JPH02504470A - アントラサイクリン抗生物質に対して耐性の遺伝子の単離及び特徴付け - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 二ｚ］］した一ｆ　７’）＞　　　　　　１．：　　Ｌ又ｆｌ！及麦］九監１Ｊ 九 本発明は、アントラサイクリン抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含むＤ ＮＡフラグメント、このようなりＮＡフラグメントを含む組換体ベクター及び該 ベクターで形質転換された宿主に係る。

抗腫瘍療法で最も広く使用されている物質には、ドキソルビシン、カルミノマイ シン及びアクラシノマイシンのようなダウノルビシン群のアントラサイクリンが ある。これらのアントラサイクリンは５ｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓの種々の株（Ｓ 。

より産生されるポリケチドである。

ドキソルビシンはＳ、　ｅｕｅｅｔｉｕｓ　ｖａｒ、　Ｃａｅ＄ｉｕＳによって のみ産生される。　Ｓ、　ｅｕｃｅｔｉ　ｓ　ｖａｒ、　ｃａｅＳｉｕＳＩＭＲ Ｕ　３９２０（以下、”も」！ジ：ｅｔｉｕｓ　３９２０”と略称する）型の株 は一般に入手可能であり、米国特許第八−３５９００２８号に記載されている。

Ｓ、　ｅｕｃｅｔｉｕｓ　３９２０は米国Ｒｕｔｇｅｒ大学のＩｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ　ｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙに受託番号ＩＨＲ１ｌ　３９２０で寄託され ている。この株及び従来の突然変異誘発処理により得られるその突然変異体は高 レベルのドキソルビシンに対して耐性である。

これらの物質に対する耐性に関与するメカニズムの研究は主に次の２つの理由で 重要である。

＆）二次代謝産物の生合成に関与する遺伝子が少なくとも１種の耐性遺伝子と共 に完全にクラスター化されているような例は多く、例えばオキシテトラサイクリ ン（Ｒｈｏｄｅｓ　Ｐ　Ｍ。

Ｈｕｎｔｅｒ　Ｉ　Ｓ、　Ｆｒ１ｅｎｄ　Ｅ　Ｊ及びＷａｒｒｅｎ　Ｍ、　１９ ８４．　ＴｒａｎｓＢｉｏｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　１２．５８６−５８７）、エリス ロマイシン（Ｓｔａｎｚａｋ　Ｒ。

Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ　Ｐ、　Ｂ１１ｔｚ　ＲＢ及びＲａｏ　ＲＮ、　Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙｖｏｌ　４．　Ｍａｒｃｈ　１９８６．２２９−２３２）、 タイロシン（Ｆａｙｅｒｍａｎ　Ｊ　Ｔ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ　４．５ｅｐｔ　１９８６．７８６−７８ ９）及びテトラセノマイシン（Ｍｏｔａｍｅｄｉ　Ｈ，Ｈｕｔｅｈｉｎｓｏｎ　 ＣＲ，Ｐｒｏｃ　ＮａｔｌΔｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳ＾、　ｖｏｌ　８４．４４ ４５−４４４９．１９８７＞がその例である。

経路を変更して異なる分子を産生ずるため、又は生合成経路中に存在する障害を 解決し、こうして株の産生率を増加する目的では、生合成遺伝子のクローニング が有益であり得る。

ｂ）耐性それ自体は調節機構に関与し得るので、耐性レベルを変える（即ち遺伝 子量を増加する）ことにより株の産生率を改良することができる。これは従来の 突然変異誘発及びランダムスクリーニング法により通常実施されている旧来の思 想であるが、ｒＤＮＡ法（Ｃｒａｖｅｒｉ　Ｒ及びＤａｖｉｅｓ　Ｊ　Ｅ＋Ｔｂ ｅ　Ｊｏｕｒｔ＋ａｌ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、　Ｊａｎ　１９８６． １２８−１３５）の使用により改良された。

さて本発明者らは、ドキソルビシン耐性遺伝子を含む２種のＤＮＡセグメントを 単離するに至った。従って、本発明は添付図面の第１図又は第２図に示す制限部 位の構造を有するＤＮＡ、又は該ＤＮＡから誘導され、ドキソルビシン耐性をコ ードする遺伝子を含む制限フラグメントを提供するものである０便宜上、第１図 及び第２図に示すＤＮＡセグメントを本明細書中ではインサートＤＮＡと呼称す る０本発明は更に、 一宿主細胞を形質転換することが可能であり、インサートＤＮＡ又は該ＤＮＡか ら誘導され、ドキソルビシン耐性遺伝子を含む制限フラグメントを含む組換体ベ クター、及び−このようなベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。

図面の簡単な説明 より詳細には添付図面を参照されたい。

尚、第１図は本発明の第１．のＤＮへの制限地図分析である。

これは組換体プラスミドＦＩＣＥ　１（Ｒｅｃ　１）のインサートである。イン サートは５ａｕ３＾Ｉ末端を有しており、ｐｌＪ７０２のＢｇ［■部位に挿入し た。連結後に１つのＢｇｌ１１部位を再構成した。

第２図は本発明の第２のＤＮＡの制限地図分析である。これは組換体プラスミド ＦＩＣＥ　２（Ｒｅｃ　２）のインサートである。

インサートは５ａｕ３＾Ｉ末端を有しており、ｐｌＪ７０２のＢｇｌ１１部位に 挿入した。連結後に１つのＢｇｉ部位を再構成した。

第１図及び第２図に示した地図は必ずしも各ＤＮＡセグメント中に存在する全制 限部位を残らず列挙したものではない、もっとも、図面上に記した部位でセグメ ントを十分明確に認識することができる。

本発明のインサートＤＮＡ及び制限フラグメントはドキソルビシン耐性をコード する遺伝子を含む、このような遺伝子を発現させるためには、ＤＮＡはそれ自体 の転写制御配列、特に有効に作動するように遺伝子に結合され且つ宿主細胞ＲＮ ＾ポリメラーゼにより認識されるそれ自体のプロモーターを担持し得る。あるい は、インサートＤＮＡ又は制限フラグメントを別の転写制御配列に正確に連結す るか、又はベクター内の転写制御配列に隣接するように適当に配置された制限部 位でベクターにクローニングすることができる。

ドキソルビシン耐性遺伝子を有するインサートＤＮＡ又は制限フラグメントを、 組換体ＤＮＡクローニングベクターにクローニングしてもよい、１以上の付加的 ＤＮＡセグメントを加えることが可能なり８３分子を含む自律複製及び／又は組 込み物質であればどのようなものでも使用することができる。しかしながら、典 型的にはベクターはプラスミドである。好適なプラスミドは高コピー数のプラス ミドｐｌＪ７０２（Ｋａｔｚ他、Ｊ　にｅｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌ　１９８３１ ２９２７０３−２７１４）である。

インサートＤＮＡ又はその制限フラグメントをベクターに挿入するためには適当 なものであればどのような方法を用いてもよい、挿入は開環したベクターの適当 な制限部位にＤＮＡを連結することにより達せられる。このためには、付着末端 もしくはホモポリマー末端の直接結合、又はリンカ−もしくはアダプター分子を 使用することができる。

適当な宿主細胞、典型的にはドキソルビシン耐性を発現する能力から利益を得る 細胞を形質転換するために、組換体ベクターを使用する。宿主細胞はドキソルビ シン感受性のものであり得、即ちドキソルビシンの存在下では増殖することがで きない細胞、又はドキソルビシン耐性でありながらより高いドキソルビシン耐性 から利益を得るような細胞であり得る。宿主は微生物であり得る。従って、ドキ ソルビシンを産生するＳ　　ｅｕｃｅｔｉｕｓ工の株、より特定的にはＬ７　ｖ ａｒ、　ｅａｅｓｉｕｓ及びアントラサイクリンを産生する５ｔｒｅ　ｔｏｅ　 ｃｅｓの他の株が形質転換され得る。ドキソルビシンに対する耐性、又はより高 い耐性はこのような株の細胞により更に多量のドキソルビシンを産生させ得る。

より高濃度のドキソルビシンに対する耐性が得られる。Ｓ凹ｕｅｅｔｉｕｓ−の 株の形質転換細胞は典型的にはプロトプラスト形質転換により得られる。即ちド キソルビシンは、Ｌ７−の形質転換株を培養し、こうして産生されたドキソルビ シンを回収することにより得られる。

インサー）ＤＮＡは７μｍ８７６のゲノムＤＮ＾がら得られる。Ｓ　　ｅｕｅｅ ｔｉｕｓ工Ｍ７６はダウノルビシンを高レベルでドキソルビシンに変換すること が可能な辷肚肚■亘ハ９２０の突然変異体である。　Ｓ　　ｅｕｃｅｔ、ｉｕｓ 　８７６は１９８８年５月１１日付けで西ドイツのＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍ ｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に受託番号り、 Ｓ、Ｍ、　４５９２で寄託された。典型的には同様にダウノルビシンをドキソル ビシンに転換することが可能な、Ｓ　　ｅｕｃｅｔｉｕｓ　８７６由来のその誘 導様も使用することができる。従って、インサートＤＮＡは、（ａ）１」旦ｕｅ ｅｔｉｕｓ工Ｍ７６もしくはその誘導様のゲノムＤＮへのライブラリーｌを作製 する段階と、 （ｂ）ライブラリーからドキソルビシン耐性をスクリーニングする段階と、 （ｅ）ライブラリーの一部を形成し且つドキソルビシン耐性が陽性であるとして スクリーニングされた組換体ベクターからインサートＤＮＡを得る段階と、 （ｄ）場合によって、ドキソルビシン耐性をコードする遺伝子を含む制限フラグ メントをインサートＤＮＡから得る段階とにより得られる。

ライブラリーは段階（ａ）においてＳ　　ｅｕｃｅｔｉｕｓ　８７６もしくはそ の誘導様のゲノムＤＮ＾を部分的に消化することにより作製され得る。好ましく は制限酵素Ｍｂｏ　Ｉを使用する。こうして得られたフラグメントをサイズ分画 する。４り６Ｋｂの寸法のフラグメントが好適である。これらのフラグメントを ｐｌＪ７０２のような開環したベクターに連結する。宿主細胞を連結混合物で形 質転換する。典型的には宿主細胞はドキソルビシン感受性であり、例えば５（１ ｍｃｇ／皺１以下、好ましくは３０ａｃｇ／ｘｉ以下のドキソルビシンに対して 感受性である。

例えば、Ｓ　１ｉｖｉｄａｎｓτＫ　２３１０ドプラストが形質転換され得る。

段階（ｂ）では、こうして得られた形質転換細胞からドキソルビシン耐性をスク リーニングする。ドキソルビシンを含む培地で増殖することによりドキソルビシ ン耐性のクローンを同定する。このようなりローンを単離し、該クローンに含ま れる組換体ベクターを抽出する０段１１ｉＦ（ｃ）で組換体ベクターを適当な制 限酵素で消化後、各ベクターに挿入したＳ　　ｅｕｅｅｔｉｕｓ工Ｍ７６　ＤＮ Ａを同定、サイジング及びマツピングし得る。こうして、ベクターが本発明のイ ンサートＤＮＡを含んでいるかどうかをチェックしてもよい。

更に、本発明のＤＮＡ内に完全又は部分的に含まれる２つ以上のオーバーラツプ するインサートを単離することができる。このインサートは、共通制限部位で切 断し、その後、本発明のＤＮＡを得るように連結することにより相互に融合され 、必要に応じて適当な制限酵素を使用して対合され得る。ドキソルビシン耐性を コードする遺伝子を含むインサートＤＮＡの制限フラグメントは、同様に段階（ ｄ）でインサー）　ＤＮＡを適当な制限酵素で切断することにより得てもよい。

最後に、ドキソルビシン耐性を付与する能力に影響しないような方法で本発明の ＤＮＡを突然変異させることができる。これは例えば特定部位の突然変異誘発に より得られる。

このような突然変異したＤＮＡも本発明の一部を形成する。

以下の実施例は本発明を具体的に説明するものである。

実施例中、Ｔｓ’、Ｄｏｘｏ″及びＤｏｘｏ’は夫々チオストレプトン耐性、ド キソルビシン耐性及びドキソルビシン感受性の表現型を表す。

え１１ １．１１１ＬＬＬ びブースミド： ダウノルビシン及びドキソルビシンを産生じ且つドキソルビシンに対して耐性Ｃ ＭＩＣ２５０ｍｃｇ／ｉｌ）の糸状ストレプトマイシートである８工証上述りじ １」Ｊ左ゴユリエ８７６と、ドキソルビシンに対して感受性の数種の生合成突然 変異体、及びドキソルビシンに対して感受性のＳ、１ｉｖｉｄａｎｓ　ＴＫ　２ ３を使用した。

高コピー数のプラスミドｐｌＪ７０２は、英ｒ５Ｎｏｒｗｉｃｈに所在のＪｏｈ ｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎがら入手した。

境１巳【びｎ腋− ＴＳＢは蒸留水！当たり３０．のトリプシンダイズブロス（ＤＩＦＣＯ）を含有 し、ＹＥＭＥは蒸留水！当たり５ｇの酵母エキス（ＤＩＦＣＯ）、１０ｇの麦芽 エキス（ＤＩＦＣＯ）、３４０ｙのスクロース、５ｍＭのＭｇＣ１，。

６Ｈ２０及び可変濃度のグリシンを含有するものとした。

再生培地Ｒ２ＹＥはＰ　ＨＨｏｆｓｅｈｎｅｉｄｅｒ及びＩｌｌ　Ｃｏｅｂｂｅ ｌｉｉ″ＧｅｎｅＣ１ｏｎｉｎｇ　：ｎ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｏｔｈｅｒ　ｔ ｈａｎ　Ｅ、　ｃｏｌｉ″、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　Ｂｅｒｌｉ ｎに所収のＣｈａｔｅｒ　Ｋ　Ｆ、　Ｂｏｐｗｏｏｄ　Ｄ　Ａ。

Ｋｉｅｓｅｒ　Ｔ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ　ＣＪ（１９８２）　−Ｇｅｎｅ　ｅｌ ｏｎｉｎｇ　ｉｎＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”、　６９−９５の記載に従った。

培地は！当たりの組成が、 スクロース　　　　１０３１ ２．５％に、ＳＯ，１０ｘｌ１ ＭｇＣｌ　２・６８，０　　　１０．１ｆグルコース　　　　１０ｇ カザミノ酸　　　　０．１ｇ 寒天　　　　　　２２゜ 微量成分混合物　２ｍ１ ０．５％ＫＨ２ＰＯ，１０ｚｌ ＬＭ　ＣＣＬ　　　　　　ＺＯｘｌ プロリン　　　　　３２ ０．２５Ｍ　ＴＥＳ　ｐＨ７゜Ｚ　　１００ｖＩ！１０％酵母エキス　５０ｍ１ となるように調製した。

培地ＰはＢａ［ｔｚ　ＲＨ，Ｊ　Ｃｅｎ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏ！　１０７：　９３ −１０２（１９７８）の記載に従った。

ストレプトマイシートは、米国特許第＾−３５９００２８号の実施例２に記載さ れている固体培地に維持した。

１１灸１：液体培！！物の場合、２種の−至一種を２８℃の５０ｍ１のＹＥＭＥ ＋　ＴＳＢ（１：１）で、回転振盪器で２８Ｏｒｐｍで振盪して増殖した。増殖 培地に均質化した菌糸体を接種した。

均質化は、ガラスピーズを収容する管に菌糸体を入れて渦形成することにより行 った。

ロ　ブースト 液体培養物（０，５％グリシンを補充）３５ｉ１から菌糸体を遠心分離（１０分 間、ｔｓｏｏｘｇ）により回収し、１０．３％スクロースで２回洗い、ｌｚｙ／ ｚ１のリゾチーム（ＳＩにＭ＾）を含むＰ培地１０１１に再懸濁し、往復＠盪（ ２８０ｒｐｍ）下に３０℃で６０分間インキュベートした。プロトプラスト形成 後、懸濁液を綿に通して一過し、Ｐ培地で１回洗い、Ｐ培地１ｘｌに再懸濁した １通常１０１個のプロトプラストが得られた。

各形質転換につき、約２Ｘ１０’個のプロトプラストを含むＰ培地２００ｐ４を 、所望量のＤＮＡをＴＥ（Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　１０Ｊ、ＥＤＴ＾１ｅｉＮ　ｐＨ ８，０）に溶解して成る溶液１０ｐ４及び２５％ポリエチレング’、Ｊ　ニア　 −ル（ＰＥに）１０００ノＰ培地溶液８００ｕｌト混合しり、ＰＥＧ溶液の添加 から１分後に、Ｐ培地５ｘｌを加えることにより形質転換を終了した。１０ドプ ラストを遠心分離によりベレット化し、ＩＲｌのＰ培地に再懸濁し、ＲＺＹＥ上 でプレー１−培養した。２８℃で２４時間インキュベーション後、適当な抗生物 質を含有する３１１１の軟ＮＡ（１当たり８．の旧ＦＣＯニュートリエンドブロ ス及び５ｇの寒天を含有する）でプレートを溢流することにより形質転換細胞を 選択した。形質転換細胞の数は使用した株に従って、ＤＮＡｍｃｇ当たり約ｌＸ ｌ０’〜ｌＸｌ０’であった。

プラスミド　びゲノムＤＮ＾の！！ＪＬＨｅｐｗｏｏｄ　　Ｄ　　Ａ他（１９８ ５）”Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍ ｙｅｅｓ−＾Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−Ｔｈｅ　Ｊｏｈｎ　Ｉｎｎ ｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の方法を使用してストレプトマイシートからの プラスミド及びゲノムＤＮ＾の単離を実施した。

Ｓ、　ｅｕｃｅｔｉｕｓ　Ｍ２Ｓ　　ツム１仁ｆ１去コαｉｌ全制限酵素、仔ウ シ胸腺アルカリホスファターゼ及びＴ４リガーゼはＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｃｌａ 、　ＨＤ）から入手し、製造業者ノＴｊｇ　示に従って使用した。　Ｓ、　ｅｕ ｅｅｔｉｕｓ　８７６ゲノムＤＮ＾をＭｂｏ　■で部分的に消化し、アガロース ゲルから電気溶離により４〜６Ｋｂの寸法の範囲のフラグメントを回収した。Ｂ ｇｌｌＩで開環し、ホスファターゼ処理したｐｌＪ７０２にこれらのフラグメン トを連結した。連結混合物を使用して３０ｍｃｇ／ｘ１のドキソルビシンに対し て感受性のＳ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ　ＴＫ　２３プロトプラストを形質転換した。

２、直」 ド　１ルビシン　　　・　　るＤＮ＾フーグメントの　。

部分的にＭｂｏ　ｌで消化したＳ、　ｅｕｅｅｔｉｕｓ　８７６ゲノムＤＮ＾を ｐｌＪ７０２のＢｇｌ１１部位に挿入した。連結混合物を使用してＬｌｉｖｉｄ ａｎｓ　ＴＫ　２３プロトプラストを形質転換した。形質転換細胞から、ｐｌＪ ７０２のメラニン遺伝子の挿入不活化を示すチオストレプトン耐性及び白色のコ ロニーを選択した。

チオストレプトン耐性の白色コロニーから次にドキソルビシン耐性（１００纏ｃ ｇ／ｘｉ）をスクリーニングした。該コロニーをＲ２ＹＥ培地でプレート培養し 、５００ＩＩｃｇ／Ｉ１１のドキソルビシンを含有する３１１１の軟Ｎ＾と共に ２８℃で２４時間インキユベートシ、こうして２つのクローンＴｓ’及びＤｏｘ ｏ’を同定した。

これらの２つのクローンからプラスミドＤＮＡを抽出した処、５．７ｋｂ及び４ ．４ｋｂの長さのインサートの存在が判明した。２っの組換体プラスミドを夫々 ＦＩＣＥＩ及びＦＩＣＥ２と命名し、Ｌｌｉｖｉｄａｎｓ　ＴＫ　２３プロトプ ラストを形質転換するために再び使用した。いずれの場合も形質転換は、形質Ｄ ｏｘｏ’が形質Ｔｓ’と共に高い効率で付与されることを示した。

Ｓ　　ｅｕｃｅｔｉｕｓ”　、””　　　Ｄｏｘｏ’にお番る多ＤＯｘ０８の次 に、２つの組換体プラスミドをＤｏｘｏ”（ＭＩＣ５０ｐｙ／ｉ１）であるＳ、 　ｅｕｅｅｔｉｕｓ　８７６の数個の誘導突然変異体に導入した。

形質転換細胞はＤｏｘｏ”形質の相補性を示した。形質転換細胞はクローン化遺 伝子の供与体である親株Ｓ、　ｅｕｃｅｔｉｕｓ−８７６のドキソルビシン耐性 レベル（ＭＩＣ２５０ｇｅｄｇ／ｚ１）よりも高いレベルであるドキソルビシン １５００ｕｙ／ｚＺ上で増殖することが可能であった。形質転換細胞における耐 性レベルの増加は組換体プラスミド（ｐｌＪ１０ルプリコン、Ｋａｔｚ他１９８ ３）の高いコピー数により説明され得る。

ローン　ツー　メントの　　　、 ２つのクローン化フラグメントにより付与される表現型は同一であるので、Ｄｏ ｘｏ’形質を付与することが可能な機能が１つ存在するか又は２つ存在するかを 調査した。第１図及び第２図はＦＩＣＥＩ及びＦＩＣＥ２の１」！と１１ハ＋ｓ 　８７６から誘導されたインサートの制限地図を示す、各地図の大部分は酵素の 異なる組み合わせを使用する単−及び二重の消化により生成されたフラグメント の寸法から作成した。隣接する部位の間隔は、適当な二重又は単一消化物におけ る該当フラグメントの直接測定に基づいて決定した。

２つのクローン化フラグメントの地図の間に明白な対応は認められず、従って、 耐性は２つの異なる遺伝子により付与されると考えられる。

国際調査報告 ｌ庫口呻…−へ帥一沖間１シバＰＣＴ／ＥＩ”　８９７００５１７１１１　〜２ 気−＋ｅ電＃＋小ＩＩ倚島−Ａ帥増電””＝ＰＣＴ／ＥＰ８９１００５８Ｂ−３ −国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．添付図面の第１図又は第２図に示される制限部位の構造を有するＤＮＡ、又 は該ＤＨＡから誘導され、ドキソルビシン耐性をコードする遺伝子を含む制限フ ラグメント。
2. ２．請求項１に記載のＤＮＡ配列を含む組換体ベクター。
3. ３．プラスミドであることを特徴とする請求項２に記載のベクター。
4. ４．ＤＮＡ配列がアラスミドｐＩＪ７０２に挿入されていることを特徴とする請 求項３に記載のベクター。
5. ５．請求項２に記載のベクターで形質転換された宿主。
6. ６．アントラサイクリンを産生する微生物であることを特徴とする請求項５に記 載の宿主。
7. ７．Ｓｐｅｕｃｅｔｉｕｓの株であることを特徴とする請求項５に記載の宿主。
8. ８．（ａ）ＳｐｅｕｃｅｔｉｕｓＭ７６（Ｄ．Ｓ．Ｍ．４５９２）もしくはその 誘導株のゲノムＤＮＡのライブラリーを作製する段階と、（ｂ）ライブラリーか らドキソルビシン耐性をスクリーニングする段階と、 （ｃ）ライブラリーの一部を形成し且つドキソルビシン耐性が陽性であるとして スクリーニングされた組換体ベクターからインサートＤＮＡを得る段階と、 （ｄ）場合によって、ドキソルビシン耐性をコードする遺伝子を含む制限フラグ メントをインサートＤＮＡから得る段階と を含む、請求項１に記載のＤＮＡ配列を取得するための方法。
9. ９．請求項１に記載のＤＮＡ配列をベクターにクローニングする段階を含む、請 求項２に記載の組換体ベクターの製造方法。
10. １０．請求項５に記載のＳ．ｐｅｕｃｅｔｉｕｓの株を培養する段階と、こうし て産生されたドキソルビシンを回収する段階とを含むことを特徴とするドキソル ビシンの製造方法。