JPH0139552B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は直接ビリルビン測定法に関するもので
ある。 体液中のビリルビンには間接型と直接型があ
り、間接ビリルビンは非抱合型ビリルビン（遊離
ビリルビン）であり、直接ビリルビンは抱合型ビ
リルビンであつて、前記遊離ビリルビンの側鎖の
プロピオン酸がグルクロン酸とエステル結合した
グルクロナイド（モノグルクロナイド、ジグルク
ロナイド等）である。総ビリルビンは直接ビリル
ビンと間接ビリルビンの総称である。 体液中の各種のビリルビンの病態時に臨床検査
として測定されるものは血中ビリルビン濃度とそ
の分画（直接型ビリルビンと間接型ビリルビン）、
尿中ビリルビンおよびウロビリン体、糞便中のウ
ロビリン体などが主であつて、このうち血中ビリ
ルビンの動態は最も重要で、各種黄疽の分類、鑑
別に重要な意義をもつている。また近年Rh不適
合による胎児の溶血性疾患の重症度の判定や対策
などに羊水中のビリルビンの分析が重要視されて
いる。 ビリルビンのジアゾ化反応を利用した測定法は
1910年代にHIJMANS VAN DEN BERGHら
により考案され、1930年代にMALLOY、
EVELYN、JENDRASSIK、GRO′Fらにより定
量法として確立されて以来、多くの改良法が提案
されているが、現在もなお、この測定原理を利用
した方法が臨床分析の主流を占めている。 この古典的な測定方法とはジアゾニウム塩を用
いるとき、スルフアニル酸と亜硝酸を反応させて
調製する方法である。そして、その改良方法の１
つとして、KULHANEKら、
ERTHINGHAUSENらによつて提案された安定
化ジアゾニウム塩を用いる方法がある。この改良
法は予め作成した安定化ジアゾニウム塩粉末を緩
衝液に溶解するだけで、試薬調製ができるという
優れた方法である。ここで安定化ジアゾニウム塩
とは、ジアゾ化合物とナフタリンスルホン酸塩、
塩化亜鉛との複塩、フツ化ホウ素酸塩などで、固
体状態で分離されたものである。 一般に病院等診療施設においては、血清、尿等
の多数の検体を、多数の検査項目において短時間
に限られた人員、スペースで分析を実施するた
め、試薬が安定であり測定操作が簡便であるとい
うことは、極めて重要なことである。 総ビリルビンおよび直接ビリルビンの一般的な
測定法は、間接ビリルビンの反応を促進する促進
剤の存在下にジアゾ化反応を行い、アゾビリルビ
ン色素を形成せしめ比色定量することにより、総
ビリルビンを定量し、促進剤の不存在下に同様に
して直接ビリルビンを定量する。促進剤として
は、水相溶性の有機溶剤、カフエイン―安息香
酸、ダイフイリン、尿素、非イオン界面活性剤等
が用いられる。 ところで、血清中の総ビリルビンの濃度は、健
常者で0.1〜1.0mg／dl程度と極めて微量であるた
め、前記比色定量においては、検体ブランクの測
定を併用し補正を行う必要がある。且つまた、上
記方法では総ビリルビン及び直接ビリルビンのそ
れぞれに対応する検体ブランク値が異るため合計
４回の測定操作が必要であり、繁雑であると共に
必要検体量も多い。特に新性児黄疸の診断に関す
るビリルビン測定においては必要血清量を低減す
ることは極めて重要なことである。 前述のジアゾ化法によるビリルビン測定法に
は、酸性条件下でアゾビリルビン色素を形成し、
比色定量する酸性アゾ法と、その後、反応系をア
ルカリに変化させ、ジアゾ化反応を停止し、アル
カリアゾビリルビン色素を比色定量するアルカリ
アゾ法がある。従つて、測定操作の段階の数は、
酸性アゾ法で少なくとも１回、アルカリアゾ法で
少なくとも２回である。この点、酸性アゾ法が優
れている。MALLOY―EVELYN法に代表され
るこの酸性アゾ法では、前記別々の検体ブランク
を必要とする点、試薬調製が繁雑である点、発色
の吸収極大が530〜540mmの低波長域にあり、ビリ
ルビン自体の吸収と重なり合う点などの理由によ
り、直接ビリルビン発色及び総ビリルビン及び直
接ビリルビンに対応するそれぞれの検体ブランク
において正確を期し難い。また促進剤としてエタ
ノールを用いているため発色時混濁を発生し易
い。更には一般的に、酸性下での直接ビリルビン
反応は、多くの血清検体において、反応時間に対
して平衡点を示し難く、漸増傾向を示す。したが
つて反応停止操作を伴わない上記方法では、反応
時間の長短に依り直接ビリルビン値が変動する。 一方、アルカリアゾ法は、発色の吸収極大が
600mm付近にある点、および反応停止操作を伴う
点において、優れる。特にMICAELISON法等で
は、総ビリルビン及び直接ビリルビンの最終反応
液組成を互いに一致させることにより、検体ブラ
ンクが一体化されているという点で優れた方法で
ある。しかし試薬調製が繁雑であり、総ビリルビ
ン、直接ビリルビン及び検体ブランクの測定操作
が、全て少くとも２段階を必要とする点において
満足すべき方法ではない。 本発明者等は従来法の係る欠点に鑑み簡便性、
正確性、再現性の優れた総ビリルビンおよび直接
ビリルビンの測定システムを得るべく、種々鋭意
検討した結果、直接ビリルビン測定試薬をジアゾ
化試薬と反応停止試薬の二つに分けることを見出
し、本発明に到達した。すなわち本発明はｐ―ス
ルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレン
ジスルホン酸塩及び鉱酸を含有するジアゾ化試薬
(A)を検体と混合し反応させ、次いでｐ―スルホベ
ンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジスル
ホン酸塩を不活性化する還元剤及び水溶性有機溶
剤および水溶性有機溶剤を含有する反応停止試薬
(B)を添加混合した後、吸光度を測定することを特
徴とする直接ビリルビン測定法である。 本発明方法に使用する試薬は安定化ジアゾニウ
ム塩、鉱酸および有機溶媒を用いる１段階反応酸
性アゾ法による総ビリルビン測定試薬に対し、検
体ブランク値、ジアゾ発色の吸収極大波長を一致
させることができる直接ビリルビン測定用試薬で
ある。従つて本発明の直接ビリルビン測定用試薬
を用いれば総ビリルビンと直接ビリルビンとを測
定してビリルビン分画を行う場合に、両測定にお
ける検体ブランクはいずれか一方の検体ブランク
測定操作を行うのみで足りる。すなわちこの検体
ブランク値を直接ビリルビンおよび総ビリルビン
のジアゾ発色測定値から各々差し引いて補正を行
なうことができ、これにより正確度は損われな
い。 このことはMALLOY―EVELYN法等に比べ、
検体ブランクの一体化という点で優れ、操作簡便
性および必要血清量が2/3に低減する。一方、検
体ブランクが一体化されたMICHALERISON法
等に比べても総ビリルビン測定が１段階反応でピ
ペツト回数および反応段階数において、簡略され
るため直接ビリルビンおよび総ビリルビンの両測
定を通して、より簡略化されたものとなる。 従来の安定化ジアゾニウム塩法に比べても検体
ブランクが一本化されたこと、直接ビリルビンと
総ビリルビンの極大吸収波長が一致したことによ
り、簡便性、必要検体量の点で改善がなされ、両
測定の整合性が進歩する。 本発明に用いる安定化ジアゾニウム塩はｐ―ス
ルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレン
ジスルホン酸塩である。 鉱酸は塩酸が好ましく、0.01〜0.2Nの範囲の濃
度が好ましい。 本発明で用いる上記ジアゾニウム塩を不活性化
する還元剤とは上記ジアゾニウム塩を分解してビ
リルビンとの反応性を失わしめるものであれば何
でも良い。例えばジチオスレイトール、メルカプ
トエタノール、システイン、グルタチオン等のス
ルフヒドリル化合物、亜硫酸ナトリウム、アスコ
ルビン酸等が挙げられる。その濃度は反応液中
0.01〜５％が好ましい。 本発明の水溶性有機溶剤としてはジメチルスル
ホキシド、ジメチルアセトアミド、ジメチルホル
ムアミド、エチレングリコール、アセトニトリ
ル、ジオキサン、テトラヒドロフラン等が挙げら
れる。その濃度は反応液中５〜50％である。 反応停止試薬中にはこのほかイオン性及び非イ
オン性界面活性剤、キレート剤等が添加されてい
ても良く吸光度及び吸収曲線の調整、不活性等化
剤の安定性のために好ましい。 本発明の試薬を用いて直接ビリルビンを測定す
るには、まず検体（通常0.02〜0.1ml）とジアゾ
化試薬（通常0.5〜2.5ml）を混合し、室温で10〜
30分間又は37℃で５〜15分間反応させる。次いで
反応停止試薬（通常2.5ml〜0.5ml）を添加混合し
た後、吸光度を測定する。第一反応段階において
は、直接ビリルビンからアゾビリルビン色素が形
成され520〜560mmに吸収極大を有する発色がおこ
る。一方、間接ビリルビンはジアゾ化されないで
残る。 アゾビリルビンの吸収極大は酸の濃度の増大に
従つて長波長側に出現するが、間接ビリルビンの
ジアゾ化を抑制し直接ビリルビンのジアゾ化を促
進するためには酸の濃度は0.01〜0.2Nの範囲が好
ましい。第二段階ではジアゾニウム塩が分解され
ると共に有機溶剤の作用によりアゾビリルビンの
吸収極大が550〜570mmにシフトし同時に吸光度が
増大する、残溜間接ビリルビンの吸収は、アゾビ
リルビンの吸収極大より低波長側に分布するよう
になるため吸光度測定の妨害にならない。 検体ブランクの測定には、上記本発明の試薬よ
り安定化ジアゾニウム塩を除いて操作する方法及
びジアゾ化試薬及び反応停止試薬を混合して一試
薬一段階操作する方法があり、いずれの方法でも
実質的に等しい検体ブランク値が得られる。然
も、有機溶剤及び反応停止剤を用いない従来の一
段階の直接ビリルビン測定に比べその検体ブラン
クは低い。総ビリルビンの測定を上記直接ビリル
ビンの測定と整合せしめ検体ブランクの一体化、
吸収極大の一致、検量線の共用を行うことが可能
である。この場合、総ビリルビンは、安定化ジア
ゾニウム塩及び有機溶剤を含む一試薬一段階反応
で実施することが簡便性の上から好ましい。 安定化ジアゾニウム塩の添加量は、総ビリルビ
ン用と直接ビリルビン用とで変えることが好まし
い。直接ビリルビンの為には間接ビリルビンの反
応抑制のため0.5〜1.0ミリモル／の範囲が好ま
しい。また、総ビリルビンのためには1.0〜20ミ
リモル／の範囲が好ましい。また総ビリルビン
及び直接ビリルビンの反応性を高めるために、ジ
アゾ化反応液中にはスルフアニル酸等、求電子性
基で該置換されたアニリン誘導体を共存せしめる
ことが好ましい。 以下に本発明を実施例により説明する。 実施例 １ ジアゾ化試薬 (A) ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナ
フタレンジスルホン酸塩 0.6ミリモル スルフアニル酸 10 ミリモル 塩 酸 100 ミリモル 精 製 水 １ 反応停止試薬 (B) ジメチルスルホキシド 500ml アスコルビン酸 ５ｇ EDTA Na₂ 372mg 精 製 水 500ml 血清0.1ml及びジアゾ化試薬(A)１mlを混合し、
37℃で10分間反応後、反応停止試薬(B)２mlを添加
混合した後、波長560nmで吸光度を測定した（第
１表ジアゾ発色）。ジアゾ化試薬(A)からｐ―スル
ホベンゼンジアゾニウム１，５―ナフタレンジス
ルホン酸塩を除いた試薬を用いて、検体ブランク
を同様に測定した（第１表検体ブランク）。結果
を第１表に示す。 比較例 １ ジアゾ化試薬 ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナ
フタレンジスルホン酸塩 0.3ミリモル スルフアニル酸 ３ ミリモル 塩 酸 30 ミリモル 精 製 水 １ 血清0.1ml及びジアゾ化試薬３mlを混合し37℃
で10分間反応後、波長530nmで吸光度を測定した
（第１表ジアゾ発色）。検体ブランクは、ｐ―スル
ホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジ
スルホン酸塩を除いて同様に測定した（第１表検
体ブランク）。結果を第１表に示す。 参考例 １ 本発明と整合する総ビリルビン測定 ジアゾ化試薬 ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナ
フタレンジスルホン酸塩 ３ミリモル スルフアニル酸 ３ミリモル 塩 酸 100ミリモル 精 製 水 １ 血清0.1ml及びジアゾ化試薬３mlを混合し37℃
で10分間反応後、波長560nmで吸光度を測定した
（第１表ジアゾ発色）。検体ブランクは、ｐ―スル
ホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタレンジ
スルホンジスルホン酸塩を除いて同様に測定した
（第１表検体ブランク）。結果を第１表に示す。

【表】 第１表から明らかなように、本発明の検体ブラ
ンク値は従来法によるもの（比較例１）に比べて
総ビリルビン測定の検体ブランク値（参考例）に
近似している。この傾向は特に乳び血清において
顕著である。また第１表中の直接ビリルビンが高
値の検体（血清３、４、５）ではジアゾ発色の吸
収極大波長がいずれの検体でも実施例１では
560nm、比較例１では530nm、参考例560nmであ
り、本発明試薬を用いると、直接ビリルビンと総
ビリルビンの吸収が一致し、同一波長での測定が
可能である。 実施例 ２ 実施例１におけるアスコルビン酸をグルタチオ
ンに置き換える以外は、実施例１と同様にして検
体中の直接ビリルビンを測定した。結果を第２表
に示す。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ｐ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―
   ナフタレンジスルホン酸塩及び鉱酸を含有するジ
   アゾ化試薬(A)を検体と混合し反応させ、次いでｐ
   ―スルホベンゼンジアゾニウム―１，５―ナフタ
   レンジスルホン酸塩を不活性化する還元剤及び水
   溶性有機溶剤を含有する反応停止試薬(B)を添加混
   合した後、吸光度を測定することを特徴とする直
   接ビリルビン測定法。