JPH031311B2

JPH031311B2 -

Info

Publication number: JPH031311B2
Application number: JP56035467A
Authority: JP
Inventors: Nooton Saimon Raioneru; Jinaa Soroora Arufuretsudo; Gutsutagu Arubin
Original assignee: NYUUHOOTO PHARM INTERN Inc; SUROON KETARINGU INST FUOO KYANSAA RISAACHI
Current assignee: NYUUHOOTO PHARM INTERN Inc; SUROON KETARINGU INST FUOO KYANSAA RISAACHI
Priority date: 1980-03-14
Filing date: 1981-03-13
Publication date: 1991-01-10
Also published as: NO155579C; CA1159827A; DK154768C; EP0036077A2; IE51019B1; AU535052B2; PT72665A; ZA811181B; PL129094B1; NZ196295A; JPS572287A; US4340726A; GR74807B; IN155441B; KR830005224A; NO810723L; PT72665B; EP0036077B1; NO155579B; DK154768B

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は下記の構造式を有する化合物に関する
ものである。（ただし、R¹は炭素原子３〜８個のアルキル
基、R²は非置換脂肪族モノ又はジカルボン酸の
アシル部分である。）この化合物は抗ウイルス活
性及び抗腫瘍活性特に抗白血病活性を有する免疫
調節剤であり且つまた酵素インヒビターである。
この化合物はある例では増強された効力をもつて
生物系中に相当するアルコールを導入するために
使用され得る。このエステル基R²の酸部分は例えば非置換脂
肪族モノカルボキシル酸即ち蟻酸、酢酸、プロピ
オン酸、酪酸、バレリン酸、イソバレリン酸、カ
プロン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸、オレイン酸のような炭素原子
１〜18個をもつもの及び非置換脂肪族ジカルボキ
シル酸即ちマロン酸、フマール酸、マレイン酸、
コハク酸、グルタール酸及び炭酸であり得る。ジ
カルボキシル酸では炭酸メチル及び炭酸エチルと
同様にヘミマロネート、ヘミフマレート、ヘミマ
レエート及びヘミサクシネート等の半エステルが
通常形成される。有機酸エステルは従来の方法即ち酸無水物又は
ハロゲン化アシル即ち塩化アセチルのようなアシ
ル塩化物を用いて調製される。カルボン酸エステ
ルは例えばクロロ蟻酸エステル即ちクロロ蟻酸エ
チル、クロロ蟻酸メチル又はホスゲンから調製さ
れる。無機酸エステルは従来の方法で即ち燐酸塩を作
るにはｏ−フエニレンホスホクロリデートを、硝
酸塩を作るには硝酸を用いて調整される。ウイルス（インフルエンザウイルス、HSV、
フレンド白血病ウイルス）、細菌及び真菌等の多
くの感染性因子が、その宿主中に免疫低下状態を
惹起し、感染因子による感染に対するその防御力
を弱めることは、確証された事実である。抗ウイ
ルス性代謝阻害剤の殆んどは例えばAraCのよう
に、宿主免疫防御機構の抑制をおこし、そのため
生体独自の自然防御機構を減弱させそして二次感
染を高める能力を示すものである。免疫増強剤又は免疫調節剤は、低下した免疫機
能を回復させるか或は正常免疫機能を昂進させる
か又はその両方の作用剤である。免疫機能は体液
性免疫４抗体由来）、細胞性免疫（胸腺由来）又
はマクロフアージ及び顆粒球由来抵抗の発現とし
て定義される。それは論理的には免疫応答の表現
に関与する細胞、又は免疫応答に関与する細胞機
能を修正するように作用する細胞又は分子メカニ
ズムに対し直接的に働く因子を包含するものであ
る。免疫機能増強は、免疫系に内因的又は外因的
に影響を与えるネガテイブフイードバツクに由来
する抑制機構を阻害する因子の働きによるもので
ある。このように免疫増強剤は異つた作用機序を
有する。細胞作用部位、免疫増強剤の生化学的作
用機序の多様性にも拘らず、免疫増強剤の応用は
本質的に同一で即ち宿主抵抗を高めることであ
る。免疫増強剤の応用 (1) 免疫系の主要防御機能は、ウイルス、リケツ
チア、ミコプラズマ、細菌、真菌及びすべての
種類の寄生虫等を含む病原因子の侵入に対する
抵抗に関連するものである。このように免疫応
答の改善は特に低下状態では、上記病原因子の
いずれかによる感染又は侵襲において計画的に
抵抗を改善するものであろう。免疫増強剤単独
又は抗感染療法との併用はいずれの又はすべて
の感染性疾患に応用され得る。 (2) 免疫系の第二番目の防御機能は異種組織の移
殖に対する抵抗…これは胎児母体関係における
自然的なもの或は移殖医によつて行われた人為
的なもののいずれも…と考えられている。免疫
増強剤はまた胎児又は胎盤組織の排出を容易に
したり、或は移殖物に対する忍容性を改善した
り又は惹起させるために使用され得る。 (3) 免疫系の第三番目の防御機能は癌のような悪
性細胞増殖に対する抵抗と考えられる。免疫増
強剤は癌治療において腫瘍排出を昂進させるた
めやその他の療法に続く腫瘍再発を阻害するた
めに使用し得る。 (4) 第四番目の防御機能は異種性を認識しそして
正の抑制機序によつて自己に対する無反応性を
維持する能力に関するものである。自己免疫及び関連疾患では、自己抗原に対する
免疫反応性又は誇張され増加した応答が明白でこ
れらは自己破壊的なものである。免疫増強剤はま
た正常な抑制機構を回復させ、忍容性を惹起し又
は正常免疫応答を促進させるために使用し得る。免疫系のこれら防御機能のそれぞれは、免疫増
強剤単独又は侵入病原体に対する抵抗を改善し又
は殺すために使用される他の薬剤との併用によつ
て改善され得る。更に免疫増強剤をある種の抗原
を例えばウイルス、腫瘍細胞等を使用しワクチン
として共用することにより特異的な抵抗を増強し
得る。この使用法は特異的免疫又は忍容性のいず
れかを誘起することができる。後者はアレルギー
又は自己免疫疾患における抗原の使用によつて例
証することができよう。免疫増強剤の使用は治療
的又は予防的のいずれかであり、後者では特に感
染、自己免疫及び癌がより多い老化の場合であ
る。投与の時期及び経路は種々であり、正又は負
の応答が起るか否かを決定する上で非常に重要な
ものである。免疫応答を増強するいずれの薬剤も
その投与時期及び用量に依つて阻害作用をもつも
のであり、このように或る状態下では免疫増強剤
はアレルギー、自己免疫及び移殖において免疫抑
制剤として使用され得るものである。 R¹がヘキシル基である場合の母体アルコール
はエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）
−ピポキサンチンであり、このものはコード番号
NPT15392として試験した。本発明に属する化合
物のうちには、エリスロ−９−（２−アセチル−
３−ノニル）−ヒポキサンチン（コード番号
NPT15485；実施例１参照）、エリスロ−９−（２
−サクシノキシ−３−ノニル）−ヒポキサンチン
（コード番号NPT15457；実施例２参照）。その他の本発明化合物としては、たとえば第１
表に示すものがある。第１表で、R¹のアルキル
基はすべてｎ−アルキルである。

【表】

【表】 NPT15392は抗ウイルス、免疫調節及び抗腫瘍
作用を有することが以前に実証されている。こゝ
に提出した結果は下記を実証するものである。即
ち(1)NPT15392の新規誘導体が調製され得る(2)そ
の誘導体は生体系中で活性物質（NPT15392）に
転換され(3)活性物質（NPT15392）のより高い血
中濃度を導き、こうしてNPT15392の効力を増強
する。次の表は本発明による若干の化合物の化学的性
質を要約したものである。

【表】本発明による免疫増強剤は例えば表Ａのウイル
スによる侵入に対し抵抗を与えるものである。

【表】

【表】これら化合物は特にPNAウイルスにして有用
である。本発明の化合物及び配合剤はヒト、ブタ、イ
ヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、マウス、
ウサギ、ラツト、モルモツト、ハムスター、サル
等の哺乳動物（及び哺乳動物細胞）を治療する上
で有用である。特に記述しない限り、すべての割合とパーセン
トは重量によるものである。特記しない限り、すべての温度は摂氏度であ
る。配合剤は記述された物質を含有し、本質的に
それより成る又はそれより成るものであり、その
配合法はかかる物質と共に示された行程を含み、
本質的に成る、或はそれより成るものである。これら配合剤は従来の方法により哺乳動物に投
与し得る即ち経口、経鼻、経直腸、経腔又は注射
等。これらは水等の注射用溶液又は錠剤、丸球、
カプセル剤として使用される。好ましき実施例の説明エリスロ−９−（２−アセトキシ−３−ノニル）
−ヒポキサンチン（NPT15458）（″アセチル−ノ
ニルヒポキサンチン）の合成エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）
−ヒポキサンチン、NPT15392（2.78ｇ、10ミリ
モル）をピリジン（120ml）に溶解し、無水酢酸
（３ml、30ミリモル）を加える。この溶液を24時
間25℃に保つ。エタノール（50ml）を加え、この
溶液を減圧下で蒸発乾固させる。ピリジンを除去
するためこの操作を４回繰り返す。残渣にエーテ
ル（150ml）を加えた後固形物を過して集める。
沈澱物をエーテルで３回洗浄する。白色の結晶性
物質が得られる。（2.51ｇ、80％）融点150〜150
℃UV最大吸収（H₂O、PH5.5）249nm、Am10.1
×10³、ir1700cm^-1（Ｃ＝０）。 C₁₆H₂₄N₄O₃として分析、計算値Ｃ、59.97；
Ｈ、7.55；Ｎ、17.48。実験値Ｃ、59.83；Ｈ、
7.42；Ｎ、17.39。上行クロマトグラフ（ワツトマン紙＃１）Ｒ＋
値：ｎ−ブタノール／水／AcOH（２：１：１）＝
0.92；エタノール／1M酢酸アンモニウム（14：
６）＝0.88；イソプロパノール／濃アンモニア／
水（７：２：４）＝0.90 実施例２エリスロ−９−（２−サクシノキシ−３−ノニ
ル）ヒポキサンチン（サクシニル−ノニル−ヒポ
キサンチン）（NPT15457）の合成。 600mgのエリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−
ノニル）−ヒポキサンチン、（NPT15392）（2.2ミ
リモル）と１ｇの無水酢酸（10ミリモル）を最小
容量のピリジン中に撹拌しながら溶解する。この
溶液を撹拌を維続しつつ10日間穏やかに加温する
（約30℃）。ロータリーエバポレーターを使用してピリジン
を除去し、残渣を20mlの無水エタノール中に48時
間抽出する。その溶液を遠心し、上清を薄層クロ
マトグラフにより精製する（２mmシリカゲル60、
Ｎ−ブタノール：2N NH₄OH10：2V／Ｖ）。Rf
＝0.17におけるバンドを無水エタノール中に溶出
する。この化合物の純度は薄層クロマトグラフ及
び紫外線分光分析によつて判定する。化学的安定性第３表に示されたデータからエステル、
NPT15458及びNPT15457は37℃、PH中性（7.0、
生理学値）で処理したときに安定性を有すること
が明白に実証された。PH9.5における塩基加水分
解が、アセチル（NPT15458）及びサクシニル
（NPT15457）エステルの両方をNPT15392に転
換し得る事実は、これら化合物構造の一層の証明
となるものである。

【表】

【表】抗ウイルス性血球吸着分析法を用いてインフルエンザウイル
ス増殖阻害に対するNPT15457とNPT15458の能
力が測定された。第４表からみられる通り、殆ん
ど完全にNPT15392（活性薬剤）に分割されるブ
ロドラツグNPT15458は、活性薬剤
（NPT15392）と同様にウイルス発育阻害につい
て類似の能力をもつている。事実NPT15458が僅
かにより有効であるように見えるが、これは多分
NPT15458の細胞内での吸着がより大きいことに
依るものと思われる。PH7.2でマイナスに荷電す
るコハク酸誘導体では容易に細胞に入ることが期
待されず、この方法ではより効力が弱いと思われ
る。

【表】免疫調節作用 NPT15392のアセトキシ（NPT15458）及びサ
クシノキシ（NPT15457）エステルの免疫系調節
能を下記システムを用いてin vitro及びin vivo
で測定した。１ネズミ脾臓細胞を用いたミトゲン誘発リンパ
球増殖（in vitro）２ヒト末梢血液リンパ球を用いたシトゲン誘発
リンパ球増殖（HPBL）（in vitro）３活性ロゼゾト形成の昂進（in vitro）４ヒツジ赤血球細胞（SRBC）で免疫したマウ
ス中のIgM抗体形成昂進（in vivo）１第５表に示すデータから、三重水素化チミジ
ンの取込みによつて測定されるようにNPT15458
がPHA誘発リンパ球増殖を増強する能力をもつ
ことが明白に実証される。NPT15458の50％μ
ｇ／mlの濃度では約25％の増加が観察された。同
様な増加がNPT15392の10μｇ／mlで観察された。２第６表に示されたデータは、等モル濃度の
NPT15457とNPT15458が、HPBLを用いた
PHA誘発リンパ球増殖の増強に有効でることを
明白に実証している。これはHPBLが両エステル
をNPT15392に分割することを示した第９表のデ
ータの面から興味あることである。NPT15457よ
りも高度に分割されるNPT15458は（表９参照）、
PHA誘発変換のより有効な増強剤である（第６
表、1.48対1.28）。３第７表から認めるように、NPT15457及び
NPT15458両者は、HPBLにおいて活性ロゼツト
形成の調節に有効であつた。実験１において、プ
ラセボ処理リンパ球が非常に低いレベルの活性ロ
ゼツト（免疫低下）を示したのに、NPT15457と
NPT15458は低下した免疫能を正常レベルに回復
させるのにNPT15392と同様に活性であつたこと
は興味あることである。実験２においては、プラ
セボ処理コントロールは活性ロゼツト形成に異常
高値を示した。この例ではNPT15392を
NPT15458は正常値を減少させ、このようにこれ
ら薬剤の真の免疫調節能を実証するものであつ
た。４ NPT15457、NPT15458と活性剤NPT15392
が、ヒツジ赤血球SRBCで免疫されたBalb／ｃ
マウスに投与された。SRBCに対する抗体産生が
測定された。NPT15458及びNPT15392がIgM抗
体産生の調製に非常に有効であることを認めたの
は興味あることであつた。NPT15392は検討され
たレベルではIgM産生の46％増加をおこした。よ
り高用量のNPT15392は対照値を越える増加又は
減少により弱く作用した。NPT15458ではそれが
NPT15392に転換され且つNPT15392より少なく
とも10倍高い血中濃度に達し（第10表）、IgM形
成の阻害を惹起したこと（第８表）は興味あるこ
とであつた。これは予期されたことであると云う
のはNPT15458はIgM形成を阻害すると思われる
NPT15392の非常な高レベルを作り出すからであ
る。第８表に示されるデータはNPT15457と
NPT15458の免疫調節作用を実証するものある。
NPT15457の作用はNPT15458のそれよりも弱
く、且つNPT15458よりも少なくNPT15457が
NPT15392に転換されることは注目すべきことで
ある。

【表】

【表】代謝性転換第９表からみられる通り、NPT15457及び
NPT15458のプロドラツグをベロ細胞（アフリカ
ミドリザル腎細胞）、肝ホモジユネート及びヒト
末梢血リンパ球（HPBL）とインキユベートする
と、活性剤NPT15392の生成がおこる。
NPT15458からNPT15392への転換は、
NPT15457からNPT15392への転換よりもより高
度におこるようにみえる。第10表中のデータはNPT15457及びNPT15458
両化合物が腹腔内投与後血中に吸収され、そして
NPT15458の投与はNPT15392それ自体を投与し
た時よりも約12倍高いNPT15392レベルに達する
ことを実証するものである。これはin vivoにお
いてNPT15458とNPT15457がNPT15392を作り
得ること及び更にこれら誘導体の少なくとも一つ
ははるかに高い血中濃度を与えより強い作用を発
揮する事実を明白に確立するものである。

【表】

【表】 In vivo腫瘍（白血病）細胞発育に対するエリ
スロ−９−（２−アセトキシ−３−ノニル）−ヒ
ポキサンチンの作用

【表】

【表】上記性質の測定のために下記方法が使用され
た。Ａ細胞培養法Ａヘラ又はベロ細胞増殖１ 120cm³フラスコ中の細胞培養は下記の方法で
単一層で二次培養される。２培地を流し出し、この単一層をカルシウム又
はマグネシウムを含まない燐酸緩衝生理的食塩
液（PBS）…PH7.2…で１回当り50mlで２回洗
浄する。３ 0.5ｇのトリプシン（１：250）とCa⁺⁺及び
Mg⁺⁺を含有しないHanKS均衡塩溶液
（HBSS）１当り2.0のEDTAを含むトリプシ
ン−EDTA溶液１mlを37℃で各フラスコに加
え静かに振とうして単一層上に拡散させる。４次にフラスコを37℃のインキユベーター中に
置き、細胞を取り出すに必要な時間に依つて約
３〜５分間保温する。手で振とうすることが必
要である。５各フラスコに10mlの植付培地を加え、ピペツ
トで懸濁液を吸引及び吹出すことによつて細胞
を拡散させる。この操作を10回行う。６一連のフラスコの内容物を集め、懸濁液中の
細胞は植付培地で７〜8.5×10⁴細胞／mlに稀釈
する。７植付培地は下記の組成より成る。 Earle塩、HEPESバツフアーとMinimum
Essential Medium Eagles（MEM）に、
MEM100ml当り下記物質の記載量を追加して
補充した。胎児仔牛血清10ml（最終濃度10％）１−グル
タミン１ml（200モル）ペニシリン10000単
位、ストレプトマイシン10000μｇ及びネオ
マイシン10000混合物１ml ８ 24個の平底ウエルを有してその各ウエルが３
mlの容量をもつCosstar組織培養トレイ中で細
胞を二次培養し、細胞培養懸濁液１mlを各ウエ
ルに加える。９単一層はそれが殆んど連続的に発育した時
（約１〜２日）に実験に使用する。 10 細胞系を維持するために別のフラスコが使用
される。維持培地はMENに補充物を加えたも
ので（７頁参照）仔牛胎児血清の最終濃度を５
％に減じたものから成る。Ｂ赤血球１雄Hartly系モルモツトから心穿刺により全
血を採取する。２約10c.c.の全血をAlsever溶液25mlと混合す
る。４℃で１週間まで保存できる。３使用直前に赤血球をPH7.2の燐酸緩衝生食水
（PBS）で３回洗浄する。４各洗浄後赤血球懸濁液を室温、450ｇで10分
間遠心する５ Hanks均衡塩溶液で0.4％Ｖ／Ｖの赤血球懸
濁液を調製する。Ｃウイルスの卵増殖１９〜10日目の受精鶏卵を光に透かしい発育能
力を調べ、気嚢の位置を殻上に鉛筆でしるしを
つける。疑わしい卵（動きのないもの又は変
色）は棄てる。２殻表面を70％エタノールで消毒して乾かす。３各卵の気嚢を示す鉛筆マークの円内約1/4イ
ンチに、滅菌卵穿刺で殻に小穴を開ける。４ 10²〜10³E1D₅₀／mlの各種ウイルス懸濁液1/1
０mlを、１c.c.のツベルクリン注射筒を使つて尿
膜腔内に45゜の角度で小穴を通して接腫する。
胚又は卵黄嚢を損傷しないよう注意する。５プラスチツクテープの１インチ片を使つて小
穴を封じ、各卵に適正なウイルス名、卵通過番
号及び日付をラベルする。６卵はウイルス発育の早さに依つて35〜37℃で２
〜５日間培養する。インキユベーシヨン時間と
温度を各行程通過の関連データと共に記録す
る。Ｂ尿膜液の採取１インキユベーシヨンの終りに卵を３〜４時間
４℃に冷し、ウイルス採取操作中に尿膜腔への
出血を最小にするようにする。２殻表面を再度70％エタノールで消毒して乾か
す。３鉛筆線に沿つて殻の頂点を滅菌ハサミを使つ
て切り取り、鉗子で膜を梳き出す。４胚と殻膜の間に鉗子を静かに挿入し、胚を片
側に押しやつて尿膜液の“ポケツト”を作る。
羊膜を破らないよう（羊水も採取する場合を除
いて）そして胎盤動脈の引裂を最小にするよう
注意する。５機械的減圧バルブのついた10ml滅菌・使い棄
てピペツトを用いて尿膜液を集め、滅菌・使い
棄て遠心管に移す。各卵から約５〜８mlが採取
される。６採取液を４℃、1200ｇで10分間遠心する。上
清を滅菌試験管に移す。７プールした各液から滴定及び滅菌試験用のサ
ンプルを採取する。残りの懸濁液を滅菌２c.c.血
清試験管中に分注し、菌株、通過番号及日付を
ラベルする。８分注物は直ちに液体窒素中で凍結し、ウルト
ラフリーザー又は液体窒素クリオフリーザー中
に−70℃で保存する。Ｄ組織培養中のウイルス増殖Ａ感染１通常250cm³使い棄て組織培養フラスコ中、適
当な細胞タイプの24〜48時間単一層培養が僅か
に連接的となつた時に使用する。２全感染及び採取は生物学的安全キヤビネツト
中で行い機械ピペツト装置のみを使用する。滅
菌技法を順等する。３被感染培養液の発育培地を25mlの維持培地で置
換する。対照培養液も維持培地25mlを加える。４ウイルスのソース又は前行程の滴定から提供さ
れた情報に従つて種ウイルスを血清無添加
MEMで稀釈し、そして0.5mlを各培養液に加え
る（コントロールを除く）。５培養液は37℃、５％CO₂と95％空気の湿つた
大気中で48〜72時間インキユベートし、各ウイ
ルスに特徴的な細胞変性作用（CPE）の発現
について毎日観察する。Ｂ採取１ CPEが３〜４＋度に達した時に培養液を採
取のため取出す。０明白な細胞変性作用のないもの１＋ 25％の細胞が細胞変性作用を示すもの２＋ 50％〃３＋ 75％〃４＋ 100％〃２培養液は３回凍結及び融解して細胞層から溶
解し取除く。三回目に融解した後、培養液を滅
菌した使い棄て遠心管に移し、細胞層を除去す
るため300ｇで30分間遠心する。このウイルス
懸濁液は細菌悪染について検査される。３上清は直ちに２c.c.滅菌血清試験管内に分注
（0.5〜１ml）され、液体窒素中で凍結される。４滴定用には、24ウエル平底組織培養プレート
中に単一層培養が準備され次の通り感染され
る。 (a) ５％仔牛胎児血清（FCS）冷維持培地でウ
イルスの10倍稀釈剤を作る（10^-1〜10^-7）。 (b) 各稀釈液の１mlを個々のウエルの三対に加
える。 (e) 維持培地のみを含む対照培養液も含む。５培養液を37℃、湿つた５％CO₂及び95％空気
中で48時間インキユベートし、培養層を上記の
ようにスコアー付けする。Reed及びMunch滴
定法に従つてTCID50力価を算出する。Ｅ血球吸着分析（HAd）１ HAd分析を行う直前に細胞培養トレイから
培地を傾捨する。２維持培地１mlを各培養ウエル中に加える。３対照培養液の２系列は維持培地のみを加え
る。４試験培養液及び対照培養液系列の一つに直ち
に稀釈ウイルス液0.1mlを接種する。（インプツ
トカ価は前回HAd FFU分析によつて指定され
ている）。HAdFFUは血球吸着焦点形成単位で
ある。５他の対照培養系列にはブランク接種として
MEMのみを加え無感染を維持する。６別に特記しない限り培養液は37℃で16〜18時
間インキユベートする。７接種期間後、培地は傾捨し、培養をPH7.2の
PBSで一回洗浄する。８ウエル当り5/10mlのRBS懸濁液を加え、培
養液を30分間室温に維持する。９次にRBC懸濁液を傾捨し、そして培養液を
PBSで２〜３回洗浄し、特異的に結合した
RBC以外のものを除去する。 10 最後にHanKs均衡溶液（HBSS）1.0mlを各
ウエルに加える。 11 血球吸着されたRBCの焦点数は最初は４倍
対物レンズをもつニコン逆転位相差顕微鏡を用
いて算える。 12 全例とも計数にはウエル当り最低５つの無作
為視野を選ぶ。 13 HAd焦点計数をBausch ＆Lomb Omnicon
Alpha Imageアナライザーをで行う。 14 顕微鏡視野映像はVediconスキヤナー上に映
写される。そしてまた操作員が残屑による誤り
を検知し減数できるようにテレビジヨンスクリ
ーンに映される。焦点は灰色レベルと映像の大
きさによつて検知される。 15 残りの非吸収RBCの計数を除去するために、
個々のRBCを映写する特大計数モジユールが
プログラムされている。 16 統計的解析には変動デザインモデルの分析に
使用されるデータ解析を含む。変動ソースとし
ては処理、処理内のウエル及びウエル内分野に
起因する実験誤差等によるものがある。各視野
当りの平均感染細胞数及び平均値の標準誤差が
各ウエル毎に計算される。各処理に対する平均
値と標準誤差は、各処理内ウエルをプールして
計算される。各処理に対する視野当りの平均感
染細胞数は、処理に対する全般Ｆ検定とは無関
係にDunnetの多重比較試験法によつて対照と
比較される。（下記参照。）

【表】Ｆヒト末梢血リンパ球（HPBL）の調製Ａ Ficoll−Hypaque分離培地の調製１ 22.5ｇのFicoll400（フアルマンア、分子量
400000）を蒸留水200mlに溶解する。殆んどの
物質が溶解した時に、蒸留水で容量を250mlに
調整する。２ 34ｇのHypaque（sodium diatrigoate、
Sterling Organics、分子量636）を100mlの蒸
留水に溶解する。３次にこの溶液を0.45μのミリポアフイルター
を通して無菌過し、無菌容器中に遮光して４
℃で保存する。４ 10mlのHypaque溶液と24mlのFicoll溶液を混
合して試験溶液を調製する。この混合物はたえ
ず撹拌して、25℃に加温する。Ｂ全血からPBLの分離１ヒト全血清検体は静脈穿刺によつてヘパリン
加20ml減圧試験管中に採取する。非稀釈血液15
〜20mlを、滅菌50mlポリカーボネート遠心管中
に等量のFicoll−Hypaque溶液の上に無菌的に
静かに重層する。２調製検体は25℃、400ｇで30分間遠心する。
境界面のかすんだ白色帯を、10〜20mlRPMI−
1640を加えた50ml滅菌遠心管中に無菌的に吸引
する。細胞を25℃、400ｇ10分間で１回洗浄す
る。３ペレツト状PBLを最初に使われた全血各８
ml当り１mlのRPMIに再溶解し、コールターカ
ウンターで計数する。濃度はグルタミン及び抗
生物質加RPMI1640によつて調整する。細胞は
使用される迄室温で保存する。Ｇ PHA及びLPSによるHPBLの使激１健康人ボランテイアから10〜40mlの全血をヘ
パリン加試験管内に採血する。２ Ficoll−hypaque分離法を使つて上記血液か
らリンパ球を分離する。３種々の濃度の被験化合物をRPMI1640中に調
製する。４リンパ球濃度はRPMI1640／ml当り２×10⁶
に調整する。５リンパ球を被験化合物と共に37℃で90分間イ
ンキユベートする。６ヒツジ赤血球（SRBC）（１〜２週経つたも
の）をPBSで３回洗浄し、RPMI1640中に最終
濃度0.5％に稀釈する。７反応試験管中下記を含有するように準備す
る。リンパ球（２×10⁶） 0.2ml ９％Ficollを含むRPMI1640 0.2ml SRBC（RPMI1640中に0.5％） 0.2ml ８上記反応物を室温、200ｇで５分間遠心する。９次に沈渣を静かに再懸濁し、血球計上に101
検体を置く。 10 顕微鏡を用い、３個以上の付着赤血球をもつ
リンパ球をロゼツトとして数えて、ロゼツト数
を計数する。ＨＥ−ロゼツト形成細胞Ａミトゲンの調製１リポポリサツカライドＢ又はフイトヘマグル
チニンＰ粉末を計量しRPMI1640中に1000μ
ｇ／ml“１mg／ml）の濃度になるように溶解
し、0.45μミリポアフイルターを通して無菌
過する。２溶液をラベルした滅菌クリオ試験管内に無菌
的に分注（１ml／管）し凍結する。検体は一部
使用後凍結はしないが、４℃で１〜２日間保存
し得る。凍結乾燥末は４℃で冷蔵庫に保存す
る。Ｂ培養液の調製１グルタミンと抗生物質−真菌溶液（GIBCO）
で補充した無血清RPMI1640中に、PBLをSOP
＃Ｉ−004として調製する。96ウエルマイクロ
テスト平板（Costar plastics）の各ウエルに
ウエル当り1/10mlを、滅菌チツプを備えた８チ
ヤンネル自動マイクロピペツト（Flow Lab）
を使つて添加する。２ミトゲン溶液を急速に融解し、RPMI1640で
所要濃度に４倍稀釈する。３被験化合物はSOP＃Ｃ−002として調製さ
れ、RPMI1640を稀釈剤として所要最終濃度に
４倍稀釈される。４ミトゲン及び／又は被験化合物の各稀釈液50μ
を六対の培養液に加える。対照培養液中には
RPMI1640のみを同量の計0.2ml／ウエルの量
を加えた。５培養液は37℃で加湿した95％空気５％CO₂大
気（PH6.0〜7.0）中で48時間インキユベートす
る。次に更に18時間細胞を3H−TdR（チミジ
ン）0.5μCi／ウエルで標識する。細胞を多重自
動サンプル採取器（Ｍ、Ａ、Ｓ、Ｈ）で採取す
る。非粘着細胞は0.9％生食水（10ウエル洗浄）
と共にグラスフアイバーフイルター片上に吸引
され、そして細胞は蒸留水で溶解される（20ウ
エル洗浄）。フイルター片は完全に風乾され、
残つた細胞沈澱物はフイルター片から切離さ
れ、各サンプルは１ドラムガラスシンチレーシ
ヨンバイアル中に置かれる。シンチレーシヨン
濃縮液（Scintiprep1、Fisher Chemicals）を
シンチレーシヨングレードトルエン
（Packard）で50倍に稀釈し、その１mlを各バ
イアルに加える。液体シンチレーシヨン分光で
検体を測定し、データは平均カウント数／分／
被験群で表現される。Ｉ免疫プラク分析Ａ NPT15392の調製１ NPT15392の500μｇ／mlを含有する溶液は、
滅菌PBS中に事前計量した薬剤粉末を加えそ
の溶液を30分間超音波処理することにより調製
した。２ GCA／Mc Pherson ダブルビームスペクト
ロフオトメーターの波長を250nmに調整する。３ NPT15392を0.1規定塩酸を0.1規定塩酸で
１：10に稀釈する。４ 0.1規定塩察15mlをビーカーに注入する。こ
の溶液はキユベツト洗浄に使われる。両キユベ
ツトに0.1規定塩酸を満たしその波長を読む。
吸光度はゼロ値から0.001〜0.005の範囲になけ
ればならない。５検体用キユベツトを空にし、稀釈した薬剤溶
液を加える。６吸光度を記録し濃度を次式により算出する。式Ａ（吸光度）／11.31×稀釈係数×原子量（278）
＝ｇ／ml Ｂ０日以前１ NPT15392薬剤溶液はPBS1ml当り
NPT15392 500ｇを溶解して調製する。２このSOPのＡ項に従つて濃度を調べる。３ストツクは１mlサンプルに分注し、−20℃で
数ケ月間保存する。４溶液を融解し所要濃度に稀釈する。Ｃアガロースベースプレートは下記のように調
製する。１ PBS中1.4％アガロース懸濁液（500ml中７
ｇ）を15分間加熱滅菌する。２ Cornwell注射筒を使つて、溶けたアガロー
ス３ml量を無菌的にFalcon＃1006ペトリ血上
にとり、均一な層を作らせるように回転させ
る。３これらのプレートは使用前４℃で１週間迄保
存できる。これらのプレートは転倒した状態で
保存する（プレートの上に寒天）。Ｄモルモツト血清の調製１２〜６匹のモルモツトから心穿刺により10ml
の血液を採血し、抗凝固剤なしで50mlFalcon
＃2070遠心管中に入れる。２これら試験管を凝固塊形成のため37℃で45分
間インキユベートする。３次に試験管をインキユベーターより取出し、
凝固物を収縮させるため30分間氷上に置く。４各試験管から血清を無菌的に流し出し、プー
ルした後１mlに分注し、使用迄−70℃に保存す
る。Ｅ免疫法、０日１下記の通りマウスを免疫する。ヒツジ血（ヒ
ツジ＃23）は毎週Hyland Labから供給され
る。それは血液１容に対しAlser Vier液２容
に無菌的に集められる。２ Alservier液中のヒツジ赤血球5/10mlを＃４
（2800rpm）に調節したIEC臨床遠心機で室温
で10分間遠心することによつて無菌PBSで３
回洗浄する。３ペレツトを滅菌PBS中１：10に再懸濁する。４コールター使用手引書に従つてＺ型コールタ
ーカウンターを検量する。５コールターカウンター細胞計数のためには
１：10000稀釈が必要であるが、最初のPBSで
１：100稀釈液をつくり次にこの溶液をisoton
で１：10に稀釈して調整する。コールターカウ
ンター閾値はセツテイング＃５に調節する。６細胞数を測定し、ストツク溶液を４×10⁷細
胞／mlに稀釈する。この最終懸濁液を免疫法に
使用する。７各マウスにSRBC懸濁液0.1mlを側尾静脈
（血管拡張させるため水浴中で50℃に加温）中
に静注して免疫する。SRBCの最終濃度は４×
10⁶マウスである。Ｆ処置１マウスは０，１，２及び３日目に腹腔内注射
により処置する。注射筒（１c.c.）に1.5インチ
の26ゲージ針をつける。針を白線の右側に沿つ
て45゜の角度で導入する。薬剤処置群と対照群
の両方とも0.2mlの量を投与する。２薬剤処置群では所定濃度のNPT15392溶液
0.2mlを投与するが、20ｇのマウスでは5μｇ／
mlである。Ｇ脾臓調製、４日目１脾臓を無菌的に除去し、MEM3mlを含んだ
Falcon＃2025組織培養試験管中に別個に入れ
る。次にこれら試験管を氷上に保存する。２ G.K.Heller GT−21 モーターコントロー
ラーセツテイング＃６に連結されたG.K.
Heller可変速度可逆モーターに取付けられたテ
フロン乳棒で、同一試験管中で脾臓をホモジエ
ナイズする。３ホモジエナイズ時間と操作はサンプル毎に同
様でなければならない。４次に検体を100メツシユ40ミクロンステンレ
ススチール篩を通して標準組織培養試験管中に
過する。篩を３mlのMEMで洗浄し、細胞懸
濁液を氷上に保存する。５コールターカウター細胞計測のために１：
1000稀釈液を作るが、最初にPBSで１：100に
稀釈しついでisotonで１：10に稀釈する。６細胞数を測定し、ストツク懸濁液を１×10⁷
細胞／mlに稀釈する。コールターカウンター閾
値を10に調節する。赤血球をZap isoton ３滴
に溶解する。Ｈ Topアガーの調製（0.7％）１ 35/100ｇのアガロースと0.53ｇのMEM末を
エルレンマイヤーフラスコ中にとる。蒸留水50mlをフラスコに加える。２この溶液を15分間、250〓及び15psiで高圧蒸
気滅菌する。次にそれを45゜の水浴中に５分間
置く。重炭酸ナトリウム（0.1mlNo₂Co₃）を加
えてPHを約7.2に調整する。３前もつて水浴中に置かれた５ml組織培養試験
管中に１mlを分注する。プレート操作時エラー
の場合の交換用に数本の余分な試験管を準備す
る。Ｉ 10％SRBC溶液の調製１５mlのヒツジ血（免疫法に使用したものと同
じバツチ）を、IEC Clinical Standard
Centrifugeを使用して回転数＃４（2800rpm）
で10分間、PBSで３回洗浄する。２３回目の洗浄後、充填細胞容量の10倍容量の
PBS中に、即ち充填SRBC0.5mlをPBS5mlに、
細胞を再懸濁する。Ｊ平板調製１寒天平板を冷蔵庫から取出し、室温にもどす。
これら平板を各実験群用に三対づつ標識する。２寒天を満した試験管を水浴から取出す。10％
SRBCの1/10及び脾細胞懸濁液0.1mlを各寒天
試験管中に加える。試験管をVortex混合機上
で撹拌する。３試験管の内容物を寒天平板中に直ちに流し出
し、なめらかな層となるまで回転させる。この
平板を寒天が固化するまで平らな平面上に置
く。４この平板を５％CO₂と95％空気の加湿大気中
37℃で90分間インキユベートする。５モルモツト補体（Ｄ項の調製参照）をフリー
ザーから取出し、室温で溶解してPBSで１：
10に稀釈する。６インキユベーターから平板を取出し、各平板
に稀釈補体１mlを加える。７次に平板を37℃で更に30〜45分間インキユベ
ートとする。次に平板をインキユベーターより
取り出し、斜角光を使つて数をかぞえる。８平板は転倒位で４℃で保存され、24時間後迄
計数する。実施例における治療的使用の概要本発明の主題化合物は、標準組織培養法を使つ
てRNAウイルスの代表的サンプルの増殖を抑制
することを示した。RNAウイルスの場合、亜型
Ａに属するインフルエンザウイルスは血球吸着法
を使つて抑制されることが認められた。
NPT15457及びNPT15458の数化合物は、3.6〜
360nmole／mlの範囲の濃度でインフルエンザウ
イルスの増殖を抑制することを示した。その他のRNAクラスのウイルスが第６表に示
され、これらは記載された疾患の原因となる。世
界中の全疾患の中、少くとも25％ウイルスによつ
て起ることが知られている。更に、腫瘍の発生を
示す多数のウイルスが分離されている。このよう
に抗ウイルス剤はそれ自身若干の抗腫瘍作用即ち
抗白血病作用が期待されるものである。これら薬剤の一つの活性として、NPT15458が
異常リンパ球発育阻害剤として決定された。とり
わけNPT15458は組織培養においてマウス白血病
リンパ球（Ｌ−1210細胞系）の増殖を阻害し得
る。NPT15458は10μｇ／mlの濃度でＬ−1210細
胞の40％阻害に有効であつた。最終的に、第３表に示されたデータから正常体
PH（7.2）においてこれら化合物は良好な化学安
定性を有するが、しかしアルカリ性PHに於ては活
性剤NPT15392に分割されることが実証された。
第９表に認められるように、エステル特に
NPT15458は動物組織とのインキユベーシヨンに
よつてNPT15392に分割する。これが主題化合物
“プロドラツグ”がその示された生物活性を有す
る理由であろうと推測される。更に第10表に示さ
れたデータは、NPT15458をマウスの腹腔内に注
入した時、NPT15392自体を投与した時よりも少
くとも12倍高い生物学的活性物質NPT15392の高
血中濃度を生ずることが実証された。更に第９表
から認められるように、ベロ細胞（腎）、肝及び
HPBLはすべてこの“プローホスト”を生物学的
に活性なNPT15392に分割する。本発明による物質は特異的なウイルスの増殖を
阻害し、免疫応答を調節し（増強又は抑制）そし
て白血病リンパ球の発育を阻害する。NPT15392
に較べて、これら化合物が成し遂げたinvitro実
験及びより高い血中濃度に基いて、これら化合物
は0.01〜100μｇ／mlの濃度範囲にわたつて活性を
示したことから、哺乳動物における有効量範囲は
0.0005〜50mg／Kgと予想される。剤型本発明による化合物は体重Kg当り１〜1000mgの
用量を与えることが出来、そして0.0005mg／Kgの
低濃度で活性であることが期待される。これら化合物はヒト或は動物に錠剤又はカプセ
ルの剤型で投与し得るし、溶解度が許せば水溶性
シロツプ、油性溶液又は不溶性ならば懸濁液とし
て投与され得る。代表的な医薬品処方を下記に示
す。カプセル NPT15458 0.1〜500mg Avicel PH 101 で800mgとする。（微晶質セルローズ）懸濁液水溶性懸濁液は活性薬剤に多くの懸濁剤を加え
ることによつて調製し得る。懸濁剤としてはカル
ボキシメチルセローズナトリウム、アルギニン酸
ナトリウム、トラガカント、Avicel RC−591（微
晶末セルローズ）、メチルセルロース、Veegum、
Xanthanガムのようなものが含まれる。懸濁剤の
他に甘味剤、香料、色素、防腐剤、保護コロイド
及び分散剤等の物質が加えられることがある。シロツプ処方 NPT15458 0.05〜250mg （又は最大溶解量）デキストロース 3.25 ｇ蒸留水 0.05 ｇ FDC赤色40 0.00175ｇサツカリンナトリウム 0.00250ｇアルコール（U.S.P.） 0.08 ｇメチルパルベン（U.S.P.） 0.005 ｇグリセリン 0.001 ｇ Cherry Flavor 0.31225ｇ Fruit Flavor 0.00825ｇ蒸留水適宜加える５ml 錠剤処方 NPT15458 0.1〜500mg Avicel PH 101 130mg でんぷん（変性） 20mg ステアリン酸マグネシウム（U.S.P.）
5.5mg ポリピニールピロリドン 22mg ステアリン酸（U.S.P.） 30mg

Claims

【特許請求の範囲】１下記の構造式を有する化合物。（ただし、R¹は炭素原子３〜８箇のアルキル
基であり、R²は非置換脂肪族モノ又はジカルボ
ン酸のアシル部分である。）２ R¹はノルマルアルキル基である特許請求の
範囲１の化合物。３ R¹が炭素原子３〜７箇のノルマルアルキル
基である特許請求の範囲２の化合物。４ R¹が炭素原子３〜６箇のノルマルアルキル
基である特許請求の範囲３の化合物。５ R¹がｎ−ヘキシルである特許請求の範囲４
の化合物。６ R²が炭素原子１〜18箇を有する脂肪酸、ま
たは、アルカンジ酸若しくはアルケンジ酸の半エ
ステル基である特許請求の範囲１の化合物。７ R¹がｎ−ヘキシルである特許請求の範囲６
の化合物。８ R²が蟻酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸又は
パルチミン酸のエステル基である特許請求の範囲
６の化合物。９ R²が酢酸のエステル基である特許請求の範
囲８の化合物。１０ R²がヘミマロネート、ヘミフマレート、
ヘミマレエート又はヘミサクシネートである特許
請求の範囲６の化合物。１１ R²がヘミサクシネートである特許請求の
範囲１０の化合物。