JPH0147471B2

JPH0147471B2 -

Info

Publication number: JPH0147471B2
Application number: JP55110158A
Authority: JP
Inventors: Raru Kuhanna Puyare; Fuitsushaa Uruman Edoin
Original assignee: Syva Co
Current assignee: Syva Co
Priority date: 1979-09-07
Filing date: 1980-08-11
Publication date: 1989-10-13
Also published as: JPH01308485A; EP0025912A1; JPS5643279A; JPH034596B2; US4351760A; DE3071680D1; CA1159823A; EP0025912B1

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な２，７―ジ―置換―９―置換―
キサンテン―６―ヒドロキシ―3H―３―オン化
合物に関する。ケイ光化合物は多様な用途を有する。例えば、
ケイ光免疫分析、組織化学的染色、デイスプレ
ー、インキなどに有用である。その中で、本発明
が対象とするのは、多様なリガンド（抗原でも受
容体でもよい）の測定に使用されるケイ光化合物
―抗原複合体（受容体複合体を含む）を製造する
のに有用なケイ光化合物である。リガンドの大部
分は血清のような生理的液体中で分析される。そ
の際に、血清がかなりのバツクグラウンドケイ光
を生ずることがある。天然に存在するケイ光体か
ら発せられるバツクグラウンドケイ光を減少させ
る１方法は、比較的長波長で吸収を行うケイ光化
合物を提供することである。このような化合物は
ストークスシフトが大きく、分析条件下で安定
で、溶液状態の物質およびこのケイ光体が結合す
る相手方の化合物の両方からの非特異的妨害を比
較的受けず、量子収率が高いという要件を満足す
るのが望ましい。更に、用途によつては、消光剤
分子、すなわち一定の距離内にあるときにそのケ
イ光体の励起状態のエネルギーを吸収して、ケイ
光体がケイ光を発しないようにすることができる
分子とケイ光体をカツプリングさせるのが望まし
い。文献には多数のフルオレセイン誘導体が報告さ
れている。下記は本発明に最も関連性があると考
えられる従来化合物であり、ケミカルアブストラ
ツク（C.A.）における引用で述べる。位置番号
は基本分子である3′，6′―ジヒドロキシスピロ
〔インベンゾフラン―１（3H），9′―（9H）キサ
ンテン〕―３―オンに基づく。 2′，7′―ジ（ｎ―ヘキシル）またはジ（ｎ―ヘ
プチル）―4′，5′―ジブロモ―４，７―ジクロロ
―，C.A.311621（に製造が報告されている、以下
同じ）；2′，7′―ジ（ｎ―ヘキシル）―，C.A.31，
1621；2′，7′―ジ（アルキル）―，C.A.31，
1388；2′，7′―ジエチルまたは2′，7′―ジブチル
―，C.A.27，5056；2′，7′―ジメチル，C.A.83，
18972s；2′，4′，5′，7′―テトラブロモ―５また
は６―カルボキシル―，C.A.63，13210h。本発明の化合物は、リガンドと受容体からなる
特異的結合対の構成成分との新規なケイ光複合体
の前駆物質である新規なケイ光性物質である。こ
の複合体は、特に免疫分析における試薬として多
様な用途を有する。本発明の化合物は、２，７―
ジ脂肪族―９―置換―６―ヒドロキシ―3H―キ
サンテン―３―オン類であり、キサンテンの２位
または９位に結合している脂肪族または芳香族の
基に結合基または官能基を有している。より具体的には、本発明はフルオレセインの類
似物であるケイ光化合物、特に２，７―ジ脂肪族
置換―９―置換―６―ヒドロキシ―3H―キサン
テン―３―オン類に関する。本発明のケイ光性前駆物質は炭素数が約15以
上、通常は21以上で、約40以下、特に炭素数約22
〜36である。これは１，８―位置以外の位置に少
なくとも２個、最大６個程度までの塩素原子（ク
ロロ基）を有しているのが好ましい。塩素のほか
に存在しうるヘテロ原子は臭素、カルコゲン（特
に酸素とイオウ）および窒素であり、ヘテロ原子
は少なくとも４個、通常は20個以下、特に約16個
以下、好ましくは約12個以下の範囲内で存在す
る。塩素以外のヘテロ原子としては、酸素が少な
くとも３個、通常は少なくとも５個存在し、キサ
ンテン環の一部を構成する酸素以外の酸素原子は
非オキソ型カルボニルまたはオキシ、特に酸、エ
ステルまたはエーテル（普通は炭素と水素だけに
結合）として存在する。ここで非オキソ型カルボ
ニルとは、ヘテロ原子（炭素及び水素以外の原
子、例えば、酸素原子等）に結合されているカル
ボニル

【式】の意味である。イオウは一般にスルホニル、チオエーテルまたはメルカプトとし
て存在し、窒素は一般にアミノまたはアミド（炭
素と水素のみに結合）として存在する。このケイ光化合物は、0.05Mリン酸緩衝液（PH
８）中で約500nmより長波長に吸収極大を有し、
同じ媒質中での吸光係数が少なくとも約65000、
通常は少なくとも70000であり、同じ媒質中での
ストークスシフトが少なくとも約10nm、通常は
少なくとも約12nmであるという特徴を更に有す
る。本発明の２，７―ジ置換―９―置換―キサンテ
ン―６―ヒドロキシ―3H―３―オンは下記の一
般式で表わされる。〔式中、E¹は水素、クロロ、ブロモ又はC_1〜3ア
ルキル基であり；ＲはC_1〜3のアルキレン基であり；Ｄは水素又はカルボキシル基であり；そして Lφは、 (i) 式：｛式中、E²はクロロであり、Ｚはカルボキ
シル基であり、ＷはＹへの直接結合又はカルボ
キサミドアルキレン基（該アルキレン基はC_1〜2
である。）であり、Ｙは水素又はカルボキシル
基であり、ｍは０〜３であり、そしてX²は０
〜４である。但しＤ及びＹのうちの一つはカル
ボキシル基である。｝又は (ii) Ｌは、C_1〜6のアルキレン基であり、そしてφ
はカルボキシル基である。〕当然ながら、本発明の化合物は、、その特性に
顕著な影響を及ぼさずに、上記の一般式の範囲内
から逸脱するように変性させることもできる。例
えば、１または２以上の酸性アニオン基をエステ
ル化またはアミド化してもよく、或いはフエニル
環をアルキル基ならびにシアノ、ニトロなどの他
の基で置換することもできる。しかし、このよう
な変化は多くの場合に追加の合成工程を必要と
し、これは得られた生成物の分光学的または化学
的性質に向上があつたとしても、その向上の程度
により正当化されるほどのことはない。次に本発明のフルオレセイン誘導体の範囲内に
包含される例として下記のものが挙げられる。第１表２，７―ジメチル―４，５―ジクロロ―９―
（2′，4′，5′―トリカルボキシフエニル）―６―ヒ
ドロキシ―３―キサンテン―３―オン；２，７―ジエチル―４，５―ジクロロ―９―
（2′，4′，5′―トリカルボキシ―3′，6′―ジクロ
ロ
フエニル）―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン
―３―オン；２，７―ジヘキシル―９―（2′，4′，5′―トリ
カルボキシフエニル）―６―ヒドロキシ―3H―
キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―４，５―ジクロロ―９―
（2′―カルボキシ―4′―イソチオシアナト―3′，
5′―ジクロロフエニル）―６―ヒドロキシ―3H
―キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―９―（2′―カルボキシ―
4′―イソシアナト―3′，5′，6′―トリクロロフエ
ニル）―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３
―オン；２，７―ジメチル―９―（4′―カルボキシ―
5′―カルボキシフエニル）グリシルグリシルグリ
シンアミド―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン
―３―オン；２，７―ジ（カルボキシメチル）―９―（4′，
5′―ジカルボキシ―2′，3′，6′―トリクロロフエ
ニル）―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３
―オン；２，７―ジ（カルボキシプロピル）―４，５―
ジクロロ―９―（3′，4′―ジカルボキシフエニ
ル）―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―
オン；２，７―ジエチル―９―（2′―カルボキシ―
4′―アミノ―3′，5′―ジクロロフエニル）―６―
ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―９―（2′―カルボキシ―
4′―メルカプトフエニル）―６―ヒドロキシ―
3H―キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―９―（2′―カルボキシ―
4′―カルボキシメチルフエニル）―６―ヒドロキ
シ―3H―キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―９―〔2′―カルボキシ―
4′―（4″―カルボキシブチル）フエニル〕―６―
ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オン；２，７―ジメチル―４，５―ジクロロ―９―
〔2′，4′―ジカルボキシ―5′―（カルボキサミドメ
チレン）フエニル〕―６―ヒドロキシ―3H―キ
サンテン―３―オン；２，７―ジメチル―４，５―ジクロロ―９―
（3′―カルボキシプロピル）―６―ヒドロキシ―
3H―キサンテン―３―オン。本発明のフルオレセイン誘導体はリガンドおよ
び／または担体と結合させて複合体を形成させる
ことができる。次に適用可能なリガンドについて
説明する。被分析物（Analyte）リガント被分析物はモノエピトープまたはポリ
エピトープ性であるという特徴を有する。ポリエ
ピトープ性リガンド被分析物は一般にポリアミノ
酸、すなわちポリペプチドおよびタンパク質、多
糖類、核酸ならびにこれらの混合物である。この
ような集合混合物には細菌、ウイルス、染色体、
遺伝子、ミトコンドリア、細胞核、細胞膜などが
ある。たいていは、本発明で使用するポリエピトープ
性リガンド被分析物は分子量が少なくとも約
5000、より普通には少なくとも約10000である。
ポリアミノ酸の類では、対象となるポリアミノ酸
は一般に分子量が約5000〜5000000より普通には
約20000〜1000000であり；対象となるホルモンは
分子量が通常は約5000〜60000の範囲内である。多様なタンパク質を、類似の構造特徴を有する
タンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパ
ク質、特定の微生物、特に病気の原因となる微性
物に関連するタンパク質などの分類で考慮するこ
とができる。下記は構造により分類したタンパク質の種類で
ある。プロタミン類ヒストン類アルブミン類グロブリン類硬タンパク質類リンタンパク質類ムコタンパク質類色素タンパク質類リポタンパク質類核タンパク質類糖タンパク質類プロテオグリカン類上記に分類されないタンパク質（例、ソマトト
ロピン、プロラクチン、インシユリン、ペプシ
ン）人の血シヨウ中に存在する多数のタンパク質は
臨床的に重要であり、これらには次のものが含ま
れる。プレアルブミンアルブミン α₁―リポタンパク質 α₁―酸糖タンパク質 α₁―抗トリプシン α₁―糖タンパクトランスコルチン 4.6S―ポストアルブミントリプトフア欠乏α₁―糖タンパク質 α₁x―糖タンパク質チロキシン結合性グロブリンインターα―トリプシン阻害因子 Gc―グロプリン（Gc １―１）（Gc― ２―１）（Gc ２―２）ハプトグロビン（Hp １―１）（Hp ２―１）（Hp ２―２）セルロプラスミンコリンエステラーゼ α₂―リポタンパク質ミオグロビンＣ―反応性タンパク質 α₂―マクログロブリン α₂―HS―糖タンパク質 Z_o―α₂―糖タンパク質 α₂―ノイラミノ―糖タンパク質エリスロポイエチン β―リポタンパク質トランスフエリンヘモペキシンフイブリノーゲンプラスミノーゲン β₂―糖タンパク質 β₂―糖タンパタ質免疫グロプリンＧ，（IgG）又はγG―グロプリ
ン分子式：γ₂κ₂又はγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ，（IgA）又はγA―グロブリ
ン分子式：（α₂κ₂）ｎ又は（α₂β₂）ｎ免疫グロブリンＭ，（IgM）又はγM―グロブリ
ン分子式：（μ₂κ₂）⁵又は（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ，（IgD）又はγD―グロブリ
ン（γD）分子式：（δ₂κ₂）又は（δ₂λ₂）免疫グロブリンＥ，（IgE）又はγE―グロブリ
ン（γE）分子式：（ε₂κ₂）又は（ε₂λ₂）遊離κおよびλライト・チエイン（light
chains）相補因子： C′1 C′1q C′1r C′1s C′2 C′3 β₁A α₂D C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な血液凝固因子には下記のものがある。

【表】フイブリノーゲン

【表】重要なタンパク質ホルモンには次のものがあ
る。ペプチドおよびタンパク質ホルモン上皮小体ホルモンチロカルシトニンインシユリングルカゴンレラキシンエリスロポイエチンメラノトロピン（黒血球刺激ホルモン、インテ
ルメジン）ソマトトロピン（成長ホルモン）コルチコトロピン（向副腎皮質性ホルモン）チロトロピン（向甲状腺性ホルモン）卵胞刺激ホルモン黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン）黄体乳腺刺激ホルモン（ルテオトロピン、プロ
ラクチン）ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン）組織ホルモンセクレチンガストリンアンギオテンシンおよびブラデイキニン人胎盤性ラクトゲン下垂体後葉からのペプチドホルモンオキシトシンバンプレツシン放出因子（RF） CRF，LRF，TRF，ソマトトロピン―RF，
GRF，FSH―RF，PIF，MIF 対象となる他の重合体物質はムコ多糖類および
多糖類である。微生物から誘導される抗原性多糖類の例を次に
示す。

【表】分析を受ける微生物は、そのままでも、或いは
溶解、粉砕その他の破砕処理したものでもよく、
得られた組成物または部分（例、抽出によるも
の）を分析する。対象となる微生物は下記を含
む。コリネバクテリウム属（Corynebacteria）ジフテリア菌（Corynebacterium
diptheriae）肺炎球菌（Pneumococci）肺炎双球菌（Diplococcus pheumoniae）連鎖球菌属（Streptococci）化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）唾液連鎖球菌（Streptococcus salivarus）ブドウ球菌属（Staphylococci）黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）白色ブドウ球菌（Stphylococcus albus）ナイセリア属（Neisseriae）髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）淋菌（Neisseria gonorrheae）腸内菌科大腸菌群細菌：大腸菌（Escherichia coli）アエロゲネス菌（Aerobacter aerogenes）肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）サルモネラ属：腸チフス菌（Salmonella typhosa）豚コレラ菌（Salmonella choleraesuis）ネズミチフス菌（Salmonella
typhimurium）シゲラ属：シガ赤痢菌（Shigella dysenteriae）シユミツツ赤痢菌（Shigella schmitzii）シゲラ・アラビノタルダ（Shigella
arabinotarda）フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri）ボイド赤痢菌（Shigella boydii）ソンネ
赤痢菌（Shigella sonnei）その他の腸内菌プロテウス属：尋常変形菌（Proteus vulgaris）奇怪変形菌（Proteus mirabilis）モルガン変形菌（Proteus morgani）緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）アルカリ大便菌（Alcaligenes faecalis）コレラ菌（Vibrio cholerae）ヘモフイルス―ボルデテラ族インフルエンザ菌（Hemophilus
influenzae）ヘモフイルス・ドウクレイ（H.ducreyi）ヘモフイルス・ヘモフイルス（H.
hemophilus）ヘモフイルス・アエギプチクス（H.
aegypticus）パラインフルエンザ菌（H.
parainfluenzae）百日咳菌（Bordetella pertussis）パスツレラ属ペスト菌（Pasteurella pestis）野兎病菌（Pesteurella tulareusis）ブルセラ属マルタ熱菌（Brucella melitensis）牛流産菌（Brucella abortus）豚流産菌（Brucella suis）好気性胞子形成菌炭ソ菌（Bacillus anthracis）枯草菌（Bacillus subtilis）巨大菌（Bacillus megaterium）セレウス菌（Bacillus cereus）嫌気性胞子形成菌ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）破傷風菌（Clostridium tetani）ウエルチ菌Ａ型（Clostridium perfringens）ノービ菌（Clostridium novyi）セプチツクス菌（Clostridium septicum）ヒストリチクス菌（Clostridium
histolyticum）第三型ロデラ菌（Clostridium tertium）クロストリジウム・ビフエルメタンス
（Clostridium bifermentans）スポロゲネス菌（Clostridium sporogeneg）ミコバクテリウム属人型結核菌（Mycobacterium tuberculosis
hominis）牛型結核菌（Mycobacterium bovis）鳥型結核菌（Mycobacterium avium）ライ菌（Mycobacterium leprae）パラ結核性腸炎菌（Mycobacterium
paratuberculosis）放線菌類（真菌様細菌）牛放線菌（Actinomyces israelii）および
（Actinomyces bovis）アクチノマイセス・ネスルソデイ
（Actinomyces naeslundii）ノカルジア・アステロイデス（Nocardia
asteroides）ノカルジア・ブラジリエンシス（Nocardia
brasiliensis）スピロヘータ目梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）フランベジア・トレポネーマ（Treponema
pertenue）ピンタ・トレポネーマ（Trponema
carateum）小スピリルム（Spirillum minus）ストレプトバチルス・モニリホルミス
（Streptobacillus moniliformis）オーベルマイエ回帰熱スピロヘータ
（Borrelia recurrentis）黄ソ出血病レプトスピラ（Leptospira
icterohemorrhagiae）犬レプトスピラ（Leptospira canicola）マイコプラズマ属マイコプラズマ・ニユーモニアエ
（Mycoplasma pneumoniae）その他の病原菌単球病リステリア（Listeria
monocytogenes）豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae）ソ径肉芽腫菌（Donvania granulomatis）バチルス型バルトネラ（Bartonella
bacilliformis）リケツチア属（細菌様寄生虫）発疹熱リケツチア（Rickettsia prowazekii）リケツチア・ムーセリ（Rickettsia moseri）斑点熱リケツチア（Rickettsia rickettsii）コノリ・リケツチア（Rickettsia conori）リケツチア・オーストラリス（Rickettsia
australis）リケツチア・シビリクス（Rickettsia
sibiricus）リケツチア・アカリ（Rickettsia akari）つつが虫リケツチア（Rickettsia
tsutsugamushi）Ｑ熱リケツチア（Rickettsia burnetii）リケツチア・キンタナ（Rickettsia
quintana）クラミジア（分類不可能な寄生虫、細菌／ウイ
ルス性）クラミジア薬剤（名称未確定）真菌類クリプトコツクス・ネオフオルマンス
（Cryptococcus neoformans）ブラストマイセス・デルマチジス
（Blastomyces dematidis）ヒトプラズマ・カプスラツム（Histoplasma
capsulatum）コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides
immitis）パラコクシジオイデス・プラジリエンシス
（Paracoccidioides brasiliensis）ガロ瘡カンジダ（Candida albicans）アスペルギルス・フミガツス（Aspergillus
fumigatus）かさ状ケカビ（Mucor corymbifer（Absidia
corymbifera））藻菌類：リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae）リゾプス・アルリスズ（Rhizopus
arrhizus）リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus
nigricans）スポロトリカム・シエンキイ（Sporotrichum
schenkii）フオンセカエア・ペドロゾイ（Fonsecaea
pedrosoi）フオンセカエア・コンパクタ（Fonsecaea
compacta）フオンセカエア・デルマチジス（Fonsecaea
dermatidis）クラドスポリウム・カルリオニイ
（Cladosporium carrionii）フイアロフオラ・ベルルコサ（Phialophora
verrucosa）アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus
nidulans）マズレラ・マイセトミ（Madurella
mycetomi）マズレラ・グリセア（Madurella grisea）アレシエリア・ボイジイ（Allescheria
boydii）フイアロスホラ・ゼアンセルメイ
（Phialosphora jeanselmei）ミクロスポルム・ギブセウム（Microsporum
gypseum）トリコフイトン・メンタグロフイテス
（Trichophyton mentagrophytes）ケラチノマイセス・アジエルロイ
（Keratinomyces ajelloi）ミクロスポルム・カニス（Microsporum
canis）トリコフイトン・ルプルム（Trichophyton
rubrum）ミクロスポルム・アンドウイニ
（Microsporum andouini）ウイルスアデノウイルス類ヘルペスウイルス類単純性疱疹水痘帯状疱疹ウイルスＢシトメガロウイルス痘疹ウイルス類天然痘（痘瘡）種痘牛痘ウイルス変態痘伝染性軟属腫ピコルナウイルス（Picornavirus）類ポリオウイルスコツクスサツキーウイルスエコーウイルス（Echovirus）リノウイルス（Rhinovirus）粘液ウイルス類インフルエンザ（Ａ，ＢおよびＣ）パラインフルエンザ（１〜４）耳下腺炎ウイルスニユーカツスル病ウイルス麻疹ウイルス牛疫ウイルス犬ジステンパーウイルス呼収シンシチウムウイルス風疹ウイルスアルボウイルス（Arbovirus）類東部馬脳炎ウイルス西部馬脳炎ウイルスシンドビス（Sindbis）ウイルスチクグンヤ（Chikugunya）ウイルスセムリキ森林ウイルスマヨラ（Mayora）ウイルスセントルイス脳炎ウイルスカリフオルニア脳炎ウイルスコロラドチツク熱ウイルス黄熱病ウイルスデング熱ウイルスレオウイルス（Reovirus）類レオウイルス１〜３型肝炎ウイルス類Ａ型肝炎ウイルスＢ型肝炎ウイルス腫瘍ウイルス類ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルスグロス（Gross）ウイルスマロニー（Maloney）白血病ウイルスモノエピトープ性リガンド被分析物は一般に分
子量が約100〜2000、より普通には125〜1000であ
る。対象となる被分析物には薬物、代謝産物、殺
虫剤、汚染物質などがある。対象となる薬物に含まれるものとして、まずア
ルカロイドがある。アルカロイドには、モルフイ
ンアルカロイド（モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルフアン、これらの誘導体お
よび代謝産物を含む）、コカインアルカロイド
（コカイン、ベンゾイルエクゴニン、これらの誘
導体および代謝産物を含む）、麦角アルカロイド
（リゼルグ酸のジエチルアミドを含む）、ステロイ
ドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キ
ナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカロイ
ド、キノリンアルカロイド（キニーネおよびキニ
ジンを含む）、ジテルペンアルカロイド、ならび
にこれらの誘導体および代謝産物がある。別の群の薬物はステロイドであり、これはエス
トロゲン、ゲストロゲン、アントロゲン、副腎皮
質ステロイド、胆汁酸、強心剤グリコシドおよび
アグリコン（ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、
サポニンおよびサポゲニンを含む）、ならびにこ
れらの誘導体および代謝産物がある。ジエチルス
チルベストロールのような擬ステロイド物質も包
含される。次の群の薬物は５または６員環のラクタムであ
り、これにはバルビツール酸化合物（例、フエノ
バルビタール、セコバルビタール）、ジフエニル
ヒダントイン、プリミドン、エトスクシミドおよ
びこれらの代謝産物がある。次の群の薬物はアルキルの炭素数が２〜３のア
ミノアルキルベンゼンであり、これにはアンフエ
タミン、カテコールアミンの類が包含され、具体
的にはエフエドリン、Ｌ―ドーパ、エピネフリ
ン、ナルセイン、パパベリン、これらの代謝産物
および誘導体が含まれる。次の群の薬物は、ベンゾ複素環化合物であり、
これにはオキサゼパム、クロルプロマジン、テグ
レトール、イミプラミン、これらの誘導体および
代謝産物が含まれ、複素環はアゼピン、ジアゼピ
ンおよびフエノチアジンである。次の群の薬物はプリンであり、これにはテオフ
イリン、カフエイン、これらの代謝産物および誘
導体が含まれる。次の群の薬物はマリフアナから誘導されるもの
であつて、これにはカンナビノールおよびテトラ
ヒドロカンナビノールが含まれる。次の群の薬物は、ビタミンＡ，Ｂ（B₁₂など）、
Ｃ，Ｄ，ＥおよびＫ、葉酸、チアミンのようなビ
タミン類である。次の群の薬物はプロスタグランジンであつて、
これはヒドロキシル化および不飽和の程度と位置
で各種の種類に分かれる。次の群の薬物は抗生物質であり、これにはペニ
シリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチ
ン、テトラサイクリン、テラマイシン、これらの
代謝産物および誘導体が含まれる。次の群の薬物はヌクレオシドおよびヌクレオチ
ドであり、これにはATP，NAD，RAN、アデ
ノシン、グアノシン、チミジンおよびシチジンな
らびにこれらの適当な糖およびリン酸置換生成物
が含まれる。次の群の薬物はその他の雑多な薬物であり、こ
れにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、
メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、ライドカイン、プロカインアミド、アセチル
プロカインアミド、プロプラノロール、グリセオ
フルビン、バルプロイン酸、ブチロフエノン、抗
ヒスタミン剤、抗コリン剤（例、アトロピン）、
これらの代謝産物および誘導体がある。次の群の化合物はアミノ酸および小ペプチドで
あり、これにはポリヨードチロニン（例、チロキ
シンおよびトリヨードチロニン）、オキシトシン、
ACTH、アンギオテンシン、met―およびleu―
エンケフアリン、これらの代謝産物ならびに誘導
体が含まれる。疾病症状に関係する代謝産物にはスペルミン、
ガラクトース、フエニルピルピン酸およびボルフ
イリン１型がある。次の群の薬物は、ゲンタマイシン、カナマイシ
ン、トブラマイシンおよびアミカシンのようなア
ミノグリコキシドである。対象となる殺虫剤にはポリハロゲン化ビフエニ
ル、リン酸エステル、チオホスフエート、カルバ
メート、ポリハロゲン化スルフエナミド、これら
の代謝産物および誘導体がある。受容体型の被分析物に関しては、分子量は一般
に10000ないし２×10⁶、より普通には10000ない
し10⁶の範囲内である。免疫グロブリンIgA，
IgG，IgEおよびIgMについては、分子量は一般
に約160000〜10⁶の範囲内である。酵素の分子量
は一般に約10000〜6000000である。天然受容体は
多岐にわたり、一般に分子量は約25000以上であ
つて、10⁶またはそれ以上に達することもあり、
アビジン、チロキシン結合性グロブリン、チロキ
シン結合性プレアルブミン、トランスコルチンな
どの物質を包含する。本発明のフルオレセイン誘導体の多くの応用に
おいて、リガンドを担体に結合させることが望ま
しい。この結合は、直接、リガンドを中間に介在
させて、またはリガンドに結合させながら担体直
接に行われる。多様な担体が使用できる。担体すなわち粒子は
天然物、天然物を合成手段により変性したもの、
および合成物から得ることができる。特に重要な
ものは、多糖類、特に架橋多糖類、例えばアガロ
ース（Sepharoseとして市販）、デキストラン
（SephadexおよびSephacylとして市販）、セルロ
ース、でんぷんなどである。その他の材料にはポ
リアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルア
ルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメ
チルメタクリレートのコポリマー、シリコーン、
ガラス（Bioglasとして市販）、核酸、ポリアミ
ノ酸、菌体などがある。固体粒子のほかに、内部
液体を収容し、或る空間を区画する作用をする親
油性または両親媒性膜を有する液状粒子も使用で
きる。このような粒子には小胞、細胞およびリポ
ゾームがある。粒子は、多孔質または非多孔質、水性または有
機媒質で膨潤性または非膨潤性、架橋または非架
橋、表面が平滑または粗面などの点に関して何れ
でもよく、一般にヒドロキシル、アミノ、カルボ
キシなどの多様な官能基を有し、これらの官能基
は主鎖に直接結合しているか、または結合鎖によ
つて結合している。多孔性粒子は多様なカツトオフ（cut off）値
を有し、分子量は一般に約10000から数百万以上
にも達するが、通常は20000000をこえない。既に述べたように、フレオレセイン化合物とリ
ガンドおよび／または担体との間には多様な結合
鎖が使用できる。結合基の選択は、利用可能な、
もしくは容易に導入できる官能基の種類、結合鎖
の所望の長さ、結合鎖を特定の環境に備えさせる
ことが望ましいかどうか、化学的または物理的性
質（例、正または負への帯電、溶解度の増大、双
極子効果）などに応じて大幅に変動しよう。次の表は、フルオレセイン化合物をリガンドに
結合するのに使用できる多様な結合基を示す。

【表】上の表において、Ｇは炭素数１〜８、通常は１〜６のアルキレン
であり；G′は炭素数２〜６、通常は２〜４のア
ルキレンであり；ｇとg′はそれぞれ１〜６、通常
は１〜４である。上の表は単により普通の結合基
の例示にすぎず、他の結合基も特殊な情況では利
用できる。例えば、チロシルのようにフエノール
基が存在する場合にはアリールジアゾニウム官能
基も使うことができる。また、フルオレセインと
リガンドの官能基を逆にする（それに伴なつて結
合基の方向も逆向きになる）ことができることも
理解されよう。本発明の化合物は多くの望ましい性質を有す
る。この生成物は顕著な水溶性を有し、それによ
りこれを多様なポリペプチドに結合して複合体を
形成しても、ポリペプチドの水溶性に顕著な悪影
響を及ぼしたり、ポリペプチドが本発明の化合物
の分光学的性質に悪影響を及ぼすことがない。本発明の化合物の分光学的性質に関しては、こ
の化合物は一般に500nm、より普通には510nmを
こえた比較的長波長で吸光する。すなわち、生理
的液体を扱うときに見られるような天然のケイ光
は、この天然ケイ光体を著しく励起しない波長範
囲の励起光線を使用することにより実質的に避け
られる。また、本発明の化合物は比較的急峻な吸
光ピークおよび発光ピークを示す。そのため、ケ
イ光体と消光体の間で効率的な重なりを得ること
ができ、約70Åの距離まで効率的な消光が可能と
なる。本発明のケイ光化合物はまたストークスシ
フトが大きいので、吸光帯と発光帯のピークが少
なくとも10nm、しばしば少なくとも15nmは離れ
る。この大きなストークスシフトにより、観測さ
れるケイ光に対するバツクグラウンドの妨害が最
小限ですむ。本発明の化合物は慣用手段によつて製造され
る。適当なレソルシノールとカルボン酸もしくは
無水物をルイス酸（例、塩化亜鉛）の存在下に混
合し、混合物を目的生成物を形成するのに十分な
時間加熱する。その後、生成物を常法により精製
してもよい。本発明の化合物は、特にタンパク結合分析にお
けるリガンドおよび／または担体への複合体形成
材料として、多様な用途がある。この複合体は、
検体中の対象化合物の存在を定性的、半定量的ま
たは定量的に測定するのに使用できる。被検出化
合物が生理的液体中に含まれている場合、この種
の液体としては、血清、尿、唾液、リンパ液など
がある。対象化合物が化学工業または環境問題に
関連する物質である場合、試料（検体）は水性媒
質、有機媒質、土壊、無機混合物などであること
がある。免疫分析または他の診断的応用に使用するため
には、本発明の分光学的に活性な化合物を、被分
析物の受容体またはリガンドを含む対象化合物に
結合させる（ここで、受容体とは或る空間的およ
び極性分子構造に特異的に結合する分子を意味
し、リガンドはこのような構造を有する有機分子
である）。被分析物は一般にハプテンまたは抗源
である。使用化合物が結合のための利用可能な官
能基を有していない場合には、このような官能基
を導入し、しかも得られた生成物を免疫学的性質
が残るように変性を行う。リガンドとなりうる被
分析物の類似物質である化合物は、リガンド類似
物と呼ばれる。既述のように、本発明の化合物は、既知の免疫
分析法により測定しうる化合物に結合させてもよ
い。得られた複合体は、免疫媒質中で検体中の対
象化合物すなわち被分析物と競合する試薬であ
る。従つて、複合体は、受容体（通常は抗体）に
対して対像化合物と競争することのできる対象化
合物の構造の実質的部分をなお保有している。本発明の分光学的に活性な化合物に結合される
被分析物もしくはその類似物、受容体またはリガ
ンドはモノエピトープ性またはポリエピトープ性
という特徴を有する。分析は一般に、分光学的に活性な化合物の周囲
環境の変化またはケイ光体―消光体の対がその消
光体がケイ光体と相互作用するのに十分な近さの
範囲内まで近づくことによる分光学的性質の変化
に基づく。或いは、対になつているケイ光体とそ
うでないケイ光体を分離し、この２種の画分の一
方または両方のケイ光体を検出する方法も採用で
きる。第１の分析法においては、リガンドおよびケイ
光体に対する受容体または抗体を使用し、リガン
ドに対する受容体およびケイ光体に対する受容体
の同時結合が阻止されるという立体排除を利用す
る。更に、ケイ光体に対する受容体（抗ケイ光
体）がケイ光体に結合した場合には、そのケイ光
体のケイ光は実質的に減少する。ケイ光の阻害が
完全でない場合には、抗ケイ光体に消光体を結合
させておくことによりケイ光のより一層の減少を
達成することができる。この分析法は米国特許第
3998943に詳述されている。この文献で使用され
るフルオレセインを本発明のケイ光化合物に代え
ても構わない。この分析法は該特許の３〜５欄に
記載されている。一般に、この方法は、被分析物を含有すること
が疑われる検体を、リガンド―ケイ光体複合体、
抗ケイ光体およびリガンドの受容体または抗リガ
ンド（リガンドが被分析物である場合）と混合す
ることからなる。これらの材料をPHが約５〜10、
通常は約６〜９の範囲内の水性媒質中で、約10〜
45℃の範囲内の温度において混合し、ケイ光を変
化率（rate）方式または平衡方式の何れかで測定
する。変化率方式では全部の材料を混合してから
約１秒ないし１時間以内に測定を行うのに対し、
平衡方式では約24時間まで、またはそれ以上の長
時間にわたつて測定を行うこともある。別の免疫分析法では、ケイ光体―消光体の対を
使用し、この対の一方をリガンドと抗リガンドか
らなる特異的結合対の一方の成分に結合してお
き、他方の発色成分はその特異的結合対の同一ま
たは異なる成分に結合しておく。例えば、ケイ光
体と消光体を抗リガンドの異なる分子に結合させ
てもよい。こうすると、得られた２種類の抗リガ
ンド複合体を抗原と混合すると、ケイ光体と消光
体が消光距離の範囲内に近づく。或いは、発色物
質の対の一方をリガンドに結合し、他方の発色物
質を抗リガンドに結合することもできる。この分
析法は米国特許第3996345の第17欄から第23欄に
詳述されている。発色物質とリガンドおよび受容
体との比率は、該特許の第４〜６欄に記載されて
いる。この分析法は上述した第１の方法と実質的に同
様に行われるが、ただしこの分析ではケイ光体複
合体と消光体複合体を検体と共に加え、ケイ光の
測定は既知量の被分析物を含有する分析媒質との
比較により行う。本発明の化合物を利用してその他の分析法も実
施できる。その例としては、米国特許出願連続番
号824576に記載の重原子消光を利用する方法また
は生理的液体その他の分析すべき検体中に本来的
に存在するケイ光化合物が発する光より実質的に
長波長の光を発するケイ光分子を必要とするその
他の分析法が挙げられる。また、本発明の複合体は、米国特許出願連続番
号964099に記載のように担体と組合わせて使用す
ることもできる。この分析法は、ケイ光体分子が
バルク溶液（bulk solution）状態で信号変調物
質との相互作用に利用でき、または粒子に結合さ
れる（その場合に粒子の周囲環境はこの相互作用
を妨げる）ことに基づく。或いは、ケイ光体複合
体が粒子に結合されたときにケイ光信号を変調す
る環境を粒子が与えることもできる。実験以下の実施例は、制限を目的とするものではな
く、単に例示のために挙げたものである。実施例において、特に指定のない限り、温度は
すべて℃であり、部と％はすべて重量による。た
だし、液体の混合物では、部と％は容量による。
実施例で使用した略号は次の通りである。 TLC―薄層クロマトグラフイー THF―テトラヒドロフラン DCC―ジシクロヘキシルカルボジイミド NHS―Ｎ―ヒドロキシスクシンイミド T₃ ―トリヨードチロニン実施例１２，７〓ジメチル―９―（3′，4′―ジカルボキ
シ―2′，5′，6′―トリクロロフエニル）―６―
ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オンの製
造Ａ４―メチル無水フタル酸（20.0ｇ）を20％発
煙硫酸（25ml）に溶解し、粉末ヨウ素（0.5ｇ）
を加えた。混合物を90〜100℃に加熱し、塩素
ガスをこの溶液中に連続的に吹き込んだ。24時
間加熱した後、更に0.5ｇのヨウ素を加え、加
熱を更に24時間続けた。２日間の加熱後に、白
色の固体が析出した。反応混合物を冷却し、
100mlの氷冷水中に投入し、過して、白色の
固体を得た。この固体を冷水（20ml）で洗浄し
た後、真空乾燥した。生成物である３，５，６
―トリクロロ―４―メチルフタル酸および無水
物（）の試料を加水分解して、白色粉末、融
点226―228℃を得た。Ｂ機械的撹拌機と水凝縮器を備えた１の三ツ
口フラスコに上記の生成物（）（20ｇ、0.075
モル）を入れ、10％K₂CO₃400mlを加えた。得
られたスラリーを120℃の油浴で固体がすべて
溶解するまで（約１時間）還流加熱した。ｔ―
ブタノール10mlを加えた後、粉末状のKM_o
O₄33.0ｇ（0.2モル）をこの高温撹拌溶液に少
しづつ加えた。KM_oO₄の堆積を避けるように
注意する必要がある。更に100mlの10％K₂CO₃
を使用して、KM_oO₄を洗浄した。KM_oO₄を全
部添加し終つた後、反応をHLCで検査した。
〔TLCは次の方法により行つた。反応混合物の
試料を6M H₂SO₄で酸性化した。過剰のKM_o
O₄をシユウ酸の飽和溶液と反応させ；得られ
た溶液をエーテルで抽出した。このエーテル溶
液をジアゾメタンのエーテル溶液と反応させ、
N₂下に濃縮した。このメチルエステルの100％
ベンゼン中でのTLCを測定した。R_f＝0.3。
（）から誘導されたジカルボン酸のメチルエ
ステルのR_fは0.5であつた〕。 TLCですべてのジカルボン酸が消失してし
まつた後、反応を止めた。ｔ―ブタノールを留
去し、撹拌しているスラリーを6M H₂SO₄で
PH１に酸性化した。過剰のKM₂O₄を固体シユ
ウ酸との反応により除去した。シウ酸の添加中
に6M硫酸を加えて混合物のPHを１に保つた。
得られた溶液をRotovapで濃縮して、白いスラ
リーを得た。6M塩酸を全容積が約300mlになる
まで加えて固体をすべて溶解させた。得られた
溶液を室温で30分間撹拌して、微細な白色沈殿
を生じさせた。このスラリーをエーテル（３×
400ml）で抽出した。白い無機塩が水層の方に
残つた。エーテル抽出液をRotovapで蒸発さ
せ、残留する油状物をRotovapで乾燥ベンゼン
を使用して共沸蒸留により乾燥した。白い粉末
（20ｇ）が単離された。この粉末を酢酸エチル
―四塩化炭素から再結晶して、19.5ｇの３，
５，６―トリクロロトリメリツト酸（）、融
点238―240℃を得た。Ｃ 250mlの丸底フラスコで、上記のトリクロロ
トリカルボン酸（）（10ｇ）を30ml無水酢酸
に溶解し、この混合物を窒素下で140〜145℃に
45分間加熱した。冷却後、Rotovapで高真空
下、35〜40℃に加熱して無水酢酸を除去した。
無水酢酸を完全に除去した後、フラスコをその
まま高真空下に１晩放置して、無水酢酸の最後
の痕跡を除去し、得られた生成物（）を次の
工程にそのまま使用した。Ｄ上で得たトリクロロ酸無水物（）（9.5ｇ）
を広口管の中で粉末状の４―メチルレソルシノ
ール（8.5ｇ、高真空で１晩乾燥したもの）と
混合し、185〜190℃の予熱された油浴で加熱し
た。無水Z_oCl₂（１ｇ）をこの混合物に加え、
時々スパチユラで混合しながら加熱を1.5時間
続けた。赤色の硬い塊状物が得られた。内容物
を冷却し、赤色の固体を管からかき集めた。この固体を８％NaOH水溶液300mlに撹拌し
ながら溶解し、氷浴で冷却し、１：1HClでPH
１に酸性化した。黄色の固体が析出した。この
沈殿を別し、水（150ml）で洗浄し、高真空
下で１晩乾燥した。乾燥後の黄色固体の量は約
15.5ｇであつた。乾燥した黄色粉末を酢酸エチル200mlと共に
１晩撹拌し、混合物を過し、固体を15mlの酢
酸エチルで洗浄した。液の酢酸エチル溶液を
Rotovapで約35〜40℃の温度でほぼ乾固状態ま
で濃縮した。残渣を200mlのベンゼンと共に２
時間撹拌し、過した。別された固体を200
mlのCH₂Cl₂と共に３〜４時間撹拌し、また
過した。残留する固体は9.0ｇであつた。その
THF：CH₂Cl₂（１：１）中でのTLCは、これ
が殆んど純粋で、TLCでの主要スポツトは１
個だけであり、一対の小スポツトがほぼ溶媒前
面と共に移動することを示した。この黄色の固
体をこれ以上精製せずに次の反応に使用した。上記の黄色固体混合物（6.0ｇ）を、新たに蒸
留したTHF（C₁H₂上で蒸留）150mlに溶解し、3.0
ｇのDCCを加えた。得られた透明溶液を１晩撹
拌した。翌日、生成した白色固体を別し、この
固体を15mlの乾燥THFで洗浄した後、液と洗
液を合わせて室温でRotovapにより蒸発乾固し
た。固体残渣に200mlのｎ―ヘキサンを加え、混
合物を２時間撹拌して、過剰のDCCを除去した。
黄色固体を過し、50mlのｎ―ヘキサンで洗剰し
た。残つた固体は、TLC（溶媒系THF：CH₂Cl₂
＝60：40）が示すところによると、未反応物質
（）と無水物（）の混合物である。〔：２，
７―ジメチル―９―（2′，4′―ジカルボキシ―
3′―5′―6′―トリクロロフエニル）―６―ヒドロ
キシ―3H―キサンテン―３―オン；：２，７
―ジメチル―９―（3′，4′―ジカルボキシ無水物
―2′，5′，6′―トリクロロフエニル）―６―ヒド
ロキシ―3H―キサンテン―３―オン〕。実施例２２，７―ジメチル―９―（3′または4′―カルボ
キサミド―4′または3′―カルボキシ―2′，5′，
6′―トリクロロフエニル）―６―ヒドロキシ―
3H―キサンテン―３―オン酢酸の製造実施例１で得た黄色固体を乾燥THF（300ml）
に溶解し、３―β―コレスタニルグリシネート
8.5ｇと混合し、この混合物を室温で１晩撹拌し
た。次いで溶媒を除去し、残留する固体を水
（150ml）と共に２時間撹拌した。得られた混合物
を希塩酸でPH１に酸性化し、低温室で撹拌を更に
１時間続けた。析出した黄色固体を別し、100
mlの氷冷水で洗浄し、真空乾燥した。そのTLC
（THF：CH₂Cl₂＝１：１）は、これが主要化合
物２種類だけの混合物であることを示した。この
黄色固体をTHFと共にシリカゲル（30ｇ）に吸
収させ、乾燥した。乾燥粉末をシリカゲル（200
ｇ）の乾燥カラム上に投じ、THF：CH₂Cl₂混合
物（１：４）で溶離し、この溶離の状況をTLC
で追跡した。スポツトの移動速度が速い方の溶離
液を集め、溶媒を除去して、上記目的化合物のコ
レスタニルエステル誘導体を黄色粉末（2.6ｇ）
として得た。上記エステルの加水分解は、上記エステル1.5
ｇをTHF10mlに溶解し、NaOH水溶液（水70ml
中１ｇ）を加え、得られた溶液を室温で24時間撹
拌することにより行つた。白色固体が析出した。
このアルカリ性溶液をエーテル（３×50ml）で抽
出し、水溶液を濃塩酸でPH２に酸性化した。黄色
の固体が析出した。この溶液をエーテル（３×
100ml）で抽出し、エーテル溶液を食塩水（２×
15ml）で洗浄し、エーテル除去後に得られた黄色
固体を４時間真空乾燥した。残留する固体を
CH₂Cl₂（45ml）と共に１晩撹拌すると、黄色粉末
の析出を生じた。これを別し、更にCH₂Cl₂（20
ml）で洗浄し、最終的に真空乾燥して黄色固体
（700mg）を得た。実施例３実施例２の生成物のヒトIgGへの結合ａこの色素の活性化NHS誘導体の製造実施例２の生成物（色素）（60mg）を乾燥THF
（１ml）に溶解し、NHS（30mg）を加えた後、
DCC（30mg）を加え、室温で３時間撹拌を行つ
た。析出した白色固体を去した。液を真空濃
縮し、残渣を10mlのｎ―ヘキサンと共に30分間撹
拌して過剰のDCCを除去した。得られた黄色粉
末を別して、そのまま使用した。ｂ色素のNHSエステルとヒトIgGとの反応ヒトIgG（10mg）をPH8.0の0.05Mリン酸緩衝液
1.2mlに溶解し、氷冷浴で０〜５℃に冷却した。
このタンパク質溶液を高速撹拌しながら、これに
上で調製したNHSエステル1.2mgの乾燥DMF
（40μl）中の溶液を20分間かけて添加した（NHS
エステルの添加中に溶液のPHは痕跡量の固体
Na₂CO₃の添加により8.0に保持した）。添加完了
後、混合物を室温で1.5時間撹拌し、次に
2NNH₂OH（PH8.1に調整）１mlを加え、混合物を
低温室で更に１時間撹拌した。反応混合物を遠心
分離機にかけ、上澄み液をセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ―25のカラムに通して、PH8.0の
0.05Mリン酸緩衝液を使用して精製した。移動速
度がより速い複合体は、吸光のλ_naxが521〜
522nmで、発光のλ_naxが537〜538nmであること
が見出された。この複合体の色素／タンパク質比
はUV計算に基いて7.56であることが判明した。実施例４実施例２の生成物とトリヨードチロニン（T₃）
およびデキストランとの複合体一般に、下記の反応工程の全工程において化合
物の露光を避けるように特に注意を払つた。Ａ T₃（１ｇ）を乾燥メチルアルコール（15ml）
に懸濁させ、塩化水素ガスの緩慢な流れをこの
懸濁液に20分間通した。透明な溶液が得られ
た。Rotovapで室温において溶媒を除去し、残
渣の白色固体を真空乾燥して、そのまま使用し
た。Ｂトリエチルアミン（100μl）を含有する乾燥
DMF（１ml）中の上記エステル（70mg）の混合
物に、実施例２の生成物のNHSエステル（70
mgから上記の方法にしたがつて調製したもの）
を加え、この溶液を１晩撹拌した。DMFを真
空除去し、残渣を希塩酸で処理して黄色の固体
を析出させ、これを別し、水洗し、真空乾燥
した。そのTLC（THF：CH₂Cl₂＝40：60）は、
この主スポツトが１個であることを示した。こ
の生成物を16プレート（20×20cm）および上記
の溶媒系を使用した調製用TLCにより精製し
た。主スポツトをメタノールで溶出させ、メタ
ノールを除去して約40mgを得た。Ｃ上記生成物（30mg）の1N NaOH（２ml）中
の溶液を室温で２時間撹拌した。この溶液を希
塩酸で酸性化し、析出した黄色固体を別し、
乾燥した。この酸を更に調製用TLC（CH₂Cl₂：
MeOH：AcOH＝75：25：１）で精製し、生
成物をシリカゲルからメタノールで溶出させ
た。メタノールを除去した後、残渣を1N
NaOHに溶解し、溶液を過し、希塩酸で酸
性化した。析出した黄色沈殿を別し、水洗
し、１晩65℃で真空乾燥して、目的とする酸生
成物（13mg）を得た。その0.05Mリン酸緩衝液
中でのUVスペクトルは吸光のλ_nax＝519nm、
発光のλ_nax＝533〜534nmであつた。Ｄ関連出願の米国特許出願連続番号017874
（1979，3.3出願）に記載のようにしてBHP活
性化デキストラン70（シグマ社）からアミノデ
キストランを調製した。すなわち、BHP活性
化デキストラン70（500mg）を緩衝液（0.15M
NH₄OHと0.1M NaHCO₃―Na₂CO₃，PH9.0）
10mlと共に室温で１晩撹拌した。β―メルカプ
トエタノール（70μl）を加え、撹拌を室温で10
時間続けた。週末にかけて室温で水に対して透
析すると、透析後の全体積は約14ml（約500mg
のデキストラン70を含有）になつた。Ｅ上記のＣで得た酸10mgを、DCC（９mg）と
NHS（５mg）を含有する乾燥THF（１ml）にと
かし、この溶液を１晩撹拌した。白色の固体が
析出した。過後、液を真空濃縮した。残渣
をｎ―ヘキサン（10ml）で冷浸し、黄色固体
（約20mg）を分離した。THF：CH₂Cl₂（１：
１）中でのTLC検査によると、この黄色固体
は殆んどがNHSエステル（R_f大）で、少量の
出発物質（R_f小）が共存することが示された。Ｆ上で製造したアミノデキストラン溶液
（300μl）を0.1N NaHCO₃―Na₂CO₃溶液（PH
9.0）300μlで希釈し、これにＥで調製した
NHSエステル0.5mgのTHF25μl中の溶液を加え
た。得られた溶液を室温で1.5時間撹拌した。
この溶液に3N NH₂OH溶液（PH8.0）0.3mlを
加え、混合物を室温で45分間撹拌した。２分間
の遠心分離後、上澄み液をセフアデツクスＧ―
25のカラム（１×30cm）で0.1N NaHCO₃―
Na₂CO₃緩衝液（PH9.0）を使用して精製した。
移動がより速い複合体を捕集した（クロマトグ
ラフ後の複合体溶液の全量は約２ml）。その吸
光のλ_nax＝521〜522nmで、発光のλ_nax＝537〜
538nmであつた。量子収率は実施例２の基本フ
ルオレセイン誘導体に比較して43％であつた
（共に500nmで励起したときの発光ピーク面積
に基づいて）。実施例５２，７―ジメチル―９―（2′，4′または5′―ジ
カルボキシフエニル）―６―ヒドロキシ―3H
―キサンテン―３―オンと４，５―ジクロロ誘
導体の製造Ａ反応フラスコで、４―メチルレソルシノール
1.35ｇ、無水トリメリツト酸１ｇおよび
ZnCl₂100mgを混合し、この混合物を195〜200
℃に15分間加熱した。得られた固体を水で冷浸
し、過した。この沈殿を５％NaOHに溶解
し、５分間撹拌し、過し、液を希塩酸でPH
２に酸性化した。析出した固体を取得後、メタ
ノールから再結晶して、橙赤色の固体、融点＞
280℃を得た。Ｂ上記生成物の一部をDMFに溶解し、氷酢酸
中の2.2当量の塩素を加えた。反応がもはや起
らなくなるように思われた後、生成物を単離
し、CHCl₃：MeOH（80：20）を使用した調製
用TLCで精製した。実施例６２，７―ジ（2″―カルボキシエチル）―９―
（2′―カルボキシフエニル）―６―ヒドロキシ
―3H―キサンテン―３―オンの製造反応フラスコに４―（2′―カルボキシエチル）
レソルシノール1.1ｇ、無水フタル酸0.45ｇおよ
びZnCl₂250mgを入れ、この混合物を160〜170℃
に0.5時間加熱した。水で処理して過した後、
得られた固体を５％NaOHに溶解し、この溶液
を15分間撹拌し、過し、液を希塩酸でPH２に
酸性化し、析出した黄色固体を別し、乾燥し
た。生成物を酢酸エチルで冷浸し、更に調製用
TLC（CHCl₃：MeOH：氷AcOH＝80：20：0.5）
で調製した。実施例７２，７―ジ（3″―カルボキシプロピル）―９―
（2′，4′および3′，4′―ジカルボキシ―3′，5′，
6′および2′，5′，6′―トリクロロフエニル）―
６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オン
の製造前記と同様の方法により、反応フラスコに４―
（3′―カルボキシプロピル）レソルシノール2.6
ｇ、３，５，６―トリクロロ―１，２，４―ベン
ゼントリカルボン酸1.95ｇおよびZnCl₂100mgを入
れ、この混合物を180〜185℃に40分間加熱した。
混合物を前述と同様に処理し、最後の調製用
TLCによる生成物の精製をCHCl₃：MeOH：
AcOH＝80：20：１を使用して行つた。次の表は、各実施例で得られたケイ光化合物の
分光学的性質を示す。

【表】実施例８２，７―ジメチル―９―（カルボキシエチル）
―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オ
ンの製造トリクロロ酸無水物（）の代わりにコハク酸
無水物を使用した以外は実施例１と同様な方法に
より、上記の化合物を製造した。該化合物の吸光
λ_naxは約494nmであり、発光λ_naxは約512nmであ
つた。実施例９２，７―ジメチル―４，５―ジメチル―９―
（カルボキシエチル）―６―ヒドロキシ―3H―
キサンテン―３―オンの製造トリクロロ酸無水物（）の代わりにコハク酸
無水物を使用し、適切に置換したレソルシノール
を使用した以外は実施例１と同様な方法により、
上記の化合物を製造した。該化合物の吸光λ_naxは
約509nmであり、発光λ_naxは、約526nmであつ
た。実施例 10 式：を有する複合体の製造ジメチルホルムアミド中でパラジウム（０）触
媒存在下で、５―ヨード―2′，3′―ジオキシウリ
ジンをＮ―トリフルオロアセチルプロパルギルア
ミンに結合させることにより、上記複合体を製造
した。得られたヌクレオシド誘導体を、その5′―
三燐酸塩体に変換し、脱アシル化して５（３―ア
ミノ―１―プロピニル）―2′，3′―ジデオキシウ
リジン三燐酸塩を得た。このアミンは上記複合体
―サルコシンのＯ―アシル保護体と結合されたも
のであり、次いで脱保護体化した。得られた生成
物は、約538nmの発光λ_naxであつた。実施例 11 式：を有する複合体の製造相当するアデノシンを使用する以外は、実施例
10で記載した同様な方法で上記の複合体を製造し
た。実施例 12 ２，７―ジメチル―９―（2′―カルボキシ―
３，６―ジクロロフエニル）―６―ヒドロキシ
―3H―キサンテン―３―オンの製造実施例１と同様の方法により標記の化合物を得
た。吸光λ_naxは513nmであり、発光λ_nxは529〜
531nmであつた。実施例 13 ２，７―ジメチル―４，５―ジブロモ―９―
（3′または4′―カルボキサミド―4′―または3′―
カルボキシ―2′，5′，6′―トリクロロフエニル）
―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オ
ン酢酸の製造実施例２の化合物をブロム化することにより、
上記の化合物を得た。該化合物の吸光λ_naxは532
〜533nmであり、発光λmaxは547〜550nmであ
つた。実施例 14 実施例２の生成物のBSA（牛血清アルブミン）
への結合実施例３の方法に従つて、実施例２の化合物
を、BSAに結合させた。得られた生成物の吸光
λ_naxは522〜524であつた。前出の実施例から、本発明の化合物が多くの望
ましい性質を有することは明らかである。ここれ
らの化合物は500nmまたはこれより長波長で吸光
し、ストークスシフトが大きく、その分光学的性
質はタンパク質に複合化（結合）することにより
悪影響を受けない。本発明の有用性を更に実証するために、本発明
の範囲内の化合物をケイ光化合物として使用して
免疫分析を行つた。この分析は免疫グロブリンＧ
（IgG）に関するものであつた。この分析を行う
ための試薬類の調製において下記の溶液を使用し
た。緩衝液：0.01M Na₂HPO₄，0.15M NaCl，２％
PES6000，0.05％NaN₃，PH8.0；試薬Ｂ希釈剤：0.05M トリズマベース
（trizmabase），0.02Mグリシン、0.01Mベン
ズアミジン―HCl，0.15M NaCl，0.05％
NaN₃，PH8.0；試薬Ａ希釈剤：0.05M トリズマベース、１％胆
汁酸塩、0.01Mベンズアミジン―HCl，0.05
％NaN₃，PH8.0；検定剤希釈剤：0.01M Na₂HPO₄，0.15M NaCl，
0.01M ベンズアミジン―HCl，0.01％
NaN₃，PH7.2。試薬Ａは、ローダミン―抗（hIgG）複合体
（ローダミン／タンパク質の比は11）を試薬Ａ希
釈剤で１：30まで希釈したものである。試薬Ｂは
２，７―ジメチル―９―（2′，5′，6′―トリクロ
ロ―3′または4′―カルボキサミドグリシン―4′ま
たは3′―カルボキシフエニル）―６―ヒドロキシ
―3H―キサンテン―３―オンとhIgGとの複合体
（ケイ光体／タンパク質の比は約２）を試薬Ｂ希
釈剤で１：26.7まで希釈したものである。検定剤はフレオン―硫酸デキストラン処理した
血清を検定剤希釈剤で希釈して得たものである
が、ただし24mg／ml検定剤は未希釈の血清を使用
している。負（ネガチブ）検定剤は分析用緩衝液
である。分析は、Varian Fluorichromケイ光計（改
造）を使用して25℃で行い、ゲインとしてはケイ
光体自体の3.8×10^-9M濃度の標準溶液を使用し
て1600に設定されたケイ光信号を用いた。分析は、検定剤または試料16μlを分析用緩衝液
400μlで希釈したものに試薬ＡおよびＢ各50μlを
加え、更に400μlの分析用緩衝液を加えることに
より行つた。５秒後に、ケイ光の変化を６秒間に
わたつて測定して、ケイ光の変化速度（変化率）
を求めた。０，1.6，5.6，11.2，17.6および24.0mg／mlの各
hIgG濃度を利用して標準曲線を調製した。次いで、多数の試料（検体）を使用してhIgG
濃度を測定し、一般に利用されている放射免疫拡
散法（RID）または比濁法による結果と比較し
た。次の表にその結果を示す。

【表】上の結果から明らかなように、本発明の化合物
を使用した分析法と他の一般に利用されている分
析法の間に確固たる関係が存在する。即ち、相関係数の欄からわかるように、本発明
の化合物を使用した分析法は、RID法（0.97）及
び比濁法（0.91及び0.96）と非常に良い相関を示
し、本発明の化合物を使用した分析法が非常にす
ぐれていることを示す。２種類の比濁法の結果に
明らかなずれがあるが、これは恐らく各方法でそ
れ自体の評価法を採用したことに起因しよう。本発明は、長波長で吸光が起り、吸光係数が高
く、吸収帯およびケイ光帯が急峻で、吸収帯とケ
イ光帯の間が実質的に離間しているという重要な
分光学的性質を有する新規化合物を提供する。こ
のような性質は、ケイ光法の発展および多様な物
質の検出にとつて特に望ましく重要である。以上に本発明を詳述したが、本発明の範囲を逸
脱せずに或る種の結果・修正が可能であることは
当然である。

Claims

【特許請求の範囲】１式：〔式中、E¹は水素、クロロ、ブロモ又はC_1〜3ア
ルキル基であり；ＲはC_1〜3のアルキレン基であり；Ｄは水素又はカルボキシル基であり；そして Lφは、 (i) 式：｛式中、E²はクロロであり、Ｚはカルボキ
シル基であり、ＷはＹへの直接結合又はカルボ
キサミドアルキレン基（該アルキレン基はC_1〜2
である。）であり、Ｙは水素又はカルボキシル基であり、
ｍは０〜３であり、そしてX²は０〜４である。
但し、Ｄ及びＹのうちの一つはカルボキシル基
である。｝又は (ii) Ｌは、C_1〜6のアルキレン基であり、そしてφ
はカルボキシル基である。〕を有する化合物。２Ｘが３である特許請求の範囲の第１頃記載の
化合物。３化合物が２，７―ジメチル―９―（3′，4′―
ジカルボキシ―2′，5′，6′―トリクロロフエニル）
―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン―３―オン
である、特許請求の範囲第１項記載の化合物。４化合物が２，７―ジメチル―９―（3′または
4′―カルボキサミド―4′または3′―カルボキシ―
2′，5′，6′―トリクロロフエニル）―６―ヒドロ
キシ―3H―キサンテン―３―オン酢酸である、
特許請求の範囲第１項記載の化合物。５ L₁ψが前記(ii)の場合、Ｄは水素である、特許
請求の範囲第１項記載の化合物。６化合物が２，７―ジメチル―９―（カルボキ
シエチル）―６―ヒドロキシ―3H―キサンテン
―３―オンである、特許請求の範囲第５項記載の
化合物。７化合物が２，７―ジメチル―４，５―ジメチ
ル―９―（カルボキシエチル）―６―ヒドロキシ
―3H―キサンテン―３―オンである、特許請求
の範囲第５項記載の化合物。