CN109608679B - 一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法。该方法包括以下步骤：(1)基膜表面的羟基与硅烷偶联剂3‑氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应，使基膜表面胺基化；(2)表面胺基化的膜与双功能蛋白交联剂4‑(p‑马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)反应使膜表面具有高活性马来酰亚胺；(3)核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)末端的巯基(SH)与膜表面的马来酰亚胺键合将核孔复合体接枝到膜表面，制得具有蛋白选择性分离功能的核孔复合体接枝聚合物仿生膜。

Description

一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法
技术领域
本发明涉及生物分离领域，具体地说是一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法。
背景技术
蛋白质药物是在蛋白质水平对疾病进行诊断、预防和治疗，广义的蛋白质药物包括所有化学本质为蛋白质或多肽的产品，如激素、生长因子/细胞因子、蛋白酶、受体分子、单克隆抗体及抗体相关分子、部分蛋白或多肽疫苗等。与以往小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成功率高、安全可靠，已成为医药产品中重要组成部分。然而，天然存在的蛋白质，或者通过发酵、培养或合成的蛋白质，在初始阶段总是由多种成分组成，须经分离和纯化后才能在医药、食品等领域中应用。因此，蛋白质的高效率和选择性分离研究具有重要的理论意义和实际应用价值，成为现代药物分析、生命科学、生物工程及至化学工程研究的热点。
目前用于蛋白质分离的手段主要是色谱，包括凝胶色谱、离子交换色谱、高效液相色谱等。然而这些技术所需的设备昂贵且处理量小，难以实现工业化生产应用。近年来，亲和色谱以其良好的分离性能被广泛应用于蛋白、核酸，多肽等生物大分子的分离纯化，该方法基于配基与目标生物分子间的相互识别作用，如抗体与抗原、糖与凝集素、酶与底物等，来达到分离目的，是目前大分子分离机制中最有效的手段之一，然而其操作易受传质限制、处理量少、同样难以实现工业化生产。
膜分离是以外界能量为动力，凭借各组分在膜中传质的选择性差异实现分离，具有操作条件温和、压力低、无相变、无污染等特点。膜分离技术在蛋白质的分离与纯化方面具有非常广阔的应用前景，并逐渐向工业化生产发展。然而，它也存在一些问题，例如基于蛋白质分子尺寸实现分离的技术，一般要求相对分子质量相差10倍以上才具有良好的分离效果。但是某些蛋白质的分子质量以及体积大小往往相差不大，仅结构、构象略有差异，通过尺寸筛选还远远不能满足生物大分子高精度分离纯化的需求。
生物体中细胞内核-质之间的蛋白质选择性传输通过细胞核膜完成。细胞核膜是由外膜和内膜组成的磷脂双分子层结构，同时镶嵌一些核孔复合体(nuclear porecomplex，NPC)。NPC是一个多蛋白复合体，其分子量达到125MDa。无论是脊椎动物还是酵母，NPC均大约由30个不同的核孔蛋白(nucleoporin，Nup)组成。NPC的孔径为25nm，中心通道的直径约为9nm。NPC是一种具有分子筛功能的孔状结构，可以允许分子量少于40kDa的小分子物质(如离子、代谢底物和小分子蛋白等)以弥散方式自由通过；而分子量超过此范围或直径大于5nm的生物大分子(如RNA与蛋白质等)则必须在核浆转运蛋白Kaps95的介导下，以能量依赖的方式进行主动转运。在细胞体内，每个NPC每秒钟要将数以千计的蛋白分子选择性运送到细胞核。
综上所述，生物体巧妙设计了核孔复合体，依赖转运因子作载体，选择性运输功能蛋白通过核孔复合体穿越核膜进入细胞核内。受此启发，本发明以多孔膜为基体经表面修饰马来酰亚胺后与核孔复合体的末端巯基(-SH)进行化学键合，制备核孔复合体接枝聚合物多孔仿生膜，用于对蛋白质的选择性传输。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法。
本发明所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，该方法包括以下步骤：(1)基膜表面的羟基与硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应，使基膜表面胺基化；(2)表面胺基化的基膜与双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)反应使膜表面具有高活性马来酰亚胺；(3)核孔复合体(nuclear porecomplex，NPC)末端的巯基(SH)与基膜表面的马来酰亚胺键合将核孔复合体接枝到膜表面，制得具有蛋白选择性分离功能的核孔复合体接枝聚合物仿生膜。其中，所述基膜材料为聚乙烯醇、聚乙烯-乙烯醇、壳聚糖、纤维素、聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯中的一种或几种的混合物。基膜表面的羟基来自于膜材料本身或经表面等离子处理或过硫化物氧化产生；表面等离子处理条件为等离子源为氢气和氦气混合物，二者体积比0.5～2：99，流量10～40L/min，功率为120～220W；过硫化物为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的一种或任意比例的混合物，过硫化物氧化条件为将过硫酸化物配成质量浓度为5～20％的水溶液，将基膜浸泡于过硫化物溶液中于50～80℃下反应2～6h，即得表面羟基化的基膜。基膜表面的羟基与硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应条件为，先将APTES溶解于水或乙醇中，配成质量浓度为2～20％的溶液，然后将膜浸泡于APTES溶液中于40～80℃下反应1～5h。表面胺基化的基膜与双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)反应的条件为，将SMPB溶解于pH值为7.0～8.2的磷酸缓冲盐溶液中，SMPB的浓度为0.5～5.0mmol/L，然后把表面带有活性胺基的聚合物膜置于SMPB溶液中于室温下反应10～60min，即得马来酰亚胺功能化的聚合物膜。最后将核孔复合体储备液溶解于pH为7.0～8.2的PBS缓冲溶液中，浓度为0.05～0.5mg/mL，然后将马来酰亚胺功能化的基膜浸泡于核孔复合体溶液中反应10～60min，即得核孔复合体接枝聚合物仿生膜。
采用上述方法制备的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜可以实现对核浆转运蛋白Kaps95的选择性运输。
附图说明
图1本发明实施例1中所用的蛋白质分离装置示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围：
实施例1
(1)先将APTES溶解于水中，配成质量浓度为10％的溶液，然后将再生纤维素膜浸泡于APTES溶液中于60℃下反应2h，使基膜表面胺基化。(2)将SMPB溶解于pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，SMPB的浓度为2.0mmol/L，然后把表面带有活性胺基的再生纤维素膜置于SMPB溶液中于室温下反应20min，即得马来酰亚胺功能化的聚合物膜。(3)将核孔复合体储备液溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，浓度为0.2mg/mL，然后将马来酰亚胺功能化的再生纤维素膜浸泡于核孔复合体溶液中反应30min，即得核孔复合体接枝再生纤维素仿生膜。
将核孔复合体接枝再生纤维素膜仿生膜固定于如图1所示的扩散池中间并将左右两室隔离，右室放入待分离蛋白(核浆转运蛋白Kaps95或牛血清蛋白BSA)样品溶液(原液，蛋白浓度为0.5mg/mL)，左室放入缓冲溶液，两室体积均为5mL。根据浓差原理，蛋白质将透过膜从右室向左室扩散。为了扩大两室的浓度差，将左室通过管道外接一个体积较大的稀释池(1000mL)，以增大浓差驱动力，使蛋白质能更快速的向左室扩散。在不同实验时刻分别从左右两室取样，并用酶标仪测试蛋白质浓度。扩散24h后，左室Kaps95的浓度从0mg/mL提高到0.18mg/mL，而相同条件下BSA几乎不向左室扩散。结果表明该核孔复合体接枝再生纤维素仿生膜对Kaps95蛋白具有选择性，有望应用于蛋白质的选择性分离。
实施例2
(1)将过硫酸钾配成质量浓度为20％的水溶液，将聚偏氟乙烯膜浸泡于过硫酸钾溶液中于80℃下反应5h，即得表面羟基化的聚偏氟乙烯膜。(2)将APTES溶解于乙醇中，配成质量浓度为15％的溶液，然后将表面羟基化的聚偏氟乙烯膜浸泡于APTES溶液中于60℃下反应2h，使基膜表面胺基化。(2)将SMPB溶解于pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液中，SMPB的浓度为2.0mmol/L，然后把表面带有活性胺基的聚偏氟乙烯膜置于SMPB溶液中于室温下反应20min，即得马来酰亚胺功能化的聚偏氟乙烯膜。(4)将核孔复合体储备液溶解于pH为7.4的PBS缓冲溶液中，浓度为0.2mg/mL，然后将马来酰亚胺功能化的聚偏氟乙烯膜浸泡于核孔复合体溶液中反应30min，即得核孔复合体接枝聚偏氟乙烯仿生膜。
将核孔复合体修饰的聚偏氟乙烯膜固定于如图1所示的扩散池中间并将左右两室隔离，右室放入待分离蛋白(核浆转运蛋白Kaps95或牛血清蛋白BSA)样品溶液(原液，蛋白浓度为0.5mg/mL)，左室放入缓冲溶液，两室体积均为5mL。根据浓差原理，蛋白质将透过膜从右室向左室扩散。为了扩大两室的浓度差，将左室通过管道外接一个体积较大的稀释池(1000mL)，以增大浓差驱动力，使蛋白质能更快速的向左室扩散。在不同实验时刻分别从左右两室取样，并用酶标仪测试蛋白质浓度。扩散48h后，左室Kaps95的浓度从0mg/mL提高到0.23mg/mL，而相同条件下BSA几乎不向左室扩散。结果表明该核孔复合体接枝聚偏氟乙烯仿生膜对Kaps95蛋白具有选择性，有望应用于蛋白质的选择性分离。

Claims (6)

1.一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：(1)基膜表面的羟基与硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应，使基膜表面胺基化；(2)表面胺基化的基膜与双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)反应使膜表面具有高活性马来酰亚胺；(3)核孔复合体(nuclear pore complex，NPC)末端的巯基(SH)与基膜表面的马来酰亚胺键合将核孔复合体接枝到膜表面，制得具有蛋白选择性分离功能的核孔复合体接枝聚合物仿生膜；
所述基膜材料为聚乙烯醇、聚乙烯-乙烯醇、壳聚糖、纤维素、聚砜、聚醚砜、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯中的一种或几种的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于基膜表面的羟基来自于膜材料本身或经表面等离子处理或过硫化物氧化产生；
所述表面等离子处理条件为等离子源为氢气和氦气混合物，二者体积比0.5～2∶99，流量10～40L/min，功率为120～220W；
所述过硫化物为过硫酸铵、过硫酸钾、过硫酸钠中的一种或任意比例的混合物；
所述过硫化物氧化条件为将过硫酸化物配成质量浓度为5～20％的水溶液，将基膜浸泡于过硫化物溶液中于50～80℃下反应2～6h，即得表面羟基化的基膜。
3.根据权利要求1所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于基膜表面的羟基与硅烷偶联剂3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)反应条件为，先将APTES溶解于水或乙醇中，配成质量浓度为2～20％的溶液，然后将膜浸泡于APTES溶液中于40～80℃下反应1～5h。
4.根据权利要求1所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于表面胺基化的基膜与双功能蛋白交联剂4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸琥珀酰亚胺酯(SMPB)反应的条件为，将SMPB溶解于pH值为7.0～8.2的磷酸缓冲盐溶液中，SMPB的浓度为0.5～5.0mmol/L，然后把表面带有活性胺基的聚合物膜置于SMPB溶液中于室温下反应10～60min，即得马来酰亚胺功能化的聚合物膜。
5.根据权利要求1所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于先将核孔复合体储备液溶解于pH为7.0～8.2的PBS缓冲溶液中，核孔复合体的浓度为0.05～0.5mg/mL，然后将马来酰亚胺功能化的基膜浸泡于核孔复合体溶液中反应10～60min，即得核孔复合体接枝均孔聚合物仿生膜。
6.根据权利要求1所述的一种核孔复合体接枝聚合物仿生膜制备方法，其特征在于可以实现对核浆转运蛋白Kaps95的选择性运输。
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