JPH02207789A - アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子および遺伝子構造物、およびこの遺伝子を発現する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 独国特許公開第３８１８８５１号明細書く以前に公開さ
れたものではなくて、１９８９年１２月６日に公開され
た第ＥＰ−Ａ２０３４４６８３号明細書に相当する）は
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＤＨｌから単離されたアミ
ノトランスフェラーゼ（トランスアミナーゼ）を既に提
示している。

この新たなトランスアミナーゼをコードする遺伝子が、
今見出された。それによって、本発明によれば、以前の
提示によるよりもより大量に酵素を調製することも可能
であるが、また、本発明によって形質転換される微生物
を用いて特異的なアミノ基転移反応を行うことも可能で
ある。このように、遺伝子の単離および特＠付けによっ
て、以前の提示によって単離された酵素を用いて可能で
あったよりははるかに効果的なアミノ基転移が可能にな
る。

独国特許公開第３８１８５８１号明細書は、この新酵素
を、なかでも、Ｎ末端のアミノ酸配列によって特徴づけ
している。これらアミノ酸の最初の３０個は、以下に示
される通りである。

アミノ酸４から１０の領域には、唯一のトリブレットに
よってコードされるメチオニンおよび唯二つのトリブレ
ットによってコードされる四つのアミノ酸がある。ロイ
シンのみが遺伝子コードにおいて６倍「縮重（ｄｅｇｅ
ｎｅｒａｔｅ）Ｊ　Ｌ／ている。このように、この配列
は２０個のヌクレオチド（２０ｍｅｒ）のプローブの構
築に特に適している。

Ｓ　　−ＡＡＣＡＡＡ　　Ｃ；ＡＡ　ＴＴＡ　　ＡＴＧ
　ＣＡＡ　　ＣＧ−３Ｔ　　　Ｇ　　　ＧＣＣ；　　　
　　　　ＧＡこのプローブは、公知の方法でホスフォル
アミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法によ
って合成された。

加えて、アミノ酸１５から２７の３８ｍｅｒの非コード
鎖が合成された。

３−ＴＡＧ　ＧＧＣＧＣＧ　ＣＣＧ　ＣＡＡ　ＣＣＧ　
にＴＣＴＡＧ　ＧＴＧ　ＧＣ；ＣＴＡＧ　ＡＡＧ　ＣＧ
−５Ｔ　　　　　　　　　　Ｔ　　　　　　　Ｔ　　　
　　　　　　　Ｔこのオリゴヌクレオチドもまた、ホス
フォルアミダイト法によって合成された。

これらのプローブを大腸菌ＤＨＩのコスミド遺伝子バン
クのスクリーニングに用いた。ハイブリダイゼーション
陽性のクローンを、上昇したＬ−２−アミノ−４−メチ
ルホスフィノ酪酸（Ｌ−ＰＰＴ））ランスアミナーゼ活
性について最初に分析して、次いで、制限酵素地図作出
によって詳細に特徴付けした。サブクローニングおよび
サブフラグメントの活性分析によって、ゲノム中の遺伝
子の位置決めをして、次いて、さらにエキソヌクレアー
ゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）分解によって定義するこ
とが可能であった。このように、最初は、本発明による
遺伝子が位置している１５ｋｂの５ａｌＩフラグメント
が同定されて、同様に、遺伝子の位置方向を確立させる
３、８ｋｂの５ａｌＩ／ＢａｍＨＩフラグメントが同定
された（第１図）。

後者のフラグメントはまた、遺伝子自体のプロモーター
を含む。このように、適当なベクターに制限フラグメン
トをクローニングするだけで、トランスアミナーゼ活性
を出発株と比較して約５０倍に増加させることが可能で
あった。

酵素の収ｆ！Ｌまたは酵素活性は、適当な培養条件の選
択によっても影響される。すなわち、例えば、培地のグ
ルコース含有量は重要であって、発現系（ｓｙｓｔｅｍ
）の選択に依存する。すなわち、０．０５％以上の濃度
では、酵素活性の急激な下降が見られるかもしれない。

この依存性は、細菌染色体におけるトランスアミナーゼ
遺伝子のコピーのみを発現する対照株を用いてさえも明
らかである。

本発明のこの概念のさらなる発展において、アミノトラ
ンスフェラーゼをコードする遺伝子をより正確に位置づ
けることが次いで可能で・あった。

すなわち、遺伝子は、４２６個のアミノ酸のタンパク質
をコードする１２８１個のヌクレオチドの長さ（停止コ
ードンを含む）の解読枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇ　ｆ
ｒａｍｅ）を含む１．６ｋｂのＤｒａＩ／ＢａｍＨＩフ
ラグメント（第２図）上に位置している。

ＤＮＡ配列は表１に示される通りである。

Ａ　Ｔ　Ｇ　ｒ’ｊＡ始コードンはヌクレオチド番号２
７５で始まり、ＴＡＣ停止コードンはヌクレオチド番号
１５５３で始まる。

表２は、本発明によるトランスアミナーゼの、遺伝子の
コード鎖およびアミノ酸配列を表す。後者は、大腸菌か
らの他の既知のトランスアミナーゼとは配列のわずかの
相同性しか示さない（ａｓｐＣ，ｔｙｒＢ、ｈｉｓｃ、
１ｌｖＥ。

ａｖｔＡおよび５ｅｒＣ）。

■、−ＰＰＴ）ランスアミナーゼの４−アミノ酪酸（Ｇ
ＡＢＡ）に対する基質特異性および１５ｋｂの５ａｌＩ
フラグメント（第１図参照）の制限酵素地図と大腸菌に
−１２ゲノムの物理地図（Ｋｏｈａｒａら：　（１９８
７）、Ｃｅ１ｌ　５０．４９５−５０８）との類似のた
めに、クローニングされたトランスアミナーゼ遺伝子を
、５７．５　ｍｉｎ・の位置の：大腸菌に一１２ｇａｂ
クラスター（Ｍｅｔｚｅｒら二（１９７９）、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１３７．１１１１−１１１８）
からの座（ｆｏｃｕｓ）、ｇ　ａ　ｂ　Ｔ、として同定
することが可能であった。

遺伝子の知識によって、指示された方法で構造遺伝子を
強力なプロモーターを有するものにすることができる。

このようにして得られた遺伝子構築物（ｃｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｓ）は、前述の発現プラスミドよりもより高い発現
率を示すばかりではなく、それらの活性をインデューサ
ーによって調整することを可能にする。さらに、ｔａｃ
系のような異化代謝産物抑制（ｃａｔａｂｏｌｉｔｅ　
ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を行わない発現系を選ぶことが
可能である。これによって、そのような遺伝子構築物に
よって形質転換された細菌はまた、栄養培地中でグルコ
ースの存在下で発酵させることができる。これは、高細
胞密度を可能にして、発酵容量（ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ　
ｖｏｌｕｍｅ）の割合に高い収量の達成をもたらす。

したがって、本発明は、大腸菌ＤＨＩのゲノムからの１
．６ｋｂのＤｒａＩ／ＢａｍＨＩフラグメント上に位置
しており、かつ、表２に示されるＤＮＡ配列を有する、
Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸（Ｌ−ＰＰ
Ｔ）に特異的なトランスアミナーゼの遺伝子に間し、さ
らに、表２に示されるアミノ酸配列を有する酵素および
同じ作用を有しており、かつ、そのアミノ酸配列が表２
に示された配列からアミノ酸の付加、欠失または置換（
ｅｘｃｈａｎｇｅ）によって誘導される酵素をコードす
る遺伝子に関する。

本発明は、さらに、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフ
ィノ酪酸（Ｌ−ＰＰＴ）に特異的であって、かつ、表２
に示されるアミノ酸配列からアミノ酸の付加、欠失また
は置換によＩっで誘導されたアミノ酸配列を有する、ト
ランスアミナーゼに関する。

さらに、本発明は、この型の遺伝子を含むプラスミド、
およびこの型のプラスミドを含む微生物、とくに大腸菌
、に関する。

本発明は、また、（３−カルボキシ−３−オキソプロピ
ル）−メチルホスフィン酸（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐ旧
旧ｃ　ａｃｉｄ）からの、微生物を用いるアミノ基転移
反応による、Ｌ−ＰＰＴの立体選択的（５ｔｅｒｅｏｓ
ｅｌｅｃｔｉｖｅ）生産方法に関し、これは、上記に明
記したプラスミドの一つによって形質転換される微生物
を用いること、またはアミノ酸配列の修飾によって（上
記のように）修飾される酵素を用いること、を含む。

本発明の詳細は、以下の諸例によって説明される通りで
ある。諸例中のパーセント表示は、重量パーセントを表
す。

例１： 大腸菌ＤＨＩからのＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ遺伝
子のクローニング／発現プラスミドの構築大腸菌ＤＨＩ
からの染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　ｔｔＡｕｓｕｂｅｌら（（１
９Ｂ？）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ
　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｉｏｌｏｇｙ、５．３．２．−
５．４．３．．５．７．１．−５．７．３）に記載の方
法によって単離して、５ａｕ３Ａによって部分切断して
、アガロ−ゲル中で大きさによって分画した。約２５〜
４０　ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントを、ＢａｍＨ
Ｉで切断しておいたコスミドベクターｐＴ　Ｂ　Ｅ　（
Ｇｒｏｓｖｅｌｄ、　Ｆ、Ｇ、ら：　（１９８２）、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　１０．
６７１５）に連結して、入ファージζこパ・ソケージン
グした（Ａｍｅｒｓｈａｍ：　１ｎｖｉｔｒｏ　ｐａｃ
ｋａｇｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｌａｍｂｄａ　
ＤＮＡ、　ＣｏｄｅＮｏ、　３３４ｚ、およびＭａｎｉ
ａｔｉｓら：　（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ
Ｉｏｎｉｎｇ、　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ、　２９
６−２９９）　ｏ受容株（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓｔｒａ
ｉｎ）大腸菌ＤＨＩのトランスフェクションに続いて、
２０００個の単一クローンを単離した。

これは、大腸菌のいくつかのゲノム相当物に相当する。

Ｌ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼタンパク質のＮ末端アミ
ノ酸配列領域に相当する二つのオリゴヌクレオチド（２
０ｍｅｒおよび３８　ｍｅｒ、本文を参照されたい）を
、構築しておいたコスミド遺伝子バンクにおいて探索さ
れた遺伝子を見出すために、合成した。

次いで、単一クローンから単離されたコスミドを（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら＝３３１によって）ニトロセルロースフ
ィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｌ
ｌ　ＢＡ８５）に８ＲＬ　Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ吸引装置を
用いて結合させて、３２Ｐ−末端−標識したオリゴヌク
レオチド（Ａｕｓｕｂｅｌ　ら：　６．４．１．−６．
４．４．）とハイブリダイズさせた。四つのハイブリダ
イゼーション陽性クローンのうちの二つは、Ｌ−ＰＰＴ
）ランスアミナーゼ酵素分析（例２、以下を参照された
い）において３〜５倍の活性の増加を示した。二つのク
ローンは、同一の１５ｋｂの大きさの５ａｌＩ挿入を含
んでいた。その制限酵素地図は第１図に示される通りで
ある。

ともにＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼの５′−特異性オ
リゴヌクレオチドとハイブリダイズさせた、このＤＮＡ
部分からの５．６ｋｂのＨｉｎｄＩｆｆ／５ａｌＩフラ
グメントおよび３．８ｋｂのＢａｍＨＩ／５ａｌｌフラ
グメントを、ベクターｐＵｃ１２およびｐＭＬ　Ｃ１２
／１３　（Ｐｅｒｂａｌ、　Ｂ、：　（１９８４）、Ａ
　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　ＣＩｏｎｉｎｇ、　２５９２７２）に大腸菌
１ａｃプロモーターの後に開位置方向にクローニングし
て、次いで組換えプラスミドをトランスアミナーゼ活性
について分析した（第１図）。構築物（１）および（２
）の酵素活性はバックグランドよりやや上回ったのに対
して、同じＤＮＡフラグメントをｌａｃプロモーター（
（１）および（２）に授けた）に対して反対の位置方向
に含む（３）および（４） （ｐＴｒａｎｓ２および１）Ｔｒａｎｓ３．第３図）で
示されるＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ発現は、約５０
倍に増加した。このことから、第１図に示されるように
、遺伝子の転写の方向を確立することが可能であった。

３．８ｋｂのＢ　ａｍＨＩ／Ｓ　ａ　ｌ　Ｉフラグメン
ト上のトランスアミナーゼ遺伝子の位置は、さらに制限
酵素地図を作出することおよび一連のＥｘｏ［Ｉ／Ｓｌ
欠失物（ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ）を調製することによって
より正確に確立された（）Ｉｅｎｉｋｏｆｆ、　Ｓ、：
　（１９８４）、Ｇｅｎｅ　２８．３５１−３５９）。

後の方法において、ｐＭＬＣ１２／１３にクローニング
された３、８ｋｂのフラグメントを、それぞれの場合に
一端から開始して種々の時間で行う酵素的消化に供した
。次いで、端を切った挿入物の酵素活性を分析した。

もはや活性を有しないＤＮＡフラグメントにおいてトラ
ンスアミナーゼ構造遺伝子の部分が欠失していると仮定
すると、第１図の下に示されるように、遺伝子の位置を
確立することが可能であった。

第３図には、大腸菌ＤＥ（１からのクローニングされた
Ｌ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ遺伝子を有している、以
下の請訓において使用される、三つの異なる！ｌＩ換え
プラスミドが示されている。プラスミドｐＴｒａｎｓｌ
は、コスミドベクターｐＴＢＥ中の１５ｋｂのＳ晶、Ｉ
　Ｉ挿入物を含み、内因性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）ブ
ロモ−ターの調整下テトランスアミナーゼを発現する。

他の二つの構築物は、大腸菌１ａｃプロモーターを有す
る発現プラスミドである。ｐＴｒａｎｓ２はｐＭＬｃ１
３の３．８ｋｂのＢａｍＨＩ／５ａｌＩフラグメントを
含み、ｐＴｒａｎｓ３はｐＵｃ１２の５．６ｋｂのＨｉ
ｎｄ［／５ａｌＩフラグメントを含む。

例２： 種々のトランスアミナーゼ発現プラスミドを有する大腸
菌ＤＨＩにおけるＬ−ＰＰＴ産生■換えプラスミドｐ　
Ｔ　ｒ　ａ　ｎ　ｓ　１、ｐＴｒａｎｓ２およびｐＴｒ
ａｎｓ３ならびに対照としてベクタープラスミドｐＴＢ
Ｅ、ｐＭＬＣ１３およびｐＵｃ１２を有する大腸菌ＤＨ
Ｉ形質転換体を、５０μｇの適当な抗生物質 （ｐＴｒａｎｓｌＳｐＴｒａｎｓ３ＳｐＴＢＥおよびｐ
Ｕｃ１２の場合にはアンピシリン、ならびにｐＴｒａｎ
ｓ２およびｌ）ＭＬＣ１３の場合にはクロラムフェニコ
ール）を含むＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培
地、Ｍａｎｉａｔｉｓら：　（１９Ｂ２）、６８）の１
０ｍ１の培養液中で３７℃で１５時間培養した。次いで
、細胞を５０００Ｘｇで５分間の遠心分離によって除去
して、それぞれ５ｍｌの１０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ燐
酸ナトリウム（ｐＨ＝７．５）で２回洗浄してから、ト
ランスアミナーゼ活性分析のために１ｍｌの反応混合液
（５ｍＭＮａＣ１，５ｍＭ燐酸ナトリウム、３０ｇ／リ
ットルの（３−カルボキシ−３−オキソブロピル）−メ
チルホスフィン酸、９０　ｇ／リットルのし一グルタミ
ン酸、１００ｍＭ）リス１ＨＣＩ、ｐＨ＝８．０）に再
懸濁させた。細胞を、この溶液中で振盪させながら３７
℃で１時間培養して、次いで、９５℃で１０分間で変性
させた。

反応上清を、アミノ酸分析機（Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃ　Ａ
ｍ１ｎ。

Ａｃ１ｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　ＬＣ５００１，３，２ｘ
　１３０　ｍｍ　ＢＴＣ−２７１０カラム）中でＬ−Ｐ
ＰＴ産主について分析した。

種々の構築物によって得られた空間−時間収量（ｓｐａ
ｃｅ−ｔｉｍｅ　ｙｉｅｌｄ）は、表３に示される通り
である。はるかに高い酵素活性が二つのｌａｃ発現プラ
スミドによって達成された。結果は、おそらくは細胞当
りのコピー数がより多いためにｐＵＣ１２誘導体ｐＴｒ
ａｎｓ３はｐＭＬｃ１３誘導体ｐＴｒａｎｓ２よりもよ
り優れていた。

ｐＴｒａｎｓ３について測定された空間−時間収量は、
ｐＵｃ１２ベクタープラスミドによって形質転換された
対照細胞の結果よりも約６０倍高かった。

表３＝　種々のトランスアミナーゼ発現プラスミドを有
する大腸菌ＤＨＩにおけるＬ−ＰＰＴ産生プラスミド：
　　　　空間−時間収量 （産生されたＬ−ＰＰＴ（ｍｇ）／リットル／時間）＝
ｐＴＢＥ　　　　　　　　　　１００ ｐＭ１００ｐ　　　　　　　　　６０ ｐＵｃ１２　　　　　　　　　７０ ｐＴｒａｎｓｌ　　　　　　　３００ ｐＴｒａｎｓ２　　　　　２４００ ｐＴｒａｎｓ３　　　　４３００ ミナーゼ活性の分析を行った。結果は表４に示される通
りである。プラスミドｐＴｒａｎｓａ上の１ａｃ−発現
トランスアミナーゼ遺伝子および対照株からの染色体遺
伝子（ｐＵＣ１２を有する）の双方が、グルコース濃度
＞０．０５％によって抑制された。最高のＬ−ＰＰＴ合
成は培地中のグルコース０．０５％で達成された。

例３： Ｌ−ＰＰＴトランスアミナーゼ活性に及ぼす培養培地中
のグルコース濃度の影響 大腸菌ＤＨＩ−ｐＴｒａｎｓ３および大腸菌ＤＨ１−ｐ
Ｕｃ１２を、グルコース無添加およびグルコース濃度を
上げた（０．０１％、ｏ、０５％、０．１％および０．
５％）ＬＢ培地１０ｍ１中で培養して、操作処理して、
例２と同様にＬ−ＰＰＴ）ランスア表４： 大腸菌ＤＨ−１におけるＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ
活性の、培養培地中のグルコース濃度への依存性 培地中のグルコース　　トランスアミナーゼ濃度（％）
　　　　　　比活性（％） ０．０１ ０．０５ ０．１ ８　　　　　　　１００” グルコース無添加のｐＴｒａｎｓ３の活性を１００％と
した。

例へ 大腸菌ＤＨＩからのＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼタン
パク質の過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）大
腸菌ＤＨＩ−ｐＴｒａｎｓ３および大１１ｉＷＤＨ１−
ｐＵｃ１２を例３と同様にして培養した。細胞を洗浄し
て、１ｍｌの１０ｍＭＮａＣ１，１０ｍＭ燐酸ナトリウ
ム（ｐＨ＝７．５）中に再懸濁させて、次いで、５×２
０秒間の音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）によって破
壊してから、これらの粗抽出液の一部を同量のタンパク
質とともに１２．５％ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル
（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、に、：　（１９７０）、Ｎａ
ｔｕｒｅ　２２７．６８０）に供した。

過剰発現されたＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼタンパク
質は、大腸菌ＤＨＩ−ｐＴｒａｎｓ３からの抽出液のタ
ンパク質パターンにおいて４３，０００ダルトンの追加
のバンドとして現れる。これは、培養培地中に０．５％
のグルコースを用いた試料における発現株および０．０
５％グルコースな用いた対照株大腸ＭＤＨＩ−ｐＵｃ１
２では存在しない。

例５ 大腸菌に１２からのＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ遺伝
子の配列決定 ３．８ｋｂのＢ　ａｍＨＩ／Ｓ　ａ　ｌ　Ｉフラグメン
トの制限フラグメントのさらなるサブクローニングおよ
び活性分析によって、Ｌ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ遺
伝子を１．６ｋｂＯＤ　ｒ　ａ　Ｉ／Ｂ　ａｍＨｌＤＮ
Ａフラグメントに位置させることが可能であった（第２
図）。α−ｒ３５ｓｌ　−ｄＡＴＰおよび二本鎖ＤＮＡ
を鋳型として用いる（Ｃｔ）ｅｎ、　Ｅ、Ｙ、およびＳ
ｅｅｂｕｒｇ、　Ｐ、　Ｈ，＝（１９８５）、ＤＮＡ　
４．１６５−１７０）ジデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ、　
Ｆ、ら：　（１９７７）、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５
４６３−５４６８）によって後者の配列決定を行った。

この目的のために、ＥＸＯＩＩＩ／Ｓｌヌクレアーゼ消
化によっておよび遺伝子の３′末端（ＢａｍＨ［切断部
位）から開始して調製された欠失物ＣＨｅｎ１ｋｏｆｆ
、　Ｓ、：　（１９８４）、Ｇｅｎｅ　２８．３５１−
３５９）および１．６ｋｂのＤｒａＩ／ＢａｍＨＩフラ
グメントの多数の制限フラグメントを、既知の方法（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら：　（１９８２）、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍ
ａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）に
よってベクターｐＭＬＣ１２／１３およびｐＵＣ１２／
１３にクローニングして、市販のブライマーＣｐＵＣ配
列決定キットから、ベーリンガーマンハイム社製、オー
ダ一番号１０１３１０６）を用いて配列決定した。加え
て、既に利用可能な配列情報に基づいて調製（ホスフォ
ルアミダイト法）することが可能な合成オリゴヌクレオ
チドもまた、配列決定ブライマーとして用いられた。１
．６ｋｂのＤ　ｒ　ａ　Ｉ／Ｂ　ａｍＨＩフラグメント
の正確な制限酵素地図は、第２図に示される通りである
。

例６： 大腸菌に−１２からのＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼ構
造遺伝子を有する発現プラスミドの調製ａ）ｌａｃ発現
プラスミド トランスアミナーゼ構造遺伝子を他のプロモーターと融
合させるために、ＡＴＧ開始コードンの上の１．６ｋｂ
のＤ　ｒ　ａ　Ｉ／Ｂ　ａｍＨＩフラグメントの非コー
ド５′領域をできるだけ除去することが必要であった。

この目的のために、ＤＮＡフラグメントを、上記のＥｘ
ｏ［／Ｓｌヌクレアーゼ技法を用いてＤｒａＩ末端から
切断した。このようにして調製された二つの欠失物（−
５６〜ＡＴＧおよび一３５〜ＡＴＧ、表５、構築物（Ｄ
および（Ｉｆ）、を参照されたい）を、ＳｍａＩ／Ｂａ
ｍＨＩで切断したベクターｐＵｃ１２中のｌａｃプロモ
ーターの後にＳｍａ　Ｉ／ＢａｍＨＩフラグメントとし
てクローニングした。このようにして得られた発現プラ
スミドｐＴｒａｎｓ４およびｐＴｒａｎｓ５は、第４図
に示される通りである。

他のアプローチでは、ＮｃｏＩ切断部位を、Ｔａｇポリ
メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技法（Ｈｉｇｕｃｈｉ　ら
：　（１９８８）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５ｅａｒｃｈ１６．７３５１−７３６７）を用いるイン
ビトロ突然変異によってトランスアミナーゼ遺伝子をＡ
ＴＧ開始コードン領域または位置−６に導入したく表５
、構築物（ＩＩＩ）および（ＩＶ）を参照されたい）。

位置−６のＮｃｏＩ切断部位はトランスアミナーゼ構造
遺伝子に影響しないのに対して、開始コードンの領域に
おける突然変異はトランスアミナーゼのアミノ酸２をＡ
９　ｎからＡｓｐに代える。しかし、この保存的（ｃｏ
ｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）アミノ酸置換は酵素タンパク質
の活性には影響を及ぼさない。二つの構築物（ｍ）およ
び（ＩＶ）に導入された制限切断部位の故に、５”−非
コード配列を有しないトランスアミナーゼ構造遺伝子を
、ＮｃｏＩ／Ｈｉｎｄｍで切断されたベクターｐＭＧ１
２（ＩＩ！飾されたポリリンカー　ＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ
Ｉ−ＢａｍＨＩ−Ｎｃｏ　Ｉ−Ｎｈｅ　ｌ−Ｈｇ１ＡＩ
−Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＫｐｎＩ−Ｘｂａｌ−Ｃ１ａＩ−Ｓａ
ｌ　ｌ−５ａｃＩＩ−５ｐｈＩ−Ｐｖｕ　ｌ−Ｈｌｎｄ
ＩＩ［、を有するｐｔｒｃ１２誘導体）中にｌａｃブロ
ーモーターの後に、それぞれの場合、ＮｃｏＩ／Ｈｉｎ
ｄｍフラグメントとしてクローニングすることが今回能
であった（第４図ニブラスミドｐＴｒａｎｓ６およびｐ
Ｔｒａｎｓ？）。

種々の遺伝子構築物を用いてトランスアミナーゼの発現
を調べるために、組換えプラスミドｐＴｒａｎｓ４、ｐ
Ｔｒａｎｓ５、ｐＴｒａｎｓ６、ｐＴｒａｎｓ？および
ｐＴｒａｎｓ３　（例１を参照されたい）ならびに対照
としてベクタープラスミドｐＵｃ１２を有する大腸菌Ｊ
Ｍ１０３形質転換体を、グルコース無添加および添加（
０，５％）ＬＢ培地の１０ｎｌ中で培養した。Ｌ−ＰＰ
Ｔ特異性トランスアミナーゼ活性を例２に記載のように
して測定して、Ｌ−ＰＰＴのｎｍｏ　Ｉ　／分／ｍｇ細
胞で表した。結果は表６に示される通りである。これら
のｌａｃ発現プラスミドを用いた酵素活性は、プラスミ
ドｐＴｒａｎｓ３を用いたものと比較して約２倍高い。

全ての構築物は、グルコースの存在下で異化代謝産物抑
制を示す。

ｂ）ｔａｃ発現プラスミド 発現ベクターｐＪＦ１１８ｕを、バイブリドｔａｃプロ
モーター（ｌａｃおよびｔｒｐ部分）を有するＬ−ＰＰ
Ｔ）ランスアミナーゼ遺伝子の発現に用いた。これは、
ｐＫＫ２２３−３の誘導体であって、制限切断部位Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳｍａＩ−ＢａｍＨＩ−５ａｌ　Ｉ−ＰｓｔＩ
−Ｈｉｎｄｍを有するポリリンカーをｔａｃプロモータ
ー配列の直後に含む。加えて、このベクターは、ｌａｃ
リプレッサーをコードす°る１ａｃｌ遺伝子を発現する
。

このため、ｔａｃプロモーターの活性はＩＰＴＧによっ
て誘導される。ｔａｃブａモーターはグルコースによる
異化代謝物抑制の対照にはならない。

表５に示されるトランスアミナーゼ遺伝子構築物（Ｉ）
および（ＩＩ）（Ｅｘａｍ／Ｓｌヌクレアーゼ除去物、
−５６〜ＡＴＩＧおよび一３５〜八Ｔ’　Ｇ　）を、Ｅ
ｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで切断したベクターｐＪＦ１１８
ｕ中のｔａｃプロモーターの後にＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨ
Ｉフラグメントとしてクローニングした。このようにし
て得られた組換えプラスミドｐＴｒａｎｓ８およびｐＴ
ｒａｎｓ９は、第５図に示される通りである。インビト
ロ突然変異（表５を参照されたい）によって調製された
トランスアミナーゼ遺伝子構築物（ｍ）および（ＩＶ）
をプラスミドｐＴｒａｎｓ６およびｐＴｒａｎｓ７から
のＢａｍＨＩフラグメントとして単離して、粘着末端を
フレノウ酵素で埋填した。これらのフラグメントを、Ｅ
ｃｏＲＩで切断してからＳ１ヌクレアーゼで処理したｐ
ＪＦ１１８ｕ中にｔａｃプロモーターの後にクローニン
グした。さらに用いられる単離サブクローンは、Ｌ−Ｐ
ＰＴ）ランスアミナーゼ構造遺伝子をｔａｃプロモータ
ーに対して正しい位置方向に含むものだけであった（第
５図、組換えプラスミドｐＴｒａｎｓ　１０およびｐＴ
ｒａｎｓｌｌを参照されたい）。

Ｌ−ＰＰＴ−特異性トランスアミナーゼ活性を決定する
ために、組換えプラスミドｐＴｒａｎｓ８、ｐＴｒａｎ
ｓ９、ｐＴｒａｎｓｌｏ、 ｐＴｒａｎｓｌｌおよびｐＴｒａｎｓ３ならびに対照と
してベクタープラスミドｐＪＦ１１８ｕを有する大腸Ｗ
ＪＭ１０３形質転換体を、グルコース無添加および添加
（０，５％）のＬＢ培地の１０ｍ１中で培養して、８時
間後に集菌した。平行混合物（ｐａｒａｌｌｅｌ　ｍ１
ｘｔｕｒｅｓ）において、０．Ｄ６８１１ｎｍ値が０．
５に達した後、細胞を１ｍＭＩＰＴＣ；て４時間誘導し
て、次いで、同様に集菌した。トランスアミナーゼ活性
を６．ａ）に記載のようにして決定した。酵素測定の結
果は、表７に示される通りである。プラスミドｐＴｒａ
ｎｓ３と比較して、全ての四つのｔａｃ発現プラスミド
は、ＩＰＴＣ；による誘導が可能であって、グルコース
の存在下で異化代謝産物抑制を示さない。グルコース培
地における最高酵素活性はプラスミドｐＴｒａｎｓ　１
１で達成されて、これはグルコース無添加培地において
達成されたＩａｃ発現構築物による値に匹敵する。

例７： 発酵によるＬ−ＰＰＴ）ランスアミナーゼの産生発酵の
ために、トランスアミナーゼ発現プラスミドｐ’ｒｒａ
ｎｓ７で産生株穴１９菌Ｗ３１１０（Ｃａｍｐｂｅｌ　
Ｉ　ら：　（１９７８）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ
ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　７５．２２７６−２２８０）を形質転換させた
。細胞を発酵培地（Ｍａｎｉａｔｉｓら（（１９８２）
、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、　　Ａ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　　Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、６８−６９）の記載によるＭ
９ミネラル培地に、炭素源として４％マルトース、２％
カザミノ酸および０．４％ＣＡＢＡを加える）に接種し
て、１０リツトルのファーメンタ−（Ｂａｉｏｓｔａｔ
　５、ＢｒａｕｎＭｅｌｓｕｎｇｅｎ社製）中で一定の
攪拌速度（４０Ｏｒｐｍ）で通気（２ｍ３／時）しなが
ら自動ｐＨ調整（ｐＨ＝７．０）をして３５℃で２４時
間培養した。

発酵中に対照サンプルを採フて培養物の吸光度および細
胞のＬ−ＰＰＴ−特異性トランスアミナーゼ活性を測定
した。トランスアミナーゼ比活性が０．３５　ｎｋａｔ
／ｍｇ細胞（１ｎｋａｔ＝　１　ｎｍｏｌのＬ−ＰＰＴ
／秒）で吸光度２９（細胞湿重量３ｋｇの量に相当する
）・になった細菌を２４時間後に集めて、次いで、細胞
分離機（Ｗｅｓｔｆａｌ　ｉａ型５ＡＩ−０２−５７５
）を用いて１０倍に濃縮した。２０１ＴＩＭ燐酸ナトリ
ウム、ｐＨ＝７．０．０．０１ｍＭピリドキサル燐酸、
５ｍＭ２−メルカプトエタノールおよび１叶フエニルメ
タンフツ化スルホニル（ＰＭＳＦ）を加えた後、細菌を
ミクロ液化機（ｍｉｃｒｏ−ｆｌｕｉｄｉｚｅｒ、Ｍ−
１１０ＴＩＶ型、Ｍｉｃｒｏ　Ｆｌｕｉｄｓ、　Ｎｅｗ
ｔｏｎ　ＵＳＡ）で８００バール以下で破砕した。粗抽
出物を７０℃で１０分間インキュベートして、次いで、
細胞残滓および沈澱タンパク質を６０００ｘｇで２０分
間の遠心分離によって除去した。この処理後の上清は、
７４８０　ｎｋａｔ７Ｂタンパク質のＬ　−Ｐ　Ｐ　Ｔ
−特異性トランスアミナーゼ活性を有する１６ｇのタン
パク質を含んでいた。形質転換されない産生株Ｗ３１１
０を用いて同様に調製された上清中で測定されたトラン
スアミナーゼ活性は、わずか２００　ｎｋａｔ／ｍｇタ
ンパク質であった。これは、組換えプラスミド ｐＴｒａｎＳ７による酵素活性の増加が約４０倍である
ことを示す。タンパク質のＳＤＳゲル分析（Ｌａｅｍｍ
ｌ　ｉ　、　Ｕ、に、：　（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ
　２２７．６８０）によって、Ｌ−ＰＰＴ）ランスアミ
ナーゼは７０°Ｃの加熱沈澱後の調製発酵上清中におい
て明かに優勢なタンパク質であることが示される。トラ
ンスアミナーゼのこの程度の濃厚富化は、独国特許公開
第３，８１８，８５１号明細書に提示された方法による
酵素の担体への固定化に直接に用いる材料として充分で
ある。

１ＦＬＩＬ、　　ｅｔＪ＞　　＞）−１１１ｒ％　口ｌ
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ＰＣＤｍ　　Ｖ２Ｃメ −ａｏａ　　−ａｏａ　トド← ｕｓ　　　（Ｊｌｌｌ　　　＋ｐａ ｕｌ−Ｉ　　ａ−ｕＬ Ｏａ　　ω工　　ＬｌｆＬ 口ひ　ｌ−Ｌ　　　Ｉ−Ｃ ＣＤＬ　　　（Ｃ＞　　（Ｃψ ｕａ　　　）−１−ａζ ｕＩＩ　　Ｌｌｌ喝　　〇− ＬＩＳＬｌ−Ｓ〜 口ζ　　のａ　　ロ〉 ０山　　口＞（ｊａｍ Ｓ　　　　Ｉｊ−Ｃ＞ ζ　　　（Ｑ（Ｑ　　　（ＣＪ ｃｒＯコ ーζ− ｃｏｏ。

ＬＩＬ （！ＩＬＩ＋ ζω （Φ トー ζ− Ｏ＞ 〇− 〇ｃ！１ｌ ＬＩＬＩ＋ ζ− ０工 ＞０コ かトΦ ｂ（ＪＪ ＤＯ ＬＩＬ （Ｊ（Ｌ Ｏφ Ｃ！ｌｌ＞ トＵ ト０ 口Ｌ ＯＬ：Ｌ トＬ ζメ トド ぐトコ のトω トロ」 口１ 一 口ζ Ｏひ Ｌ）Ｌ Ｏａ トＬ ａ洲 一ト トー ）−喝 ■〉 かω　１ む〕ω− ω■ζ Ｉ−α ■（ｃ トＣ ζψ ａζ ａφ ａΣ （」 １−二 Ｉｔ（Ｊｌｊ ぐトー の（ｌＳＩ Ｃ！３σ ＯＬ Ｕζ （Ｉ４ Ｕ工 υｌ ト― （ｌｘ ＬＩＬ ■ω ａω ＞ＬｌｌＩ Ｎ　［Ｊ　− ω口ζ ｌａｌ トー ζ− ト− ０Ｈ Ｏａ Ｏａ ａφ Ｏζ トα （ｌ Ｏａ ψζコ ）ζ− 〇＋Ｕ３０ ヒ　α ζ　φ ωζ 一 ω（ ）−ω ヒー ζ− ロフ ト山 口」 か■４Ｊ トドΦ かζΣ ω中 トー Ｉ３＞ ■− ０口 ＬＩＩ ζ−一 〇工 ■コ ζ− ｃ！ｌｌＯ ぐＬｌ（Ｌ −０ζ晒 ０＋■ζ ヒ坊 ｃ！ｌｌ＞ トω ■コ トΦ Ｏ」 ヒ１ 一 ■ζ Ｏａ ＯＬ Ｌｌ（Ｃ ｒＬｆＬ二種々のｌａｃ発現プラスミドを有する大腸　
　表１−：種々のｔａｃ発現プラスミドを有する大腸菌
ＪＭ１０３形質転換体における、Ｌ−ＰＰＴ−特　　菌
ＪＭ１０３形質転換体における、Ｌ−ＰＰＴ−特異性ト
ランスアミナーゼ活性　　　　　　　　　　　異性トラ
ンスアミナーゼ活性プラスミド：　培地： ｐＴｒａｎｓ４ ｐＴｒａｎｓ５ ｐＴｒａｎｓ６ ｐＴｒａｎｓ？ ｐＴｒａｎｓ３ ｐυＣ１２ トランスアミナーゼ比活性 ［ｎｍｏｌ　Ｌ−ＰＰＴ／分／ｍｇ細胞］：２２．８ ０．６ ２５．７ １．２ ２４．５ １．２ ２４．９ ０．９ ９．７ ０．９ ０．９ ０．１ プラスミド：　培地： Ｂ ＬＢ＋０．５Ｘｇｌｕｃ。

Ｂ Ｌ８＋０．５Ｘ　ｇｌｕｃ。

Ｂ ＬＢ＋０．５Ｘ　ｇｌｕｅ。

Ｂ ＬＢ＋０．５Ｘ　ｇｌｕｃ。

Ｂ ＬＢ＋０．５Ｘ　ｇｌｕｃ。

Ｂ ＬＢ＋０．５Ｘｇｌｕｃ。

ｐＴｊａｎｓ８ ｐＴｒａｎｓ９ ｐＴｒａｎｓｌ。

トランスアミナーゼ比活性 ［ｎｍｏｌ　Ｌ−ＰＰＴ／分／ｍｇ細胞］：１１．４ ２０．５ ２．６ １２．９ Ｂ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ Ｌ８＋０．５Ｘ　ｇｌｕｅ。

Ｌ８＋０．５Ｘｇｌｕｅ。

＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ しＢ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ ＬＢ＋０．５Ｘ　、ｇｌｕｅ。

ＬＢ＋０．５Ｘ　　ｇｌｕｃ。

＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ Ｂ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ Ｌ８＋０．５Ｘ　　ｇｌｕｅ。

ＬＢ＋０．５χ　ｇｌｕｅ。

＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ ９．６ ２１．７ ３．９ １１．３ ２．３ １６．６ ０．７ ４．５ ｇｌｕｅ、： グルコース 表７ （続き） プラスミド： ｐＴｒａｎｓｌｌ 培地ニ ドランスアミナーゼ比活性 ［ｎｍｏｌ　Ｌ−ＰＰＴ／分１ｍｇ＠胞］：５．９ ２０．９ ２．２ ２２．１ ｐＴｒａｎｓ３ ＪＦ １８ｕ Ｂ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ ＬＢ＋０．５Ｘ　、ｇｌｕｃ。

ＬＢ＋０．５％　ｇｌｕｃ。

＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ Ｂ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ ＬＢ＋０．５Ｘｇｌｕｃ。

ＬＢ＋０．５Ｘ　ｇｌｕｅ。

＋１０１Ｍ　　ＩＰＴＧ Ｂ ＬＢ＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ ＬＢ＋０．５Ｘ　ｇｌｕｃ。

ＬＢ＋０．５’Ａ　ｇｌｕｃ。

＋１ｍＭ　　ＩＰＴＧ １０．２ １０．７ ０．３ ０．４ １．０ ０．９ ０．２ ０．３

【図面の簡単な説明】

第１図は、３．８ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメント上
の、本発明による遺伝子の位置を示す、説明図である。 第２図は、このフラグメントが所望の遺伝子（ｇａｂＴ
）以外に他の遺伝子（ｇａｂＤ）を含むことを示す、説
明図である。 第３図は、最初に開発されたベクター ｐＴｒａｎｓｌ、ｐＴｒａｎｓ２およびｐＴｒａｎｓ３
を示す、説明図である。 第４図は、ベクターｐＴｒａｎｓ４およびｐＴｒａｎｓ
７における本発明による遺伝子の位置を示す、説明図で
ある。 第５区は、ベクターｐＴｒａｎｓ８およびｐＴｒａｎｓ
ｌｌにおける本発明による遺伝子の位置を示す、説明図
である。 ｇｌｕｃ、ニ ゲルコース

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、大腸菌Ｋ１２のゲノムから得ることができる３．８
   ｋｂのＢａｍＨ I ／Ｓａｌ I フラグメント上に位置す
   る、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸に特異
   的なトランスアミナーゼの遺伝子。 ２、第１図に示される制限酵素地図を有する、請求項１
   に記載の遺伝子。 ３、大腸菌ＤＨ１のゲノムからの１．６ｋｂのＤｒａ
   I ／ＢａｍＨ I フラグメント上に位置し、かつ、表２
   に示されるＤＮＡ配列を有する、Ｌ−２−アミノ−４−
   メチルホスフィノ酪酸に特異的なトランスアミナーゼの
   遺伝子。 ４、表２に示されるアミノ酸配列を有する酵素および同
   作用を有し、かつ、そのアミノ酸配列が表２に示される
   アミノ酸配列からアミノ酸の付加、欠失または置換によ
   って誘導される酵素をコードする、遺伝子。 ５、請求項１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子を含む
   、プラスミド。 ６、請求項５に記載のプラスミドを含む、微生物。 ７、請求項５に記載のプラスミドを含む、大腸菌。 ８、Ｌ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸に特異
   的であって、かつ、表２に示されるアミノ酸配列からア
   ミノ酸の付加、欠失または置換によって誘導されたアミ
   ノ酸配列を有する、トランスアミナーゼ。 ９、請求項６または７に記載の微生物を用いることを含
   む、微生物を用いるアミノ基転移反応による（３−カル
   ボキシ−３−オキソプロピル）−メチルホスフィン酸か
   らのＬ−２−アミノ−４−メチルホスフィノ酪酸の立体
   選択的生産法。 １０、請求項８に記載の酵素を用いることを含む、アミ
   ノ基転移法。