HU217210B - Eljárás doxorubicin antibiotikumokra rezisztens gének izolálására és jellemzésére - Google Patents
Eljárás doxorubicin antibiotikumokra rezisztens gének izolálására és jellemzésére Download PDFInfo
- Publication number
- HU217210B HU217210B HU264/89A HU26489A HU217210B HU 217210 B HU217210 B HU 217210B HU 264/89 A HU264/89 A HU 264/89A HU 26489 A HU26489 A HU 26489A HU 217210 B HU217210 B HU 217210B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- doxorubicin
- dna
- peucetius
- resistance
- vector
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
- C12P19/56—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical directly bound to a condensed ring system having three or more carbocyclic rings, e.g. daunomycin, adriamycin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
A találmány tárgya eljárás dőxőrűbicinrezisztenciát kódőló génttartalmazó DNS-inszert vagy annak restrikciós fragmense, ilyen DNS-inszertet tartalmazó rekőmbináns vektőr és a rekőmbináns vektőrraltranszfőrmált gazdaszervezet előállítására. A találmány szerinti DNS-inszert restrikciós kőnfigűrációját az 1. és 2. ábra műtatja be. ŕ
Description
A találmány tárgya eljárás doxorubicin antibiotikumra rezisztens gének izolálására és jellemzésére.
A találmány tárgya továbbá eljárás olyan DNSfragmensek előállítására, amelyek doxorubicin antibiotikum elleni rezisztenciát közvetítenek, továbbá eljárás az ilyen DNS-fragmenseket tartalmazó rekombináns bakteriális vektorok és a vektorokkal transzformált baktérium gazdaszervezetek előállítására.
A daunorubicin csoportba tartozó antraciklinek, mint például a doxorubicin, karminomicin és aklavinomicin a daganatellenes terápiában legszélesebb körben alkalmazott szerek közé tartoznak. Ezeket különböző Streptomyces törzsek termelik, így például S. peucetius, S. coeruleorubidus, S. galilaeus, S, griseus, S. griseoruber, S. viridochromogenes és S. bifurcus.
A doxorubicint csak a S. peucetius var. caesius termeli. A S. peucetius var. caesius IMRU 3920 (a továbbiakban „S. peucetius 3920”) hozzáférhető, és a 3 590028 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban van ismertetve. Az S. peucetius 3920 törzset letétbe helyezték az Institute of Microbiology of the Rutger University, US intézetnél az IMRU 3920 számon. Ez a törzs és a klasszikus mutagén kezeléssel kapott mutánsa rezisztensek a doxorubicin nagy mennyiségével szemben.
Az ezen anyagokkal szembeni rezisztencia mechanizmusának tanulmányozása két fő szempontból fontos:
a) Számos olyan eset van, ahol a szekunder metabolitok bioszintézisében részt vevő gének legalább egy rezisztencia génben csoportosulnak, ilyen például az oxitetraciklin (Rhodes P. M., Hunter I. S., Friend E. J. és Warren M., 1984, Trans Biochem Soc. 12, 586-587), eritromicin (Stanzák R., Matsushima P., Baltz R. H. és Rao R. N., Biotechnology 4, 1986. március, 229-232), tilozin (Fayerman J. T., Biotechnology 4, 1986. szeptember, 786-789) és tetracenomicin (Motamedi H., Hutchinson C. R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 4445-4449, 1987). A bioszintetizáló gének klónozása hasznos lehet különböző molekulák előállítási lépései sorozatának megváltoztatása vagy a bioszintetikus útban jelen levő szűk keresztmetszet kiküszöbölése szempontjából, megnövelve ezáltal a törzs termelőképességét.
b) Maga a rezisztencia beiktatható a szabályozó mechanizmusba úgy, hogy megváltozzon a rezisztencia szintje (azaz megnőjön a gén dózisa), így a törzs termelőképessége javítható. Ezt a régi ötletet rendszerint a klasszikus mutagén módszerekkel és random kiválogatással valósítják meg, de a rekombináns DNS-technikák hasznosításával újra előtérbe került (Craveri R. és Davies J. E., The Journal of Antibiotics, 1986. január, 128-135).
Kutatásaink során izoláltunk két DNS-szegmenst, amelyek magukban foglalják a doxorubicinrezisztencia géneket.
A találmány tárgya ennek megfelelően eljárás rekombináns bakteriális vektor előállítására oly módon, hogy egy szülő vektorba
i) olyan DNS-molekulát klónozunk, amelyben a restrikciós mintázatát az 1. és 2. ábra mutatja, vagy ii) ezekből származó restrikciós fragmenst klónozunk, amely a doxorubicinrezisztenciát kódoló gént tartalmazza.
Az egyszerűség kedvéért az 1. és 2. ábrán bemutatott DNS-szegmenseket a továbbiakban DNS-inszerteknek nevezzük.
A találmány tárgya továbbá eljárás baktérium gazdasejtek előállítására oly módon, hogy egy baktériumsejtet egy, a találmány szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.
Az alábbiakban a mellékelt ábrákat részletesen ismertetjük.
Az 1. ábra egy, a találmány szerinti eljárással előállított első DNS-szegmens restrikciós térképét mutatja. Ez egy, a FICE 1 (Rec 1) rekombináns plazmidban található inszert. Az inszert Sau3AI végekkel rendelkezik, és a pIJ702 plazmid BglII helyére iktattuk be. Ligálás után egy BglII helyet helyreállítottunk.
A 2. ábra egy másik, a találmány szerinti eljárással előállított DNS-szegmens restrikciós térképét mutatja. Ez egy, a FICE 2 (Rec 2) rekombináns plazmidban található inszert. Az inszert Sau3AI végekkel rendelkezik, és a pIJ702 plazmid BglII helyére iktattuk be. Ligálás után egy BglII helyet helyreállítottunk.
Az 1. és 2. ábrán bemutatott térképek szükségszerűen nem mutatják a DNS-szegmensek minden restrikciós helyének kimerítő listáját, a bemutatott helyek azonban elegendő útmutatást adnak a szegmensek egyértelmű felismerésére.
A találmány szerinti eljárással előállított DNS-inszertek és restrikciós fragmenseik egy doxorubicinrezisztenciát kódoló gént tartalmaznak. Az ilyen gén kifejezéséhez a DNS tartalmazhat egy saját transzkripciós kontrollszekvenciát, és különösen egy saját promotert, amely működőképesen kapcsolódik a génhez, és amelyet a gazdasejt RNS-polimeráza felismer. Az is lehetséges, hogy a DNS-inszertet vagy restrikciós fragmensét egy másik transzkripciós kontrollszekvenciához Egáljuk korrekt elrendezésben, vagy egy bakteriális vektorba klónozzuk egy olyan restrikciós helyre, amely alkalmas helyen, a vektorban egy transzkripciós kontrollszekvencia szomszédságában helyezkedik el. Egy doxorubicinrezisztencia gént hordozó DNS-inszert vagy restrikciós fragmense klónozható egy rekombináns DNS-klónozó vektorba. Erre a célra bármely, DNS-molekulát tartalmazó, autonóm módon replikálódó és/vagy integrálódó konstrukció alkalmazható, amelyhez egy vagy több további DNS-szegmens adható. Tipikusan azonban a vektor egy plazmid. Egy előnyös plazmid a nagy kópiaszámú pIJ702 plazmid (Katz és munkatársai, J. Gén. Microbiol. 1983, 129, 2703-2714). A DNSinszert vagy restrikciós fragmense vektorba történő beiktatásához bármely alkalmas módszert alkalmazhatunk. A beiktatást végezhetjük úgy, hogy a DNS-t egy linearizált vektorba Egáljuk egy alkalmas restrikciós helynél. Ezt végezhetjük a tapadós végek közvetlen kombinálásával vagy homopolimer farok segítségével, vagy egy linker vagy adapter molekula alkalmazásával.
A rekombináns bakteriális vektort egy alkalmas baktérium gazdasejt transzformálására használjuk, gazda2 sejtként tipikusan olyan sejteket használunk, amelyek esetén előny származik abból, hogy doxorubicinrezisztenciával rendelkeznek. Gazdasejtként olyanokat használhatunk, amelyek doxorubicinszenzitívek, azaz doxorubicin jelenlétében nem képesek lenni, vagy olyanokat, amelyek doxorubicinrezisztensek, de előnyösebb, ha nagyobb rezisztenciával rendelkeznek doxorubicin ellen.
S. peucetius törzsek, különösen S. peucetius var. caesius, amely doxorubicint termel, és más Streptomyces törzsek, amelyek antraciklineket termelnek, transzformálhatok. A doxorubicin elleni rezisztencia vagy nagyobb rezisztencia lehetővé teszi, hogy ezek a törzsek több doxorubicint termeljenek. A doxorubicin nagyobb koncentrációival szembeni tolerancia érhető el. Az S. peucetius törzsek transzformálását rendszerint protoplaszt transzformálással lehet végezni így a doxorubicint a transzformált S. peucetius törzs tenyésztésével és a termelt doxorubicin kinyerésével kapjuk.
A DNS-inszerteket az S. peucetius M76 genom DNS-éből állíthatjuk elő. Az S. peucetius M76 az S. peucetius 3920 mutánsa, amely a daunorubicint nagymértékben képes doxorubicinné alakítani. Az S. peucetius M76 törzset letétbe helyeztük a Deutsche Sammlung von Mikroorgan ismén (DSM), NSZK letéti helyen 1988. május 11-én DSM 4592 számon. Az olyan S. peucetius M76 törzsből származó törzsek, amelyek a daunorubicint doxorubicinné képesek alakítani, szintén alkalmazhatók.
A DNS-inszerteket a következőképpen állítjuk elő:
a) S. peucetius M76 (DSM 4592) törzsből vagy egy abból származó törzsből genom DNS-könyvtárat készítünk;
b) a könyvtárat doxorubicinrezisztenciára átvizsgáljuk;
c) egy rekombináns vektorból, amely a könyvtárnak részét képezi, és amely az átvizsgáláskor pozitívnak mutatkozott doxorubicinrezisztenciára, egy DNSinszertet állítunk elő;
d) és kívánt esetben a DNS-inszertből olyan restrikciós fragmenst állítunk elő, amely tartalmazza a doxorubicinrezisztenciát kódoló gént.
Az a) lépésben a könyvtárat úgy állítjuk elő, hogy az S. peucetius M76 vagy egy abból származó törzs genom DNS-ét részlegesen emésztjük. Erre a célra előnyösen Mbol enzimet alkalmazunk. Az így kapott fragmenseket méret szerint frakcionáljuk. Előnyösek a 4-6 kb méretű fragmensek. Ezeket a fragmenseket azután egy linearizált vektorba, például pIJ702 plazmidba ligáljuk. A ligálási eleggyel gazdasejteket transzformálunk. A gazdasejtek rendszerint doxorubicinszenzitívek, például szenzitívek 50 pg vagy annál kevesebb, vagy előnyösen 30 pg vagy annál kevesebb doxorubicinre mlenként. A transzformáláshoz például S. lividans TK 23 protoplasztot használunk.
A b) lépésben az így kapott transzformánsokat doxorubicinrezisztenciára vizsgáljuk át. A doxorubicinrezisztens kiónokat doxorubicint tartalmazó tápközegen történő növesztéssel azonosítjuk. Az ilyen kiónokat izoláljuk, és a bennük található rekombináns vektorokat extraháljuk. A rekombináns vektorok alkalmas restrikciós enzimmel történő emésztésével a c) lépésben a vektorba beiktatott S. peucetius M76 DNS azonosítható, méret szerint meghatározható és feltérképezhető. Ilyen módon ellenőrizhető, hogy a vektor tartalmazza-e a találmány szerinti eljárással előállított DNS-inszertet.
Ezenkívül két vagy több olyan átlapoló inszert izolálható, amelyek teljesen vagy részben beleesnek a találmány szerinti eljárással előállított DNS-fragmensbe. Ezek összekapcsolhatók úgy, hogy egy szokásos restrikciós helynél hasítjuk, és ezután ligáljuk, így a találmány szerinti DNS-fragmenst kapjuk, kívánt esetben alkalmas restrikciós enzimmel a hossza módosítható. A d) lépésben a találmány szerinti eljárással előállított DNS-inszert olyan restrikciós fragmensét kaphatjuk, amely tartalmazza a doxorubicinrezisztenciát kódoló gént, oly módon, hogy a DNS-inszertet alkalmas restrikciós enzimmel hasítjuk.
Végül a találmány szerinti eljárással előállított DNS mutálható úgy, hogy az ne érintse a doxorubicinrezisztenciát közvetítő képességet. Ez elérhető például helyre irányított mutagenezissel. Az ilyen mutált DNS előállítása szintén a találmány tárgyát képezi. A találmány szerinti eljárást a következő példákban szemléltetjük közelebbről. A példákban TsR, DoxoR és Doxos a tiosztrepton-rezisztencia, doxorubicinrezisztencia és doxorubicinszenzitivitás fenotípusát jelöli.
Példa
l. Anyagok és módszerek
Baktériumtörzsek és plazmidok
Streptomyces peucetius M76, egy fonalas streptomyceta, amely daunorubicint és doxorubicint termel, és doxorubicinre rezisztens (minimális inhibíciós koncentráció : 250 pg/ml), néhány bioszintetikus mutánsa szenzitív doxorubicinra; S. lividans TK 23 szenzitív doxorubicinra.
pIJ702 plazmid nagy kópiaszámú plazmid, beszerezhető John Innes Culture Collection, Norwich, GB intézettől.
Tápközegek és pufferek
TSB 30 g triptonos szójalé (DIFCO) literenként, desztillált vízben; YEME összetétele: 5 g élesztőkivonat (DIFCO), 10 g malátaextraktum (DIFCO), 340 g szacharóz, 5 mmol/1 MgCl2.6H2O és különböző glicinkoncentrációk literenként, desztillált vízben.
Az R2YE regeneráló tápközeget Chater K. F., Hopwood D. A., Kieser T. és Thompson C. J. (1982) ismerteti a „Gene cloning in Streptomyces”, (69-95) című fejezetben, a P. H. Hofschneider és W. Goebbel által szerkesztett „Gene Cloning in Organisms other than E. coli”, Springer-Verlag, Berlin című műben. A tápközeg összetétele literenként a következő:
Szacharóz 103 g
2,5%K2SO4 10 ml
MgCl2.6H2O 10,1 g glükóz 10 g kazaminosavak 0,1 g agar 22 g nyomelemkeverék 2 ml
0,5% KH2PO4 10 ml lMCaCl2 20 ml prolin 3 g
0,25M TES pH=7,2 100 ml
10% élesztőextraktum 50 ml
A P tápközeget Baltz R. H. ismerteti a J. Gén. Microbiol. 107:93-102 (1978) helyen.
A streptomycetákat a 3 590028 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás 2. példája szerinti szilárd tápközegen tartottuk fent.
Növesztési körülmények
Folyékony tenyészetekhez mindkét Streptomyces fajt 50 ml YEME + TSB (1:1) közegen növesztettük 28 °C-on egy 280 fordulat/perc sebességű rázógépen. A növesztő tápközeget homogenizált micéliumokkal inokuláltuk. A homogenizálást a micéliumok üveggyöngyök jelenlétében végzett keverésével végeztük.
Protoplaszt transzformálás ml folyékony tenyészetből (0,5% glicinnel kiegészítve) micéliumokat nyerünk 10 percig 1500 g-vel történő centrifugálással, kétszer mossuk 10,3%-os szacharózzal, 10 ml P tápközegben, amely 1 mg/ml lizozimot (SIGMA) tartalmaz, szuszpendáljuk, és 60 percig 30 °C-on reciprok rázatással (280 fordulat/perc) inkubáljuk. A protoplasztok képződése után a szuszpenziót egy vásznon leszűrjük, egyszer mossuk P tápközeggel, és szuszpendáljuk 1 ml P tápközeggel. így rendszerint 108 protoplasztot kapunk.
Transzformáláshoz 200 μΐ, körülbelül 2xl07 protoplasztot tartalmazó P tápközeget keverünk 10 μΐ, kívánt mennyiségű DNS-t tartalmazó TE pufferrel (10 mmol/1 Tris-HCl, 1 mmol/1 EDTA, pH = 8,0) és 800 μΐ 25%-os polietilénglikollal (PEG, 1000) P tápközegben. 1 perccel a PEG-oldat adagolása után a transzformálást 5 ml P tápközeg adagolásával leállítjuk. A protoplasztokat centrifugálással ülepítjük, és 1 ml P tápközegben szuszpendálva R2YE lemezeken szélesztjük. 24 óra hosszat 28 °C-on végzett inkubálás után a transzformánsokat úgy szelektáljuk, hogy a lemezeket elárasztjuk 3 ml lágy NA tápközeggel (8 g DIFCO tápközeg és 5 g agar literenként), amely megfelelő antibiotikumot tartalmaz. A transzformánsok száma körülbelül 1χ104-1χ107 egy pg DNS-re számítva, az alkalmazott törzstől függően.
Plazmid és genom DNS izolálása
A plazmid és a genom DNS izolálását a streptomycetákból Hepwood D. A. és munkatársai által (1985) „Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual” The John Innes Foundation helyen ismertetett módon végezzük.
S. peucetius M76 genomkönyvtár előállítása
A restrikciós enzimeket, borjútimusz alkalikus foszfatázt és T4 ligázt BRL-től (Bethesda, MD) szereztük be, és a gyártó általi előírások szerint alkalmaztuk. Az S. peucetius M76 genom DNS-t részlegesen emésztettük Mbol-vel, és a 4 és 6 kb közötti méretű fragmenseket elektroelúcióval agarózgélről kinyertük. Ezeket a fragmenseket BglII-vel linearizált és foszfatázzal kezelt pIJ702 plazmidba ligáltuk. A ligálási elegyet S. lividans TK 23 protoplasztok transzformálására használtuk, amelyek 30 pg/ml doxorubicinre szenzitívek.
2. Eredmények
DNS-fragmensek klónozása, amelyek doxorubicinrezisztenciát visznek át szenzitív Streptomyces törzsekbe
Mbol-vel részlegesen emésztett S. peucetius M76 genom DNS-t a pIJ702 BglII helyére iktatjuk be. A ligálási elegyet S. lividans TK 23 protoplasztok transzformálására használjuk. A transzformánsokat tiosztreptonrezisztenciára és fehér színre szelektáljuk, amely a pIJ702 melanin génjének beiktatásos inaktiválására utal.
A tiosztreptonrezisztens fehér kolóniákat azután doxorubicinrezisztenciára (100 pg/ml) vizsgáljuk át. Ezeket R2YE tápközegen szélesztjük, 500 pg/ml doxorubicint tartalmazó 3 ml lágy NA tápközeggel 28 °C-on 24 óra hosszat inkubáljuk. így két TsR és DoxoR kiónt azonosítunk.
A két kiónból a plazmid DNS extrakciójával kimutatható volt az 5,7 kb és 4,4 kb hosszúságú inszertek jelenléte. A két rekombináns plazmidot F1CE 1 és FICE 2 jellel jelöltük, és újra S. lividans TK 23 protoplasztok transzformálására használtuk. Mindkét esetben a transzformálás azt mutatta, hogy a DoxoR jelleg nagy hatásfokkal vivődött át a TsR jelleggel együtt.
DoxoR jelleg kifejezése S. peucetius Doxos mutánsokban
A két rekombináns plazmidot azután S. peucetius M76 olyan mutáns származékaiba vittük be, amelyek Doxos mutánsok (minimális inhibíciós koncentráció 50 pg/ml). A transzformánsok a Doxos jelleg komplementálását mutatták. Képesek voltak nőni 1500 pg/ml doxorubicint tartalmazó közegen, ami a doxorubicinrezisztencia magasabb szintjére utal, mint a szülő S. peucetius M76 törzs, a klónozott gének donoija esetén megfigyelhető (minimális inhibíciós koncentráció 250 pg/ml). A rezisztencia magasabb szintje a transzformánsokban azzal magyarázható, hogy a rekombináns plazmidok magas kópiaszámmal rendelkeznek (pIJlOl replikon, Katz és munkatársai, 1983).
A klónozottfragmensek restrikciós enzimes analízise
Mivel a két klónozott fragmens által közvetített fenotípus azonos volt, megvizsgáltuk, hogy van-e egy vagy két határozott funkció, amely a DoxoR jelleget közvetíti. Az 1. és 2. ábra mutatja a FICE 1 és FICE 2 S. peucetius M76-ból származó inszertjeinek restrikciós térképét. A két térkép nagy részét egyszeres és kétszeres, különböző enzimkombinációkat alkalmazó emésztésekkel nyert fragmensek méretéből határoztuk meg. A két szomszédos hely közötti hosszúság a megfelelő kettős vagy egyszeres emésztések során kapott illető fragmensek közvetlen méréséből adódik.
A két klónozott fragmens térképe között nincsen nyilvánvaló megfelelés, ami arra utal, hogy a rezisztenciát két különálló gén közvetíti.
Claims (7)
1. Eljárás rekombináns bakteriális vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vektorba i) olyan DNSmolekulát, amelynek a restrikciós mintázatát az 1. és
2. ábra mutatja, vagy ii) ezekből származó olyan restrikciós fragmenst klónozunk, amely a doxorubicinrezisztenciát kódoló gént tartalmazza.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy vektorként plazmidot használunk.
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS-molekulát egy pIJ702 plazmidba inszertáljuk.
4. Eljárás baktérium gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy baktériumsejtet egy, az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárással előállított vektorral transzformálunk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy antraciklin antibiotikumot termelő baktériumot transzformálunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy S. peucetiust transzformálunk.
7. Eljárás az 1. és 2. ábrán bemutatott restrikciós mintázattal rendelkező DNS-molekula vagy annak restrikciós fragmense előállítására, azzal jellemezve, hogy
a) S. peucetius M76 (DSM 4592) törzsből vagy 5 ennek származékából genom DNS-könyvtárat állítunk elő,
b) a könyvtárat doxorubicinrezisztenciára átvizsgáljuk,
c) egy, a könyvtár részét képező és a doxorubicin10 rezisztenciára történő átvizsgálás során pozitívnak mutatkozó rekombináns vektorból kinyerjük az 1. és 2. ábrán bemutatott restrikciós mintázattal rendelkező
DNS-molekulát, és
d) kívánt esetben a DNS-molekulából egy restrik15 ciós fragmenst állítunk elő, amelynek része a doxorubicinrezisztenciát kódoló gén.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888812697A GB8812697D0 (en) | 1988-05-27 | 1988-05-27 | Isolation & characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU217210B true HU217210B (hu) | 1999-12-28 |
Family
ID=10637720
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU264/89A HU217210B (hu) | 1988-05-27 | 1989-05-26 | Eljárás doxorubicin antibiotikumokra rezisztens gének izolálására és jellemzésére |
| HU893264A HUT52818A (en) | 1988-05-27 | 1989-05-26 | Process for isolation and characterization of genes resistent to anthracycline antibiotics |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU893264A HUT52818A (en) | 1988-05-27 | 1989-05-26 | Process for isolation and characterization of genes resistent to anthracycline antibiotics |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0371112B1 (hu) |
| JP (1) | JP3240052B2 (hu) |
| KR (1) | KR970010761B1 (hu) |
| AT (1) | ATE115627T1 (hu) |
| AU (1) | AU610411B2 (hu) |
| CA (1) | CA1335575C (hu) |
| DE (1) | DE68920007T2 (hu) |
| DK (1) | DK175446B1 (hu) |
| FI (1) | FI97728C (hu) |
| GB (1) | GB8812697D0 (hu) |
| GR (1) | GR1002049B (hu) |
| HU (2) | HU217210B (hu) |
| IE (1) | IE66718B1 (hu) |
| IL (1) | IL90386A (hu) |
| NZ (1) | NZ229237A (hu) |
| PT (1) | PT90667B (hu) |
| RU (1) | RU2118367C1 (hu) |
| WO (1) | WO1989011532A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA893979B (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPN799596A0 (en) * | 1996-02-09 | 1996-03-07 | Northern Sydney Area Health Service | Chemotherapy resistance gene |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| YU33730B (en) * | 1967-04-18 | 1978-02-28 | Farmaceutici Italia | Process for preparing a novel antibiotic substance and salts thereof |
| JPS6158589A (ja) * | 1984-08-30 | 1986-03-25 | Meiji Seika Kaisha Ltd | ビアラホス生産遺伝子及び耐性遺伝子 |
| US4935340A (en) * | 1985-06-07 | 1990-06-19 | Eli Lilly And Company | Method of isolating antibiotic biosynthetic genes |
-
1988
- 1988-05-27 GB GB888812697A patent/GB8812697D0/en active Pending
-
1989
- 1989-05-08 CA CA000598991A patent/CA1335575C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-23 GR GR890100339A patent/GR1002049B/el not_active IP Right Cessation
- 1989-05-23 IL IL9038689A patent/IL90386A/en not_active IP Right Cessation
- 1989-05-23 NZ NZ229237A patent/NZ229237A/en unknown
- 1989-05-24 PT PT90667A patent/PT90667B/pt not_active IP Right Cessation
- 1989-05-25 ZA ZA893979A patent/ZA893979B/xx unknown
- 1989-05-26 RU SU4743220A patent/RU2118367C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 AU AU36927/89A patent/AU610411B2/en not_active Ceased
- 1989-05-26 HU HU264/89A patent/HU217210B/hu unknown
- 1989-05-26 AT AT89906078T patent/ATE115627T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 DE DE68920007T patent/DE68920007T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-26 JP JP50550789A patent/JP3240052B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-26 EP EP89906078A patent/EP0371112B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-26 KR KR1019900700134A patent/KR970010761B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-05-26 WO PCT/EP1989/000588 patent/WO1989011532A1/en active IP Right Grant
- 1989-05-26 HU HU893264A patent/HUT52818A/hu not_active IP Right Cessation
- 1989-06-12 IE IE173089A patent/IE66718B1/en not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-01-24 FI FI900359A patent/FI97728C/fi not_active IP Right Cessation
- 1990-01-26 DK DK199000218A patent/DK175446B1/da not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL90386A0 (en) | 1989-12-15 |
| AU610411B2 (en) | 1991-05-16 |
| PT90667A (pt) | 1989-11-30 |
| HU893264D0 (en) | 1990-07-28 |
| IE891730L (en) | 1989-11-27 |
| FI97728B (fi) | 1996-10-31 |
| JP3240052B2 (ja) | 2001-12-17 |
| PT90667B (pt) | 1994-10-31 |
| DK175446B1 (da) | 2004-10-25 |
| DE68920007T2 (de) | 1995-04-27 |
| EP0371112A1 (en) | 1990-06-06 |
| GB8812697D0 (en) | 1988-06-29 |
| GR890100339A (el) | 1990-03-12 |
| RU2118367C1 (ru) | 1998-08-27 |
| JPH02504470A (ja) | 1990-12-20 |
| IL90386A (en) | 1995-12-31 |
| EP0371112B1 (en) | 1994-12-14 |
| KR900702024A (ko) | 1990-12-05 |
| WO1989011532A1 (en) | 1989-11-30 |
| ZA893979B (en) | 1990-02-28 |
| ATE115627T1 (de) | 1994-12-15 |
| HUT52818A (en) | 1990-08-28 |
| FI900359A0 (fi) | 1990-01-24 |
| AU3692789A (en) | 1989-12-12 |
| NZ229237A (en) | 1992-05-26 |
| DK21890A (da) | 1990-01-26 |
| CA1335575C (en) | 1995-05-16 |
| IE66718B1 (en) | 1996-01-24 |
| DE68920007D1 (de) | 1995-01-26 |
| GR1002049B (en) | 1995-11-16 |
| DK21890D0 (da) | 1990-01-26 |
| KR970010761B1 (ko) | 1997-06-30 |
| FI97728C (fi) | 1997-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5098837A (en) | Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms | |
| EP0238892A2 (en) | Cloning vectors for streptomyces and use thereof in macrolide antibiotic production | |
| Stutzman-Engwall et al. | Multigene families for anthracycline antibiotic production in Streptomyces peucetius. | |
| Romero et al. | Discrete amplifiable regions (amplicons) in the symbiotic plasmid of Rhizobium etli CFN42 | |
| HUT54416A (en) | Process for utilizing placespecific integrating function of fag fi-c-31 | |
| EP0118367B1 (en) | Recombinant dna cloning vector pve1, deletion and hybrid mutants, and recombinant derivatives thereof, products and processes | |
| DE69736673T2 (de) | Rifamycin biosynthese genkluster | |
| US5665564A (en) | Isolation and characterisation of genes resistant to anthracycline antibiotics | |
| DE68918532T2 (de) | Für eine 4''-0-Isovalerylacylase kodierende rekombinante DNS. | |
| EP0213898B1 (en) | A host-vector system | |
| HU217210B (hu) | Eljárás doxorubicin antibiotikumokra rezisztens gének izolálására és jellemzésére | |
| US4880746A (en) | Streptomycetes plasmid PSG5, a process for obtaining it, and its use | |
| EP0288200A1 (en) | Spiramycin resistance-conferring cloning vectors | |
| US5057425A (en) | Picromycin resistance-conferring gene, designated pica, for use in streptomyces and other organisms | |
| AU615524B2 (en) | The use of psg5 as a temperature-sensitive plasmid | |
| US4914030A (en) | Carbomycin resistance-conferring gene, designated carb, for use in streptomyces and other organisms | |
| JPH09163982A (ja) | ジエノンマクロライドの製法 | |
| WO1997008323A1 (en) | Staurosporin biosynthesis gene clusters | |
| JPH0638750A (ja) | マクロライド抗生物質の３位アシル化酵素およびそれをコードする遺伝子 | |
| Lampel | Transformation and cloning in anthracycline-producing streptomycetes | |
| JP2006523447A (ja) | クラバム、例えばクラブラン酸の製造を改良する新規方法 | |
| JPS59154991A (ja) | リボスタマイシン耐性遺伝子およびプラスミド | |
| DE3412092A1 (de) | Das streptomyceten-plasmid psg5, verfahren zu seiner gewinnung und seine verwendung |