FI97728C - Doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin sisältävä DNA, yhdistelmävektori ja bakteeri - Google Patents
Doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin sisältävä DNA, yhdistelmävektori ja bakteeri Download PDFInfo
- Publication number
- FI97728C FI97728C FI900359A FI900359A FI97728C FI 97728 C FI97728 C FI 97728C FI 900359 A FI900359 A FI 900359A FI 900359 A FI900359 A FI 900359A FI 97728 C FI97728 C FI 97728C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- dna
- doxorubicin
- restriction
- resistance
- vector
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
97728
Doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin sisältävä DNA, yhdistelmävektori ja bakteeri - DNA, hybridvektor och bakterie, vilka innehäller en gen som kodar doxorubi-cinresistens Tämä keksintö koskee DNA-fragmentteja, jotka muodostuvat geeneistä, jotka aikaansaavat resistenssin antrasykliinian-tibiooteille, keksintö koskee yhdistelmävektoreita, jotka sisältävät tällaisia DNA-fragmentteja, ja isäntiä, jotka on transformoitu vektoreilla.
Daunorubisiiniryhmän antrasykliinit, kuten doksorubisiini, karminomysiini ja aklavinomysiini, kuuluvat kaikkein laajimmin käytettyihin aineisiin kasvaimia estävässä hoidossa. Ne ovat polyketidejä, joita Streptomyces'in erilaiset kannat (S.peucetlus, S.coeruleorubidus, S.qalilaeus, S.qriseus, S.grlseoruber, S.viridochromogenes ja S.bifurcus) tuottavat.
Doksorubisiinia tuottaa ainoastaan kanta S.peucetius var. caesius. Tyyppikanta S.peucetius var caesius IMRU 3920 (joka tämän jälkeen lyhennetään "S.peucetlus 3920”) on julkisesti saatavilla oleva ja se on kuvattu julkaisussa US-A-3 590 028.
S.peucetlus 3920 on talletettu laitokseen The Institute of Microbiology of the Rutger University, USA, jossa sille on • · · annettu indeksinumero IMRU 3920. Tämä kanta ja sen mutantit, jotka saadaan klassisilla mutagenointikäsittelyillä, ovat resistenttejä suurille doksorubisiinipitoisuuksille.
• · • · • · · • · · : Näiden aineiden resistenssiin sisältyvien mekanismien tutki minen on ratkaisevaa kahdesta pääsyystä johtuen: • · · • · · if « a) On monia esimerkkejä, joissa geenit, jotka ovat osallisi-na sekundääristen metaboliittien biosynteeseissä, ovat kaik- • <« *... ki ryhmittyneet yhteen yhdessä ainakin yhden resistentin • · geenin kanssa; esimerkiksi oksitetrasykliini (Rhodes P.M,, Hunter I.S, Fried E.J. ja Warren M., 1984, Trans Biochem ·:·*: Soc. 12, 586-587), erytromysiini (Stanzak R., Matsushima P.,
Baltz R.H. ja Rao R.N., Biotechnology voi. 4, maaliskuu 2 97728 1986, 229-232), tylosiini (Fayerman J.T., Biotechnology voi. 4, syyskuu 1986, 786-789) ja tetrasenomysiini (Mota-medi H., Hutchinson C.R.- Proc.Natl.Acad.Sei. USA, voi. 84, 4445-4449), 1987). Biosynteettisten geenien kloonaus voi olla hyödyllistä tarkasteltaessa vaihtoehtoisia keinoja erilaisten molekyylien tuottamiseksi tai biosynteesirei-teissä esiintyvien pullonkaulojen ylitsepääsemiseksi ja siten kannan tuottavuuden lisäämiseksi.
b) Resistenssi itsessään voi sisältyä säätelymekanismeihin niin, että muuttamalla resistenssipitoisuuksia (t.s. lisäämällä geeniannosta) kannan tuottavuutta voidaan parantaa.
Tämä on vanha ajatus, joka tavallisesti suoritetaan klassisilla mutagenointimenetelmillä ja satunnaistestauksella, mutta jonka rDNA-menetelmien käyttö on uudistanut (Craveri R. ja Davies J.E., The Journal of Antibiotics, tammikuu 1986, 128-135).
Me olemme nyt eristäneet kaksi DNA-segmenttiä, jotka yhdistävät yhdeksi kokonaisuudeksi doksorubisiiniresistentit geenit. Näin ollen tämä keksintö koskee eristettyä DNA:ta, jolla on restriktiokohtien konfiguraatio, joka on esitetty .;·. liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1 tai 2, tai jolla on näistä johdettu eristetty restriktiofragmentti, joka si-sältää doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin, joka • · · • · DNA tai restriktiofragmentti on saatavissa Streptomvces • · *“·* peueetius M76:sta (DSM 4592). Mukavuussyistä kuvioissa 1 ja *.··* 2 esitettyjä DNA-segmenttejä kutsutaan tässä insertti-DNA:- • · * *.* * ksi. Keksintö koskee myös - yhdistelmävektoreita, jotka pystyvät transformoimaan ::: isäntäsolun ja jotka sisältävät insertti-DNA:n tai siitä johdetun restriktiofragmentin, joka sisältää doksorubisii-niresistentin geenin, ja *..* - bakteereja, joka on transformoitu tällaisilla vektoreil- *··/* la.
« · · • · ♦
Yksityiskohtaisemmin liitteenä olevissa piirustuksissa: kuvio 1 on keksinnön ensimmäisen DNA:n restriktiokartan ana- 3 97728 lyysi. Tämä on insertti yhdistelmäplasmidissa FICE 1 (Rec 1). Insertillä on Sau3AI-päät ja se insertoitiin plasmidin pIJ702 Bglll-kohtaan. Yksi Bglll-kohta järjestettiin uudelleen ligoinnin jälkeen; kuvio 2 on keksinnön toisen DNA;n restriktiokartan analyysi. Tämä on insertti yhdistelmäplasmidissa FICE 2 (Rec 2). Insertillä on Sau3AI-päät ja se insertoitiin plasmidin pIJ702 BGlII-kohtaan. Yksi Bglll-kohta järjestettiin uudelleen ligoinnin jälkeen.
Kuvioissa 1 ja 2 esitetyt kartat eivät välttämättä sisällä tyhjentävää listaa kaikista restriktiokohdista, jotka esiintyvät jokaisessa DNA-segmentissä. Kuitenkin esitetyt kohdat ovat riittävät segmenttien yksiselitteiseen tunnistamiseen.
Keksinnön mukaiset insertti-DNA:t ja restriktiofragmentit sisältävät doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin.
Tällaisen geenin ilmentämiseksi, DNA voi sisältää sen oman transkriptiokontrollisekvenssin ja erityisesti sen oman pro- .·;·. moottorin, joka on toteuttamiskelpoisesti liittyneenä gee- niin ja jonka isäntäsolun RNA-polymerassi tunnistaa. Vaihto- ehtoisesti insertti-DNA tai restriktiofragmentti voidaan li- : t;' goida toiseen transkriptiokontrollisekvenssiin oikeassa muo- dossa tai kloonata vektoriin resktriokohtaan, joka sijaitsee ...* sopivasti transkriptiokontrollisekvenssin vieressä vektoris- • · · • I | sa.
Doksorubisiiniresistenssigeenin sisältävä insertti-DNA tai restriktiofragmentti voidaan kloonata yhdistelmä-DNA:n kloo- .*“. naavaan vektoriin. Mitä tahansa autonomisesti replikoivaa • ♦ · ja/tai integroivaa ainetta, joka sisältää DNA-molekyylin, • · · .’· · johon voidaan lisätä yksi tai useampia lisä-DNA-segmenttejä, voidaan käyttää. Tavallisesti kuitenkin vektori on plasmidi. Mieluimmin plasmidi on suuren kopioluvun omaava plasmidi 4 97728 pIJ702 (Katz et ai., J.Gen.Microbiol 1983, 129 2703-2714).
Mitä tahansa sopivaa tekniikkaa voidaan käyttää insertti-DNA:n tai sen restriktiofragmentin insertoimiseksi vektoriin. Insertio voidaan tehdä ligoimalla DNA linearisoituun vektoriin sopivaan restriktiokohtaan. Tässä voidaan käyttää tarttuvien päiden suoraa kombinaatiota tai homopolymeeeristä hännitystä tai voidaan käyttää kytkijä- tai adapterimolekyy-liä.
Yhdistelmävektoria käytetään transformoimaan sopivaa isäntä-solua, tavallisesti soluja, joista olisi hyötyä niiden ollessa kykeneviä osoittamaan doksorubisiiniresistenssiä. Isäntäsoluja voivat olla solut, jotka ovat doksorubisiini-sensitiivisiä, t.s. jotka eivät voi kasvaa doksorubisiinin läsnäollessa, tai solut, jotka ovat doksorubisiini-resis-tenttejä mutta joista olisi hyötyä suuremman doksorubisiini-resistenssin omaavina. Isäntä voi olla mikro-organismi.
S.peucetius-kantoj a, erityisesti kantaan S♦peucetius var. caeslus, jotka tuottaa doksorubisiinia, ja muita Streptomy-ces-kantoja, jotka tuottavat antrasykliinejä, voidaan siten transformoida. Resistenssi tai suurempi resistenssi doksoru-.* . bisiinille voi tehdä mahdolliseksi sen, että tällaisten kan- tojen solut tuottavat enemmän doksorubisiinia. Voidaan saa- :t<;’ vuttaa doksorubisiinin suurempien konsentraatioiden tole- « · *···* ranssi. S. peucetius-kantoj en transformantit saadaan tavalli- ·...· sesti protoplastisella transformaatiolla. Näin doksorubisii- • · · ; nia voidaan saada viljelemällä transformoitua S.peucetius- kantaa ja näin tuotettu doksorubisiini otetaan talteen.
Insertti-DNA:t saadaan S.peucetius M76:n perimän DNA:sta.
.**·. S.peucetius M76 on S.peucetius 3920:n mutantti, joka pystyy muuttamaan daunorubisiinin doksorubisiiniksi suurilla pitoi- • · · *. . suuksilla. S.peucetius M76 talletettiin laitokseen The Deut sche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Saksan liittotasavalta, li. toukokuuta 1988, talletusnumerolla D.S.M. 4592.
5 97728
Myös S.peucetius M76:sta johdettua kantaa, joka tavallisesti myös pystyy muuttamaan daunorubisiinin doksorubisiiniksi, voidaan käyttää. Tästä johtuen insertti-DNA:t voidaan saada: (a) valmistamalla S.peucetius M76:n tai siitä johdetun kannan perimän DNA-kirjasto; (b) testaamalla kirjasto doksorubisiiniresistenssin suhteen; (c) valmistamalla insertti-DNA yhdistelmävektorista, joka muodostaa osan kirjastoa ja joka on testattu doksorubi-siiniresistenssipositiiviseksi; ja (d) mahdollisesti valmistamalla insertti-DNA:sta restriktio-fragmentti, joka sisältää doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin.
Kirjasto voidaan valmistaa vaiheessa (a) katkaisemalla osittain S.peucetius M 76:n tai siitä johdetun kannan perimän DNA. Mielummin käytetään restriktioentsyymiä Mbol. Näin saa- ;·, dut fragmentit voidaan fraktioida koon mukaan. Fragmentit, • » jotka ovat kooltaan 4-6 kiloemästä, ovat edullisia. Nämä * i < fragmentit ligoidaan linearisoituun vektoriin, kuten » t * :i(;' pIJ702:teen. Isäntäsolut transformoidaan ligointiseoksella.
'···* Tavallisesti isäntäsolut ovat doksorubisiini-sensitiivisiä,
« 4 I
esimerkiksi ne ovat sensitiivisiä 50 /ugrlle tai pienemmälle v · määrälle, tai mieluimmin 30 /ug:lle tai pienemmälle määrälle doksorubisiinia per millilitra. Esimerkiksi S.lividans TK 23 protoplastit voidaan transformoida.
,*··. Vaiheessa (b) näin saadut transformantit testataan doksoru- • » .···, bisiiniresistenssin suhteen. Kloonit, jotka ovat doksorubi- • · · . siiniresistenttejä, identifioidaan kasvattamalla doksorubi siinia sisältävässä kasvatusalustassa. Tällaiset kloonit
I I
eristetään ja niihin sisältyvät yhdistelmävektorit uutetaan.
f t 6 97728
Katkaisemalla yhdistelmävektorit sopivilla restriktioentsyy-meillä vaiheessa (c), jokaiseen vektoriin insertoitu S.peucetius M76 DNA voidaan identifioida, määrittää sen koko ja kartoittaa. Tällä tavalla voidaan tarkistaa, että vektori sisältää keksinnön mukaisen insertti-DNA:n.
Lisäksi voidaan eristää kaksi tai usempia toisensa peittävää (overlapping) inserttiä, jotka kokonaan tai osittain kuuluvat keksinnön mukaiseen DNA:hän. Nämä voidaan liittää yhteen katkaisemalla yhteisestä restriktiokohdasta, jonka jälkeen ligoidaan keksinnön mukaisen DNA:n saamiseksi, leikkaamalla pituutta käyttäen tarvittaessa sopivia restriktioentsyymejä. Insertti-DNA:n restriktiofragmentit, jotka sisältävät dokso-rubisiiniresistenssiä koodittavan geenin, voidaan saada vaiheessa (d) myös katkaisemalla insertti-DNA sopivalla res-triktioentsyymillä.
Lopuksi keksinnön mukainen DNA voidaan mutatoida tavalla, joka ei vaikuta sen kykyyn aikaansaada doksorubisiiniresis-tenssiä.Tämä voidaan tehdä esimerkiksi paikkaan kohdistetul-la mutagenoinnilla. Myös tällainen mutatoitu DNA on osa kek- : .·. sintöä.
Seuraava esimerkki kuvaa keksintöä. Esimerkissä TsR, DoxoR
ja Doxos tarkoittavat tiostreptoni-resistenttejä, doksorubi- ’···* siini-resistenttejä ja vastaavasti doksorubisiini-sensitii- • · · ; visiä fenotyyppejä.
Esimerkki ·1. 1. Materiaalit ja menetelmät
• « td .1.11..1. I
• · · • · · • · · • Bakteerikannat ja plasmidit:
Streptomyces peucetlus M76, joka on filamenttinen streptomy-keetti, joka tuottaa daunorubisiinia ja doksorubisiinia ja 7 97728 on resistentti doksorubisiinille (MIC 250 /ug/ml), ja eräät biosynteettiset mutantit, jotka ovat sensitiivisiä doksorubisiinille; S.lividans TK 23, joka on sensitiivinen doksorubisiinille.
Suuren kopioluvun omaava plasmidi pIJ702 saatiin John Innes Culture Collection'ista, Norwich, GB.
Kasvatusalustat ja puskurit: TBS sisälsi 30 g tryptistä soijakasvatuslientä (DIFCO) per litra tislattua vettä; YEME sisälsi 5 g hiivauutetta (DIFCO), 10 g mallasuutetta (DIFCO), 340 g sakkaroosia, 5 mM MgCl2. 6H20:ta ja vaihtelevat konsentraatiot glysiiniä per litra tislattua vettä.
Regeneraatiokasvatusalusta R2YE oli sellainen, jonka ovat kuvanneet Chater K.F., Hopwood D.A., Kieser T. ja Thompson C.J., (1982) "Gene cloning in Streptomyces", 69-95 julkaisussa "Gene Cloning in Organisms other than E.coli", toimittajat P.H.Hofschneider ja W.Goebbel, Springer-Verlag, Ber-liini. Kasvatusalusta valmistettiin siten, että sillä oli seuraava koostumus per litra: * · · sakkaroosi 103 g • · · * ·’ 2,5%:inen K2S04 10 ml
MgCl2.6H20 10,1 g glukoosi 10 g :.· : kasaminohapot 0,1 g agar 22 g hivenaineseos 2 ml 0,5%:inen KH2P04 10 ml .···. 1 M CaCl2 20 ml proliini 3 g ’ 0,25 M TES, pH 7,2 100 ml 10%:nen hiivauute 50 ml 8 97728
Kasvatusalusta P oli sellainen, jonka on kuvannut Baltz R.H., J.Gen.Microbiol. 107: 93-102 (1978).
Streptomykeettejä pidettiin kiinteällä kasvatusalustalla, kuten kuvataan julkaisun US-A3 590 028 esimerkissä 2.
Kasvatusolosuhteet: nestemäisissä viljelmissä molemia Streptomyces-lajeja kasvatettiin 50 mltssa YEME +TBS-seosta (1:1) 28 °C:ssa rotaatio-sekoittajassa 280 kierr./min. Kasvatusalusta ympättiin homogenoidulla myseelillä. Homogenointi suoritettiin pyörrese-koittamalla myseeliä lasihelmiä sisältävässä koeputkessa.
Protoplastln transformaatio 35 ml:sta nestemäistä viljelmää (jota oli täydennetty 0,5 %:lla glysiinillä) otettiin myseeli talteen sentrifugoimalla (10 min, 1500 x g), pestiin kaksi kertaa 10,3%:isella sakkaroosilla, suspendoitiin uudestaan 10 ml:aan kasvatusalustaa P, joka sisälsi 1 mg/ml lysotsyymiä (SIGMA), ja inkuboitiin 60 minuuttia 30 °C:ssa molempiin suuntiin sekoittaen (280 . kierr./min). Protoplastln muodostumisen jälkeen suspensio * · · suodatettiin pumpulin läpi, pestiin kerran kasvatusalustalla *ti; P ja suspendoitiin uudestaan 1 ml:aan kasvatusalustaa P. Ta- “··. vallisesti saatiin 108 proplastia.
I · · « • « • · · • · · ♦ ·* Jokaiseen transformaatioon 200 /ui kasvatusalustaa P, joka sisälsi noin 2 x 107 protoplastia, sekoitettiin 10 /ul:n kanssa halutun määrän DNA:ta sisältävän TE:n kanssa (tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) ja 800 /ul:n kanssa 25%:ista ,*··. polyetyleeniglykoli (PEG) 1000:ta kasvatusalustassa P. Yksi ,···, minuutti PEG-liuoksen lisäyksen jälkeen, transformaatio lo- • · · \ . pettiin lisäämällä 5 ml kasvatusalustaa P. Protoplastit pel- e letoitiin sentrifugoimalla, suspendoitiin uudestaan 1 ml:aan kasvatusalustaa P ja levitettiin R2YE-levyille. Inkuboitiin ♦ < 9 97728 24 tuntia 28 eC:ssa, jonka jälkeen transformantit valittiin huuhtomalla maljat 3 ml:11a pehmeää NA:ta (8 g DIFCO'n ra-vintokasvatuslientä ja 5 g agaria per litra), joka sisälsi sopivan antibiootin. Transformanttien lukumäärä oli noin 1 x 104 - l x 107 per /ug DNA:ta, käytettyjen kantojen mukaan.
Plasmidin ja perimän DNA:n eristäminen
Plasmidin ja perimän DNA:n eristäminen streptomykeeteistä suoritettiin käyttäen menetelmiä, jotka ovat kuvanneet Hep-wood D.A. et ai. (1985) "Genetic Manipulation of Streptomy-ces - A Laboratory Manual", The John Innes Foundation.
S.peucetlus M76:n qeeniklrjaston valmistaminen
Kaikki restriktioentsyymit, vasikankateenkorvan alkalinen fosfataasi ja T4-ligaasi saatiin BRL:Itä (Bethesda, MD) ja niitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.
S.peucetius M76:n perimän DNA katkaistiin osittain MboI:llä ja fragmentit, joiden koko vaihteli 4 kiloemäksestä 6 kilo-emäkseen, otettiin talteen elektroeluoimalla agaroosigeelis-tä. Nämä fragmentit ligoitiin pIJ702:teen, joka oli lineari-soitu BglII:lla ja käsitelty fosfataasilla. Ligointiseosta ’;·· käytettiin transformoitaessa S.lividans TK 23 protoplastit, ’.··* jotka olivat sensitiivisiä 30 /ug:lle/ml doksorubisiinia.
2. Tulokset DNA-fragmenttien, jotka aikaansaavat doksorubisiiniresls-.*·*. tenssin sensitiivisillä Streptomyces-kannoilla, kloonaus • · · • · · • · ·
• · Osittain MboI:llä katkaistu S.peucetius M76:n perimän DNA
insertoitiin pIJ702:n Bglll-kohtaan. Käytettiin ligointiseosta transformoitaessa S.lividans TK 23 protoplastit. Trans- 10 97728 formanteiksi valitut olivat tiostreptoni-resistenttejä ja väriltään valkoisia, mikä osoitti pIJ702:n melaniinigeenin inaktivoituneen insertiossa.
Sen jälkeen tiostreptoni-resistenttien, valkoisten kasvupe-säkkeiden doksorubisiiniresistenssi testattiin (100/ug/ml).
Ne levitettiin maljoille kasvatusalustana R2YE, inkuboitiin 28 eC:ssa 24 tuntia käyttäen mukana 3 ml pehmeää NA:ta, joka sisälsi 500 /ug/ml doksorubisiinia, tällä tavalla identifioitiin kaksi kasvupesäkettä TsR ja DoxoR.
Plasmidi-DNA:n uuttaminen näistä kahdesta kasvupesäkkeestä osoitti niissä esiintyvät insertit, jotka pituudeltaan 5,7 kiloemästä ja 4,4, kiloemästä. Näitä kahta yhdistelmäplasmi-dia, jotka nimeltään FICE 1 ja vastaavasti FICE 2, käytettiin taas transformoitaessa S.livldans TK 23 protoplastit. Molemmissa tapauksissa transformaatio osoitti, että DoxoR-ominaisuus aikaansaadaan suurella tehokkuudella yhdessä TsR-ominaisuuden kanssa.
DoxoR-omlnaisuuden ilmentäminen S.peucetlus mutantelssa Doxos
Sen jälkeen kaksi yhdistelmäplasmidia siirrettiin S-peucetlus
M76:n eräisiin johdannaismutantteihin, jotka ovat Doxos (MIC
50 /ug/ml). Transformanteilla todettiin DoxoR-ominaisuuden *.·.· täydentyminen. Ne voivat kasvaa alustalla, jossa doksorubi- • · · : siinia 1500 /ug/ml, ollen resistenttejä doksorubisiinipitoi- suudelle, joka on suurempi kuin alkuperäisellä kannalla
S.peucetius M76, joka oli kloonattujen geenien donori (MIC
250 /ug/ml). Resistenssipitoisuuden lisääntyminen transfor- .**·. mänteissä saattaisi selittyä yhdistelmäplasmidien suurella • · · kopioluvulla (plJIOl-replikaatio, Katz et ai., 1983).
• · · . *Ht ill H M 4 m 11 97728
Kloonattujen fragmenttien restriktioentsyymlanalyysi
Koska fenotyyppi, joka aikaansaatiin kahdella kloonatulla framentilla, oli sama, tutkimme, olisiko yksi tai kaksi selvästi erottuvaa funktiota, jotka pystyvät aikaansaamaan DoxoR-ominaisuuden. Kuvioissa 1 ja 2 on esitetty S.peucetius M76:sta johdettujen inserttien FICE 1 ja FICE 2 restriktio-kartat. Suurin osa kummastakin kartasta on johdettu sen kokoisista fragmenteista, jotka muodostuvat yksinkertaisella katkaisulla tai kaksoiskatkaisulla, käytettäessä erilaisia enstyymikombinaatioita. Vierekkäisten paikkojen välimatkat saadaan asiaankuuluvien fragmenttien suorista mittauksista sopivissa kaksoiskatkaisuissa tai yksinkertaisissa katkaisuissa.
Näiden kahden kloonatun fragmentin kartoissa ei havaita minkäänlaista ilmeistä vastaavuutta, joka tukisi ajastusta, että resistenssin aikaansaa kaksi erilaista geeniä.
• i · • I · • · · * · • · · • · · • · · • · · • · · • « • · • · · 1 · · * · ·
• « I
Claims (7)
1. Eristetty DNA, tunnettu siitä, että sillä restrik-tiokohdissa on konfiguraatio, joka on esitetty liitteenä olevien piirustusten kuviossa 1 tai 2, tai niistä johdettu eristetty restriktiofragmentti, joka sisältää doksoru-bisiiniresistenssiä koodittavan geenin, joka DNA tai restriktiofragmentti on saatavissa Streptomyces peucetius M76:Sta (DSM 4592).
2. Yhdistelmävektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksessa 1 määritellyn DNA:n tai restrik-tiofragmentin.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi.
4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vektori, tunnettu siitä, että DNA tai restriktiofragmentti insertoidaan plas-midiin pIJ702.
5. Bakteeri, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksessa 2 määritellyllä vektorilla.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että se tuottaa antrasykliinejä. • · · • · · • 1 1 ·> »
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen bakteeri, tunnettu siitä, että se on S.peucetius-kanta. 2 2 · »»· • · · • # 97728
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8812697 | 1988-05-27 | ||
| GB888812697A GB8812697D0 (en) | 1988-05-27 | 1988-05-27 | Isolation & characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics |
| EP8900588 | 1989-05-26 | ||
| PCT/EP1989/000588 WO1989011532A1 (en) | 1988-05-27 | 1989-05-26 | Isolation and characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI900359A0 FI900359A0 (fi) | 1990-01-24 |
| FI97728B FI97728B (fi) | 1996-10-31 |
| FI97728C true FI97728C (fi) | 1997-02-10 |
Family
ID=10637720
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI900359A FI97728C (fi) | 1988-05-27 | 1990-01-24 | Doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin sisältävä DNA, yhdistelmävektori ja bakteeri |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0371112B1 (fi) |
| JP (1) | JP3240052B2 (fi) |
| KR (1) | KR970010761B1 (fi) |
| AT (1) | ATE115627T1 (fi) |
| AU (1) | AU610411B2 (fi) |
| CA (1) | CA1335575C (fi) |
| DE (1) | DE68920007T2 (fi) |
| DK (1) | DK175446B1 (fi) |
| FI (1) | FI97728C (fi) |
| GB (1) | GB8812697D0 (fi) |
| GR (1) | GR1002049B (fi) |
| HU (2) | HU217210B (fi) |
| IE (1) | IE66718B1 (fi) |
| IL (1) | IL90386A (fi) |
| NZ (1) | NZ229237A (fi) |
| PT (1) | PT90667B (fi) |
| RU (1) | RU2118367C1 (fi) |
| WO (1) | WO1989011532A1 (fi) |
| ZA (1) | ZA893979B (fi) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN799596A0 (en) * | 1996-02-09 | 1996-03-07 | Northern Sydney Area Health Service | Chemotherapy resistance gene |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| YU33730B (en) * | 1967-04-18 | 1978-02-28 | Farmaceutici Italia | Process for preparing a novel antibiotic substance and salts thereof |
| JPS6158589A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 |
| US4935340A (en) * | 1985-06-07 | 1990-06-19 | Eli Lilly And Company | Method of isolating antibiotic biosynthetic genes |
-
1988
- 1988-05-27 GB GB888812697A patent/GB8812697D0/en active Pending
-
1989
- 1989-05-08 CA CA000598991A patent/CA1335575C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-23 GR GR890100339A patent/GR1002049B/el not_active IP Right Cessation
- 1989-05-23 NZ NZ229237A patent/NZ229237A/en unknown
- 1989-05-23 IL IL9038689A patent/IL90386A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-24 PT PT90667A patent/PT90667B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-05-25 ZA ZA893979A patent/ZA893979B/xx unknown
- 1989-05-26 WO PCT/EP1989/000588 patent/WO1989011532A1/en active IP Right Grant
- 1989-05-26 HU HU264/89A patent/HU217210B/hu unknown
- 1989-05-26 HU HU893264A patent/HUT52818A/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 JP JP50550789A patent/JP3240052B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-26 DE DE68920007T patent/DE68920007T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-26 RU SU4743220A patent/RU2118367C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 EP EP89906078A patent/EP0371112B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-26 AT AT89906078T patent/ATE115627T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 AU AU36927/89A patent/AU610411B2/en not_active Ceased
- 1989-05-26 KR KR1019900700134A patent/KR970010761B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-06-12 IE IE173089A patent/IE66718B1/en not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-01-24 FI FI900359A patent/FI97728C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-01-26 DK DK199000218A patent/DK175446B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT90667A (pt) | 1989-11-30 |
| WO1989011532A1 (en) | 1989-11-30 |
| DK21890A (da) | 1990-01-26 |
| DK175446B1 (da) | 2004-10-25 |
| DE68920007T2 (de) | 1995-04-27 |
| AU610411B2 (en) | 1991-05-16 |
| NZ229237A (en) | 1992-05-26 |
| EP0371112B1 (en) | 1994-12-14 |
| DE68920007D1 (de) | 1995-01-26 |
| FI97728B (fi) | 1996-10-31 |
| ZA893979B (en) | 1990-02-28 |
| EP0371112A1 (en) | 1990-06-06 |
| IE66718B1 (en) | 1996-01-24 |
| JPH02504470A (ja) | 1990-12-20 |
| PT90667B (pt) | 1994-10-31 |
| AU3692789A (en) | 1989-12-12 |
| HU893264D0 (en) | 1990-07-28 |
| KR900702024A (ko) | 1990-12-05 |
| GB8812697D0 (en) | 1988-06-29 |
| IE891730L (en) | 1989-11-27 |
| GR1002049B (en) | 1995-11-16 |
| IL90386A0 (en) | 1989-12-15 |
| HUT52818A (en) | 1990-08-28 |
| FI900359A0 (fi) | 1990-01-24 |
| DK21890D0 (da) | 1990-01-26 |
| ATE115627T1 (de) | 1994-12-15 |
| HU217210B (hu) | 1999-12-28 |
| RU2118367C1 (ru) | 1998-08-27 |
| CA1335575C (en) | 1995-05-16 |
| IL90386A (en) | 1995-12-31 |
| GR890100339A (el) | 1990-03-12 |
| KR970010761B1 (ko) | 1997-06-30 |
| JP3240052B2 (ja) | 2001-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Otten et al. | Cloning and expression of daunorubicin biosynthesis genes from Streptomyces peucetius and S. peucetius subsp. caesius | |
| EP0346000A2 (en) | Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms | |
| EP0118367B1 (en) | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes | |
| US4340674A (en) | Cointegrate plasmids and their construction from plasmids of Escherichia and Streptomyces | |
| DE69736673T2 (de) | Rifamycin biosynthese genkluster | |
| US5589385A (en) | Cloning of the biosynthetic pathway for chlortetracycline and tetracycline formation and cosmids useful therein | |
| US4703009A (en) | RDNA cloning vector pVE1, deletion and hybrid mutants and recombinant derivatives thereof products and processes | |
| EP0176321A1 (en) | Recombinant dna cosmid shuttle vectors | |
| US5665564A (en) | Isolation and characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics | |
| EP0391594A3 (en) | Cloning genes from streptomyces avermitilis for avermectin biosynthesis and the methods for their use | |
| FI97728C (fi) | Doksorubisiiniresistenssiä koodittavan geenin sisältävä DNA, yhdistelmävektori ja bakteeri | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| DE69129429T2 (de) | Zur Actinomyceten-DNS-Klonierung nützliches bifunktionelles Cosmid | |
| JPH04211382A (ja) | プラーク阻害表現型を付与するｄｎａ配列 | |
| US4880746A (en) | Streptomycetes plasmid PSG5, a process for obtaining it, and its use | |
| Genthner et al. | Isolation of a recombination-deficient mutant of Rhodopseudomonas capsulata | |
| EP0288200A1 (en) | Spiramycin resistance-conferring cloning vectors | |
| US4686184A (en) | Gene transfer vector | |
| US5057425A (en) | Picromycin resistance-conferring gene, designated pica, for use in streptomyces and other organisms | |
| Lampel | Transformation and cloning in anthracycline-producing streptomycetes | |
| JPH08168379A (ja) | ストレプトマイセスおよび類縁属の複製起点として機能するｄｎａセグメント |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB | Publication of examined application | ||
| GB | Transfer or assigment of application |
Owner name: PHARMACIA & UPJOHN S.P.A. |
|
| FG | Patent granted |
Owner name: PHARMACIA & UPJOHN S., P.A. |
|
| MA | Patent expired |