JPS6322263B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は総ビリルビンまたは直接ビリルビン測
実用試薬に関するものである。 体液中のビリルビンには間接型と直接型があ
り、間接ビリルビンは非抱合型ビリルビン（遊離
ビリルビン）であり、直接ビリルビンは抱合型ビ
リルビンであつて、前記遊離ビリルビンの側鎖の
プロピオン酸がグルクロン酸とエステル結合した
グルクロナイド（モノグルクロナイド、ジグルク
ロナイド等）である。総ビリルビンは直接ビリル
ビンと間接ビリルビンの総称である。 体液中の各種のビリルビンの病態時に臨床検査
として測定されるものは血中ビリルビン濃度とそ
の分画（直接型ビリルビンと間接型ビリルビン）、
尿中ビリルビンおよびウロビリン体、糞別中のウ
ロビリン体などが主であつて、このうち血中ビリ
ルビンの動態は最も重要で、各種黄疸の分類、鑑
別に重要な意義をもつている。また近年Rh不適
合による胎児の溶血性疾患の重症度の判定や対策
などに羊水中のビリルビンの分析が重要視されて
いる。 ビリルビンのジアゾ化反応を利用した測定法は
1910年代にHIJMANS VAN DEN BERGHら
により考案され、1930年代にMALLOY、
EVELYN、JENDRASSIK、GRO′Fらにより定
量法として確立されて以来、多くの改良法が提案
されているが、現在もなお、この測定原理を利用
した方法が臨床分析の主流を占めている。 この古典的な測定方法とはジアゾニウム塩を用
いるとき、スルフアニル酸と亜硝酸を反応させて
調製する方法である。 そして、この改良方法のしつとして、
KULHANEKら、ERTHINGHAUSENらによ
つて提案された安定化ジアゾニウム塩を用いる方
法がある。この改良法は予め作成した安定化ジア
ゾニウム塩粉末を緩衝液に溶解するだけで、試薬
調製ができるという優れた方法である。しかしな
がら、この改良法では総ビリルビンのみの測定
で、直接ビリルビンの測定は行なわれていない。
ここで安定化ジアゾニウム塩とは、ジアゾ化合物
とナフタリンスルホン酸塩、塩化亜鉛との複塩、
フツ化ホウ素酸塩などで、固体状態で分離された
ものである。 一方、総ビリルビンおよび直接ビリルビンの分
画測定法として、安部らによつて安定化ジアゾニ
ウム塩の１種、Ｐ―スルホベンゼンジアゾニウ
ム、1.5―ナフタレンジスルホン酸塩を用いる方
法が提案されている。ところが、該安定化ジアゾ
ニウム塩を3.4ミリモル／用いるこの直接ビリ
ルビン測定法では間接ビリルビンが強く発色し
て、直接ビリルビン値として過大な測定値を与え
るという欠点がある。 本発明者らはこのような欠点を改良するため
に、種々鋭意検討したところ、求電子性基で核置
換されたアニリン誘導体を含有することにより、
安定化ジアゾニウム塩を用いる総ビリルビンまた
は直接ビリルビン測定において反応速度および発
色度を著しく促進させることを見出し、本発明に
到達した。すなわち本発明はｐ―スルホベンゼン
ジアゾニウム―１，５―ナフタレンジスルホン酸
塩、塩酸およびニトロ基、アリールスルホニル
基、カルボキシル基またはハロゲン原子で核置換
されたアニリン誘導体および促進剤を含有するこ
とを特徴とする総ビリルビン測定用試薬およびｐ
―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタ
レンジスルホン酸塩、塩酸およびニトロ基、アリ
ールスルホニル基、カルボキシル基またはハロゲ
ン原子で核置換されたアニリン誘導体を含有する
ことを特徴とする直接ビリルビン測定用試薬であ
る。 本発明では上記アニリン誘導体を用いることに
より、安定化ジアゾニウム塩の濃度がきわめて低
い場合にも、総ビリルビンまたは直接ビリルビン
を正確にかつ迅速に測定することができる。しか
も同一濃度の安定化ジアゾニウム塩の使用によ
り、総ビリルビンまたは直接ビリルビンの分画測
定を行なうことができる。 本発明の直接ビリルビン測定用試薬は安定化ジ
アゾニウム塩と塩酸とを含む。 本発明の総ビリルビン測定用試薬は安定化ジア
ゾニウム塩、塩酸および促進剤を含有する。 塩酸の濃度は直接ビリルビン測定用試薬の場合
は0.01乃至0.10規定の範囲であり、総ビリルビン
測定用試薬の場合は0.05乃至0.2規定の範囲であ
ることが望ましい。 本発明に用いる安定化ジアゾニウム塩とはｐ―
スルホベンゼンジアゾニウムクロライドを１，５
―ナフタレンジスルホン酸で安定化したｐ―スル
ホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジ
スルホン酸塩である。 安定化ジアゾニウム塩の濃度は直接ビリルビン
測定用試薬の場合は0.05乃至1.0ミリモル／、
総ビリルビン測定用試薬の場合は、0.01乃至10.0
ミリモル／の範囲が望ましい。 本発明に用いる促進剤（カツプリング剤）とし
ては、メタノール、エタノールなどのアルコール
類、アセトアミド、ジメチルアセトアミド、ジメ
チルホルムアミドなどの酸アミド類、ジメチルス
ルホキシド、アセトニトリル、ジオキサン、テト
ラヒドロフラン、アセトン等の水と相溶性の有機
溶媒、およびカフエイン、ダイフイリン、安息香
酸、非イオン界面活性剤等がある。 促進剤の濃度は、水と相溶性の有機溶媒の場合
20乃至80％の範囲が望ましい。一般に該有機溶媒
量は多い程反応速度は促進されるが、過多である
と却つて発色度が低下する。 本発明に用いる求電子性基で核置換されたアニ
リン誘導体の求電子性基としては、ニトロ基、ア
ルキル基、アリールスルホニル基、カルボキシル
基またはハロゲン原子がある。これらの求電子性
基は１つまたは２つ以上核置換されていてもよ
い。このようなアニリン誘導体としては、たとえ
ば２，４―ジクロロアニリン、スルフアニル酸、
Ｐ―ニトロアニリン、Ｐ―アミノ安息香酸、２，
４，６―トリクロロアニリン等が挙げられる。こ
れらのアニリン誘導体は単独で使用してもよい
し、複数併用してもよい。 上記アニリン誘導体の含有量は総ビリルビン測
定用試薬あるいは直接ビリルビン測定用試薬に対
して、0.01〜50ミリモル／、好ましくは0.1〜
20ミリモル／である。 上記アニリン誘導体は総ビリルビンまたは直接
ビリルビン測定において、反応速度および発色度
を著しく促進させる。特に安定化ジアゾニウムの
濃度が0.05〜1.0ミリモル／の低濃度場合には、
直接ビリルビン測定において、間接ビリルビンの
影響を抑制し、かつ反応速度および発色度を著し
く高め、正確にかつ迅速に測定することができ
る。 以下に実施例により本発明を説明する。 実施例 １ 総ビリルビン測定におけるアニリン誘導体の効
果 総ビリルビン測定反応試薬として、0.17規定塩
酸、ジメチルホルムアミド40％、メタノール10％
を含有する水溶液１に、Ｐ―スルホベンゼンジ
アゾニウム―１，５―ナフタレンジスルホン酸塩
（以下NDDSと略す）0.2ミリモルおよび第３表に
示されるアニリン誘導体５ミリモルを添加して調
製した。 得られた総ビリルビン測定反応試薬３mlに、間
接ビリルビン溶液（20mg／dl）50μlを添加し、37
℃で10分間加温した後、波長560nmにおける吸光
度を測定した。試薬ブランクとの吸光度差（△○
〓）を第１表に示す。

【表】 第１表から明らかなように、アニリン誘導体が
含有されることにより、総ビリルビン測定におけ
る反応速度および発色度は著しく高められる。 実施例 ２ 総ビリルビンおよび直接ビリルビン測定におけ
るスルフアニル酸の効果 総ビリルビン測定用試薬（１中） ジメチルスルホキシド 30％ スルフアニル酸 ５ミリモル NDDS ２ミリモル 塩 酸 0.125規定 総ビリルビン測定用試薬（１中） ジメチルスルホキシド 30％ スルフアニル酸 ５ミリモル NDDS 0.2ミリモル 塩 酸 0.125規定 直接ビリルビン測定用試薬（１中） スルフアニル酸 ５ミリモル NDDS 0.2ミリモル 塩 酸 0.02規定 検体として人血清（MALLOY―EVELYN法
で測定した総ビリルビン値21.2ng／dl、直接ビリ
ルビン値6.5mg／dl）50μlを上記試薬，また
はのそれぞれ3.0mlに添加し、37℃に加温しつ
つ、波長560nmにおける吸光度変化を測定した。
反応曲線を第１図に示す。図中、Ａ，Ｂ，Ｃは試
薬，，による反応曲線である。比較対照と
して試薬，，でスルフアニル酸の存在しな
い系で同様にして測定したものの反応曲線をA′，
B′，C′で示す。 第１図から明らかなように、スルフアニル酸は
総ビリルビンおよび直接ビリルビン測定におい
て、反応速度および発色度を促進する効果を示
す。

【図面の簡単な説明】

第１図は総ビリルビンおよび直接ビリルビン測
定におけるスルフアニル酸の添加効果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―
   ナフタレンジスルホン酸塩、塩酸およびニトロ
   基、アリールスルホニル基、カルボキシル基また
   はハロゲン原子で核置換されたアニリン誘導体お
   よび促進剤を含有することを特徴とする総ビリル
   ビン測定用試薬。 ２ ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―
   ナフタレンジスルホン酸塩、塩酸およびニトロ
   基、アリールスルホニル基、カルボキシル基また
   はハロゲン原子で核置換されたアニリン誘導体を
   含有することを特徴とする直接ビリルビン測定用
   試薬。