JPH03140330A - 生物学的活性物質固定体及びその製造方法並びにその製造用担体及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は生物学的活性物質固定体に関する。さらに詳し
くは固定体が親水性であるポリホスファゼンポリマーか
ら構成される生物学的活性物質固定体に関する。

〈従来技術〉 近年、生物学的活性物質を用いた化学工業プロセス、臨
床化学用材料などの研究開発が盛んに行われている。

生物学的活性物質の１つである生物内の種々の反１，６
を触媒する酵素が司どる生化学反応は、有機化学反応と
比べて （１）常温、常圧下で反応が進行するので所要エネルギ
ーが大幅に節減できる。

（２）特定の構成の特定の位置に特異的に反応が起こる
ので副生成物が少なく収率の向上が可能であり、精製も
容易である。

（３）基質特異的が厳密なため、社々の化合物の混在下
でも特定の物質のみｊ′：Ａ択的に変化させうる。

などの利点を有している。

しかしながら、水溶性の球状蛋白質である酵素は熱、有
機溶媒、酸性やアルカリ性溶液に対して不安定であり容
易にその活性を失う。また、これまで酵素は水溶液中に
溶解して用いられその回収は困難であったので、通常１
回の反応ごとに捨てられてしまいきわめて不経済であっ
た。

酵素の固定化は、このような酵素の持つ欠点を除いて長
所を利用するための技術である。

酵素の固定化方法としては、（１）担体結合法、（２）
架橋法、（３）包括法やそれらを組み合わせた複合法な
どがある。これらの技術を利用して酵素を利用した化学
工業プロセスの開発が行われている。さらに近年、酵素
のみならず、ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ　（Ｐ）ＨやＡＴＰ
のような補因子、細胞内オルガネラ、微生物菌体、動植
′ＰＪＪＪ細胞なども固定化して利用する技術が報告さ
れている。これらの技術において酵素等に用いた生化学
反応を行うためには機能を発現できる酵素等が数多く存
在していることが望ましい。

また、臨床検査分野においても、抗原、抗体などの生物
学的活性物質をポリスチレン系ラテックス等の固体担体
に固定化して診断に用いられている。これらの固定化法
は吸着型と（ヒ学結合型に分けられる。現在実用化され
ているものは、はとんどが吸着型と思われるがこれらは
生物学的活性物質（抗体タンパク等）とラテックスの疎
水性相互作用にとらづく物理吸着を主とするため、生物
学的活性物質の脱離や診断における免疫化学的反応に好
ましくないタンパクが吸着するという可能性がある。従
って表面に反応性が高くかつ安定な官能基を高濃度にか
つ定量的に有し水系での反応で容易にタンパクなどを（
ヒ学結合的に固定できる担体があれば上記不都合な点を
解決することができる。

さらにアフィニティータロマドグラフィーのような生物
学的親和性を利用した分角１精製技術にも担体への生物
学的活性物質の固定化が必要となる。

この技術においても精製しようとする物質と生物学的親
和性を存する生物学的活性物質を数多く固定化している
ことが望ましく、かつ、精製しようとする物質が担体へ
非′Ｊ！ｒ異的に吸着しないことが必要とされる。

先に、本発明者らは、ポリホスファゼンからなる成形物
の表面を処理して、該表層部に生物学的活性物質（以下
リガンドということがある）を固定化できる官能基（更
に反応させることにより、リガンドを固定化できる官能
基に変換し得るものも含む）を導入した生物学的活性物
質固定用担体を提案したく特開平１−３０６５０号公報
参照〉。また、マクロモレキュルズ１９巻（Ｎｏ、６）
　１５０２頁（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　１９　
（６）１．５０２）には、多孔質アルミナ上にポリビス
アリールオキシホスファゼンを担持させ、表層部のポリ
ホスファゼンにアミン基を導入し、これに酵素を固定化
することが提案されている。

〈発明が解決しようとする問題点〉 しかしながら、これらの担体をアフイニテイクロマトグ
ラフィーあるいは診断薬にそのまま応用した場合、リガ
ンドと結合し得る官能基を有さない側鎖が疎水性である
と、リガンドと親和性の５Ｆ）る物質〈以下目的物質と
称することがある）以外の物質が担体に疎水結合等によ
り吸着して、分Ａｉ精度あるいは診断精度が低下する場
合がある。

また、特開平１づ０６５０号公報に提案されている担体
では、ポリホスファゼンの側鎖に存在する生物学的活性
物質と結合可能な官能基の数が多すぎるために、生物学
的活性物質を数多く、又は定量的に固定できるものの、
固定した生物学的活性物質の三次元的構造が変化したり
、活性部位が上記官能基で不活性化される等の不都合な
現象が発生する場合もある。更には、生物学的活性物質
と結合しなかった官能基に、後にリガンドとなるべきで
はない他の生物学的活性物質が結合してしまうこともあ
る。かかる固定体がアフイニテイクロマトグラフィーに
用いられた場合には、リガンドと親和性のある目的物質
以外のものによって目的物質が汚染されることにつなが
るし、診断薬に用いた場合には、誤診につながるなど不
都合な点が多い。

く間圧を解決するための手段〉 本発明名らは、かかる不都合な点を解決すべく鋭意研究
の結果、本発明に到達した。

即ち、本発明は、ポリホスファゼンポリマーから構成さ
れる生物学的活性物質固定体であって、該固定体の少な
くとも表層部のポリホスファゼンポリマーの側鎖は、そ
の少なくとも一部の側鎖に生物学的活性物質が結合固定
されかつ残りの側鎖は非反応性であって親水性を有する
有機基から実質的になることを特徴とする生物学的活性
物質固定体に係るものである。

本発明でいう生物学的活性物質とは、生体内にある物質
と特異的に相互作用を示ず物質であって、例えば酵素、
抗体、核酸等の高分子、補酵素、ハブテン等の低分子い
ずれであってもよく、目的に応じて適宜還択して用いれ
ば良い。

ポリホスファゼンポリマーは、主鎖がリンと窒素のみか
ら構成されている高分子であって、側頭に種々のものを
尋人することができるので、それにより種々の性質を示
すことが知ちれている。

本発明の生物学的活性物質固定体は、かかるポリホスフ
ァゼンポリマーから構成されるものであって、該固定体
の少なくとも表層部のポリホスファゼンは、生物学的活
性物質が結合固定された側鎖を有し、かつ残りの側鎖は
実質的に非反応性であって親水性を有する有機基からな
る必要がある。

生物学的活性物質が結合固定された側鎖とは、生物学的
活性物質がエステル結合、アミド結合、アミノ結合、エ
ーテル結合、千オニーチル結合等の共有結合により有機
基に結合したものを言い、１つの側鎖中に固定される該
生物学的活性′Ｓ質の数は単数であっても複数であって
もよいし、１つの生物学的活性物質は単数の位１で固定
されていても複数の位置で固定されていてもよいし、ま
た、側鎖の中央、末端いずれの位置に固定されていても
よい。通常は側鎖の末端のみに単数の箇所で結合固定化
されていることが、使用時の分子４＠精度、生物学的活
性度等向上の面で好ましい。

また、この側鎖は、生物学的活性物質を除いた場合の最
長連鎖原子数が１４以内（分枝及び水素は含まない）が
好ましく、しかも酸素、窒素、イオウ等のへテロ原子が
直接分枝として結合していない炭素原子が６個以上連続
して並ぶことのないものが好ましい。連５Ｎ原子数が１
４を越えると、生物学的活性物質を固定する際の反応性
が低下する顔向があり、一方上記の如き炭素原子が６個
以上連続すると非特異吸着が増加する、あるいは固定化
された生物学的活性物質の活性度が低下する等の不都合
を現象が発生する場合がある。なお、側鎖には分枝鎖を
有していてもよいが、かかる分子鎖を構成する原子数は
、上記最長連鎖原子数未満のものが好ましい（この場合
においても水素原子は含まない）。

本発明においては、少なくとも表層部のポリホスファゼ
ン側鎖のうち上記側鎖以外は、非反応性であって親水性
を有する有機基から実質的になる必要がある。ここでい
うパ実質的に′とは、残りのすべての側鎖が上記有機基
からなることを怠昧するのではなく、本願の目的、すな
わち非特異吸着を減少させる、生物学的活性物質の活性
度を維持するといった目的を損なわない範囲で池の有機
基が存在していてもよいことをいう。この量は、本発明
の担体の使用目的によって変わるが、通常は５モル０≦
以下、好ましくは２モル％以下である。

本発明でいう非反応性を有する有機基とは、本発明の担
体を使用して例えば生体物質を分離精製する場合、通常
の使用条件の下ではこの有機基と生木物質が反応して共
有結合、イオン結合等しないことをいう。また親水性を
有するとは、同じく生体ｅ［が疎水性結合等によって非
特異吸着されないことをいう。

かかる有機基としては、例えば水酸基及び／又はエチレ
ンオキシ単位を有する有機基が好ましく用いられる。

水酸基を有している有機基の場合、すなわち側鎖に水酸
基を有している場合には、水酸基は側鎖のどの位置にあ
ってもよく、単数、複数いずれであってもよい。なお、
側鎖中の主鎖に結合した原子より数えて最も遠い原子ま
での数（最長連鎖長）は２５以下、特に２０以下が好ま
しく、分枝鎖として前記最長連鎖長の数より少ない原子
数を有する有機基を有していてもよい（この場合も水素
原子を除く。以下同じ）。しかし、前述と同様に酸素、
窒素、イオウ等のへテロ原子が結合していない炭素原子
を４個以上連続して結合している場合には、本発明でい
う親水性が低下して非特異吸着等が起こる傾向がある。

また、側鎖の連鎖長が２５を越える場合には、ホスファ
ゼンポリマーの水溶性が極めて大きくなるため、側鎖間
を反応させる等により架橋させ水不溶性にせねばならず
、逆にあまりに架橋の程度を大きくしすぎると、生物学
的活性物質の担体内への移動が遅くなって効率よく本発
明の生物学的活性物質固定体を製造できなかったり、あ
るいは使用時生体物質と相互作用させる場合に生体物質
が該生物学的活性物質の固定された位置へ移動し難くな
って不都合（例えば活性度低下）が生ずる場合もある。

また、エチレンオキシ単位を有している有機基の場合に
は、通常エチレンオキシ繰り返し単位の片末端が炭素数
１〜４の脂肪族基く炭素以外のへテロ原子を含んでもよ
い）又は水素（この場合は＋酸基を有することになる）
であることが好ましい。これより炭素数の大きい脂肪族
基の場合は前述の如くヘテロ原子が結合していない炭素
原子が連続して４個以上並ばないようにする必要がある
。

エチレンオキシ単位の繰り遅し数は任意であるが、あま
りに大きすぎると前述の水酸基を有する側鎖の場合と同
じく、ポリホスファゼンの水溶性がよくなりすぎたり、
生物学的活性物質の固定が困難になったり、あるいは使
用時の活性度が低下するため望ましくなく、前述と同じ
く最長連鎖長が２５以下となるよう繰り遅し単位数を選
択するのが好ましい。なお、エチレンオキシ単位は該側
鎖中に連続して入っていてもよく、複数に別れて入って
いてもよい。

以上に説明した非反応性親水性有機基には、前記非反応
性を満足する範囲内で、イミン結合、アミノ結合、エス
テル結合、アミド結合、エーテル結合等、あるいは池の
官能基を有していてもよい。

本発明における生物学的活性物質を固定した側鎖と非反
応性・親水性の側鎖との割合は、最終的に使用する目的
により適宜選択すればよい。一般に生物学的活性物質は
立木的に嵩高いものが多く、またこの生物学的活性物質
と相互作用して吸着固定される生体物質も嵩高いものが
多いため、前者の数をあまりに多くしてもその効果は飽
和ないしは逆に低下する傾向がある。通常は、生物学的
活性物質が固定された側鎖と親水性の側鎖の比は１／１
〜！／１０００００が好ましく、特に１／１０〜１／１
００００が好ましく採用される。

以上に説明した生物学的活性物質（０と略記）を固定し
た側鎖（Ａ）及び非反応性で親水性を有する側鎖（Ｂ）
としては、下記のものを例示することができる。なお、
式に示す側鎖は、ポリホスファゼン主鎖のリン原子に結
合するものである。

ｒｆＩＪ藺（Ａ）ニ ー０ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｓ　ＣＨ＝Ｎ　　
Ｑ−ＯＣＲ２ＣＨ２Ｎ）（（ＣＨ２）　５　ＮＨ’ＤＯ
ＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）ｓ　ＣＨ０）（＝
Ｎ　　Ｃ） −０ＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｎ）（（ＣＨ２）５　Ｎ）ｌ−Ｃ
１ＯＨ ＋０ＣＨｚＣＨｚ）２　Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）３　ＣＨ＝
Ｎ−［Ｆ］ ＋ＯＣＲ２ＣＲ２） ＯＨ （ＣＨ２＞ ＯＨ−Ｏ −ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯ−［Ｆ］ ＯＣＲ２ＣＲ２ＣＲ２Ｎ　ｌ（ＣＯ−■晶 ＋　ＯＣＲ２ＣＲ２） ＮＨＣＯ−［Ｆ］ ＯＨ Ｎ　ＨＮ　ＨＣ，０ （ＣＲ２） ＣＯＮＨＮＨＣＯ−［Ｆ］ 非反応性親水性側鎖（Ｂ）： ０ＣＲ２Ｃ）Ｌ！ＯＨ。

一０ＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２０Ｈ ０ＣＨ （ＣＨ２０Ｈ） −ＯＣＲ２ＣＨ （ＯＨ） ＣＨ２０）（ −ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＝ＣＨ（ＣＦム　）３Ｃ）（＝ＮＣ
Ｈ２ＣＨ２０Ｈ −ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ）（ （ＣＨ２） ＮＨＣＨ２ＣＨ２０Ｈ ＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２Ｎ ＝ＣＨ（ＣＨ２）　３　ＣＨ＝ＮＣ囲ＣＲ２０）（−Ｏ
ＣＲ２ＣＨＣＲ２Ｓ ＯＨ ■ ＯＨ ＜ＣＨ２） ＮＨＣＯ−Ｑ Ｎ）（ （ＣＨ２） ＯＮＨ ■ Ｎ）ｌ （ＣＲ２） ｃｏｏ−。

−Ｎ　Ｆ（ （ＣＨ２） ＮＨＣＯＣ）１ ＯＲ２ （ＣＨ２） ［Ｆ］ 　Ｎ　Ｈ （ＣＨ２） −ＣＩ ＮＨ （ＣＨ２） ＣＯＣＲ２ＣＲ２Ｓ　−Ｃ） ＮＨ （ＣＨ２） ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨ−ＣＩ ＮＨ（ＣＨ２）　　６　ＮＨＣＯ（ＣＨ２）　　２−Ｃ
ＯＮ　Ｈ ■ ０　ＣＲ２ＣＲ２０ＣＲ２ＣＲ２Ｎ　Ｈ（ＣＲ２）　ｑ
−ＮＨＣＨ２ＣＨ２０Ｈ −ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）　３ＣＨ＝　Ｎ　
ＣＲ２ＣＲ２０ＣＲ２ＣＲ２０Ｈ−〇ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ
（ＣＨ２）ｓ　　ＮＨ−ＣＲ２ＣＲ２０ＣＲ２Ｃ８２０
１（ ＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２Ｎ＝ＣＨ（ＣＨ２）３　
ＣＨＮＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２０）（ ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ　Ｈ（ＣＨ２）　、Ｎ
　Ｈ−ＣＲ２ＣＲ２０ＣＲ２ＣＲ２０１−（−ＯＣＲ２
ＣＲ２Ｎ　　＝　　ＣＨ（ＣＲ２）　　　３　　　ＣＩ
−（＝Ｎ−Ｃ（ＣＨ２０Ｈ）：＝ −ＯＣＲ２ＣＲ２Ｎ　Ｈ（ＣＲ２）　５　Ｎ　ＨＣ（Ｃ
Ｈ２０Ｈ）３ ０　　ＣＨ２Ｃ）！、！　ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ　　＝　　
ＣＨ＜　　ＣＨ２）　　　３　　ＣＨ＝　Ｎ　−Ｃ＜　
ＣＨ２ＯＨ）　　３ ＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ（ＣＨ２）ｓ　　Ｎ
ＨＣ（ＣＨ２ＯＨ）　　　３ ○ＣＨ２ＣＨ２Ｎ）（ＣＨ２ＯＮ ＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２０Ｈ−ＯＣＨ
２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ
２ＣＨ２０ＣＨ２ＣＨ２０ＣＨ３以上に詳述した本発明
の生物学的活性物質固定体は以下の如くして得られる。

すなわち、ポリホスファゼンからなる成形物の少なくと
も表層部のポリホスファゼンポリマーの側鎖が、実質的
に生物学的活性物質と反応して結合固体化できる官能基
を有する側Ｍのみからなるか（担＃、１と略す）、もし
くは該側鎖と前述の非反応性で親水性を有する側鎖とか
らなる生物学的活性物質固定用担体（担体２と略す）を
、生物学的活性物質を含有する溶液（通常は水溶液）に
接触させることにより、所望の量を固定すればよい。

この際、固定量をコントロールするには、溶液の濃度、
処理時間、処理温度、処理液のｐＨ等をコントロールす
ればよく、また、上記の担体１もしくは担体２中に存在
する生物学的活性物質と反応して結合固定し得る官能基
の量をあらかじめコ〉・トロールしておいてらよい。

なお、官能基の量が過剰に存在していて生物学的活性物
質を固定した後に残っている場合には、かかる官能基が
使用時の非特異吸着による分＾ＩＩｖ製度の低下、生物
学的活性物質の活性度の低下を引き起こす傾向があるの
で、前述の非反応性で親水性のものに転換しておく必要
がある。その場合には、該官能基の種類によって反応剤
を適宜泗択すればよく、例えばアミノ基の場合には、ホ
ルムアルデヒドでヒドロキシメチル化する方法、エポキ
シ化合物と反応させる方法があり、カルボキシル基また
はアルデヒド基の場合には還元剤でアルコールまで還元
せしめる方法が好ましく用いられる。以上に示した反応
条件は、特に限定されるものではなく、生物学的活性物
質が変質しない条件、通常は室温以下で該生物学的活性
物質に適合しなｐＨ粂件下で行えばよい。

かかる製造法のなかでも、前記担体２であって生物学的
活性物質と反応して結合固体１ヒできる官能基を有する
側鎖が必要最小限の量存在するものを使用する方法は、
上述のような過剰の官能基をさらに反応させる必要もな
く、また生物学的活性物質を結合させる際、活性部位と
反応して活性度が低下する割合も小さいため特に好まし
い。この最適量は使用する生物学的活性物質の種類（特
に嵩高さが影響）により、また対象とする目的物質の種
類（嵩高さが影響〉によって変わってくるが、−船釣に
は前記官能基を有する側」と親水性を有する側鎖の比が
１／１〜１／１０００００、特に１／１０〜ｌ／１００
００とするのが望ましい。

また、ここでいう生物学的活性物質と反応して結合固定
化し得る官能基とは、生物学的活性物質とそのまま通常
の条件で反応し得るものだけでなく、あらかじめ誘導体
に変換させると反応し得るものをも含むものである。か
かる官能基としては、例えば、アミノ基、水酸基、千オ
ール基、アルデヒド基、エポキシ基、カルボキシル基、
ジアゾニウム塩基等を挙げることができる。これらの中
で、水酸基、カルボキシル基等は通常シアン化ブロマイ
ドあるいは力ｌレボジイミド、Ｎ−ヒドロキシ゛ナクシ
ンイミド等により活性化して用いられる。

生物学的活性物質と結合しうる官能基が、例えば、アル
デヒド基の場合には、生物学的活性物質中のアミン基と
反応してイミン結合が形成されることにより、該生物学
的活性物質は担体に固定される。この際、イミン結合は
加水分解し易いため、シアン化ホウ水素化ナトリウム、
ジメチルアミンボラン、トリメチルアミンボラン、テト
ラメチルボロハイドライド、ナトリウムボロハイドライ
ド等の還元剤で還元するのが好ましい。

また、生物学的活性物質と結合しうる官能基がアミン基
の場合には、生物学的活性物質のアルデヒド基と反応せ
しめるか、生物学的活性物質中のカルボキシ基とカルボ
ジイミド等の脱水剤存在下反応せしめるか、もしくは生
物学的活性物質中のカルボキシル基をあらかじめ活性エ
ステル化した後反応せしめるかして、生物学的活性物質
は担体に固定される。

さらには、生物学的活性物質と結合しうる官能基がカル
ボキシ基の場合には、あらかじめ活性エステル化するか
、もしくは脱水剤を併用して、生物学的活性物質中のア
ミン基と反応せしめることにより、生物学的活性物質は
担体に固定される。

次に、上述の方法で用いられる担体１及び担体２の製造
法について説明する。なお、担体１と担体２は成形物表
層部のホスファゼンポリマーに存在する側鎖の種類及び
その割合が異るのみで本質的には同様の方法により製造
できるので、以下担体２の製造法について説明する。

かかる担体の製造法は、大別すると下記３つの方法を挙
げることができる。すなわち、（１）あらかじめ、前記
生物学的活性物質と反応し得る官能基を有する側鎖（Ａ
′）及び非反応性で親水性を有する側鎖（Ｂ′）から実
質的になる側鎖を有するポリホスファゼンポリマーを製
造し、これを成形ないしは他の疎水性側」、好ましくは
実質的にトリフルオロエトキシ基からなる側鎖のポリホ
スファゼン成形体表面に塗布・偵層する方法、及び （２）あらかじめ、上記側Ｍ　（Ａ’　）及び（Ｂ′）
とは異なる側鎖を有するポリホスファゼンポリマーを製
造して所望の形態の成形物となした後、少なくともその
成形物の表層部に存在するポリホスファゼンの側鎖を、
前記生物学的活性物質と反応し得る官能基を有する側鎖
（Ａ′）及び７・″又は非反応性で親水性を有する側鎖
（Ｂ′）に変換せしめる方法、及び （３）上記１，２において、生物学的活性物質と反応し
得る官能基を有する側鎖（Ａ′）をあらかじめ過剰に導
入しておき（（側鎖（Ｂ′）は実質的に存在しなくても
よい：この場合は担体１に相当））、その側５１（Ａ’
）の一部を非反応性で親水性の側鎖（Ｂ′）に変換せし
める方法 である。

まず、（１）の方法においては、公知の方法によりポリ
ジクロロホスファゼンを得た後、生物学的活性物質と結
合できる官能基（さらに処理することによってかかる官
能基に変換し得る官能基の前駆体も含む）を有する側鎖
（Ａ′）となり得る有機化合物と、非反応性親水性側鎖
（Ｂ′）となり得る有機化合物とを、所望の割合でかつ
所望の順序で反応させればよい。この際の反応条件は特
に限定する必要はなく、導入する側鎖の種類によって適
宜選択すればよい。なお、導入された官能基が前記前駆
体の場合には、その前駆体の種類に応じて、公知の方法
により生物学的活性物質と結合し得る官能基に変換すれ
ばよい。

また、（２）の方法においては、前述と同様にポリジク
ロロホスファゼンを得た後、１級のアルコールまたはフ
ェノール類、例えばトリフルオロエタノールと反応させ
て成形性の良好なポリジアルコキシホスファゼンとなし
、これからフィルム、繊維、粒状等の成形物を得る。次
いで、該成形物の少なくとも表層部のポリホスファゼン
側鎖を、公知の方法により上記と同じ側鎖（Ａ′）及び
７／又は（Ｂ′）に転換する方法である。この場合にお
いても、その反応条件等は特に限定する必要がなく、用
いる有機化合物の種類に応じて適宜ｊｘ釈すればよい。

なお、本方法において、側鎖の置換を溶液中にて実施し
、その１換度を１００％としてもよく、この場合は（１
）の方法に分類されると同じものが得られる（側鎖（Ａ
′）及び（Ｂ′）の種類によっては、ポリジクロルホス
ファゼンから直接製造することが困難な場合があり、そ
のような場合に適した方法である〉。

また、方法（３）においては、上述の（１）、　＋２）
において導入した生物学的活性物質と結合可能な官能基
を、さらに親水性有機化合物と反応せしめる方法で（ｌ
る。なお、ここでいう親水性有機化合物とは、前述の親
水性側鎖を生ずるものならば何でもよいが、分子内に生
物学的活性物質と結合可能な官能基と反応する官能基を
有し、かつ水酸基及び、／′又はエチレンオキシ単位を
含んでいることが好ましい。例えば、生物学的活性物質
と結合可能な官能基がアルデヒド基、水酸基を臭化シア
ンで活性化したもの、アミノ基を臭化シアンで活性化し
たものあるいは芳香族アミン基をジアゾ化したものであ
る場合には、モノエタノールアミン、トリスヒドロキシ
メチルアミノメタン、２−アミノエトキシエタノール等
が好ましく用いられ、中でもモノエタノールアミンが特
に好ましい。

該官能基がカルボキシ基の場合には、カルボジイミド類
等の脱水剤を併用した、あるいはあらかじめカルボキシ
ル基の活性エステル化を行った後、モノエタノールアミ
ン、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、２−アミン
エトキシエタノール等を反応させるのが好ましい。なお
、この場合においてもモノエタノールアミンが特に好ま
しい。

生物学的活性物質を結合可能な官能基を有する側鎖の一
部を親水性を有する側鎖に転換せしめる方法としては、
該官能基と反応して水酸基及び７／又はエチレンオキシ
単位を新たに生成するような方法でもよい。かかる方法
としては、例えば、該官能基がアミノ基の場合には、ホ
ルムアルデヒドで一部をヒドロキシメチル化する方法も
しくはエポキシ化合物と反応せしめる方法が好ましく、
該官能基がカルボキシ基またはアルデヒド基の場合には
、還元剤によりアルコールまで還元せしめる方法が好ま
しく用いられる。

以上に説明した方法において、生物学的活性物質と結合
可能な官能基を導入する具体例としては、例えば以下の
如くして行われる。

官能基がアミノ基の場合には、公知の方法でポリジクロ
ロホスファゼンを得な後、これとニトロアルコールのア
ルカリ金属塩とを溶媒中で反応せしめてまずボリン〈ニ
トロアルコキシ）ホスファゼンとし、次にニトロ基を公
知の方法で還元せしめてアミノ基となす方法、又は、ポ
リジクロロホスファゼンとトリフロロエタノールのアル
カリ金属塩よりポリビストリフロロエトキシホスファゼ
ンを得たのち、これとアミノアルコキシドとを反応せし
めて側鎖の交換を行ってアミノ基を有する側鎖を導入す
る方法等を例示することができる。

アミン基をさらにジアゾ化して用いる場合には、上記の
アミン基の導入の際、芳香族アミノ基を導入し、次いで
公知の方法によりジアゾ化すればよいし、アミン基を臭
化シアンなどで活性化して用いてもよい。

また、該官能基がアルデヒド基の場合には、上述の方法
によりアミン基を側鎖に有したポリホスファゼンを調製
した後、大過剰のグルタルアルデヒド等のジアルデヒド
で処理して、片側のアルデヒド基のみがアミノ基と結合
したものを得るか、あるいはアルデヒド基をアセタール
でまず保護しておいたものとポリジクロロホスファゼン
あるいはポリジアルコキシホスファゼンとを反応せしめ
た後、酸でアセタールを脱保護した後行る方法を例示す
ることができる。

また、該官能基がカルボキシ基の場合には、公知の方法
で得られるポリジクロロホスファゼンあるいはポリジア
ルコキシホスファゼンとヒドロキシカルボン酸のジアル
カリ金属塩とを反応させることにより、アルコキシ部分
が選択的に反応した側鎖にカルボキシ基を有するポリホ
スファゼンを得る方法を例示することができる。

このようにして導入されたカルボキシ基は、生物学的活
性物質と反応する前あらかじめ活性エステル化等の後処
理を行って、活性化しておいてもよい。

また、該官能基が水酸基の場合には、公知の方法で得ら
れるポリジクロロホスファゼンあるいはポリジアルコキ
シホスファゼンとジオールのモノアルカリ金属塩とを反
応せしめる方法が例示される。このようにして導入され
た水酸基は、通常そのままでは生物学的活性物質と反応
させることは困難なので、例えば、臭化シアンなどで活
性化した状態で生物学的活性物質の固定に倶される。

また、官能基がエポキシ基の場合には、ポリジクロロホ
スファゼンと、エポキシ基及び水酸基を有した化合物と
を、塩基存在下に低温で反応せしめるか、もしくは、ハ
ロヒドリン基を有する化合物をポリホスファゼンの側鎖
に導入した後、アルカリで処理して側鎖にエポキシ基を
導入する方法を例示することができる。

さらには、生物学的活性物質と反応する官能基以外の官
能基をポリホスファゼンの側鎖に導入した後、該官能基
と結合する官能基及び生物学的活性物質と反応し得る官
能基（保護したもの及び前駆体を含む）とを同時に有し
ている有機化合物で処理し、次いで必要により生物学的
活性物質と反応し得る官能基の前駆体に対し脱保護等の
処理を行うことによっても得ることができる。

以上の如くして得られるポリホスファゼンが水溶性を示
す場合には、側鎖の一部を架橋することにより水に不溶
性にすることができる。架橋は、生物学的活性物質と結
合できる官能基等を利用して二官能性試薬で行ってもよ
いし、特定の条件で相互の官能基が反応するような官能
基を側鎖に導入し２次いで特定の条件にすることにより
行ってもよい。また、あらかじめ二官能性試薬で原料の
ポリジクロロホスファゼンのクロロ基を反応せしめて最
初からポリホスファゼンを架橋しておいてもよい。

以上に説明した方法により得られる本発明で用いられる
担体の形状は、生物学的活性物質の固定化に使用し得る
形状であれば任意であるが、特に球状又は繊維状である
ことが望ましく、球状の場合には平均径が０．１ノ、ｚ
ｍ以上２ｃｍ以下の範囲が好ましい。一方繊維状の場合
には、φ０．１．ｃｚｍ〜１０００μｍのフィラメント
もしくはステープルファイバ状のものが好ましい。

以上に説明した本発明の生物学的活性物質固定体は、ア
フィニティクロマトグラフィー用として１重用した場合
には、不特定吸着が極めて低減されているため不純タン
パクによる汚染がなく、高純度の目的物質を容易に得る
ことができる。また、本発明で用いる担体は、従来アフ
ィニティクロマトグラフィーに多用されているアガロー
スやセルロース等の多糖類は炭水化物よりなっているの
で保存中カビが繁殖し易いといった問題があるのに比べ
て、極めて耐久性に富むといった利点をも有する。さら
には、生物学的活性物質と結合し得る官能基以外はすべ
て非反応性でかつ親水性の側鎖よりなっているため、生
物学的活性物質と目的物質との反応の活性度の低下が極
めて少なく、目的物質の分離効率が向上するといった利
点もある。

本発明の生物学的活性物質固定体は、さらに、固定化酵
素、診断薬としても応用することができ、この場合には
、酵素活性の低下が少ない、診断の感度が向上する、誤
った結果に導くことが減少するといった効果があり、極
めて有用なものである。

〈発明の効果〉 以上に詳述したように、本発明の生物学的活性物質（リ
ガンド）固定体は、リガンドが固定された側鎖以外は実
質的にすべての側鎖が非反応性でかつ親水性であるため
、非特異吸着等による余分なタンパク質を吸着すること
がなく、また、固定されたリガンドが立体構造変化を起
してその活性度を低下させることもない。

したがって、かかる固定体を特にアフィニテイクロマト
グラフィーに利用すると、極めて効率よく純度の高い目
的物質を得ることができる。

く実方組例〉 以下実施例により本発明をさらに詳しく説明−４−る。

実施例１ ２−（２−アミノエトキシ）エタノール１０５ｇと金属
ナトリウム２．０ｇよりナトリウムアルコラードを調製
する。

これにポリビスくトリフロロエトキシ）ホスファゼン繊
維１．２ｇ（単糸２０ｄｅ、５本合糸）を浸漬し、８０
℃で１５分間処理したところ、ポリホスファゼンの側鎖
の７６％が２−（２−アミノエトキシ）エトキシ基に置
換されたことが後処理により反応系中に遊離したトリフ
ロロエトキシド由来のトリフロロエタノールをガスクロ
マトグラフィーで測定することにより判った。また、赤
外吸収スペクトル（ＡＴＲ法）では、３５００〜３３０
０ｃｍ−’付近にアミ／基に由来する幅広いピークが見
られ、かつトリフロロエトキシ基に由来する吸収が消失
したことより、この繊維の表層部のポリホスファゼン側
鎖が実質的にすべて置換して第１級アミン基が導入され
たことが判った。なお、ここでいう表層部の厚さは、Ｋ
Ｈ２−５プリズムを使用して入射角４５°でＡＴＲ法に
より測定した時の光の進入厚さをいう。

このようにして得られたポリホスファゼン繊維を５００
　ｍｌの水で６回、１時間かけて水洗した後グルタルア
ルデヒド２５％水溶液２００　ｍｌ　＜ｐＨ６，５に調
整）に室温で３時間浸漬した。これを同様に水洗峻メタ
ノール１００　ｍｌで３回洗浄しな。

これに９０ｍＭモノエタノールアミンの０．１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７，６に調整）　１００　ｍｌの溶液に３
時間浸漬して全アルデヒド基の９０％を不活性化した。

この繊維を水洗したあと０，１Ｍリン酸緩衝液１００　
ｍｌで３回洗浄し、水をきってトリプシンインヒビター
３０ｍｇの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）　１０
０　ｍｌの溶液に０℃で３時間浸漬した。この浸漬前後
の溶液の波長２８Ｏｎ＋ｎにおける吸光度を測定するこ
とによりポリホスファゼン繊維に固定化されたトリプシ
ンインヒビターの量は２７．２ｍｇであった。これにシ
アン化ホウ水素ナトリウム５０ｍｇを添加してＯ′Ｃで
２時間放置後０．ＩＭリン酸緩衝液（ｐｔｌ　７．６）
　１００　ｍｌで３回、このポリホスファゼン繊維を洗
浄した。

このトリプシンインヒビターを２７．２ｍｇ固定したポ
リホスファゼン繊維をトリプシン３０ｍｇの０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，６）の溶液１θＯｍｌに０℃で１
時間浸漬しな後５０ｍ１の０℃の０．１Ｍリン酸緩衝液
（ｐ）Ｉ７．６）で１分ずつ３回洗浄した。

次にこの繊維を０℃の０．１　ＮＨＣｌａｑに浸漬して
吸着していたトリプシンを溶離した。このときの塩酸溶
液を中和した後に波長２８０ｎｍの吸光度を測定すると
溶離したトリプシンの量は１９．６Ｂであった。トリプ
シンを溶離させた後のポリホスファゼン繊維を、０．１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）　　と０．ＩＮＨＣＩａ
ｑで２回ずつ交互に洗浄した後、再び上記の操作を行っ
た。以下、同様に行ってトリプシンの溶離量の変化を測
定した結果を下表に示す。

比鮫例１ 実施例１と同様にして表面部のポリホスファゼンの側鎖
を２−（２−アミノエトキシ）エトキシ基に変換し、グ
ルタルアルデヒドで処理したもの企水洗、メタノールに
浸漬、０．１ＭリンＰｉ緩衝液による洗浄をして、水分
をきって、トリプシンインヒビター３０ｍｇの０．１Ｍ
リン酸緩衝液＜ｐｔｌ　？、６）　１００ｍ１の溶液に
０℃で３時間浸漬したところ２７．３ｍｇが固定された
。これにシアン化ホウ水素化ナトリウム５０ｍｇを添加
して０°Ｃで２時間放置した。これを洗浄後、実施例１
と同様にしてトリプシンの吸着溶離量を測定した結果を
次長に示す。

実施例２ 実施例１と同様にして得たポリビス２−　（２−アミノ
エトキシ）ホスファゼン繊維を、ホルムアルデヒド水溶
液（３０％）とグルタルアルデヒド水溶液（２５％）と
水とを１０／９０／１の体積比で混合し７た溶液２００
　ｍｌ中に、室温で１２時間浸漬した。

その後、この繊維を水５００　ｍｌで６回洗浄後メタノ
ール１００　ｍｌで３回洗浄し、０．１！１！リン酸緩
衝液（ｐＨ７，６）　１００　ｍｌで３回さらに洗浄し
た。これをプロティンＡ５ｍｇの０，１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，６１１０ｍ１の溶液に０℃で３時間浸漬した
ところ４．８ｍｇのプロティンＡを固定できた。

これに実施例１と同様にシアン化ホウ水素化ナトリウム
による還元、０，１Ｍリン・酸桜衝液（ｐｉ（７，６＞
による洗浄、９０ｍＭモノエタノールアミンの０．１Ｍ
すン酸緩衝液への浸漬、シアン化ホウ水素化ナトリウム
による還元、Ｏ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）によ
る洗浄等の後処理を施し、次いでうさぎの１ｇ０２０ｍ
ｇの０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）溶液２０ｍ１
を用いて実施例１と同様に吸着、洗浄、溶離、再生の操
作を行った。このときにプロティンＡに吸着できたＩｇ
Ｇは１８．４ｍｇであった。

実施例３ 実施例１と同様にして得たポリビス２−（２アミノエト
キシ〉ホスファゼン繊維をホルムアルデヒド水溶液（３
０％）とグルタルアルデヒド水溶液（２５％）と水とを
１０／９０／１の体積比で混合した溶液２００　ｍｌ中
に室温で１２時間浸漬した。

このようにして調製した担体繊維を、牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）２０ｍｇの２０ミリＭリン酸緩衝液＜ｐＨ７
，６）　２０ｍ１の溶液に浸漬したところ、１時間後肢
溶液の上ずみの２８０ｎｍの吸光度の減少量より該繊維
への牛血清アルブミンの固定量を求めると１８、５ｍｇ
であった。

これに９０＋ｎＭモノエタノールアミンの０．１Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，６に調整）　１００　ｍｌの溶液に
３時間浸漬して残在アルデヒドを封鎖し、生成したイミ
ン結合をシアン化ホウ水素化ナトリウムで還元した。

ＢＳＡで免疫したウサギ血清５０ｍ１を上記担体に負荷
して通常のアフィニティクロマトグラフィーの一連の吸
着、洗浄、溶＾笛、再生の操作を行った。

このとき溶離しな抗ＢＳＡ抗体は３４．７ｍｇであり電
気泳動で単一であった。

実施例４ 実施例１と同様にして表層部のポリホスファゼンの側鎖
を２−（２−アミノエトキシ）エトキシ基に変換し、グ
ルタルアルデヒドで処理したものを水洗メタノールに浸
漬、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，９）による洗浄をし
て水分をきってインベルターゼ３０ｍｇの２０ｍＭ酢酸
桜ｆｆｆ’ａ　（１）８４．９）　１００　ｍｌ）溶液
に０℃で３時間浸漬しなところ、２ｇ、　１ｍｇが固定
された。固定インベルターゼエは上ずみのインベルター
ゼの活性の減少１より求めた。

これを２０ｍＭ酢酸ｔａ　ＦＥ液（ｐ）１４．９１で洗
浄後１Ｍモノエタノールアミンの０．１Ｍリン酸１１　
ＰＲ液〈ｐＨ７，０に調整）の溶液１００　ｍｌにｏ’
ｃで３時間浸漬した後シアン化ホウ水素化ナトリウム７
０ｍｇを添加して０℃で２時間放置した。

これを２０ｍＭ酢酸桜ｍ液（ｐＨ４，９）で洗浄し０．
１Ｍショ糖溶液で酵素活性を測定したところ７００／ｍ
ｇであった。

比較例２ 実施例４と同様にインベルターゼを固定するが、モノエ
タノールアミン溶液に浸漬しなかった場合には、０．１
Ｍショ糖溶液で酵素活性を測定したところ、　２２ｔｌ
／ｍｇであり、酵素活性が著しく減少していた。

実施例５ 実施例１と同様にしてグルタルアルデヒド水溶液に浸漬
と水洗、メタノールによる洗浄まで施したポリホスファ
ゼン繊維に対し、９０ｍＭの下記有機化合物のＯ，１Ｍ
リン酸緩衝）夜（ｐＨ７，６に調整）１００ｍｌの溶液
に３時間浸漬して、全アルデヒド基の９０％を不活性化
した。

この繊維に実施例１と同様の後処理をし、トリプシンイ
ンヒビターを２５ｍｇ固定した。さらに、同様にシアン
化ホウ水素化ナトリウムを添加し、放１後洗浄した。こ
のトリプシンインヒビター２５ｍｇを固定したポリホス
ファゼン繊維を、トリプシン３０ｍｇを溶解したウサギ
血清１００　ｍｌに０℃で１時間浸漬したｆ＆　５０　
ｍｌのｏ’ｃのＯ，１Ｍリン酸緩衝液（ｐｔ１７．６）
で１分ずつ３回洗浄した。

次にこの繊維を０℃の０．１ＮＨＣ１ａｑに浸漬して吸
着していたタンパクを溶離した。

このときの塩酸溶液を中和した紙に、波長２８０ｎｍの
トリプシンの検量線より求められるタンパク量と、酵素
活性より求められるトリプシンの量の両方の差が、酵素
活性より求められるトリプシン量の１　、＝’　Ｉ　０
００未満のときにタンパクの非特異吸着がないと判断し
た。

実施例６ 実施例２と同様にして得たポリホスファゼン繊維に対し
トリプシンインヒビターを２５ｍｇ固定した。

これを実施例５と同様にしてポリホスファゼン繊維への
タンパクの非特異吸着を測定したところタンパクの非特
異吸着は全く見られなかった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリホスファゼンポリマーから構成される生物学
   的活性物質固定体であって、該固定体の少なくとも表層
   部のポリホスファゼンポリマーの側鎖は、その少なくと
   も一部の側鎖に生物学的活性物質が結合固定されかつ残
   りの側鎖は非反応性であって親水性を有する有機基から
   実質的になることを特徴とする生物学的活性物質固定体
   。
2. （２）ポリホスファゼンポリマーから構成される生物学
   的活性物質固定用担体であって、該担体の少なくとも表
   層部のポリホスファゼンポリマーの側鎖は、生物学的活
   性物質と結合可能な官能基を有する有機基及び非反応性
   であって親水性を有する有機基から実質的になることを
   特徴とする生物学的活性物質固定用担体。
3. （３）請求項２に記載の生物学的活性物質固定用担体、
   もしくは、ポリホスファゼン成形物からなりその少なく
   とも表層部のポリホスファゼンポリマーの側鎖が、生物
   学的活性物質と結合可能な官能基を有する有機基から実
   質的になる生物学的活性物質固定用担体に、生物学的活
   性物質を反応結合せしめた後、前記官能基のうち生物学
   的活性物質と未反応の官能基を処理して、該官能基を有
   する側鎖を非反応性であってかつ親水性を有する側鎖に
   転換せしめることを特徴とする生物学的活性物質固定体
   の製造方法。
4. （４）生体物質混合物より目的とする物質を分離精製す
   るにあたり、該目的物質と特異的親和性を有する生物学
   的活性物質が固定された請求項１の生物学的活性物質固
   定体を用いることを特徴とする生体物質の分離精製方法
   。