DK175446B1 - Isoleret DNA, rekombinant vektor og vært, hvilke indeholder et gen som koder for duxurubin-resistens, samt fremgangsmåder til opnåelse heraf - Google Patents

Description

DK 175446 B1

Den foreliggende opfindelse angår isolerede DNA fragmenter omfattende gener, der giver resistens over for doxorubicin, rekombinante vektorer indeholdende sådanne DNA-fragmenter samt værter transformeret med vektorerne. Endvidere angår opfindelsen fremgangsmåder til opnåelse 5 af DNA-sekvensen, den rekombinante vektor og doxorubicin.

Anthracyclinerne fra daunorubicingruppen, såsom doxorubicin, carminomycin og aclavinomycin, er blandt de mest anvendte midler ved anti-tumoral terapi. De er polyketider produceret af forskellige stammer af Streptomyces (S. peucetius, S. coeruleorubidus, S. galilaeus, S.

10 griseus, S. griseoruber, S. viridochromogenes og S. bifurcus).

Doxorubicin produceres kun af S. peucetius var. caesis. Typen stamme S. peucetius var. caesius IMRU 3920 (herefter forkortet til "S. peucetius 3920") er offentligt tilgængelig og er beskrevet i US-A 3.590.028. S. peucetius 3920 er blevet deponeret ved the Institute of 15 Microbiology of the Rutger University, US og har modtaget indexnummer IMRU 3920. Denne stamme og dens mutanter opnået ved klassike mutagenbehandlinger, er resistente overfor høje niveauer af doxorubicin.

Undersøgelsen af mekanismerne, der er forbundet med resistensen over for disse substanser er afgørende af to hovedårsager: 20 a) Der er mange eksempler, hvor generne involveret i biosyntesen af sekundære metaboliter, alle har samlet sig sammen med mindst ét resistensgen: f.eks. oxytetracyclin (P.M. Rhodes, I.S. Hunter, E.J. Friend og M. Warren, 1984, Trans Biochem. Soc. 12, 586-587), erythromycin (R.

Stanzak, P. Matsushima, R.H. Baltz og R.N. Rao, Biotechnology vol. 4, 25 marts 1986, 229-232), tylosin (J.T. Fayerman, Biotechnology vol. 4, sept. 1986, 786-789) og tetracenomycin (M. Motamedi, C.R. Hutchinson,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 84, 4445-4449, 1987). Kloning af biosyntesegenerne kan være nyttig med henblik på ændring af veje til produktion af afvigende molekyler eller overvindelse af flaskehalse i bio-30 syntesevejene til forøgelse af stammens produktivitet.

b) Resistensen i sig selv kan ligge i de regulerende mekanismer således, at stammens produktivitet kan forbedres ved ændring af resistensniveauerne (dvs. forøgelse af gendosen). Dette er en gammel ide, der sædvanligvis udføres via de klassiske metoder med mutagenese og vi 1 -35 kårlig screening, men fornyet ved anvendelse af rDNA-metoder (R. Craveri og J.E. Davis, The Journal of Antibiotics, jan. 1986, 128-135).

Vi har nu isoleret to DNA-segmenter, som inkorporerer doxorubicin-resistensgener. Følgeligt tilvejebringes ifølge den foreliggende opfin-

I DK 175446 B1 I

I I

I delse DNA med den på tegningen i Fig. 1 eller 2 viste konfiguration af I

I restriktionspladser, eller et restriktionsfragment afledt deraf og inde- I

I holdende et gen, der koder for doxorubicin-resistens. For nemheds skyld I

I benævnes DNA-segmenterne vist i Fig. 1 og 2 her indføjelses-DNA. Ifølge I

I 5 den foreliggende opfindelse tilvejebringes også I

I - rekombinante vektorer, som er i stand til at transformere en I

I værtscelle og som indeholder et indføjelses-DNA eller et restriktions- I

I fragment afledt derfra og indeholdende et doxorubicin- resistensgen, og I

I - værtsceller transformeret med sådanne vektorer. I

10 Opfindelsen belyses nærmere i forbindelse med tegningen, hvor Fig. I

1 er restriktionskortanalysen af et første DNA ifølge opfindelsen. Dette I

I er en indføjelse i rekombinant plasmid FICE 1 (Rec 1). Indføjelsen har I

Sau3AI ender og er indføjet på BglIl-pladsen i pIJ702. En BglIl-plads I

blev gendannet efter ligering. I

I 15 Fig. 2 er restriktionskortanalysen af et andet DNA ifølge opfindel- I

I sen. Dette er en indføjelse i rekombinant plasmid FICE 2 (Rec 2). lndfø- I jelsen har Sau3AI ender og er indføjet på BglIl-pladsen i pIJ702. En

Bgl11-piads blev gendannet efter ligering.

I Kortene vist i fig. 1 og 2 tilvejebringer ikke nødvendigvis en ud-

20 tømmende opregning af alle restriktionssteder, der findes i hvert DNA

I segment. De anførte pladser er imidlertid tilstrækkelige til en utvety dig genkendelse af segmenterne.

Indføje!ses-DNA'er og restriktionsfragmenter ifølge opfindelsen omfatter et gen, der koder for doxorubicin-resistens. Til ekspression af 25 et sådant gen kan DNA'et bære sin egen transkriptionskontrolsekvens, og især sin egen promotor, som er operativt forbundet med genet, og som genkendes af en værtscelle-RNA-polymerase. Alternativt kan indføjelses-DNA'et eller restriktionsfragmentet ligeres til en anden transkriptions-kontrolsekvens på korrekt måde eller klones i en vektor ved en restrik-30 tionsplads, der hensigtsmæssigt befinder sig ved siden af en transkriptionskontrol sekvens i vektoren.

Et indføjelses-DNA eller restriktionsfragment, der bærer et doxoru-bicin-resistensgen, kan klones i en rekombinant DNA-kloningsvektor. Et vilkårligt, autonomt replikerende og/eller integrerende agens omfattende 35 et DNA-molekyle, hvortil der kan føjes ét eller flere yderligere DNA-segmenter, kan anvendes. Imidlertid er vektoren typisk et plasmid. Et foretrukkent plasmid er plasmidet pIJ702 med højt kopiantal (Katz et al., J. Gen Microbiol, 1983, 129, 2703-2714). En hvilken som helst egnet 3 DK 175446 B1 teknik kan anvendes til indføjelse af indføjelses-DNA'et eller restriktionsfragmentet deraf i vektoren. Indføjelse kan opnås ved ligering af DNA i en lineariseret vektor på en hensigtsmæssig restriktionsplads.

Hertil kan anvendes direkte kombination af klæbrige ender eller homopo-5 lymer tailing eller anvendelse af et linker- eller adaptermolekyle.

Den rekombinante vektor anvendes til transformation af en egnet værtscelle, typisk celler, som vil kunne drage nytte af at være i stand til at udvise doxorubicin-resistens. Værtscellerne kan være sådanne, der er doxorubicin-føl somme, dvs. som ikke kan vokse i nærvær af doxorubi-10 cin, eller sådanne, som er doxorubicin-resistente, men som ville have gavn af større resistens over for doxorubicin. Værten kan være en mikroorganisme. Stammer af S. peucetius, nærmere betegnet S. peucetius var. caesius, som producerer doxorubicin, og andre stammer af Streptomyces, som producerer anthracycliner, kan derfor transformeres. Resistens, 15 eller større resistens, over for doxorubicin kan muliggøre, at celler af sådanne stammer producerer mere doxorubicin. Tolerance over for større koncentrationer af doxorubicin kan opnås. Transformanter af stammer af S. peucetius opnås typisk ved protoplasttransformation. Doxorubicin kan I således opnås ved dyrkning af en transformeret stamme af S. peucetius og I 20 udvinding af det således producerede doxorubicin.

I Indføjelses-DNA'er opnås fra det genome DNA af S. peucetius M76. S.

I peucetius M76 er en mutant af S. peucetius 3920, som er i stand til at I omdanne daunorubicin til doxorubicin i høje niveauer. S. peucetius M76 I er blevet deponeret ved Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), I 25 Vesttyskland, 11. maj 1988 under accessionsnummer D.S.M. 4592. En stamme I afledt af S. peucetius M76 kan også anvendes, hvilken stamme typisk også I vil være i stand til at omdanne daunorubicin til doxorubicin. Inføjel- I ses-DNA'er kan derfor opnås ved: I (a) fremstilling af et bibliotek af det genome DNA af S. peucetius I 30 M75 eller en stamme afledt deraf, I (b) screening af biblioteket for doxorubicin-resistens, I (c) opnåelse af et indføjelses-DNA fra en rekombinant vektor, som I udgør en del af biblioteket, og som ved screening viste sig positiv med I hensyn til doxorubicin-resistens, og I 35 (d) eventuel opnåelse af et restriktionsfragment fra indføjelses- I DNA'et, hvilket fragment omfatter et gen, der koder for doxorubicin- I resistens.

I DK 175446 B1 I 4 I Biblioteket kan fremstilles i trin (a) ved partiel nedbrydning af H det genome DNA af S. peucetius M76 eller en stamme afledt deraf. For- H trinsvis anvendes restriktionsenzymet Mbol. De således opnåede fragmen- H ter kan opdeles efter størrelse. Fragmenter med en størrelse på 4-6 Kb 5 foretrækkes. Disse fragmenter ligeres i en lineariseret vektor, såsom pIJ702. Værtsceller transformeres med ligeringsbi andingen. Værtscellerne er typisk doxorubicin-følsomme, f.eks. følsomme over for 50 øg eller mindre, fortrinsvis 30 øg eller mindre, doxorubicin pr. ml. Eksempelvis kan S. lividans TK 23-protoplaster transformeres.

10 1 trin (b) screenes de således opnåede transformanter for doxorubi- cin-resistens. Kloner med doxorubicin-resistens identificeres ved dyrk- ning i et medium indeholdende doxorubicin. Sådanne kloner isoleres og rekombinante vektorer indeholdt deri ekstraheres. Ved nedbrydning af de I rekombinante vektorer med egnede restriktionsenzymer i trin (c) kan S.

15 peucetius M76 DNA'et, der er indføjet i hver vektor, identificeres, I størrelsesbestemmes og kortlægges. På denne måde kan det efterprøves, om vektoren indeholder et indføjelses-DNA ifølge opfindelsen.

I Endvidere kan der isoleres to eller flere overlappende indføjelser, I som helt eller delvist er omfattet af DNA'et ifølge opfindelsen. Disse I 20 kan sammenkobles ved spaltning på et fælles restriktionssted og efter- I følgende ligering til opnåelse af et DNA ifølge opfindelsen, der om nød- vendigt er begrænset med hensyn til længde under anvendelse af passende I restriktionsenzymer. Restriktionsfragmenter af et indføjelses-DNA, som I indeholder et gen, der koder for doxorubicin-resistens, kan også opnås i I 25 trin (d) ved spaltning af et indføjelses-DNA med et passende restrik- ti onsenzym.

I Slutteligt kan DNA ifølge opfindelsen muteres på en måde, som ikke I påvirker dets evne til at overføre doxorubicin-resistens. Dette kan f.eks. opnås ved pladsdirigeret mutagenese. Sådant muteret DNA falder I 30 også indenfor den foreliggende opfindelses rammer.

I Det følgende eksempel belyser den foreliggende opfindelse. I

I R R S

eksemplet angiver Ts , Doxo og Doxo hhv. thiostrepton-resistente, I doxorubicin-resistente og doxorubicin-følsomme phenotyper.

I 35 5 DK 175446 B1

Eksempel 1. Materialer oq metoder Bakteriestammer og pi asmider 5 Streptomyces peucetius M76, en filamentøs streptomycet, der produ cerer daunorubicin og doxorubicin og som er resistent over for doxorubicin (MIC 250 μg/ml), og nogle biosyntetiske mutanter, der er følsomme over for doxorubicin; S. lividans TK 23, der er følsom over for doxorubicin.

10 Plasmid piJ702 med højt kopi antal opnåedes fra the John Innes

Culture Collection, Norwich, GB.

Medier οα puffere TBS indeholdt 30 g tryptisk soyanæringsmedie (DIFCO) pr. liter 15 destilleret vand, YEME indeholdt 5 g gærekstrakt (DIFCO), 10 g maltekstrakt (DIFCO), 340 g saccharose, 5 mM MgCl2-61^0 og variable glycin-koncentrationer pr. liter destilleret vand.

Regenereringsmediet R2YE var som beskrevet af K.F. Chater, D.A.

Hopwood, T. Kieser og C.J. Thompson (1982), "Gene cloning in Streptomy-20 ces", 69-95 i P.H. Hofschneider og W. Goebbel (ed) "Gene Cloning in

Organisms other than E. col i", Springer-Veri ag, Berlin. Mediet fremstilledes med følgende sammensætning pr. liter;

Saccharose 103 g 25 2,5% K2S04 10 ml

MgCl2-6H20 10,1 g

Glucose 10 g

Casaminosyrer 0,1 g

Agar 22 g 30 Blanding af sporstoffer 2 ml 0,5% KH2P04 10 ml 1M CaCl2 20 ml

Prolin 3 g 0,25M TES pH 7,2 100 ml 35 10% gsrekstrakt 50 ml

Medium P var som beskrevet af R.H. Baltz, J. Gen Microbiol 107: 93-102 (1978).

I DK 175446 B1 I

I 6 I

I Streptomyceter opretholdtes på fast medium beskrevet i US-A- I

I 3.590.028, eksempel 2. I

I Vækstbetingelser I

I 5 I flydende kulturer dyrkedes begge Streptomyces arter i 50 ml YEME I

I + TBS (1:1) ved 28°C på en rotationsomryster ved 280 omdrej/minut. I

I Vækstmediet inokuleredes med homogeniserede mycelier. Homogenisering op- I

I nåedes ved at omhvirvle mycelier i et rør indeholdende glasperler. I

I 10 Protoplasttransformati on I

I Mycelier fra 35 ml flydende kultur (suppleret med 0,5% glycin) ud- I

I vandtes ved centrifugering (10 min, 1500 x g), vaskedes to gange med I

I 10,3% saccharose, resuspenderedes i 10 ml P medium indeholdende 1 mg/ml I

I lysozym (SIGMA) og inkuberedes i 60 minutter ved 30°C under reciprok om- I

15 rystning (280 omdrej./minut). Efter protoplastdannelse filtreredes sus* I

pensionen gennem bomuld, vaskedes én gang med medium P og resuspendere- I

I 8 I

des i 1 ml medium P. Almindeligvis opnåedes 10 protoplaster. I

I Til hver transformation blandedes 200 /iliter medium P indeholdende I

I ca. 2 x 10^ protoplaster med 10 /il i ter af den ønskede mængde DNA i TE I

I 20 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) og med 800 /iliter 25% polyethylen- I

I glycol (PEG) 1000 i medium P. 1 minut efter tilsætning af PEG-opløsning, I

I afsluttedes transformationen ved tilsætning af 5 ml medium P. Protoplas- I

I ter pelleteredes ved centrifugering, resuspenderedes i 1 ml P og udpla- I

I dedes på R2YE. Efter inkubation i 24 timer ved 28°C udvalgtes transfor- I

I 25 manterne ved at oversvømme pladerne med 3 ml blødt NA (8 g DIFC0 I

I næringsmedium og 5 g agar pr. liter) indeholdende et egnet antibiotikum. I

I 4 7 I

Antallet af transformanter var ca. 1 x 10 til 1 x 10 pr. øg DNA i I

I overensstemmelse med de anvendte stammer. I

I 30 Isolering af plasmid οα oenomt DNA I

I Isolering af plasmid og genomt DNA fra streptomyceter udførtes ved I

anvendelse af teknikker beskrevet af D.A. Hepwood et al. (1985), I

"Genetic Manipulation of Streptomyces - A Laboratory Manual", The John I

Innes Foundation. I

35

Fremstilling af genomt S. peucetius M76 bibliotek I

Alle restriktionsenzymer, alkalisk kalvethymus-phosphatase og T4 I

ligase opnåedes fra BRL (Bethesda MD) og anvendtes i overensstemmelse 7 DK 175446 B1 med producentens instruktioner. Genomt S. peucetius M76 DNA blev partielt nedbrudt med Mbol, og fragmenter med en størrelse på 4-6 Kb udvandtes ved elektroeluering fra agarosegel. Disse fragmenter ligeredes til pIJ702 li neari seret med Bglll og behandledes med phosphatase. Lige-5 ringsblandingen anvendtes til transformation af S. lividans TK 23 pro-toplaster, der er følsomme over for 30 /ig/ml doxorubicin.

2. Resultater 10 Kloning af DNA-fragmenter, som bibringer resistens over for doxorubicin i følsomme Streotomvces stammer

Partielt Mbol nedbrudt genomt S. peucetius M76 DNA indføjedes på BglIl-pladsen i pIJ702. Ligeringsblandingen anvendtes til transformation af S. lividans TK 23 protoplaster. Transformanter udvalgtes med hensyn 15 til Thiostrepton-resistens og hvid farve, hvilket indikerer indføjelses-mæssig inaktivering af melaningenet i pIJ702.

Thiostrepton-resistente, hvide kolonier screenedes derefter for resistens over for doxorubicin (100 μg/ml). De udpladedes på R2YE medium, inkuberedes ved 28°C i 24 timer med 3 ml blødt NA indeholdende

D

20 500 ^g/ml doxorubicin, og således identificeredes to kloner Ts og Doxo**.

Ekstraktion af plasmid DNA fra disse to kloner afslørede tilstedeværelsen af indføjelser med en længde på 5,7 og 4,4 Kb. De to rekombi-nante pi asmider, benævnt hhv. FICE 1 og FICE 2, anvendtes atter til 25 transformation af S. lividans TK 23 protoplaster. I begge tilfælde viste transformation, at Doxo -egenskaben sammen med Ts -egenskaben er forbundet med høj effektivitet.

R S

Ekspression af Doxo -egenskaben i S. peucetius mutanter Doxo 30 De to rekombinante pi asmider inkorporeredes derefter i nogle mutan- c ter afledt af S. peucetius M76, som er Doxo (MIC 50 μg/ml). Transfor- c manterné udviste komplementer!ng af Doxo -egenskaben. De kunne vokse på doxorubicin 1500 μg/ml under udvisning af en resistens over for doxorubicinniveauet, som var højere end for forældre-stammen S.

35 peucetius M76, der var donor for de klonede gener (MIC 250 μg/ml). Det forøgede resistensniveau i transformanterne kan forklares ved det høje kopiantal af rekombinante plasmider (plJlOl-replikon, Katz et al., 1983).

I DK 175446 B1 I

I 8 I

I Restriktionsenzvmanalvse af de klonede fragmenter I

I , Da phenotypen, der bibragtes med de to klonede fragmenter, var I

I identisk, undersøgte vi om der var én eller to distinkte funktioner, som I

Ir I

5 var i stand til at bibringe Doxo -egenskaben. I Fig. 1 og 2 vises I

I restriktionskort over de S. peucetius M76-afledte indføjelser af FICE 1 I

I og FICE 2. Det meste af hvert kort er afledt af størrelsen af fragmenter I

I fremkommet ved enkelt- og dobbeltnedbrydning ved anvendelse af forskel- I

lige enzymkombinationer. Intervallængden mellem tilstødende pladser kom- I

I 10 mer fra direkte målinger af de relevante fragmenter ved passende dob- I

I belt- eller enkeltnedbrydninger. I

I Der er ingen åbenlys korrespondence mellem kortene for de to klo- I

I nede fragmenter, hvilket antyder at resistens bibringes af to distinkte I

I gener. I

I 15

Claims (10)

1. Isoleret DNA med konfigurationen af restriktionspladser vist på tegningen i Fig. 1 eller 2 eller 5 et restriktionsfragment afledt deraf, som indeholder et gen, der koder for doxorubicin-resistens.

2. Rekombinant vektor, KENDETEGNET ved, AT den omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 1. 10

3. Vektor ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT den er et plasmid.

4. Vektor ifølge krav 3. KENDETEGNET ved, AT DNA-sekvensen er indføjet i plasmidet pIJ702. 15

5. Vært transformeret med en vektor ifølge krav 2.

6. Vært ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, AT den er en mikroorganisme, som producerer anthracycli ner. 20

7. Vært ifølge krav 5, KENDETEGNET ved, AT den er en stamme af S. peucetius.

8. Fremgangsmåde til opnåelse af en DNA-sekvens ifølge krav 1, KEN-25 DETEGNET ved, AT man (a) fremstiller et bibliotek af det genome DNA af S. peucetius M76 (D.S.M. 4592) eller en stamme afledt deraf, (b) screener biblioteket for doxorubicin-resistens, (c) opnår et indføjelses-DNA fra en rekombinant vektor, som udgør 30 en del af biblioteket, og som ved screening har vist sig positiv med hensyn til doxorubicin-resistens, og (d) eventuelt fra indføjelses-DNA'et opnår et restriktionsfragment, som omfatter et gen, der koder for doxorubicin-resistens. 1 ----— , I, || ^

9. Fremgangsmåde til fremstilling af en rekombinant vektor ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, AT man kloner en DNA-sekvens ifølge krav 1 i en vektor. I DK 175446 B1 I I 10 I

10. Fremgangsmåde til fremstilling af doxorubicin, KENDETEGNET ved, I I AT man dyrker en stamme af S. peucetius ifølge krav 5 og udvinder det I I således, producerede doxorubicin. I I 5 I I 10 i I 15 I