JPH02129236A - セルロース膜の活性化方法と活性化セルロース膜および生理活性物質の固定化方法と生理活性物質を固定化した膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （発明の技術分野） 本発明は生理活性物質と反応しうるように活性化したセ
ルロース膜の製造方法とそれによって得られる活性化膜
、およびその活性化膜を用いた生理活性物質の固定化方
法とそれによって得られる生理活性物質の固定化膜に関
する。

（従来の技術） 酵素、補酵素、ホルモン、レセプター、阻害剤等の生理
活性物質を不溶性担体に固定化して得た固定化生理活性
物質は、バイオリアクター、バイオセンサー、アフィニ
ティークロマトグラフィー用材料などとして化学薬品・
食品・医薬品の製造、臨床診断、治療等に広く用いられ
ている。これらの場合に於て、用いられている固定化生
理活性物質の形態としては、粒子状のものと膜状のもの
とがあり、両者とも種々のグループによって研究されて
いる。

多孔質の粒子状の担体を用いた固定化生理活性物質につ
いては最も良く研究されているが、粒子内および粒子周
囲の非攪拌層に基〈拡散制限によ膜固定化生理活性物質
の効率が低下し、場合によっては潜在活性のごく一部し
か利用されないことが指摘されている（例えば特公昭、
！ｔｒ−ｊ、ｊ６７９号）。この問題点の対策として微
孔性の膜に例えば酵素を固定化し、圧力を用いて基質水
溶液を膜中に透過させる反応方法が開発されている。

この様な膜固定化生理活性物質をバイオリアクター、バ
イオセンサー、アフイニイテイー分離用材料、臨床診断
等に巾広く応用するためには、膜担体は蛋白質との非特
異的相互作用が極力小さいことが重要で、そのためには
親水性が高く荷電をもたないセルロース等の多糖類が材
料として好ましい。

セルロース膜に酵素その他の生理活性物質を化学結合に
よシ固定化する方法については既にいくつかの方法が知
られている。例えば特開昭！６−タ７コ３！号、特公昭
！！−１９３！２号、特公昭１２−３．２り／り号には
セルロース膜に酸化剤を作用させて活性化した後に酵素
を固定化する方法が開示されている。また、英国特許第
１．／！Ｊ　、　Ｊ”ｊ　０号にはセルロース等の膜に
トリアジン誘導体を作用させて活性化した後に酵素を固
定化する方法が開示されている。

（発明が解決しようとする課題） これらの既知の方法によって生理活性物質を固定化した
セルロース膜を得ることができるが、これらの方法には
まだ問題点があり、実用的には満足できるものではない
。すなわち、酸化剤を用いる活性化法では、担体上に生
成したアルデヒド基が生理活性物質中の主にアミン基と
反応してシッフベースを形成することにより固定化され
ると考えられるが、シッフベースは不安定であるために
固定化生理活性物質の脱離が起りやすい。また、脱離を
防ぐためにＮａＢＨ４’Ｐ　ＮａＢＨ３ＣＮ等で還元す
る方法を用いると、その処理により更に生理活性が低下
する。生理活性物質を固定したあとで還元のような二段
階目の反応を要しない方法としてトリアジン誘導体によ
る生理活性物質の固定化法が開発されたが、この方法で
は固定化反応の速度が遅いために固定化に比較的長い時
間を必要とし、不安定な生理活性物質の場合にはその間
の失活が問題となることがある。

また、英国特許第１　、　／７３．２１０号にはトリア
ジン誘導体による膜の活性化に際して膜（Ｐ紙やコツト
ン布）をアルカリに浸漬することが示されているが、セ
ルロース製の非対称膜（例えばミクロフィルター）の様
に細い繊維から成る非対称膜にこの方法を応用すると、
セルロースの加水分解のためか膜がかなシ変形し、また
強度も劣化するという問題点がある。

そこで、活性化によってセルロース膜の膜物性を悪くす
ることなしに、しかも蛋白質に対して高い反応性を持つ
活性化手段を用いた固定化方法の開発が望まれていた。

本発明の目的は、したがって、セルロース膜、特に流体
に対する特性の優れた非対称膜に対し生理活性物質に対
する活性を付与する方法およびそれによって得られる活
性化膜を提供することにあり、また、生理活性を極力維
持したままで安定な化学結合によシ生理活性物質を固定
する方法およびそれによって得られる生理活性物質を固
定化した膜を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 本発明の課題は、セルロース膜を下記一般式（Ｉ）で表
される化合物と反応させることを特徴とするセルロース
膜の活性化方法、これによって得られる活性化セルロー
ス膜、この活性化セルロース膜と生理活性物質を反応さ
せることを特徴とする生理活性物質の固定化方法、およ
びこれＫよって得られる生理活性物質を固定化したセル
ロース膜によって解決された。

一般式（Ｉ） ％式％ 式中Ｒは置換されてもよいアルキル基又は置換されても
よいフェニル基を表わす。

本発明で用いられるセルロース膜は平膜咄たは中空系の
形状の膜であり、好ましくは非対称膜である。平均孔径
がθ、／μ〜１０μの範囲にある多孔質膜（例えばミク
ロフィルター）や、更に孔径が小さく、分画分子量で表
わして／　、０００〜／　、ｏｏｏ　、ｏｏｏであるい
わゆる限外口過膜が好ましく使用できる。これらの膜の
製造法については例えば特公昭４１！−４ｔ６．３３号
、特公昭２コ−／！ｔ４ｔ２号、特公昭ｆ２−３’１ｒ
４１３号に開示されている。膜の厚さ（中空系の場合は
壁部分の厚さ）としては７０μ以上のものが好ましく使
用できるが、７０μ〜３００μが更に好ましい。

次に、セルロース膜を前記一般式（Ｉ）で表される化合
物と反応させて活性化する方法について述べる。

粒子に対して同様な機構に基づく活性化反応を行うこと
は公知（Ｋ、　Ｎｉ１ｓｓｏｎ、　Ｋ、　Ｍｏ５ｂａｃ
ｈ　；Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
　ＶＯｌ、　／　ｏ　ｙ　。

ｊｊ−４り（／９．ｒｌ）であり、その内容は微小なア
ガロースおよびセルロース粒子にクートルエンスルホニ
ルクロリド、λ、２．２−）Ｊ、ｌフルオロエタンスル
ホニルクロリドを室温で作用させて活性化するものであ
るが、腹については知られていない。

セルロース製非対称膜に対して本発明者らは上記文献に
記載の反応条件で活性化を試みたがほとんど活性化され
なかった。そこで反応条件を種々探索した結果、次の反
応条件でセルロース膜を活性化できることを見出した。

例えば、ｐ−トルエンスルホニルクロリドノ場合、セル
ロース膜／ｇに対してｐ−）ルエンスルホニルクロリト
ヲ３０ｍｍｏｌ−０、２ｍｏｌ、好ましくは０　、３〜
Ｏ。

ｊｍｏｌおよＵｐ−）ルエンスルホニルクロリドの／、
！邑量分の塩基（例えばピリジンまたはトリエチルアミ
ン）を含んだ溶媒的１００ｍ１を加える。次に、２０−
／θ０Ｃ好ましくけりθ〜ｔｏ０ｃで／よ分間〜３時間
、好ましくけ／〜２時間反応させることにより活性化で
きた。ここで用いる溶媒としては、アセトニトリル、ピ
リジン、アセトン、ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホル
ムアミド、ジエチレングリコール、ジエチルエーテル、
クロロホルム等を挙げることができる。特にピリジン、
アセトニトリルを溶媒とした場合に良好な結果を得た。

ここで見出した反応方法は、反応温度の点で特に公知例
と大きく異なり、また反応溶媒も一部異なっている。

一般式（Ｉ）のＲの置換されてもよいアルキル基として
は、メチル基、エチル基、プロピル基、Ｊ、２．２−ト
リフルオロエチル基等があげられるが、特に好ましくは
メチル基および２，１．２−トリフルオロエチル基であ
る。置換されてもよいフェニル基トしては、フェニル基
、ｐ−メチルフェニル基、ｐ−クロロフェニル基、ｐ−
メトキシフェニル基があげられるが、特に好ましくはｐ
−メチルフェニル基である。

活性化反応によって導入された活性基の量は、β−フェ
ネチルアミンを反応させ、その減少量を定量することに
よって測定することができた。セルロース膜を構成する
全グルコースに対してθ。

７〜１０モルチ、よυ好ましくはＯ，！〜ｊモルチの活
性基が導入されていることが生理活性物質の固定化には
望ましい。

次に活性化されたセルロース膜への生理活性物質の固定
化法について述べる。まず、ｐＨｇ〜９゜！の範囲のバ
ッファーに固定化されるべき生理活性物質を溶解する。

この時用いるバッファーは例エバリン酸バッファー、ホ
ウ酸バッファー、モルフォリノエタンスルホン酸（ＭＥ
Ｓ）パッファ−ヒドロキシエチルピはラジンエタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファーなど７級アミン基を有
しない本のが好ましい。また、必要により生理活性物質
の安定剤をさらに加えてもよい。圧力によってセルロー
ス膜中にこの酵素溶液を送シ込み、グ〜ｔｐｔｏ０ｃで
７〜７２時間循環し反応させる。

固定化反応終了後、膜中にバッファー液を通過させ膜を
洗浄する。さらにアルカリまたはエタノルアミン等のア
ミンの水溶液を通過させることにより、膜に残存する活
性基と反応させて不活性化し、最後に再びバッファー液
で洗浄する。

以上に述べた方法によシ生理活性物質を非対称セルロー
ス膜に固定化することができる。

本発明によって固定化される生理活性物質は、酵素、補
酵素、抗体、ホルモン、レセプター　レクチン、阻害剤
等である。酵素としては、例えばトリプシン、キモトリ
プシン、サーモライシン、パパイン、アスパラギナーゼ
、リノξ−ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、リゾチーム、
ウレアーゼ力どの加水分解酵素、アルコールデヒドロゲ
ナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダー
ゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、Ｄ−アミノ酸オキシ
ダーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキ
シドディスムターゼなどの酸化還元酵素、ヘキソキナー
ゼ、クレアチンキナーゼ、アラエントランスアミナーゼ
などの転移酵素、フマラーゼ、アスハルテ−）アンモニ
アリアーゼ、スレオニンアルドラーゼ、ピルビン酸デカ
ルボキシラーゼなどのリアーゼ、グルコースリン酸イン
メラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼなどの異性化
酵素、グルタミンシンセターゼ、アセチルＣｏＡカルボ
キシラーゼ、ＤＮＡリガーゼなどのりガーゼ等をあげる
ことができる。その他の生理活性物質としてはＮ６　　
（ｔ−アミノヘキシル）−ＡＭＰなどの補酵素誘導体、
免疫グロブリンおよびそのＦａｂフラグメント、プロテ
ィンＡ等のバクチリアルＦｃレセプター　コンカナバリ
ンＡや小麦胚芽アグルチニンなどのレクチン、大豆トリ
プシン、インヒビターなどの阻害剤、フェニルアラニン
、ヒスチジン、トリプトファンなどのアミノ酸などがあ
げられる。

（発明の効果） 活性化した担体に生理活性物質を固定化する段階で失活
が少なく、また経時で生理活性物質が脱離しないことは
固定化生理活性物質にとって極めて重要である。この点
においてセルロース膜に関して公知の方法、すなわち酸
化剤による活性化方法およびトリアジン誘導体による活
性化法には、まだ改良がなされなければガらない。本発
明にしたがって活性化されたセルロース膜は生理活性物
質との反応性が高く、またポンプを用いて生理活性物質
を膜内に送り込むため、拡散に要する時間も必要ない。

その結果、多くの生理活性物質の場合、４ｔ０Ｃで／〜
数時間で固定化が完了し安定な化学結合が形成される。

これは前記の公知の方法での固定化がｔｐｔ　’Ｃで７
．２時間からダθ０Ｃで一昼夜の条件で行われるのに対
して、短時間で済むため生理活性の低下が少ない。

また、セルロース膜および生理活性物質との結合部位が
親水的かつ非イオン性であるため、蛋白質等の非特異吸
着が無く、センサーやアフイニテイ分離用材料への応用
にも適している。

さらに、セルロース膜はほとんどの有機溶媒にも耐える
ため、有機溶媒系で本発明の固定化生理活性物質を使用
することもできる。

（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に詳細に説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

−ス膜の製造 セルロース製ミクロフィルターＦＲ−＜ｔθ（富士写真
フィルム■製、孔径Ｏ，ａμ）／！θＣｍ２にアセトン
１０ｍ１！およびピリジン１１ｍ１を加える。２．．２
．２−）ＩＪフルオロエタンスルホニルクロリド２ｍＪ
ｌを滴下し、続いてりθ０Ｃで３０分間振とりする。そ
の後、膜をアセトン、／ｒｎＭ塩酸の順によく洗浄しく
ｔ　’Ｃで保存する。このようにして７ｅｐｍｏｌ／ｇ
の活性基をもつセルロース膜を得た。

実施例／で製造した活性化セルロース膜を用いた。

サーモライ’／７！Ｏｍｇを、！　ｍ　Ｍ　Ｃａ　（Ｊ
　２　　を含ｂｐＨｒ、ｏのθ、ｏｔＭモルフォリノエ
タンスルホン酸バッファー！θｒｎｌｌに溶解スる。Ｐ
ｉ用のフィルターホルダーにセントした活性化セルロー
ス膜にサーモライシン溶液をポンプを用いて透過させ、
＜ｔ　’Ｃで！時間循環させることにより固定化した。

次に、残った活性基を除くために１ｏ、７Ｍエタノール
アミン水溶液を＜ｔ　０Ｃで２時間循環させ、最後にバ
ッファー液を透過させて十分膜を洗浄した。酵素の固定
化ｉは溶液中に残った酵素をＵＶ吸収法により定量して
求めた。

活性測定 基質トしてはベンジルオキシカルボニル−し−アスパル
チル−Ｌ−フェニルアラニンメチルエステル（Ｚ−アス
パルテーム）をｆｍＭの濃度で、ｐＨ７、ｏのＯ０θｔ
Ｍ　　Ｎ−コーヒドロキシエチルヒハラジンーＮ’　−
，２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）バッファに溶解
したものを用いた。

サーモライシン固定化膜を沢適用フィルターホルダーに
セットし、コｔ　０Ｃで膜中に基質溶液を循環させて透
過液中Ｏ住酸物（Ｚ−アスパラギン酸）の濃度を定量し
た。結果を第１表に示す。

比較例／　酸化剤を用いた活性化法によるサーモライシ
ン固定化膜の製造 ＦＲ−グＯ膜を０．！Ｍのメタ過ヨウ素酸ナトリウムに
浸漬し、４ｔＯ０Ｃで５時間反応させた。

この膜を純水で洗浄した後、実施例と同様のサーモライ
シン溶液を４ｔ’Ｃで４時間循環させることにより固定
化した。次にその酵素溶液に／ｍｇ／ｍｌの濃度の水素
化ホウ素ナトリウムを加え、り０Ｃで２時間循環した。

最後にバッファー液を透過させて十分膜を洗浄した。活
性測定は実施例コと同じ方法で行った。結果を第１表に
示す。

第 表 ＊比活性は酵素／ｍｇが７分間に分解する基質のμｍＯ
ｌ量で表わした。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）セルロース膜を下記一般式（ I ）で表わされる化
   合物と反応させることを特徴とするセルロース膜の活性
   化方法。 一般式（ I ） Ｃｌ−ＳＯ＿２−Ｒ 式中Ｒは置換されてもよいアルキル基又は置換されても
   よいフエニル基を表わす。 ２）第１項の活性化方法によつて得られる活性化セルロ
   ース膜。 ３）第２項の活性化セルロース膜と生理活性物質を反応
   させることを特徴とする生理活性物質の固定化方法。 ４）第３項の固定化方法によつて得られる生理活性物質
   を固定化したセルロース膜。