衝剤を含有する共通の試薬組合せ物を調製す
ることもできる。他方のパラメータを測定するた
めのPH値は更に好適な緩衝物質の添加により調節
する。 溶液の形の、直接型ビリルビン又は全ビリルビ
ンを測定する本発明による製剤は試験に必要な全
試薬を含有する。溶剤としては、水又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、ア
セトン又はジメチルホルムアミドとの混合物が該
当する。安定性の理由から、試験に必要な試薬を
溶液２つ以上に分け、それを測定に際して初めて
一緒にするのは有利であり得る。 粉末混合物又は試薬錠剤の形の本発明による製
剤は、必要な試験成分に常用のガーレン式添加物
を加えかつ造粒して製造することができる。例え
ば、この種の添加物はモノー、オリゴ−又はポリ
サツカリドのような炭水化物、マンニツト、ソル
ビツト又はキシリツトのような糖アルコール、あ
るいはポリエチレングリコール又はポリビニルピ
ロリドンのような他の可溶性不活性化合物であ
る。一般に、試薬錠剤は最終重量約20〜200mg、
殊に50〜80mgを有する。 凍結乾燥体の製造に際し、測定に必要な全試薬
と共に常用の骨格ビルダー、例えばポリビニルピ
ロリドン、及び場合により他の充填剤、例えばマ
ンニツト、ソルビツト又はキシリツトを含有する
溶液を凍結乾燥させる。 ビリルビンを測定するため、吸収性担体に吸着
させた形の本発明による製剤を製造するに当り、
吸収性担体、殊に濾紙、セルロース又は合成繊維
フリースに例えば水、メタノール、エタノール又
はアセトンのような易揮発性溶剤中の必要な試験
成分の溶液を含浸させる。調製試験紙をそのまま
で使用することができあるいは公知方法で握りに
接着するかまたは有利に西ドイツ国特許第
2118455号明細書によりプラスチツクと細メツシ
ユ網材との間に封入することができる。 ビリルビンの測定に必要な単一試薬を試験片上
に施すこともできる。この場合には、試薬成分を
含有する試験区域上にビリルビン含有試料、例え
ば血清を滴加しかつ惹起される色の変化に基いて
公知方法で試料のビリルビン含量を測定する。 次に、本発明を実施例につき詳説する。 例 １ (1) 溶液 緩衝溶液：トリス−（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン167ミリモル及びクエン酸83ミリモ
ルを蒸留水に溶解して全量１とする。この溶
液はPH5.0を有する。 反応溶液１：前記の緩衝溶液10ml中にフアス
トレツドTR（ジアゾ化された２−アミノ−５
−クロル−トルエン×1/2ZnCl2）20mgを溶解
する。この溶液は室温で少なくとも24時間安定
である。 溶液２（全ビリルビン測定用の添加試薬）：ト
リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.9
モルを蒸留水で溶解して全量１とする。 (2) 試験の実施 マイクロキユベツト（層厚１cm）中に異なる
試薬溶液を次のようにピペツト装入する：
の非常に重要な分解生成物として産出される。ビ
リルビンは肝臓中では部分的にグルクロン酸と共
役する。グルクロン酸共役したビリルビンを“直
接型”ビリルビンと表わす。グルクロン酸と共役
しなかつたものを“間接型”ビリルビンと表わ
す。正常濃度は次の通りである： 直接型ビリルビン：0.25mg／100ml（血清）ま
で （∧＝4.3μモル／） 間接型ビリルビン：0.75mg／100ml（血清）ま
で （∧＝12.7μモル／） 健康な生体では、胆汁のビリルビンは胆液と共
に腸中に分泌される。この機構が種々の疾病で妨
害される。例えばヘモグロビン分解が増大する場
合グルクロニド化系の負担が大きく、直接型／間
接型ビリルビンの比が変化する。新合成でもグル
クロニド化容量は不完全で、同様に直接型／間接
型ビリルビンの比の移動が惹起される。肝細胞疾
患、胆細管中への流出の妨害又は輸胆管閉塞の場
合、胆汁を介するビリルビンの腸中への分泌が減
少するか又は完全に遮断される。これにより血中
ビリルビン濃度が上昇する。その際に、ビリルビ
ンの絶対濃度も直接型／間接型−ビリルビンの比
も影響を受けることがある。それ故、両方の数値
を測定することにより肝臓−胆汁−腸路の一定の
疾病の種類及び部位に関して重要な診断の決定を
することができる。従つて、両方のビリルビン画
分の測定は医学的診断において特に重要になつ
た。この際一般に、初めに全ビリルビンを測定す
る。その後で直接型ビリルビンの含量を測定す
る。間接型ビリルビンの割合は両方の数値の差か
ら明らかである。 最も頻繁に行なわれたビリルビン検出反応はビ
リルビンとジアゾニウム塩との結合に基く。ジエ
ドラシツク及びクレホルン〔Jendrassik及び
Cleghorn共著、“Biochem.Z.”、289巻、１頁
（1937年）〕によれば、直接型ビリルビンの測定の
ためには、水中のスルフアニル酸５ｇ、濃塩酸15
ml及び0.5％−亜硝酸ナトリウム溶液0.25mlから
成るジアゾ混合物0.5mlを血清に加える。この測
定方法では、反応を強酸性媒体中で実施しなけれ
ばならないということが特に欠点である。 全ビリルビンの測定に当つては、初めに試料に
カフエイン及び安息香酸ナトリウムを添加し、次
いでジアゾ化スルフアニル酸と結合させる。カフ
エインと安息香酸ナトリウムの添加は、間接型ビ
リルビンをアルブミンへのその結合から解放しか
つこれらを添加しないと起る蛋白質沈殿による妨
害を排除するという目的を有する。しかし、これ
らの添加物を用いてこの測定反応を直接型ビリル
ビンの測定のように強酸性媒体中で実施すること
はできず、中性もしくは弱酸性範囲で作業しなけ
ればならない。しかしこれらの反応条件は、試料
中の他の内容物質（例えばフエノール）で、多く
の場合試験を妨害する褐色の副生成物が生じると
いう欠点を有する。反応溶液自体も長時間安定で
はない。試料が存在しなくても酸性媒体中で無色
であるが、中性範囲では既に黄色でありかつアル
カリ性では赤色である物質が生じる。この妨害に
基いて起り得る誤差を小さくしておくために、
時々非常に複雑な工程が提案される。例えば、ジ
エドラシツク及びクレホルンにより２種の異なる
波長で作業するか、又は弱酸性乃至中性範囲でジ
アゾ化反応の終結後固有の試験バツチの測定前に
アルカリ性媒体に移す〔Jendrassik及びGrof共
著、“Biochem.Z.”、297巻、81〜89頁（1938
年）〕。 すべてこれらの測定法は実施においてやつかい
で非実用的である。その上、多数の工程の為常に
大きな正確さと誤差が伴なう。それ故、直接型ビ
リルビンと全ビリルビンの測定法を改良する実験
は常に行なわれた。 例えば、全ビリルビンの測定を強酸性媒体中に
移し変えることも実験された。このため、とりわ
け、強酸性媒体中で蛋白質結合を遮断することの
できる助剤をさがすことが必要であつた。例え
ば、バーテルズ及びベーマー〔Bartels及び
Boehmer共著、“Ｚ，Clin.Chem.Clin.
Biochem.”、７巻、444頁（1969年）〕により分散
剤が、及びウインステン及びシエリク〔Winsten
及びCehelyk共著、“Clin.Chem.Acta”、25巻、
441頁（1969年）〕によりジメチルスルホキシドが
間接型ビリルビンの溶解助剤として使用され、そ
れにより次いで直接型ビリルビンを測定するため
の測定と同じようにして全ビリルビンを強酸性媒
体中で実施することができる。 数多くの別形にもかかわらず、文献中に従来記
載された直接型ビリルビン及び全ビリルビンの試
験法は当業界をなお満足させるものではなく、例
えば種々の方法の結果の一致は不良である
〔Jacobs及びその他共著、“Clin.Chem.”、10巻、
433〜439頁（1964年）〕。 とりわけ、ある程度有用な鑑別を達成するため従
来公知の測定法をその中で実施しなければならな
い強酸性の腐食性媒体（前記文献引用中）は試験
を実際に実施するには有利ではない。 それ故、本発明の課題は、弱酸性乃至ほぼ中性
のPH範囲で実施することができ、簡単かつ容易に
実施することができかつ信頼できる数値を与える
直接型ビリルビン及び全ビリルビンの測定法を開
示することであつた。 ビリルビンとの結合に、一定の置換されたジア
ゾニウム塩、例えばジアゾ化２−アミノ−５−ク
ロル−トルエン（Fast Red TR）又はジアゾ化
２−メトキシ−５−クロル−アニリン（Fast
Red RC）を使用する場合に、直接型ビリルビン
及び全ビリルビンの測定が弱酸性乃至ほぼ中性の
範囲で可能であることが判明し驚異的であつた。 それ故、本発明の目的は、ビリルビンをジアゾ
ニウム塩と結合させかつそれにより生じた吸光度
変化を公知方法で測定することにより体液中の直
接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する方法
であり、これは結合を、試験溶液を3.5〜8.0のPH
値に調節する緩衝剤の存在において実施しかつカ
ツプリング成分として一般式： 〔式中 R1は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
アルコキシ基又はベンゾイルアミノ基を表わし、 R2は水素、低級アルキル基又は低級アルコキ
シ基を表わし、 R3は水素、ハロゲン、低級アルキル基又は低
級アルコキシ基を表わし、 その際R1とR3が同時にハロゲンを表わしては
ならず、かつ Ｘはジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形
成するアニオンを表わす〕のジアゾニウム塩を使
用することを特徴とする。 置換基R1，R2及びR3の定義における低級アル
キル基又は低級アルコキシ基としてはＣ原子１〜
５個、殊に１〜３個の基が挙げられる。メチル
基、エチル基、あるいはメトキシ基及びエトキシ
基が特に優れている。 ハロゲンでは弗素、塩素、臭素及び沃素が挙げ
られ、塩素及び臭素が特に優れている。 ジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形成す
るアニオンとしてはテトラフルオロボレート又は
テトラクロロチンケートが該当する。 本発明で使用されるジアゾニウム塩は公知の化
合物であるか又は公知化合物と同様に容易に製造
することができる。これらのジアゾニウム塩の一
部はビリルビンの測定に強酸性媒体中で使用され
ていた。しかし、ビリルビンと一般式のジアゾ
ニウム塩との間で弱酸性乃至ほぼ中性の媒体中で
も結合が行なわれことは当業者にとつて驚異的で
あつた。例えば、“ツアイトシユリフト・フユ
ア・クニリツシエ・ヒエミー・ウント・クリニツ
シエ・ビオヒエミ−（Z.Clin.Chem.Clin.
Biochem.）”〔９巻、273頁（1971年）〕には、本
発明で特に優れているジアゾニウム塩、ジアゾ化
２−アミノ−５−クロロトルエン（Fast Red
TR）がビリルビンとはPH5.2では反応しないと明
記されている。 本発明の他の目的は、直接型ビリルビン及び全
ビリルビンを測定する本発明方法を実施するため
の剤であり、これは測定に必要な成分のジアゾニ
ウム塩及び緩衝剤を溶液、粉末混合物、試薬錠
剤、凍結乾燥体又は成分を含浸させた吸収担体の
形で含有する。 全ビリルビン及び直接型ビリルビンの測定のた
め剤は付加的に溶解助剤を含有してよい。 直接型ビリルビンの測定には、PH範囲3.5〜
6.0、殊に4.3〜5.7で有効である緩衝剤を使用する
と有利である。全ビリルビンの測定にはPH範囲
5.5〜８、殊に６〜７で有効な緩衝剤を使用する
と有利である。 緩衝剤としては、前記のPH範囲で十分な緩衝能
を有するものを使用することができる。例えば直
接型ビリルビンの測定にはクエン酸／トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、クエン酸／
カセイソーダ、酢酸／カセイソーダ、フタル酸水
素カリウム／カセイソーダ又はリン酸塩緩衝剤の
ような緩衝系が特に有用であると明らかとなり、
最初に挙げた３種の緩衝系が特に優れている。全
ビリルビンの測定にはクエン酸／トリスー（ヒド
ロキシメチル）−アミノメタン、塩酸／トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタンが特に優れて
いる。塩酸／イミダゾール緩衝剤を使用すること
もできる。 全ビリルビン及び直接型ビリルビンを測定する
に当り、付加的に溶解助剤を添加することができ
る。この目的にはジメチルホルムアミド、ジメチ
ルスルホキシド、テトラヒドロフラン、ジオキサ
ン又は種々のグリコールが特に好適であることが
明らかになつた。ジメチルホルムアミドが特に優
れている。直接型ビリルビンの測定には、非イオ
ン型清浄剤、殊にトリトン（Triton）×100
（Rohm＆Haas社、フイラデルフイア在）を添加
することができ、その際トリトン×100の濃度は
約0.1〜1.0％である。非イオン型清浄剤の他の例
はトウイーン（Tween）21又は40（製造者ICI）、
タージトール（Tergitol）15−Ｓ−12（Union
Carbide Corp.）、BRIJ 78（ICI）である。 直接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する
ため、測定すべき試料をジアゾニウム塩、緩衝剤
及び場合により溶解助剤と接触させる。添加され
る物質は溶液、粉末混合物、試薬錠剤、凍結乾燥
体として又はそれを含浸させた吸収性担体の形で
存在してよい。種々の形状を組合せることができ
る。例えば、緩衝剤を好適な溶剤中の溶液とし
て、ジアゾニウム塩を錠剤の形で使用することが
できる。 試験バツチ中の測定すべきビリルビンの濃度は
0.5〜25μモル／であるべきである。場合により
出発試料を相応して稀釈すべきである。 ジアゾニウム塩、緩衝剤及び場合により溶解助
剤の使用量は、最終試験溶液中で次の濃度が達成
されるように選択する： ジアゾニウム塩：0.5〜30モリモル／、殊に
５〜15ミリモル／ 緩衝剤：0.02〜1.0モル／、殊に0.05〜0.3モ
ル／ 場合により添加する溶解助剤：全ビリルビン測
定では0.1〜４モル／、殊に１〜３モル／及
び直接型ビリルビンでは0.01〜0.1モル／ 本発明による直接型ビリルビン及び全ビリルビ
ンの測定法の重要な利点は、その都度の反応条件
が試験溶液のPH値の僅かな差によつて異なるとい
うことである。従つて、両方の測定をほぼ同一の
試薬を用いて相互に実施することができる。直接
型ビリルビン及び全ビリルビンの測定には同じジ
アゾニウム塩を使用すると有利である。必要なPH
値の差はPH値を決める緩衝物質の組成を若干変動
することにより達成される。 実際には、直接型ビリルビンと全ビリルビンを
測定するため、同じジアゾニウム塩を含有する
が、緩衝剤成分の組成は異なるそれぞれ別個の試
薬組成物を調製するように行なうことができる。
両方の測定のために、ジアゾニウム塩と、それぞ
れの測定パラメータのためのPH値を調節するため
の緩衝剤を含有する共通の試薬組合せ物を調製す
ることもできる。他方のパラメータを測定するた
めのPH値は更に好適な緩衝物質の添加により調節
する。 溶液の形の、直接型ビリルビン又は全ビリルビ
ンを測定する本発明による製剤は試験に必要な全
試薬を含有する。溶剤としては、水又は水と水溶
性有機溶剤、例えばメタノール、エタノール、ア
セトン又はジメチルホルムアミドとの混合物が該
当する。安定性の理由から、試験に必要な試薬を
溶液２つ以上に分け、それを測定に際して初めて
一緒にするのは有利であり得る。 粉末混合物又は試薬錠剤の形の本発明による製
剤は、必要な試験成分に常用のガーレン式添加物
を加えかつ造粒して製造することができる。例え
ば、この種の添加物はモノー、オリゴ−又はポリ
サツカリドのような炭水化物、マンニツト、ソル
ビツト又はキシリツトのような糖アルコール、あ
るいはポリエチレングリコール又はポリビニルピ
ロリドンのような他の可溶性不活性化合物であ
る。一般に、試薬錠剤は最終重量約20〜200mg、
殊に50〜80mgを有する。 凍結乾燥体の製造に際し、測定に必要な全試薬
と共に常用の骨格ビルダー、例えばポリビニルピ
ロリドン、及び場合により他の充填剤、例えばマ
ンニツト、ソルビツト又はキシリツトを含有する
溶液を凍結乾燥させる。 ビリルビンを測定するため、吸収性担体に吸着
させた形の本発明による製剤を製造するに当り、
吸収性担体、殊に濾紙、セルロース又は合成繊維
フリースに例えば水、メタノール、エタノール又
はアセトンのような易揮発性溶剤中の必要な試験
成分の溶液を含浸させる。調製試験紙をそのまま
で使用することができあるいは公知方法で握りに
接着するかまたは有利に西ドイツ国特許第
2118455号明細書によりプラスチツクと細メツシ
ユ網材との間に封入することができる。 ビリルビンの測定に必要な単一試薬を試験片上
に施すこともできる。この場合には、試薬成分を
含有する試験区域上にビリルビン含有試料、例え
ば血清を滴加しかつ惹起される色の変化に基いて
公知方法で試料のビリルビン含量を測定する。 次に、本発明を実施例につき詳説する。 例 １ (1) 溶液 緩衝溶液：トリス−（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン167ミリモル及びクエン酸83ミリモ
ルを蒸留水に溶解して全量１とする。この溶
液はPH5.0を有する。 反応溶液１：前記の緩衝溶液10ml中にフアス
トレツドTR（ジアゾ化された２−アミノ−５
−クロル−トルエン×1/2ZnCl2）20mgを溶解
する。この溶液は室温で少なくとも24時間安定
である。 溶液２（全ビリルビン測定用の添加試薬）：ト
リス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.9
モルを蒸留水で溶解して全量１とする。 (2) 試験の実施 マイクロキユベツト（層厚１cm）中に異なる
試薬溶液を次のようにピペツト装入する：
【表】
各試験別に関して試薬盲検値を測定する。こ
の数値は、血清を同量の水に代えて前記の“測
定値”に記載されているのと同様に行なうこと
により得られる。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差は次のようにし
て計算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)A-試薬盲検値 ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)B-試薬盲検値 得られた吸光度差から試料のビリルビン含量
は次のように計算する： ΔEA×0.93＝直接型ビリルビン ミリモル／
ΔEB×0.93＝全ビリルビン ミリモル／ 例 ２ (1) 溶液 緩衝溶液Ａ（直接型ビリルビン用）：水中のク
エン酸0.13モルの溶液にトリス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン0.35モルを加えかつ水
を装入して全量１とする。この溶液はPH5.7
を有する。 緩衝溶液Ｂ（全ビリルビン用）：水中のトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.2モル
の溶液を塩酸でPH7.0にする。ジメチルホルム
アミド50mlを加えかつ蒸留水を装入して全量１
とする。 試薬溶液ＡないしＢ：緩衝液ＡないしＢそれ
ぞれ10mlにフアストバイオレツトＢ（ジアゾ化
６−ベンゾイルアミノ−４−メトキシ−３−ア
ミノ−トルエン×1/2ZnCl2）40mgを溶解する。 (2) 試験の実施 キユベツト（層厚１cm）中に下記の溶液をピ
ペツト装入する：
の数値は、血清を同量の水に代えて前記の“測
定値”に記載されているのと同様に行なうこと
により得られる。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差は次のようにし
て計算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)A-試薬盲検値 ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)B-試薬盲検値 得られた吸光度差から試料のビリルビン含量
は次のように計算する： ΔEA×0.93＝直接型ビリルビン ミリモル／
ΔEB×0.93＝全ビリルビン ミリモル／ 例 ２ (1) 溶液 緩衝溶液Ａ（直接型ビリルビン用）：水中のク
エン酸0.13モルの溶液にトリス−（ヒドロキシ
メチル）−アミノメタン0.35モルを加えかつ水
を装入して全量１とする。この溶液はPH5.7
を有する。 緩衝溶液Ｂ（全ビリルビン用）：水中のトリス
−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.2モル
の溶液を塩酸でPH7.0にする。ジメチルホルム
アミド50mlを加えかつ蒸留水を装入して全量１
とする。 試薬溶液ＡないしＢ：緩衝液ＡないしＢそれ
ぞれ10mlにフアストバイオレツトＢ（ジアゾ化
６−ベンゾイルアミノ−４−メトキシ−３−ア
ミノ−トルエン×1/2ZnCl2）40mgを溶解する。 (2) 試験の実施 キユベツト（層厚１cm）中に下記の溶液をピ
ペツト装入する：
【表】
各試験別に関して試薬盲検値を測定する。こ
の数値は、血清を同量の緩衝液ＡないしはＢに
代えて前記の“測定値”に記載したのと同様に
して得られる。 試薬溶液の代りに相当量の緩衝溶液を使用す
る例１に相応する盲検値キユベツトは明らかに
混濁しているないしは溶血血清の場合にのみ必
要である。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差を次のように計
算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-試薬
盲検値 ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-試薬
盲検値 得られた吸光度差から試料中のビリルビン含
量は次のように計算する： ΔEA×0.49＝直接型ビリルビンミリモル／ ΔEB×0.49＝全ビリルビンミリモル／ 場合により、ビリルビン測定を、開始して１
分後と５分後の間の吸光度差を読み取ることに
より行なうこともできる（動力学的測定）。 試料中のビリルビン含量は、一定の知られて
いるビリルビン含量の種々の血清試料を測定す
ることにより検量線を作成する方法でも測定す
ることができ、この検量線から、未知のビリル
ビン含量の試料の測定で得られたそれぞれの吸
光度差に関して相応するビリルビン濃度を読み
とることができる。 緩衝液Ａの代りにトリトン×100を添加した
クエン酸塩緩衝液を使用する場合に、直接型ビ
リルビンに関して前記のような同じ数値が得ら
れる。 例 ３ (1) 溶液 緩衝溶液：トリス−（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン73ミリモル及びクエン酸49ミリモル
を蒸留水で溶解しかつ全量１にする。この溶
液はPH4.3を有する。 反応溶液１：この緩衝液10ml中にフアストレ
ツドRC（ジアゾ化２−メトキシ−５−クロルア
ニリン×1/2ZnCl2）20mgを溶解する。この溶
液は室温で少なくとも24時間安定である。 溶液２（全ビリルビン用添加試薬）：トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）0.75モル
を蒸留水を加えて１とする。 (2) 試験の実施 マイクロキユベツト（層厚１cm）中に室温で
次の溶液を記載のようにピペツト装入する：
の数値は、血清を同量の緩衝液ＡないしはＢに
代えて前記の“測定値”に記載したのと同様に
して得られる。 試薬溶液の代りに相当量の緩衝溶液を使用す
る例１に相応する盲検値キユベツトは明らかに
混濁しているないしは溶血血清の場合にのみ必
要である。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差を次のように計
算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-試薬
盲検値 ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-試薬
盲検値 得られた吸光度差から試料中のビリルビン含
量は次のように計算する： ΔEA×0.49＝直接型ビリルビンミリモル／ ΔEB×0.49＝全ビリルビンミリモル／ 場合により、ビリルビン測定を、開始して１
分後と５分後の間の吸光度差を読み取ることに
より行なうこともできる（動力学的測定）。 試料中のビリルビン含量は、一定の知られて
いるビリルビン含量の種々の血清試料を測定す
ることにより検量線を作成する方法でも測定す
ることができ、この検量線から、未知のビリル
ビン含量の試料の測定で得られたそれぞれの吸
光度差に関して相応するビリルビン濃度を読み
とることができる。 緩衝液Ａの代りにトリトン×100を添加した
クエン酸塩緩衝液を使用する場合に、直接型ビ
リルビンに関して前記のような同じ数値が得ら
れる。 例 ３ (1) 溶液 緩衝溶液：トリス−（ヒドロキシメチル）−ア
ミノメタン73ミリモル及びクエン酸49ミリモル
を蒸留水で溶解しかつ全量１にする。この溶
液はPH4.3を有する。 反応溶液１：この緩衝液10ml中にフアストレ
ツドRC（ジアゾ化２−メトキシ−５−クロルア
ニリン×1/2ZnCl2）20mgを溶解する。この溶
液は室温で少なくとも24時間安定である。 溶液２（全ビリルビン用添加試薬）：トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン）0.75モル
を蒸留水を加えて１とする。 (2) 試験の実施 マイクロキユベツト（層厚１cm）中に室温で
次の溶液を記載のようにピペツト装入する：
【表】
それぞれの試験別に関して、試薬盲検値を測
定する。これは、前記の“測定値”に記載され
ているように行なうが、血清の代りに同量の水
を使用する。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差を次のように計
算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)A-試薬キユベツト ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)B-試薬盲検値 得られた吸光度差から試料のビリルビン含量
を計算することができる： ΔEA×0.83＝直接型ビリルビン ミリモル／
ΔEB×0.83＝全ビリルビン ミリモル／ 前記の反応溶液１中でフアストレツドRC20
mgをフアストブルーBB（ジアゾ化された２、
５−ジエトキシ−４−ベンゾイルアミノ−アニ
リン×1/2ZnCl2）40mg又はフアストブルーRR
（ジアゾ化された２、５−ジエトキシ−４−ベ
ンゾイルアミノ−アニリン×1/2ZnCl2）40mg
に代える場合に比較可能な結果が得られる。 例 ４ (A) 蒸留水１中にクエン酸0.13モル、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.35モル及
びフアストバイオレツトB4.0ｇを含有する溶
液、 (B) 蒸留水１中にトリス−（ヒドロキシメチル）
−アミノメタン0.2モル、５％−トリトン×100
及びフアストバイオレツトB4.0ｇを含有しか
つ塩酸でPH7.0に調節された溶液を用いて濾紙
（例えばBinzer社のVS532）を含浸しかつ30℃
で乾燥する。 直接型ビリルビンの測定には試験片Ａ上に及び
全ビリルビンの測定には試験片Ｂ上にそれぞれ血
清１滴を与える。約５〜10分後に、帯褐色−紫色
への色の変化が見られる。この色変化から既知ビ
リルビン含量の血清試料を用いて確定したカラー
スケールと比較することにより試料のビリルビン
含量を確定する。色変化は反射光度計を用いて
578nmで吸光度変化を測定することにより確定す
ることもできる。 前記のフアストバイオレツトＢの代りにフアス
トレツドTR、フアストレツドRC、フアストブ
ルーBB又はフアストブルーRRを含有する溶液
で濾紙を含浸する際に同じ結果が得られる。
定する。これは、前記の“測定値”に記載され
ているように行なうが、血清の代りに同量の水
を使用する。 (3) 評価 測定した吸光度から吸光度差を次のように計
算する： ΔEA＝(E2-E1)A-測定キユベツト−(E2-E1)A-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)A-試薬キユベツト ΔEB＝(E2-E1)B-測定キユベツト−(E2-E1)B-盲検値キ
ユベツト−(E2-E1)B-試薬盲検値 得られた吸光度差から試料のビリルビン含量
を計算することができる： ΔEA×0.83＝直接型ビリルビン ミリモル／
ΔEB×0.83＝全ビリルビン ミリモル／ 前記の反応溶液１中でフアストレツドRC20
mgをフアストブルーBB（ジアゾ化された２、
５−ジエトキシ−４−ベンゾイルアミノ−アニ
リン×1/2ZnCl2）40mg又はフアストブルーRR
（ジアゾ化された２、５−ジエトキシ−４−ベ
ンゾイルアミノ−アニリン×1/2ZnCl2）40mg
に代える場合に比較可能な結果が得られる。 例 ４ (A) 蒸留水１中にクエン酸0.13モル、トリス−
（ヒドロキシメチル）−アミノメタン0.35モル及
びフアストバイオレツトB4.0ｇを含有する溶
液、 (B) 蒸留水１中にトリス−（ヒドロキシメチル）
−アミノメタン0.2モル、５％−トリトン×100
及びフアストバイオレツトB4.0ｇを含有しか
つ塩酸でPH7.0に調節された溶液を用いて濾紙
（例えばBinzer社のVS532）を含浸しかつ30℃
で乾燥する。 直接型ビリルビンの測定には試験片Ａ上に及び
全ビリルビンの測定には試験片Ｂ上にそれぞれ血
清１滴を与える。約５〜10分後に、帯褐色−紫色
への色の変化が見られる。この色変化から既知ビ
リルビン含量の血清試料を用いて確定したカラー
スケールと比較することにより試料のビリルビン
含量を確定する。色変化は反射光度計を用いて
578nmで吸光度変化を測定することにより確定す
ることもできる。 前記のフアストバイオレツトＢの代りにフアス
トレツドTR、フアストレツドRC、フアストブ
ルーBB又はフアストブルーRRを含有する溶液
で濾紙を含浸する際に同じ結果が得られる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ビリルビンをジアゾニウム塩と結合させかつ
それにより生じた吸光度変化を公知方法により測
定することにより体液中の直接型ビリルビン及び
全ビリルビンを測定する方法において、結合を、
試験溶液を3.5〜8.0のPH値に調節する緩衝剤の存
在において実施しかつカツプリング成分として一
般式： ［式中 R1は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
アルコキシ基又はベンゾイルアミノ基を表わし、 R2は水素、低級アルキル基又は低級アルコキ
シ基を表わし、 R3は水素、ハロゲン、低級アルキル基又は低
級アルコキシ基を表わし、 その際R1とR3が同時にハロゲンを表わしては
ならず、かつ Ｘはジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形
成するアニオンを表わす］のジアゾニウム塩を使
用することを特徴とする直接型ビリルビン及び全
ビリルビンを測定する方法。 ２ ジアゾニウム塩を濃度0.5〜30ミリモル／
（試験溶液）及び緩衝剤を濃度0.02〜１モル／
（試験溶液）で使用する特許請求の範囲第１項記
載の方法。 ３ ジアゾニウム塩を濃度５〜15ミリモル／
（試験溶液）及び緩衝剤を濃度0.05〜0.3モル／
（試験溶液）で使用する特許請求の範囲第２項記
載の方法。 ４ 直接型ビリルビンを測定するに当たり試験溶
液はPH範囲3.5〜6.0を有する特許請求の範囲第１
項から第３項までのいずれか１項に記載の方法。 ５ 全ビリルビンを測定するに当たり試験溶液は
PH範囲3.5〜８を有する特許請求の範囲第１項か
ら第３項までのいずれか１項に記載の方法。 ６ 付加的に溶解助剤を使用する特許請求の範囲
第１項から第５項までのいずれか１項に記載の方
法。 ７ 溶解助剤としてジメチルホルムアミドを使用
する特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ 試験溶液中の溶解助剤の濃度は全ビリルビン
の測定では0.1〜４モル／及び直接型ビリルビ
ンの測定では0.01〜0.1モル／である特許請求
の範囲第６項又は第７項記載の方法。 ９ 3.5〜8.0のPH範囲で有効な緩衝剤系及び一般
式： ［式中 R1は水素、ハロゲン、低級アルキル基、低級
アルコキシ基又はベンゾイルアミノ基を表わし、 R2は水素、低級アルキル基又は低級アルコキ
シ基を表わし、 R3は水素、ハロゲン、低級アルキル基又は低
級アルコキシ基を表わし、 その際R1とR3が同時にハロゲンを表わしては
ならず、かつ Ｘはジアゾニウムカチオンと貯蔵安定な塩を形
成するアニオンを表わす］のジアゾニウム塩を含
有する体液中の直接型ビリルビン及び全ビリルビ
ンを測定する試薬。 １０ 溶液、粉末混合物、試薬錠剤、凍結乾燥体
として又は成分を含浸させた吸収性担体として存
在する特許請求の範囲第９項記載の試薬。 １１ ジアゾニウム塩及び緩衝剤が、直接型ビリ
ルビン及び全ビリルビンを測定する試験溶液中で
ジアゾニウム塩最終濃度0.5〜30ミリモル／及
び緩衝剤最終濃度0.02〜１モル／が得られる濃
度で存在する特許請求の範囲第９項又は第１０項
記載の試薬。 １２ 最終濃度は試験溶液１当たりジアゾニウ
ム塩５〜15ミリモル及び緩衝剤0.05〜0.3モルで
ある特許請求の範囲第１１項記載の試薬。 １３ 付加的に、溶解助剤を含有する特許請求の
範囲第９項から第１２項までのいずれか１項に記
載の試薬。 １４ 溶解助剤としてジメチルホルムアミドを含
有する特許請求の範囲第１３項記載の試薬。 １５ 溶解助剤が、全ビリルビンを測定する試験
溶液中で最終濃度0.1〜４モル／及び直接型ビ
リルビンの測定では0.01〜0.1モル／が達成さ
れる濃度で存在する特許請求の範囲第１３項又は
第１４項記載の試薬。
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|---|---|---|---|
| DE3225331.1 | 1982-07-07 | ||
| DE19823225331 DE3225331A1 (de) | 1982-07-07 | 1982-07-07 | Verfahren zur bestimmung von direktem und gesamt-bilirubin sowie hierfuer geeignetes reagens |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5923253A JPS5923253A (ja) | 1984-02-06 |
| JPH0324629B2 true JPH0324629B2 (ja) | 1991-04-03 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58122448A Granted JPS5923253A (ja) | 1982-07-07 | 1983-07-07 | 直接型ビリルビン及び全ビリルビンを測定する方法及び試薬 |
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| JP (1) | JPS5923253A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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