JP2008530347A - 免疫刺激性ポリホスファゼン化合物 - Google Patents

Abstract

免疫調節活性を持つポリホスファゼンポリマー、および抗原または免疫原と関係するこの種のポリホスファゼンポリマーの生物医学的使用について開示する。

Description

本出願は、免疫調節活性を持つポリホスファゼンポリマー、および抗原または免疫原と関係するこの種のポリホスファゼンポリマーの生物医学的使用に関する。

多種多様な抗原が動物において抗体の生産を促進し、それにより感染に対する保護を付与する。しかしながら、いくつかの抗原は効果的な免疫応答治療を刺激することができない。

比較的弱い抗原の免疫原性は、抗原とともにアジュバントを同時に投与することによりしばしば促進される。このアジュバントは単体で投与しても免疫原性を示さないが、抗原と組み合わせると全身性、体液性、および／または粘膜性の免疫状態を誘導する。鉱油エマルジョンまたは水酸化アルミニウムなどのようなアジュバントは徐々に抗原を放出する注射部位において抗原貯蔵所を形成すると伝統的に考えられてきた。残念なことに、完全フロイントアジュバントのような免疫アジュバントの多くは有毒であり、したがって、動物を調査する上でのみ有効であるが、人間の予防接種に関しては役立たない。完全フロイントアジュバントは界面活性剤を含む鉱油の中で、熱により死滅したヒト型結核菌の浮遊物を含んでおり、動物の免疫箇所において肉芽腫性病変を生じる。フロイントアジュバントはまた、ワクチンを接種したものに結核の陽性反応を生じることができる。

何種類かの合成ポリマーは、抗原と結び合わされると免疫刺激性を付与することが分かっている。例えば、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、アクリル酸およびＮ−ビニルピロリドン共重合体（ＣＰ−ＡＡＶＰＤ）、ポリ−２−メチル−５−ビニルピリジン（ＰＭＶＰ）、ポリ−４−ビニルＮ−エチルピリジニウムブロム剤（ＰＶＰ−Ｒ_２）、およびその他の同様の化合物のアジュバント活性が、抗原に接合されたときにどうなるかの研究が行われてきた（Ｖ．Ａ．カバノフ、「合成高分子電解質からポリマーへ−サブユニットワクチン」、ピュア・アプライド・ケミストリー、２００４、７６、９、１６５９−１６７７）。しかしながら、これらのポリマーは効果的な免疫応答を引き出すために、抗原をポリマーに共有結合させる必要があり、このことは製造上および制御上の課題をもたらすことになる。加えて、これらのポリマーの大多数が毒性および生物分解性を有することはこれまで研究されておらず、またこれらのポリマーをアジュバントとしてヒトに応用して使用することを妨げる可能性がある。

ポリ［ジ（カルボキシルアトフェノキシ）ホスファゼン）］（ＰＣＰＰ）、ポリホスファゼンポリマーは、効果的な免疫反応を引き出すために抗原をポリマーに共有結合させる必要のない免疫アジュバントとして記述されている（Ｌ．Ｇ．ペイン、Ｓ．Ａ．ジェンキンズ、Ａ．Ｌ．ウッズ、Ｅ．Ｍ．グランド、Ｗ．Ｅ．ゲリボ、Ｊ．Ｒ．レベレンツ、Ａ．Ｋ．アンドリアノフ、Ｂ．Ｅ．ロバーツ。ポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン）］（ＰＣＰＰ）はインフルエンザワクチンのための強力な免疫アジュバント；ワクチン１６、９２−９８（１９９８））。しかしながら、ＰＣＰＰより強力な免疫アジュバントが必要とされている。

非抗原性もしくは弱抗原性の分子への免疫応答を刺激する能力を有する非毒性アジュバントまたは担体は、ワクチンの開発および投与において長い間求められていた必要性を満たすものとなろう。

本発明はアジュバントとして使用可能で、かつ免疫アジュバント活性においてＰＣＰＰより優れているポリホスファゼンを提示する。

ポリホスファゼンはリンおよび窒素原子を交互に含むバックボーンを持つポリマーであり、リンおよび窒素原子は一重および二重の結合を交互にすることで切り離されている。それぞれのリン原子は２つのペンダント基（Ａ）に共有結合により結合されている。

ポリホスファゼンの反復ユニットは以下の化学式を持つ：

ここで、それぞれのＡは同じ場合も異なる場合もあり、またその単位はｎ回繰り返される。

ポリホスファゼンが、そのバックボーンに繰り返し結合されるペンダント基もしくは側鎖の１種類だけを持つ場合、そのポリマーはホモポリマーと呼ばれる。ポリホスファゼンが１種類以上のペンダント基を持ち、またそれらの基がポリマーの全体に渡りランダムに変化する場合は、そのポリホスファゼンはランダム共重合体である。リンは同じ２つの基に、または２つの異なった基に結合され得る。

ポリホスファゼンは、高分子前駆体であるポリ（ジクロロホスファゼン）を、アルコール、アミンまたはチオールなどのような望ましい求核試薬と反応させることにより生成することができる。２またはそれ以上の種類のペンダント基を持つポリホスファゼンは、ポリ（ジクロロホスファゼン）を望ましい比率で、２またはそれ以上の種類の求核試薬と反応させることにより生成することができる。求核試薬は同時に、または連続した順番で反応混合物に加えることができる。ポリホスファゼン中の、結果として生じるペンダント基の比率は多くの要因に左右されるが、例えば、ポリマーを生成するために使用する出発物質の割合、添加の順番、求核置換反応が行われる際の温度、使用される溶解のシステムなどの要因が含まれる。結果として生じるポリマー内の基の正確な置換パターンを決定することは非常に困難な反面、ポリマー内の基の比率は通常の知識を有するもの者であれば容易に決定することができる。

本発明のポリマーは、最初に反応する高分子前駆体、すなわちポリ（ジクロロホスファゼン）を生成することによって生成することができる。その後、このペンダント基は主バックボーン上の反応する塩素原子および適当な有機化合物とを反応させることによりポリマーのバックボーン上へ置換される。例えば、水酸基およびエステル基を含む有機化合物は、ポリマーのバックボーン上にある反応する塩素原子と反応することができる。有機化合物の単体または混合物は、それぞれ、反応してホモポリマーまたは混合された置換共重合体とするために使用することができる。有機化合物の水酸基は、この分野で周知の方法により、ナトリウム、水素化ナトリウムまたは水酸化ナトリウムによって活性化することができ、さらにこの後、ポリホスファゼンのバックボーンに結合した塩素原子と反応することができる。これらの反応が完了した後、ペンダント基のエステル機能性は加水分解されて、カルボン酸機能性を生じることができる。全てのエステル機能性は酸性基は完全に転換させるために加水分解することができ、あるいは、必要に応じてこの反応を、結果として酸およびエステル機能性を含む混合された置換共重合体に変化させる前に止めることができる。ポリマーはその後、望ましい濃度で水溶液に溶かすことができる。酸性基はまた、必要であれば可溶性を向上し、または望ましいポリマーの形態および物理化学的な特徴を獲得するため、ナトリウムまたはカリウム等の塩の形に変換することができる。

このように、一つの見地において、本発明は次の化学式の繰り返しユニットを含むポリホスファゼンポリマーを提示するものである。

ポリマーのそれぞれの単量体ユニットにおいて、それぞれのＲは同じかまたは異なっており、およびここでポリマーの単量体の単位の少なくとも一部において、Ｒ基の１つまたはそれ以上はＷであり、

Ｗは、

であり、

であり、Ｃ、Ｃ’、またはＣ”の少なくとも１つは−ＣＯＯＨを含む。ｄ、ｆ、ｆ’、ｆ”のそれぞれは０から３である。また、ｅ、ｅ’、ｇ、ｇ’、ｇ”のそれぞれは０から１である。

そして、もしもｆ＝０で、そのようなＣ＝−−ＣＯＯＨの場合、Ｃ’、Ｃ”、Ｙ、またはＹ’の少なくとも１つは水素以外のものである。またはＸは−Ｏ−、−ＮＨ−、または−Ｓ−以外のものである。ｄ＋ｅ＋ｅ’＋ｆ’＋ｆ”＋ｇ’＋ｇ”の総計は１ないし８である。カルボン酸基はイオン化された、あるいは非イオン化された形態のどちらをも取り得る。

上記および下記のポリホスファゼンポリマーの全体分子量は５，０００ｇ／ｍｏｌ．から１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ．であることは本発明の一つの見地である。ポリホスファゼンポリマーが上記および下記の、免疫刺激性のカルボン酸を含有する基を有するモノマー単位の最小限の数を含むことは、本発明の更なる見地である。上記および下記の単量体単位のいくつが免疫刺激性のポリホスファゼンポリマーに結果としてなるかについて決定するための本開示に関連して考察する場合、これはこの分野で普及している通常の技術の範囲内であるが、ポリホスファゼンポリマーが上記のカルボン酸を含む単量体の少なくとも１０を含むということは本発明の一つの見地である。

残留するＲ基（上記のような免疫刺激性のカルボン酸基を含むもの以外の基）は、多種多様な置換基の１つもしくはそれ以上である可能性がある。代表例として、そのような基の限定されない例は以下のとおりである：
脂肪族化合物；アリール；アラルキル；アルカリル；カルボン酸；複素環式芳香族化合物；グルコースを含む炭水化物；ヘテロアルキル；ハロゲン；アルキルアミノを含む脂肪族アミノ；ヘテロアラルキル；ジアルキルアミノ、アリルアミノ、ジアリルアミノ、アルキルアリルアミノを含む２価（脂肪族）アミノ；必ずしもそれに限定されないが、オキシフェニルＣＯ_２Ｈ、オキシフェニルＳＯ_３Ｈ、オキシフェニルヒドロキシル、およびオキシフェニルＰＯ_３Ｈを含むオキシアリル；オキシアルキル、オキシ（脂肪族）ＣＯ_３Ｈ、オキシ脂肪族ＳＯ_３Ｈ、オキシ（脂肪族）ＰＯ_３Ｈを含むオキシ脂肪族、およびオキシ（アルキル）ヒドロキシルを含むオキシ（脂肪族）ヒドロキシル；オキシアルカリル；オキシアラルキル；チオアリル；チオアルキルを含むチオ脂肪族；チオアルカリル；チオアラルキル；−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（アリールまたは脂肪族）；−−Ｏ−−［（ＣＨ_３）ｘＯ］ｙ−−ＣＨ_２）−−Ｏ−−［（ＣＨ_２）ｘＯ］ｙ（ＣＨ_２）ｘＮＨ（ＣＨ_２）ｘＳＯ_３Ｈ；および、−−Ｏ−−（ＣＨ_２）ｘＯ］ｙ−（アリールまたは脂肪族）；ここで、ｘは１−８であり、ｙは１から２０の整数である。これらの基は、例えば酸素、硫黄、窒素または炭素原子を通してリン原子に結合することができる。

さらにもう一つの見地において、本発明は以下の化学式の反復単位を含むポリホスファゼンポリマーを提供する：

ここで、前記ポリマーの各々の単量体単位において、各々のＲは同じ、もしくは異なっており、およびここで、ポリマーの単量体単位の少なくとも一部分においては、Ｒ基の１つもしくはそれ以上は、

であり、ここで、

であり、ｄは０から１５である。

上記および下記のポリホスファゼンポリマーの全体分子量は５，０００ｇ／ｍｏｌ．から１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ．であることは本発明の一つの見地である。ポリホスファゼンポリマーが上記および下記の、免疫刺激性のカルボン酸を含有する基を有するモノマー単位の最小限の数を含むことは、本発明の更なる見地である。上記および下記の単量体単位のいくつが免疫刺激性のポリホスファゼンポリマーに結果としてなるかについて決定するための本開示に関連して考察する場合、これはこの分野で普及している通常の技術の範囲内であるが、ポリホスファゼンポリマーが上記のカルボン酸を含む単量体の少なくとも１０を含むということは本発明の一つの見地である。

残留するＲ基（上記のような免疫刺激性のカルボン酸基を含むもの以外の基）は、多種多様な置換基の１つもしくはそれ以上である可能性がある。代表例として、この種の基の限定されない例は以下のとおりである：
脂肪族化合物；アリール；アラルキル；アルカリル；カルボン酸；複素環式芳香族化合物；グルコースを含む炭水化物；ヘテロアルキル；ハロゲン；アルキルアミノを含む脂肪族アミノ；ヘテロアラルキル；ジアルキルアミノ、アリルアミノ、ジアリルアミノ、アルキルアリルアミノを含む２価（脂肪族）アミノ；必ずしもそれに限定されないが、オキシフェニルＣＯ_２Ｈ、オキシフェニルＳＯ_３Ｈ、オキシフェニルヒドロキシル、およびオキシフェニルＰＯ_３Ｈを含むオキシアリル；オキシアルキル、オキシ（脂肪族）ＣＯ_２Ｈ、オキシ脂肪族ＳＯ_３Ｈ、オキシ（脂肪族）ＰＯ_３Ｈを含むオキシ脂肪族、およびオキシ（アルキル）ヒドロキシルを含むオキシ（脂肪族）ヒドロキシル；オキシアルカリル；オキシアラルキル；チオアリル；チオアルキルを含むチオ脂肪族；チオアルカリル；チオアラルキル；−−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−（アリールまたは脂肪族）；−−Ｏ−−［（ＣＨ_２）ｘＯ］ｙ−−ＣＨ_２）−−Ｏ−−［（ＣＨ_２）ｘＯ］ｙ（ＣＨ_２）ｘＮＨ（ＣＨ_２）ｘＳＯ_３Ｈ；および、−−Ｏ−−（ＣＨ_２）ｘＯ］ｙ−（アリールまたは脂肪族）；ここで、ｘは１−８であり、ｙは１から２０の整数である。これらの基は、例えば酸素、硫黄、窒素または炭素原子を通してリン原子に結合することができる。

免疫アジュバントとして特に望ましいポリホスファゼンの２つの例は以下のとおりである。

図１に示すように、これらの合成物のいずれとも、ポリ［ジ（カルボキルアトフェノキシ）ホスファゼン）］（ＰＣＰＰ）と比較して著しく良好なアジュバント活性を呈した。

本発明の望ましいポリホスファゼンは、一般的には１０，０００，０００ｇ／ｍｏｌ．を上回らないが、少なくとも５，０００ｇ／ｍｏｌ．の分子量を有する。

本発明のポリホスファゼンは１種類の側基を持つホモポリマー、もしくは２個以上の種類の側基を有する混合置換基共重合体となり得る。混合置換基共重合体において、カルボン酸機能性を含む側基の少なくとも１種類、およびカルボン酸機能性を含まない側基の１種類がある。カルボン酸機能性を含まない側基は、ポリマーの物理的もしくは物理化学的な特性を調節するためにポリホスファゼン共重合体に導入することができる。そのような側基は、例えば、水溶性を改善するため、生物分解性を調節するため、疎水性を増加させるため、またはポリマーの連鎖柔軟性を変えるために使用することができる。側基を調節する物理的もしくは物理化学的な特性を有するこの種の非カルボン酸機能性の限定されない例としては、フェノキシ、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲンおよびメトキシエトキシエトキシなどをあげることができよう。特に免疫アジュバントとして望ましい共重合体の例は、以下のような単量体ユニットを含むポリマーである：

ここで、ａは０．１および１．９の間にあり、ｂは１．９および０．１の間であり、またａ＋ｂ＝２である。

本発明のポリホスファゼンは、ヒトもしくは動物に投与される場合、望ましくは生物分解性であるポリマーである。ポリマーの生物分解性は、体の遠位部位（例えば脾臓）において、最終的にポリマー分子が分解し、また蓄積するのを防止する。本願明細書において使われているように、生物分解可性という用語は、望ましい適用において受け入れられる期間内、典型的には５年未満で、望ましくはおよそ１年以内に分解するポリマーを意味している。

免疫アジュバントとして使用されるポリホスファゼンは、架橋することができる。例えば、イオンによって架橋されたポリホスファゼンは、ポリホスファゼンポリマーを多価金属陽イオン、例えば亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムまたは従来の技術で周知の他の多価金属陽イオン、または、前記以外の多価有機陽イオン（例えばスペルミン、スペルミジン、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（ビニルアミン）または従来の技術で周知の他の多価有機陽イオンと結合することにより生成され得る。

本発明のポリマーは抗原との組合せにより使用することができる。前記抗原は、それに対して免疫応答が必要とされる多種多様な抗原のいずれか一つであってもよい。抗原と混合することにより、ポリマーは非共有結合複合体を形成することができる。この種の複合体は水溶性、もしくはマイクロゲル、または極小球体を含むその他の微粒子の形態を取ることができる。複合体は、１つのポリホスファゼン分子および多数の抗原分子、または１つの抗原分子および多数のポリホスファゼンおよび抗原の両方の多数の分子を含むことができる。そのような複合体は対応する免疫性が有能な細胞に抗原を提供し、または延長された期間に渡り抗原を放出する能力を有する。免疫応答は体液性、粘膜性、および／または、細胞媒介性のものでもよい。

抗原と併用するポリマーは、所望の免疫応答を提供するための有効な量で使用される。

前記免疫原性組成物は、免疫応答を引き出す従来の技術の分野で通常の知識を有する者にとっては既知のいずれの方法によってもワクチンとして投与することができる。これらには、非経口、経口、膜透過、または粘膜透過の投与を含む。このワクチンは、望ましくは非経口的（静脈内、筋肉内、皮下）に投与される。粘膜表層への伝送ルートの非制限的な例は、鼻腔内（または一般的に、鼻に関連するリンパ組織）、経口、呼吸系、膣および直腸である。

免疫原性組成物は、投与前にポリマーアジュバントを抗原と混合もしくは共役させることにより調整される。あるいは、ポリマーと抗原は同一の部位に別々に投与することができる。

本発明のポリマーアジュバントは、好ましくは生理的ｐＨで水に可溶である、すなわち少なくとも０．０００１％（ｗ／ｗ）の可溶性を持つポリホスファゼンである。

本発明のアジュバントと共に使用される抗原は、細胞、細菌またはウイルス粒子、または、それの部分から分離することができる。抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質またはそれらの組合せであって、ヒト、動物、例えば哺乳類、鳥類または魚類などに免疫応答を誘発するものである。免疫応答は体液性、粘膜性または細胞媒介性のものとなりうる。免疫応答が目指す材料が十分に抗原性でない所では、この種の材料は標準の共有結合により結合する技術を使用して、アルブミンなどの担体、もしくはハプテンに接合させることができる。この種の共役は従来の技術で周知の市販の試薬キットで達成することができる。

１つの実施例において、ポリマーは核酸が表現される粘膜表層に対する抗原をコード化する核酸を届けるために用いられる。

ポリホスファゼン複合体、ヒドロゲル、微小粒子またはマイクロスフィアに含まれることができる抗原の限定されない例としては、インフルエンザタンパク質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質、ヘルペスウイルス・タンパク質およびＡ型・Ｂ型の肝炎タンパク質などのウイルスタンパク質をあげることができる。追加的な例としては、ロタウイルス、はしか、耳下腺炎、風疹およびポリオ、または、グラム陰性菌細胞壁のような細菌タンパク質およびリポ多糖類に由来する抗原がある。さらに、抗原はまた、インフルエンザ菌、破傷風菌、ジフテリア菌および淋菌などの有機物に由来する可能性がある。

免疫原性組成物またはワクチンは、ポリマーアジュバントを抗原と結合することによって調整される。ポリマーの１つの部分に、抗原のおよそ０．０００１−５の部分が添加されるが、これはポリマーと抗原の溶液を、望ましくはおよそ２５℃で１０分以上の間、溶液または懸濁液の状態が得られるまで、望ましくはポリマーおよび抗原の溶液を撹拌することによりポリマーの一部に添加される。ポリマーは、望ましくはアジュバントの全体に渡って一様に抗原を分散させる方法を使用して抗原と結合される。ポリマーを液化する方法は、水のベースの溶媒（望ましくは７．１および７．７の間でｐＨ範囲を有するもの）のポリマーを溶かすこと、またはポリマーを溶解させることを含む。ポリマーを溶解させる方法は、抗原がポリマーを融解させる温度で安定している場合にだけ役立つことができる。抗原は、それからポリマーと混ぜ合わせられる。ポリマーと抗原が固体の状態であって、例えば、抗原が凍結乾燥される場合、例えば、圧縮形成によって物理的に混ぜ合わせることができる。ポリマーはまた抗原を封入するために用いることができるが、それは例えばコーエンその他に許可された米国特許番号第５，１４９，５４３号、または、アンドリアノフその他に出された米国特許番号第５，８０７，７５７号の方法を使用するもので、それらの教示はここに参照として、またはポリマーおよび抗原の溶液の噴霧乾燥により組み込まれている。選択肢として、抗原およびアジュバントを含むミクロスフェアは、アンドリアノフその他に出された米国特許番号第５，５００，１６１号に記載されているように、単に構成要素を水溶液に加えて、そのあと、微粒子を形成する物理的力によって物質と共にポリマーを凝固させることによって、生成することができる。この微小粒子は、もし必要または望ましいのであれば、生物的物質を封じ込めるポリマー・マトリックスを形成するために電解質、ｐＨ変化、有機溶媒、熱、または凍結を使用して安定化させることができる。

本発明の望ましいポリマーは、生理的に緩衝された食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に可溶である。

免疫原性ワクチン組成物は水、食塩水および、または界面活性剤のような他の生理的許容成分を含むことができることは、従来の技術分野で通常の知識を有する者には理解可能であろう。ポリマーは他のアジュバントと結合することができる。

本発明のポリマーは両親媒性化合物と結合することができる。両親媒性化合物は、水溶性ポリマーが存在しない条件下ではアジュバントとして機能することもしないこともありうる。

この分野において知られている両親媒性化合物という用語は、当該化合物が疎水性および親水性部分の両方を含むことを意味する。本発明のアジュバントを生成するのに適している両親媒性化合物の限定されない例としては以下のものを列挙することができよう；
ジミリストイル・ホスファチジルコリン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン、Ｎ−（２−デオキシ−２−Ｌ−ロイシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシル）−Ｎ−オクタデシドデカノイルアミド・ヒドロ酢酸、ジミリストイル・ホスファチジルグリセロール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−グリセロールジパルミチン酸塩、三オレイン酸ソルビタン、デオキシコール酸ナトリウム塩、リン酸ジセチル、モノ−パルミトイル−ｒａｃ−グリセロール、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌａ−Ｄ−イソＧｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシ・プロピルアミド、オクタデシル・チロシン塩酸塩、Ｄ−ムラパルミチン、３−Ｏ−デスアシル−４’−モノホスホリル脂質Ａ、ｍａｎｎｉｄｅ ｏｌｅａｔｅ、１ａ，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３、ホスファチジン酸、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴシン（Ｄ−４−スフィンゲニン、セラミデ、スフィンゴミエリン、ガラクシトシルセラミド、ＧＭ_２（ガングリオシド）、オレイン酸、パルミチン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、べヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸などを含む脂肪酸塩。

一つの見地において、アジュバントは室温で、水溶性ポリマーおよび両親媒性化合物を混合することによって生成することができる。その後、抗原をそのアジュバントの組合せに加える。あるいは、抗原を最初にアジュバント構成要素のうちの１つと混ぜ合わせ、次に、第２のアジュバント構成要素を加える。本発明の免疫原性構成は望ましくは投与の前に水溶性ポリマーを抗原と混合もしくは共役させることにより生成される。水溶性のポリマーと抗原の組合せは、それから免疫原性組成物を形成するために両親媒性化合物と結合される。

本発明の一見地において、ポリホスファゼンは疾病の治療または予防に使用されるワクチンを構成するために使用されることができる。

以下の実施例によって示されるように、投薬量は、抗原の負荷およびポリマー抗原投与によって引き出される抗体の力価に基づいて、それぞれの抗原に対する投与の量およびスケジュールを決定することの標準の技術によって決定される。

望ましい実施例においてポリマー抗原混合物は同時に投与されるが、一方、別の実施例においては、ポリマーおよび抗原は、同一のまたは近くの部位に別々に投与される。

ポリホスファゼンアジュバントおよびその合成の方法は、以下の限定されない実施例を参照することでよりよく理解されるであろう。

［実施例１］
ポリ｛ジ［４−（２−カルボキシエチル）フェノキシ］ホスファゼン｝の合成。

窒素雰囲気において、３−（４−ヒドロキシルフェニル）プロピオン酸メチル（２５ｇ；０．１３９モル）をジエチレングリコールジメチルエーテル、ジグライム（０．４５Ｌ）の中で溶かした。６５％の水素化ナトリウム（０．０４２モル）の１．５５ｇを、１０分間に渡り混合液に加えた。結果として生じた混合物にポリジクロロホスファゼン（１．２５ｇ；０．０４２モル）を、撹拌しながら、１１０℃で窒素雰囲気の下でゆっくりと注射器により加えた。反応物は１１０℃で３時間撹拌され、それから８５℃に冷却した。この混合物に１２．７のＮ水酸化カリウムの０．１Ｌを加えた。反応物は８５℃で１時間撹拌され、その後、周囲温度に冷やされた。

反応混合は、大きい分離漏斗に転送された。ポリマーを含む水の層は、取り除かれて、集められた。脱イオン化された水、０．５Ｌを有機層に加え、振動させ、そして水の位相が分離され、集められた。この手順を２度繰り返した。

水溶液はこの後、４Ｎ塩化水素酸によってｐＨ２に酸性化された。沈殿物は集められてから０．４Ｌの０．５Ｎの水酸化カリウムに溶解させた。溶解にあたって、ｐＨは塩化水素酸を添加することによりｐＨ９−１０．５に調整された。

ポリマーは、それからバイオキャド・ワークステーションを使用して、サイズ除外クロマトグラフィによって精製された。ポリマー断片は集められた後、ｐＨが２に達するまで、０．５Ｎ塩化水素酸を添加することにより沈殿させた。沈殿物を濾過し、リンス液が中性になるまで水によりすすぎ、その後、真空中において乾燥させた。生成量は３ｇであった。

［実施例２−１２］
ポリマーは、実施例１で説明したとおりに合成された。ポリマー構造、試薬、試薬の量および反応状況を表１に示す。

＊油中の水素化ナトリウムの６５％懸濁液が使われた。試薬の量は懸濁液についてはｇ（グラム）で、および水素化ナトリウムについてはｍｍｏｌｅ（ミリモル）で表わす。

［実施例１３］
実施例１（ポリマー１）および実施例２（ポリマー２）で説明したように合成されたポリマーを、Ｂ型肝炎表面抗原−ＨＢｓＡｇ（バイオデザイン・インターナショナル製）に対する免疫応答（アジュバント活性）を促進する能力を測るため、ｉｎ ｖｉｖｏで評価した。ここではＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した（グループにつき５匹のマウス）。溶液（最終容量、１００μｌ）中において５０μｇのポリマーと混合した１μｇのＨＢｓＡｇを各々のマウスに注入した。抗原だけを含む処方、５０μｇのＰＣＰＰにより処方された抗原およびアルミニウムアジュバントにより処方された抗原を対照として使用した。マウスは、一回の筋内注射により免疫化した。血液サンプルは、免疫化後１６週で集められ、また血清は分析まで貯蔵された。

マウス血清中の抗原特異的抗体（ＩｇＧ）は、炭酸ナトリウムバッファ（ｐＨ９．６）中においてＨＢｓＡｇで被覆された９６−ｗｅｌｌのイミュノロンＩＩプレート中の酵素免疫測定法により測定した。このプレートは、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ＰＢＳＴ）を含むリン酸緩衝生理食塩水により６回洗浄した。０．５％のゼラチンを含むＰＢＳＴ中の血清の二倍の連続希薄液が孔に入れられて、その後プレートは周囲温度で２時間培養された。結合を解かれた血清は、ＰＢＳＴによりプレート６回洗浄することにより除去した。ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（カルタグ・ラボラトリーズ）を加えた後、プレートを周囲温度で１時間培養した。プレートはＰＢＳＴにより６回洗浄し、その後、アルカリホスファターゼと共役させたストレプトアビジン（バイオキャン・サイエンティフィック）を添加した後、プレートを周囲温度で１時間培養した。結合していない共役は、脱イオン化された水により８回洗浄することにより取り除かれ、また、血清の抗体が１％のジエタノールアミン−０．５ｍＭの塩化マグネシウム・バッファ（ｐＨ９．８）中のｐ−ニトロフェニルリン酸塩ジトリス塩１ｍｇ／ｍＬを加えることにより検出された。この反応は１５分間進行させたが、その後、吸光度がベンチマーク（登録商標）マイクロプレート・リーダー（カリフォルニア州ハーキュリーズ、バイオ・ラド・ラボラトリーズ社）を使用して４０５ナノメートルで測定された。エンドポイント（評価項目）力価は、同一の希釈、プラス３回の標準偏差で抗体にネガティブなサンプルのそれと同一の信号を生成する最も高いサンプル希釈と相反するものであった。一群のマウスの平均抗体力価は、幾何平均滴定濃度（ＧＭＴ）として表される。

結果を図１に示す。ポリマー１およびポリマー２の両方ともに、ＰＣＰＰおよびアルミニウムアジュバントよりかなり高いアジュバント活性を示した。

［実施例１４］
ポリマー１および２は実施例１３で説明したのと同様にマウスにおいて評価した。ただし、実施例１３と違い、５μｇのＸ−３１インフルエンザ（チャールズ・リバー研究所製）をＨＢｓＡｇの代わりに使用した。

結果を図２に示す。ポリマー１およびポリマー２は、ＰＣＰＰおよびアルミニウムアジュバントよりかなり高いアジュバント活性を示した。

ポリマー１およびポリマー２で処方したＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原）によりマウスを免疫化した後の血清ＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）力価を表す。ＨＢｓＡｇ、ＰＣＰＰにより処方したＨＢｓＡｇ、およびアルミニウムアジュバントにより処方したＨＢｓＡｇを対照として使用した（グループ当り５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス；マウス当り１μｇのＨＢｓＡｇ；マウス当り５０μｇのポリマー；筋内注射１回投与量；１６週のデータ）。 ポリマー１およびポリマー２で処方したＸ−３１インフルエンザによりマウスを免疫化した後の血清ＩｇＧ力価を表す。Ｘ−３１、ＰＣＰＰにより処方したＸ−３１およびアルミニウムアジュバントにより処方したＸ−３１を対照として使用した（グループ当り５匹のＢＡＬＢ／ｃマウス；マウス当り５μｇのＸ−３１；マウス当り５０μｇのポリマー；筋内注射１回投与量；１６週のデータ）。

Claims (27)

1. 以下の単位から成るポリホスファゼンポリマー：
   

   

   であって、ここで、少なくとも１つのＲは次の化学式：
   

   

   を有し、
   

   

   であり、Ｃ、Ｃ’、またはＣ”の少なくとも１つは−ＣＯＯＨを含み，ｄ、ｆ、ｆ’、ｆ”の各々は０から３であり，ｅ、ｅ’、ｇ、ｇ’、ｇ”の各々は０から１であり、ｆ＝０の場合、Ｃ＝−ＣＯＯＨとなり、次に、Ｃ’、Ｃ”、ＹまたはＹ’の少なくとも１つは水素以外のものであり、もしくは、Ｘは−Ｏ、−ＮＨ、または、−Ｓ以外のものであり、ｄ＋ｅ＋ｅ’＋ｆ＋ｆ’＋ｇ’＋ｇ”の合計は１から８に等しいことを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
2. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｆは２であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
3. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｆは１であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
4. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｄは１であり、ｅ、ｅ’、ｆ、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
5. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｅおよびｆは１であり、ｄ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
6. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｅは１であり、ｄ、ｅ’、ｆ、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
7. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
8. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ、ｆ’およびｆ”は０であり、その化合物は、
   

   

   であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
9. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
   

   

   であり、ｆは２であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、少なくともＲの側基の少なくとも一部分はフェノキシ基であり、その化合物は、
   

   

   であり、ａ＋ｂ＝２であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
10. 請求項１記載のポリホスファゼンポリマーであって、
    

    

    であり、ｆは２であり、ｄ、ｅ、ｅ’、ｇ’およびｇ”は０であり、少なくともＲの側基の少なくとも一部分はデコキシ基であり、その化合物は、
    

    

    であり、ここでａ＋ｂ＝２であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
11. 請求項１に基づく少なくとも１個のポリホスファゼンポリマーと抗原を含むヒトまたは動物に免疫応答を誘導することを特徴とする組成物。
12. 請求項１１に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記抗原は、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、およびこれらの組合せよりなるグループから選抜され、それらが細胞、細菌、ウイルス粒子、およびそれらの組合せより成るグループから誘導されることを特徴とする組成物。
13. 請求項１１に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーおよび前記抗原が非共有結合水溶性複合体を形成することを特徴とする組成物。
14. 請求項１３に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーおよび前記抗原が、多量体抗原提示が可能な非共有水溶性複合体を形成することを特徴とする組成物。
15. 請求項１１に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記抗原がポリホスファゼンポリマーに共有結合して接合されることを特徴とする組成物。
16. 請求項１１に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーが極微粒子またはマイクロクロゲルを形成するために多価イオンとイオン架橋されることを特徴とする組成物。
17. ポリホスファゼンポリマーが以下の単位、
    

    

    を含み、少なくとも１個のＲは、以下の化学式
    

    

    を有し、ここで、
    

    

    ｄは０から１５であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
18. 請求項１７に基づくポリホスファゼンポリマーであって、
    

    

    であり、ｄは５であり、その化合物は、
    

    

    であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
19. 請求項１７に基づくポリホスファゼンポリマーであって、
    

    

    であり、ｄは１であり、その化合物は、
    

    

    であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
20. 請求項１７に基づくポリホスファゼンポリマーであって、
    

    

    であり、ｄは０で、その化合物は、
    

    

    であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
21. 請求項１７に基づくポリホスファゼンポリマーであって、
    

    

    であり、そしてｄは０であり、その化合物は、
    

    

    であることを特徴とするポリホスファゼンポリマー。
22. 請求項１７に基づく少なくとも１個のポリホスファゼンポリマーおよび抗原を含むヒトまたは動物に免疫応答を誘導することを特徴とする組成物。
23. 請求項２２に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記抗原が、タンパク質、ペプチド、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、およびそれらの組合せより成るグループから選択され、それらが細胞、細菌、ウイルス粒子、およびそれらの部分り成るグループから誘導されることを特徴とする組成物。
24. 請求項２２に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーおよび抗原が非共有結合水溶性複合体を形成することを特徴とする組成物。
25. 請求項２４に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーおよび前記抗原が、多量体抗原提示が可能な非共有水溶性複合体を形成することを特徴とする組成物。
26. 請求項２２に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記抗原が共有結合によりポリホスファゼンポリマー接合されることを特徴とする組成物。
27. 請求項２２に基づくヒトまたは動物に免疫応答を誘導する組成物であって、前記ポリホスファゼンポリマーが極微粒子またはマイクロクロゲルを形成するために多価イオンとイオン架橋されることを特徴とする組成物。

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