PT90667B - Processo para a preparacao de sequencias de dna e dos seus fragmentos de restricao que comportam genes de resistencia aos antibioticos antraciclinicos - Google Patents

Processo para a preparacao de sequencias de dna e dos seus fragmentos de restricao que comportam genes de resistencia aos antibioticos antraciclinicos Download PDF

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Marinella Caruso
Anna Luisa Colombo
Luisa Garofano
Francesca Torti
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Description

DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.°
667
REQUERENTE: FARMITALIA CARLO ERBA S.r.l., italiana, com sede em Via Cario Imbonati 24, 20159,Milão, Itália.
EPÍGRAFE: Η PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS
DE DNA E DOS SEUS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO QUE COMPORTAM GENES DE RESISTÊNCIA AOS AN TIBIÚTICOS
INVENTORES: Marinella Caruso, Anna Luisa Colombo, Luisa
Garofano e Francesca Torti, e Giuseppe Za nella.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Grã-Bretanha, em 27 de Maio de 1988, sob o n3. 8812697.4.
INPt MOO 113 RF 16732
FARMITALIA CARLO ERBA S.r.l.
PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE DNA E DOS SEUS FRAGMENTOS DE RESTRIÇÃO QUE COMPORTAM GENES DE RESIS
TÊNCIA AOS ANTIBIÓTICOS ANTRACICLíNICOS
A presente invenção refere-se a fragmentos de DNA gue comportam genes que conferem resistência aos antibióticos antraciclínicos , a vectores de recombinação que comportam esses fragmentos de DNA e a hospedeiros transformados com os referidos vectores. As antraciclinas do grupo de daunorubicina, tais como a doxorubicina, a carminomicina e a clavinomicina, estão entre os agentes mais correntemente utilizados na terapêutica anti-tumoral . Estes são policetidos produzidos por diversas estirpes de Stretomyces (S .__peucetius, S. coeruleorubidos , S__galileus , S__griseus , S_.__gr iseoruber , S_.__viri dochromo^eã. e §.z__hf furcos ) .
A doxorubicina é apenas produzida pela S.
peucetius variedade caesius. 0 tipo da estirpe S_.__peucetius variedade caesius IMRU 3920 (aqui posteriormente abreviado para __peucetius 3 92 0 ) está disponível publicamente e é descrito na patente de invenção norte-americana US-A-3 590 028
A estirpe S._£eucetius 3920 foi depositada no instituto de micro-biologia da Universidade de Rutger , US , recebendo o número de indicação IMRU 3920. Esta estirpe e as suas mutantes
obtidas por tratamento mutagénico clássico são altos níveis de doxorubicina.
estudo dos mecanismos relacionados com a resistência a estas substâncias é crucial por duas razões fundamentais .
a) Existem muitos exemplos em que os genes relacionados com a biossíntese de metabolitos secundários estão todos reunidos conjuntamente com pelo menos um gene de resistência: por exemplo oxitetraciclina (Rhodes. Ρ M, Hunter I S,
Friend E J e Warren M Trans Biochem Soc. 12, 586-587, 1984), eritromicina (Stanzak R., Matsushima P., Baltz R M e Rao R N,
Biotechonology vol. 4, 229-232, Março 1986) tilosina, (Fayerman
J T, Biotechnology vol. 4, 786-789, Setembro 1986) e tetracenomicina (Motamedi H., Hutchinson C R, Proc. Natl. Acad. Sei.
USA, vol. 4, 4445-4449, 1987). A clonagem de genes biossintéticos pode ser útil tendo em vista a alteração dos esquemas para a produção das diferentes moléculas ou para se superarem obstáculos presentes nos procedimentos da biossíntese aumentando assim a produtividade da estirpe.
b) Os mecanismos regulados podem incluir a própria resistência de modo a que a alteração da produtividade dos níveis de resistência, (isto é, o aumento da concentração do gene) da estirpe, pode melhorar. Esta é uma ideia antiga usualmente realizada através de métodos clássicos de motagénese e de rastreio aleotórico, mas renovado pela utilização dos métodos rDNA (Craveri R. e Davies J.E., The Journal of
Antibiotics , 12 8-13 5 , Janeiro 1986 ).
Presentemente isolaram-se dois segmentos de
DNA os quais incorporam os genes de resistência à doxorubici3
na. Deste modo a presente invenção proporciona DNA exibindo a configuração de sítios de restrição, representados nas figuras 1 e 2 dos desenhos juntos, ou um fragmento de restrição derivado contendo um gene que codifica a resistência à doxorubicina. Por conveniência, os segmentos de DNA representados nas figuras 1 e 2 são designados aqui por DNA inserido. A presente invenção também proporciona:
- vectores recombinantes capazes de transformar uma célula hospedeira e que contêm um DNA inserido ou um seu fragmento de restrição derivado contendo o gene de resistência à doxorubicina ; e
- células hospedeiras transformadas com esses vectores .
Mais pormenorizadamente, nos desenhos juntos:
A fig. 1 representa a análise de um mapa de restrição de um primeiro DNA da presente invenção. Este é ura inserção no plasmídeo recombinante FICE 1 (Rec 1). A inserção tem extre midades Sau 3A1 e foi inserida no sítio BglII de pIJ702. Um sítio BglII foi reconstituído após a ligação.
A fig. 2 representa a análise de um mapa de restrição de um segundo DNA da presente invenção. Este conssiste numa inserção no plasmídeo recombinante FICE 2 (Rec 2).
A inserção tem extremidades Sau3Al e foi inserida no sítio BglII de pIJ702. Um sítio BglII foi reconstituído após a ligação .
Os mapas representados nas figuras 1 e 2 não proporcionam necessariamente uma listagem exaustiva de todos os sítios de restrição presentes em cada segmento de DNA. No entanto os sítios referidos são suficientes para um reconhecimento inequívoco dos segmentos.
Os DNAs inseridos e os fragmentos de restrição da presente invenção contêm um gene que codifica a resistência à doxorubicina. Para exprimir esse gene, o DNA tem de trans portar a sua própria sequência de controlo de transcrição e, em particular, o seu próprio promotor que está ligado ao gene e que é reconhecido por uma RNA polimerase da célula hospedeira. Alternativamente, o DNA inserido ou o fragmento de restrição pode ser ligado com outra sequência de controlo de transcrição de forma correcta ou clonado num vector num sítio de restrição localizado de um modo apropriado confinando com uma sequência de controlo de transcrição no vector.
Um DNA inserido ou um fragmento de restrição comportando um gene de resistência à doxorubicina pode clonar-se num vector de clonagem de DNA recombinante. Pode utilizar-se qualquer agente de replicação autonômica e/ou de integração comportando uma molécula de DNA a que um ou mais segmentos de DNA adicionais se podem juntar. Contudo tipicamente o vector é um plasmídeo. Um plasmídeo preferido é o plasmídeo pIJ702 de elevado número de cópias (Katz et al., J. Gen. Microbiol. 129, 2703-2714, 1983). Qualquer técnica apropriada pode ser utilizada para inserir o DNA inserido ou o fragmento de restrição no vector. A inserção pode ser obtida por ligação do DNA a um vector linearizado num sítio de restrição apropriado. Para isto, pode ser utilizada a combinação directa de extremidades de aderência ou resíduos homopoliméricas ou uma molécula de ligação ou de adaptação.
vector recombinante é utilizado para transfor mar uma célula hospedeira apropriada, habitualmente células que beneficiarão do facto de serem susceptíveis de exibir resistência à doxorubicina . As células hospedeiras podem ser as que são sensíveis à doxorubicina, isto é, não se podem desenvolver na presença de doxorubicina ou células que são resisten tes à doxorubicina mas que podem beneficiar de uma maior resistência a doxorubicina. 0 hospedeiro pode ser um micro-organismo .
Estirpes de S. peucetius, mais particularmente
S .__peucetius variedade caesius, que produzem doxorubicina e outras estirpes de Steptomyces que produzem antraciclinas podem portanto ser transformadas. A resistência, ou a maior resistência, à doxorubicina pode permitir que as células de uma destas estirpes produzam mais doxorubicina. Pode conseguir-se a tolerância de maiores concentrações de doxorubicina. Os trans formantes de estirpes S_.__peucetius são, habitualmente, obtidos por transformação protoplásmica. Assim pode obter-se a doxorubicina por cultura de uma estirpe transformada de S.
peucetius e tecolha da doxorubicina produzida deste modo.
Obtêm-se os DNAs, inseridos a partir de DNA genómico de S.__peucetius M76. 0 S_.__peucetius M76 foi depositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Républica Federal Alemã a 11 de Maio de 1988 sob o número de aceitação D.S.M. 4592. Pode também utilizar-se uma estirpe derivada de S_.__peucetius M76, que também tipicamente permitirá converter a daunorubicina em doxorubicina.
Os DNAs inseridos podem portanto obter-se por:
a) preparação de uma biblioteca de DNA genómi6 co de S_.__geucetius M76 ou de uma estirpe derivada desta;
b) rastreio da biblioteca para a resistência à doxorubicina;
c) obtenção de um DNA inserido a partir de um vector recombinante que faz parte da biblioteca e que foi detectado como positivo para a resistência à doxorubicina; e
d) eventualmente a obtenção de um fragmento de restrição a partir do DNA inserido o qual contém um gene que codifica a resistência à doxorubicina.
Pode preparar-se a biblioteca referida na alínea (a) por digestão parcial de DNA genómico S_.__peucetius M76 ou de uma estirpe derivada desta. A enzima de restrição Mbol é a utilizada de preferência. Os fragmentos obtidos deste modo podem ser fraccionados. São preferidos os fragmentos de 4 a 6 kg. Estes fragmentos são ligados num vector linearizado tal como o pIJ702. As células hospedeiras são transformadas com a mistura de ligação. Habitualmente as células hospedeiras são sensíveis à doxorubicina, por exemplo sensíveis a 50 mcg ou menos ou de preferência a 30 mcg ou menos de doxorubicina por ml. Por exemplo, podem transformar-se protoplásticos de S. lividans TK 23.
No passo (b) rastreiam-se os transformantes obtidos deste modo para a resistência a doxorubicina.
Os clones resistentes à doxorubicina são identificados por crescimento num meio contendo doxorubicina. Isolam-se tais clones e extraem-se os vectores recombinantes ali contidos. Na digestão dos vectores recombinantes com enzimas de restrição apropriadas no passo (c), pode identificar-se o DNA de S_.__inserido em cada vector, dividido e cartografado. Assim pode verificar-se que o vector contém o DNA inserido da presente invenção.
Além disto duas ou mais inserções sobrepostas que estão total ou parcialmente abrangidas no DNA da presente invenção podem isolar-se. Estas podem ser fundidas conjuntamente por clivagem num sítio de restrição comum e ligação subsequente para se obter um DNA desta invenção, se necessário reduzido no seu comprimento utilizando-se para tal enzimas de restrição apropriadas. Os fragmentos de restrição de um
DNA inserido que contém um gene que codifica a resistência à doxorubicina também podem ser obtidos no passo (d) por cisão de um DNA inserido com uma enzima de restrição apropriada.
Finalmente pode mutagenizar-se o DNA da presente invenção de uma forma que não afecta a sua capacidade para conferir resistência à doxorubicina. Isto pode ser conseguido por meio de uma mutagénese de sítio dirigido,por exemplo. Este DNA mutagenizado também faz parte da presente invenção.
Os exemplos que se seguem ilustram a presente RR S invenção. No exemplo Ts , Doxo e Doxo representam, respectivamente, os fenótipos tioestrepton-resistentes, doxorubicino-resistentes e doxorubicina-sensíveis.
Exemplo
- Materiais e Métodos
Estirpes bacterianas e plasmídeos:
0 Steptomyces peucetius m76 é um streptomiceta filamentoso que produz daunorubicina e doxorubicina e resistente a doxorubicina (C.I.M. 250 mcg/ml) e alguns mutantes bio-sintéticos :são sensíveis à doxorubicina. 0 S_.__ÍÍLidans
TK 23 é sensível à doxorubicina. 0 plasmídeo pIJ702, com elevado número de cópias, obteve-se de John Innes Culture Collection, Norwich, G.B..
Meios e Tampões
TSB contendo 30 g de caldo de soja triptico (DIFCO) por litro de água destilada, YEME contendo 5 g de extracto de levedura (DIFCO); 10 g de extracto de malte (DIFCO); 34 0 g de sacarose; 5 mM MgCl^óI^O; concentrações variáveis de flicina por litro de água destilada.
O meio de regeneração R2YE era o descrito por
Chater K.F., Hopwood D.A., Kieser T. e Thompson C.J. em
Gene cloning in Streptomyces, 69-95 in Ρ H Hofschneider and W Goebbel (ed) Gene Cloning in Organisms other than
E. coli, Springer-Verlag, Berlin.
meio foi preparado com a seguinte composição por litro:
Sucarose - 103 g
2,5% K2SO4 10 ml
MgCl2.6H2O 10.1 g
glucose 10 g
casaminoácidos 0 .1 g
agar - 22 g
mistura de o1igo-e1ementos - 2 ml
0,5% ΚΗ,ΡΟ, - 10 ml
4
1M CaCl2 - 20 ml prolina - 3 g
0.25M TES pH 7.2 -100 ml extracto de levedura a 10% - 50 ml
O meio P era descrito por Baltz R.M., J. Gen.
Microbiol. 107:93-102, 1978.
Os estreptomicetas foram mantidos no meio sólido descrito na patente de invenção norte-americana US-A-3 590 028, exemplo 2.
£££ÈÍ£É.££_Èê_£££££Í£££££
Para culturas líquidas ambas as espécies de §.£££Ε££Π)Σ.£££ desenvolveram-se em 50 ml de YEME + TBS (1:1) à temperatura de 28°C em um agitador rotativo a 280 r.p.m..
meio de crescimento foi inoculado com micélios homogeneizados. A homogeneização foi obtida por vortex dos micélios num tubo contendo pérolas de vidro.
Transformação de protoplastos
Os micélios provenientes de 35 ml de cultura líquida, suplementada com 0,5% de glicina, foram recolhidos por centrifugação (durante 10 minutos a 1500 x g), lavados duas vezes com sacarose a 10,3%, postos de novo em suspensão em 10 ml de meio P contendo 1 mg/ml de lisózima (SIGMA) e x o incubados durante 60 minutos a temperatura de 30 C com agitação recíproca (280 r.p.m.). Após a formação do protoplasto a suspensão foi filtrada através de algodão, lavada uma vez com meio P e posta de novo em suspensão em 1 ml de meio P.
Q
Cerca de 10 protoplastos foram obtidos.
Para cada transformação misturaram-se 200 pl de meio P contendo cerca de 2 χ 107 protoplastos com 10 pl da quantidade desejada de DNA em TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8,0) e 800 pl de polietileno glicol a 25% (PEG) 1000 em meio P. Um minuto após a adição da solução de PEG terminou10
-se a transformação pela adição de 5 ml de meio P. Gs protoplástos foram aglomerados por centrifugação, postos de novo em suspensão em 1 ml de meio P e colocados numa placa de
R2YE. Após incubação durante 24 horas à temperatura de 28°C os transformantes foram escolhidos por impregnação das placas com 3 ml de NA mole (8 g de caldo nutriente DIFCO e 5 g de agar por litro) contendo o antibiótico apropriado.
O número de transformantes era de cerca de 4 7 x 10 - 1 x 10 por mcg de DNA, de acordo com as estirpes utili zadas.
Isolamento de DNA plasmídico e de DNA genómico
O isolamento de DNA plasmídico e de DNA genómico de Streptornyces foi realizado utilizando-se as técnicas descritas por Hepwood D.A. et al., em Genetic Manipulation of Streptornyces - A Laboratory Manual, The John Innes Fundation
1985 .
Prerparação da biblioteca_2£nómica_de_S^J__peucetius M76
Obtiveram-se todas as enzimas de restrição fosfatase alcalina de timo de vitela e T4 ligase de BRL (Bethesda,
MD) e utilizaram-se de acordo com as instruções do fabricante.
Digeriu-se parcialmente o DNA genómico de S_. ££H£É.tiu£ M76 com Mbol e recolheram-se os fragmentos variando entre 4 a 6 Kb por electro-e1 uição de gel de agarose.
Estes fragmentos foram ligados ao pIJ702 linearizado com BglII e tratados com fosfatase. A mistura de ligação foi utilizada para transformar os protoplastos de S_.__li_vidans TK 23 sensíveis a 30 mcg/ml de doxorubicina.
£a£HiÊHt2.s_de_DNA_c[ue_corif erem_res i^tência_à_doXO2 rubicina em estirpes de Steptomyces sensíveis
DNA genómico de S__.__peucetius M7 6 parcialmente digerido com Mbol foi inserido no sítio BglII da pIJ702. A mistura de ligação foi utilizada para transformar protoplástos de S.__lividans TK 23. Os transformantes foram seleccionados para resistência à tioestreptona e a cor branca indicava inactivação de inserção do gene de melanina de pIJ702.
As colónias brancas resistentes à tioestreptona foram em seguida rastreadas para a resistência à doxorubicina (100 mcg/ml). Estas foram colocadas em placas em meio R2YE, incubadas durante 24 horas à temperatura de 28°C com 3 ml de p
NA mole contendo 500 mcg/ml de doxorubicina; dois clones Ts p
e Doxo foram deste modo identificados.
A extracção do DNA plasmídico destes dois clones revelou a presença de inserções de 5,7 Kb e 4,4 Kb de comprimento. Os dois plasmídeos recombinantes, denominados FICE 1 e FICE 2, foram novamente utilizados para transformar protoplástos S_.__lividans TK 23. Em ambos os casos a transformação
R Z X demonstrou que o caracter Doxo é conferido com elevada eficáp cia conjuntamente com o caracter Ts .
R S
Expressão do caracter Doxo__em mutantes de S.__peucetius Doxo .
Os dois plasmídeos recombinantes foram em seguida introduzidos em alguns mutantes derivados de S2__peucetius
M76, os quais são Doxo (MIC 50 pg/ml). Os transformantes exig biram complementariedade do caracter Doxo . Estes podiam de12 senvolver-se em doxorubicina a 1500 pg/ml apresentando uma resistência à doxorubicina de nível superior ao do exibido pela estirpe principal S_.__£eucetius M76, dadora dos genes clonados (MIC 250 mcg/ml). O nível da resistência aumentado nos transformantes deve ser explicado pelo número de cópias elevado dos plasmídeos recombinantes (replicação pIJ101, Katz et al. , 1983 ) .
Análise da einzima de restrição dos fragmentos clonados
Como o fenótipo conferido pelos dois fragmentos clonados era o mesmo investigou-se se existiam uma ou duas funções distintas aptas a conferir o caracter Doxo . As figuras 1 e 2 mostram os mapas de restrição de inserções derivadas de S. peucetius M76 de FICE 1 e de FICE 2. A maior parte deste mapa ê derivado das dimensões dos fragmentos gerados por digestos simples e duplos, utilizando-se combinações de enzimas diferentes. Os comprimentos dos intervalos entre os sítios adjacentes são obtidos por medições directas dos fragmentos relevantes nos digestos duplos ou simples apropriados.
Não existe uma correspondência óbvia entre os mapas dos dois fragmentos clonados, sugerindo que a resistência é conferida por dois genes distintos.

Claims (8)

  1. Reivindicações
    1.- Processo para a preparação de sequências de DNA que comportam sítios de restrição como se representam a seguir:
    Κρη I Psb 1 l I
    Bam HI Sph I
    Sph I Bam HI
    Pst I 8cm Hi Bam HI! Κρη I Ciai Κρη I! Bql II ι ι ι i ι ι ι i ,
    1 Kb
    Bgf !
    ou
    Ssr I
    I ι
    Κρη I ;Sci i Bem HI I II I
    Sc: I Psr II
    CIc
    Κρη I
    1 Kb ou dos seus fragmentos de restrição que contêm um gene que codifica para a resistência ã doxorubicina caracterizado pelo facto:
    a) de se preparar uma biblioteca genómica de DNA de S. peucetius M76 (D.S.M. 4592) ou uma estirpe sua derivada;
    b) de se sondar a biblioteca referida para a resistência ã doxorubicina ;
    c) de se obter uma inserção de DNA de um vector recombinante que constitui parte da biblioteca e que foi sondada como positiva para a resistência à doxorubicina; e
    d) de se obter, eventualmente, um fragmento de restrição a partir da inserção de DNA comportando um gene que codifica para a resistência ã doxorubicina.
  2. 2. - Processo para a preparação de um vector recombinante que inclui uma sequência de DNA tal como definida na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se clonar a sequência de DNA referida em um vector.
  3. 3. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de o vector ser um plasmídeo.
  4. 4.- Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se inserir a sequência de DNA sem um plasmídeo designado por pIJ02.
  5. 5.-15-
    5. - Processo para transformar um hospedeiro, caracterizado pelo facto de se utilizar um vector obtido de acordo com uma qual, quer das reivindicações 2 a 4.
  6. 6. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de se utilizar como hospedeiro um microrganismo que produz antraciclina .
  7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo facto de se utilizar um microrganismo da estirpe S. peucetiu s.
  8. 8. - Processo para a preparação de doxorubicina, caracterizado pelo facto de se cultivar a estirpe de S. peucetius de acordo com a reivindicação 5 e de se recolher a doxorubicina assim produz ida.
PT90667A 1988-05-27 1989-05-24 Processo para a preparacao de sequencias de dna e dos seus fragmentos de restricao que comportam genes de resistencia aos antibioticos antraciclinicos PT90667B (pt)

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PT90667B true PT90667B (pt) 1994-10-31

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