KR970010761B1 - 안트라사이클린 항생물질에 대한 내성 유전자, 이를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 이들의 제조방법 및 항생 물질의 제조방법 - Google Patents
안트라사이클린 항생물질에 대한 내성 유전자, 이를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 숙주, 이들의 제조방법 및 항생 물질의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
내용없음.
Description
좀 더 상세하게는, 첨부된 도면에서 ;
제1도는 본 발명의 제1의 DNA의 제한지도 분석이다. 이것은 재조합 플라즈미드 FICE 1 내의 삽입체(Rec 1)이다. 이 삽입체는 Sau3AI 말단을 가지며 pIJ702의 BglII 부위에 삽입되어 있다. 하나의 BglII 부위가 결합 후 재구성된다.
제2도는 본 발명의 제2의 DNA의 제한지도 분석이다. 이것은 재조합 플라즈미드 FICE 2 내의 삽입체(Rec 2)이다. 이 삽입체는 Sau3AI 말단을 가지며 pIJ702의 BglII 부위에 삽입되어 있다. 결합후 하나의 BglII 부위가 재구성된다.
본 발명은 안트라사이클린 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자를 함유하는 DNA 단편, 이 DNA 단편을 함유하는 재조합 벡터 및 이 벡터로 형질전환시킨 숙주에 관한 것이다.
종양 치료에 가장 널리 사용되는 항생물질중에는 독소루비신, 카르미노마이신 및 악클라비노마이신과 같은 다우노루비신 그룹의 안트라사이클린이 있다. 이들은 여러가지 스트렙토마이세스(Streptomyces) 균주, 예를 들면, 에스. 포세티우스(S. peucetius), 에스. 코에룰레오루이두스(S. coeruleorubidus), 에스. 갈릴라에우스(S. galilaeus), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 그리세오루베르(S. griseoruber), 에스. 비리도크로모게네스(S. viridochromogenes) 및 에스. 비푸르쿠스(S. bifurcus)에 의해 생성되는 폴리펩타이드이다.
독소루비신은 에스. 포세티우스 변종 케시우스(caesius)에 의해서만 생성된다. 이러한 유형의 균주 에스. 포세티우스 변종 케시우스 IMRU 3920(하기에서는 에스. 포세티우스 3920이라 약자화함)은 널리 입수가능하며 미합중국 특허원 제3 590 028호에 기재되어 있다. 에스. 포세티우스 3920은 미합중국 루트거 대학교(RutgerUniversity)의 미생물학 연구소에 기탁번호 IMRU 3920으로 기탁되어 있다. 이 균주 및 통상적 돌연변이 유발로 수득한 이의 돌연변이체는 고농도의 독소루비신에 내성이 있다.
이러한 물질에 대한 내성과 관련된 기작의 연구는 두가지 이유로 중요하다:
a) 2차 대사물질의 생합성에 관련된 유전자가 하나 이상의 내성 유전자, 예를 들어 옥시테트라사이클린(참조 : Rhodes P M, Hunter I S, Friend E J 및 Warren M, 1984, Trans Biochem Soc 12, 586-587), 에리트로마이신(참조 : Stanzak R, Matsushima P, Baltz R HRao R N, Biotechnology vol 4, March 1986, 229-232), 틸로신(참조 : Fayerman J T, Biotechnology vol 4, Sept 1986, 786-789) 및 테트라세노마이신(참조 : Motamedi H, Hutchinson C R, Proc Natl Acad Sci USA, vol 84, 4445-4449, 1987)와 함께 무리져 있는 많은 예가 있다. 생합성 유전자의 클로닝은 다른 분자를 생산하거나 생합성 경로에 존재하는 장애를 극복하여 균주의 생산성을 증강시킨다는 면에서 유용할 수 있다.
b) 내성 수준을 증가시키면서(즉, 유전자 용량을 증강시키면서) 균주의 생산성이 개선되도록 내성 자체를 조절 기작내에 포함시킬 수 있다. 이것은 돌연변이 유발 및 무작위 스크리능을 통해 일반적으로 수행되는 오래된 생각이나, rDNA법의 활용으로 새로와졌다(참조 : Craveri R 및 Davies J E, The Journal of Antibiotics, Jan 1986, 128-135).
본 발명에 이르러, 본원의 발명자는 독소루비신 내성 유전자를 통합하고 있는 두개의 DNA 단편을 분리하였다. 따라서, 본 발명은 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유하는 첨부된 도면의 제1도 또는 제2도에 나타낸 제한 부위 배열을 갖는 DNA 또는 이로부터 유래된 제한 단편을 제공한다. 편의상, 제1도 및 제2도에 나타낸 DNA 단편을 본원에서 삽입체 DNA라 부른다. 본 발명은 또한, 숙주세포를 형질전환시킬 수있고 독소루비신 내성 유전자를 함유하는 삽입체 DNA 또는 이로부터 유래된 제한 단편을 포함하는 재조합 벡터 ; 및 이러한 벡터로 형질전환시킨 숙주세포를 제공한다.
제1 및 제2도에 나타낸 지도가 반드시 각 DNA 단편에 존재하는 모든 제한 부위의 완전한 기록을 제공하지는 않는다. 그러나, 보고된 부위는 단편의 명확한 인지에 충분한 것이다.
본 발명의 삽입체 DNA 및 제한 단편은 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유한다. 발현되는 이러한 유전자의 경우에, DNA는 자신의 전사 조절 서열 및 특히 유전자와 작동적으로 연결되고 숙주 세포 RNA 폴리머라제에 의해 인지되는 자신의 프로모터를 수반할 수 있다. 달리는, 삽입체 DNA 또는 제한 단편은 올바른 방법으로 또다른 전사 조절서열과 결합되거나 벡터내의 전사조절 서열 가까이에 적합하게 위치하는 제한부위에서 벡터내로 로닝될 수 있다.
독소루비신 내성 유전자를 수반하는 삽입체 DNA 또는 제한 단편은 재조합 DNA 클로닝 벡터에 클로닝될 수 있다. 하나 이상의 추가 DNA 단편이 첨가될 수 있는 DNA 분자를 함유하는 자가 복제제 및/또는 통합제를 사용할 수 있다. 그러나, 전형적으로 벡터는 플라즈미드이다. 바람직한 플라즈미드는 고복제수의 플라즈미드 pIJ702(참조 : Katz et al, J Gen Microbiol, 1983, 129 2703-2714)이다. 벡터에 삽입체 DNA 또는 이의 제한 단편을 삽입시키기 위해 모든 적합한 기술을 이용할 수 있다. 상기 DNA를 적당한 제한 부위에서 선형화된 벡터내로 결합시켜 삽입시킬 수 있다. 이를 위해, 점착성 말단 또는 단독중합체 테일링(tailing)의 직접 조합 또는 링커 또는 어댑터 분자의 사용을 채택할 수 있다.
재조합 벡터를 사용해 적합한 숙주 세포, 전형적으로는 독소루비신 내성을 나타낼 수 있는 잇점을 가진 세포를 형질전환시킨다. 이러한 숙주 세포는 독소루비신-민감성, 즉 독소루비신의 존재하에 생육할 수 없는 세포 또는 독소루비신-내성이지만 독소루비신에 대한 보다 큰 내성이 유리한 세포이다. 숙주는 미생물일수 있다. 독소루비신을 생성하는 에스. 포세티우스, 보다 특히는 에스. 포세티우스 변종 케시우스의 균주 및 안트라사이클린을 생성하는 스트렙토마이세스의 다른 균주를 형질전환시킬 수 있다. 독소루비신에 대한 내성, 또는 보다 큰 내성은 이러한 균주 세포가 독소루비신을 더 많이 생성하게 할 수 있다. 보다 높은 농도의 독소루비신의 내성이 달성될 수 있다. 에스. 포세티우스 균주의 형질전환체는 전형적으로 원형질체 형질전환에 의해 수득된다. 따라서, 독소루비신은 에스. 포세티우스의 형질전환 균주를 배양하고 이로부터 생성된 독소루비신을 회수함으로써 수득할 수 있다.
삽입체 DNA는 에스. 포세티우스 M76의 게놈 DNA로부터 수득한다. 에스, 포세티우스 M76은 고수준으로 다우노루비신을 독소루비신으로 전환시킬 수 있는 에스. 포세티우스 3920의 돌연변이체이다. 에스. 포세티우스 M76은 1988년 5월 16일자로 독일연방공화국 도이췌 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ; DSM)에 기탁번호 D.S.M 4592로 기탁되어 있다. 전형적으로는 다우노루비신을 독소루비신으로 전환시킬 수 있는 에스. 포세티우스 M76으로부터 유도된 어떠한 균주도 사용할수 있다. 삽입체 DNA는 하기와 같이 수득할 수 있다:
(a) 에스. 포세티우스 M76 또는 이로부터 유래된 균주의 게놈 DNA의 라이브러리를 만들고 ;
(b) 독소루비신 내성에 대해 라이브러리를 스크리닝하고 ;
(c) 라이브러리의 일부를 형성하며 독소루비신 내성에 대해 양성으로 스크리닝된 재조합 벡터로부터 삽입체 DNA를 수득하고 ;
(d) 임의로는, 삽입체 DNA로부터 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유하는 제한 단편을 수득한다.
라이브러리는 단계(a)에서 에스. 포세티우스 M76 또는 이로부터 유래된 균주의 게놈 DNA를 부분적으로 절단함으로써 제조할 수 있다. 제한 효소 Mbo I가 바람직하게 사용된다. 이로써 수득한 단편은 크기-분획화할 수 있다. 크기가 4 내지 6kb인 단편이 바람직하다. 이러한 단편은 pIJ702와 같은 선형 벡터에 결합시킨다. 이 결합 혼합물로 숙주 세포를 형질전환시킨다. 전형적으로, 숙주 세포는 독소루비신-민감성, 예를 들어 1ml당 50mcg 이하, 바람직하게는 30mcg 이하의 독소루비신에 민감하다. 예를 들어, 에스. 리비단스(S. lividans) TK 23 원형질체가 형질 전환될 수 있다.
단계(b)에서, 상기 수득된 형질전환체를 독소루비신 내성에 대해 스크리닝한다. 독소루비신-내성체 클론을 독소루비신을 함유하는 배지에 생육시켜 확인한다. 이러한 클론을 분리하고 그 안에 함유된 재조합 벡터를 추출한다. 단계(c)에서 적합한 제한 효소로 재조합 벡터를 절단하고, 각 벡터에 삽입된 에스. 포세티우스 M76 DNA를 동정하고 크기를 측정하며 지도화한다. 이 방법으로 벡터가 본 발명의 삽입체 DNA를 함유하는가를 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 DNA에 전체적으로 또는 부분적으로 포함되는 둘 이상의 중첩된 삽입체를 분리할 수 있다. 이것을 공통적인 제한 부위에서 절단한 후 결합시켜 서로 융합시키고 경우에 따라 적합한 제한 효소를 사용하여 길이로 짝지음으로써 본 발명의 DNA를 수득할 수 있다. 또한 단계(d)에서 삽입체 DNA를 적합한 제한 효소로 절단함으로써 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유하는 삽입체 DNA의 제한 단편을 수득할 수 있다.
최종적으로, 본 발명의 DNA는 독소루비신 내성을 부여하는 능력에 영향을 미치지 않도록 하는 방법으로 돌연변이시킬 수 있다. 이는 예를 들어 부위-지시된 돌연변이 유발을 통해 달성될 수 있다. 이렇게 돌연변이된 DNA도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
하기 실시예는 본 발명을 설명한다. 실시예에서, TsR, DoxoR및 DoxoS는 각각 티오스트렙톤-내성, 독소루비신-내성 및 독소루비신-민감성 표현형을 나타낸다.
1. 재료 및 방법
박테리아 균주 및 플라즈미드 :
다우노루비신 및 독소루비신을 생성하며 독소루비신에 내성(MCI 250mcg/ml)인 사상형 스트렙토마이세트인 스트렙토마이세스 포세티우스 M76 및 독소루비신에 민감한 몇몇 생합성 돌연변이체 ; 독소루비신에 민감한 에스. 리비단스 TK 23.
고복제수의 플라즈미드 pIJ702는 영국 노르위치 소재의 존 인스 컬춰 콜렉션(John Innes Culture Collection)으로부터 입수한 것이다.
배지 및 완충액 ;
증류수당 트립신-처리된 대두 브로쓰(DIFCO) 30g을 함유한 TSB ; 증류수당 효모 추출물(DIFCO) 5g, 맥아 추출물(DIFCO) 10g, 슈크로즈 340g, 5mM MgCl2·6H2O 및 다양한 농도의 글리신을 함유한 YEME.
재생 배지 R2YE는 문헌[참조 ; Chater K F, Hopwood D A, Kieser T 및 Thompson C J(1982)Gene cloning in Streptomyces, 69-95 in P H Hofschneider 및 W Goebbel(ed) Gene cloning in Organisms other than E. coli, Springer-Verlag, Berlin]에 기술된 것과 같다. 이 배지는 리터당 하기 조성으로 이루어진다 :
슈크로즈 -103g 미량 원소 혼합물 -2ml
2.5% K2SO4-10ml 0.5% KH2PO4-10ml
MgCl2·6H2O -10.1g 1M CaCl2-20ml
글루코즈 -10g 프롤린 -3g
카사미노산 -0.1g 0.25M TES pH 7.2 -100ml
아가 -22g 10% 효모 추출물 -50ml
배지 P는 문헌[참조 : Baltz R H, J Gen Microbiol 107 ; 93-102(1978)]에 기술되어 있는 것과 같다.
스트렙토마이세테스는 미합중국 특허원 제3 590 028호의 실시예 2에 기재된 고체 배지상에 유지시킨다.
생육 조건 :
액체 배양을 위해 스트렙토마이세스 종을 50ml의 YEME+TSB(1 : 1)에서 28℃, 280rpm으로 회전 진탕기상에서 배양한다. 배양 배지를 균질화된 균사체로 접종시킨다. 균질화는 유리 비이드를 함유하는 튜브에서 균사체를 격렬히 진탕시켜 수행한다.
원형질체 형질전환 :
액체 배양물(0.5% 글리신 첨가) 35ml로부터 균사체를 원심분리(10분, 1500xg)하여 회수하고, 10.3% 슈크로즈로 2회 세척하고 1mg/ml 라이소자임(SIGMA 제조)을 함유하는 P 배지 10ml에 재현탁시킨 후 30℃에서 60분 동안 왕복 진탕시키면서 (280rpm) 항온처리한다. 원형질체 형성후 현탁액을 면을 통해 여과시키고 P 배지로 1회 세척한 후 P 배지 1ml에 재현탁시킨다. 일반적으로 108개 원형질체가 수득된다.
각각의 형질전환을 위해 약 2×107개의 원형질체를 함유하는 P 배지 200㎕를 TE(트리스-HCl 10mM, EDTA 1mM pH 8.0)중의 목적하는 양의 DNA 10㎕ 및 P 배지중 25% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 1000 800㎕와 혼합한다. PEG 용액을 가한 1분 후, P 배지 5ml를 가하여 형질전환을 종결시킨다. 원형질체를 원심분리하여 펠렛화하고, P 배지 1ml에 재현탁시키고 R2YE 상에 플레이팅한다. 28℃에서 24시간 동안 항온처리후 형질전환체를, 적당한 항생물질을 함유하는 연질 NA(당 DIFCO 영양 브로쓰 8g 및 5g 아가) 3ml를 플레이트에 흐르게 하여 선별한다. 형질전환체의 수는 사용된 균주에 따라, DNAmcg당 약 1×104내지 1×107개이다.
플라즈미드 및 게놈성 DNA의 분리 :
스트렙토마이세테스로부터의 플라즈미드 및 게놈성 DNA의 분리는 문헌[참조 : Hepwood D A et al.,(1985) Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual The John Innes Foundation]에 기술된 기술을 이용하여 수행한다.
에스. 포세티우스 M76 게놈 라이브러리의 제조 :
모든 제한 효소, 송아지의 흉선 알칼리 포스파타제 및 T4 리가제를 BRL(Bethesda, MD)로부터 입수하고 제조업자의 지시에 따라 사용한다. 에스. 포세티우스 M76의 게놈성 DNA를 Mbo I으로 부분 절단하고 크기가 4 내지 6kb인 단편을 아가로즈 겔로부터 전기용출시켜 회수한다. 이러한 단편을 BglII로 선형화하여 포스파타제 처리한 pIJ702에 결합시킨다. 결합 혼합물을 사용하여 30mcg/ml 독소루비신에 민감한 에스. 리비단스 TK 23 원형질체를 형질전환시킨다.
2. 결과
민감성 스트렙토마이세스 균주에 독소루비신 내성을 부여하는 DNA 단편의 클로닝 :
부분적으로 Mbo I으로 절단한 에스. 포세티우스 M76의 게놈성 DNA를 pIJ702의 BgℓII 부위에 삽입한다. 결합 혼합물을 사용하여 에스. 리비단스 TK 23 원형질체를 형질전환시킨다. 형질전환체는, pIJ702의 멜라닌 유전자의 삽입 불활성화를 나타내는, 티오스트렙톤 내성 및 백색에 대해 선별한다.
티오스트렙톤-내성 백색 콜로니를 독소루비신(100mcg/ml)에 대한 내성에 대해 스크리닝한다. 이를 R2YE 배지상에 플레이팅하고 28℃에서 24시간 동안 독소루비신 500mcg/ml를 함유하는 연질 NA 3ml와 함께 항온 처리하고; 2개의 클론 TsR및 DoxoR를 확인한다.
이러한 2개의 클론으로부터 플라즈미드 DNA의 추출은 길이가 5.7kb 및 4.4kb인 삽입체의 존재를 나타낸다. 각각 FICE 1 및 FICE 2라 명명된 2개의 재조합 플라즈미드를 다시 사용하여 에스. 리비단스 TK 23 원형질체를 형질전환시킨다. 두 경우에 있어서, 형질전환은 TsR의 특성과 함께 DoxoR특성이 높은 효율로 부여됨을 나타낸다.
에스. 포세티우스 돌연변이체 DoxoS에서 DoxoR특성의 발현 :
2개의 재조합 플라즈미드를 DoxoS(MCI 50ug/ml)인 에스. 포세티우스 M76의 몇몇 유도성 돌연변이체에 도입시킨다. 형질전환체는 DoxoS특성의 보완을 나타낸다. 이들은 독소루비신 1500ug/ml에서 성장할 수 있는데, 이는 클로닝된 유전자의 공여체인 모균주 에스. 포세티우스 M76(MCI 250mcg/ml) 보다 더 높은 수준의 독소루비신에 대한 내성을 나타내는 것이다. 형질전환체의 증가된 내성 수준은 고복제율의 재조합 플라즈미드(pIJ101 레플리콘, Katz et al 1983)에 의해 설명될 수 있다.
클로닝된 단편의 제한 효소 분석 :
2개의 클로닝된 단편에 의해 부여된 표현형이 동일하기 때문에, 본 발명자는 DoxoR특성을 부여할 수 있는 하나 또는 두개의 뚜렷한 기능이 있는지를 조사하였다. 제1도 및 제2도는 FICE 1 및 FICE 2의 에스. 포세티우스 M76-유래된 삽입체의 제한 지도를 보여준 것이다. 각 지도의 대부분은 효소의 상이한 조합물을 사용하여 단일 및 이중 절단하여 제조된 단편으로부터 유래된 것이다. 인접한 부위 사이의 길이의 간격은 적당한 이중 또는 단일 절단에서 관련 단편을 직접 측정하여 얻는다.
2개의 클로닝된 단편의 지도 사이에는 명백한 상관관계가 없으며, 이는 내성이 2개의 상이한 유전자에 의해 부여된다는 것을 제시하는 것이다.
Claims (8)
- 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유하는 첨부된 도면의 제1도 또는 제2도에 나타낸 제한 부위의 배열을 갖는 DNA 또는 이로부터 유래된 제한 단편.
- 제1항에 정의된 DNA 서열을 포함하는 재조합 벡터.
- 제2항에 있어서, 플라즈미드인 벡터.
- 제3항에 있어서, DNA 서열을 플라즈미드 pIJ702에 삽입시킨 벡터.
- 제2항에 정의된 벡터로 형질전환시킨 스트렙토마이세스 포세티우스(Streptomyces peucetius) 숙주.
- (a) 스트렙토마이세스 포세티우스 M76(D.S.M. 4592) 또는 이로부터 유래된 균주에 대한 게놈성 DNA 라이브러리를 제조하고 ; (b) 이 라이브러리를 독소루비신 내성에 대해 스크리닝하고; (c) 라이브러러 일부를 형성하며 독소루비신 내성에 대해 양성인 것으로 스크리닝된 재조합 벡터로부터 삽입체 DNA를 수득하고 ; (d) 임의로는, 삽입체 DNA로부터 독소루비신 내성 암호화 유전자를 함유하는 제한 단편을 수득함을 특징으로 하여, 제1항에 정의된 DNA 서열을 수득하는 방법.
- 제1항에 정의된 DNA 서열을 벡터내로 클로닝시킴을 특징으로 하여, 제2항에 정의된 재조합 벡터를 제조하는 방법.
- 제5항에 청구된 스트렙토마이세스 포세티우스 균주를 배양하고 이로써 수득된 독소루비신을 회수함을 특징으로 하여, 독소루비신을 제조하는 방법.
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