JPH034596B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ケイ光化合物とリガンド、受容体又
は担体との複合体及びその複合体を使用するタン
パク質結合ケイ光分析に関する。 ケイ光化合物は多様な用途を有する。例えば、
ケイ光免疫分析、組織化学的染色、デイスプレ
ー、インキなどに有用である。その中で、本発明
が対象とするのは、多様なリガンド（抗原でも受
容体でもよい）の測定に使用されるケイ光化合物
との抗原複合体（受容体複合体を含む）の使用で
ある。リガンドの大部分は血清のような生理的液
体中で分析される。その際に、血清がかなりのバ
ツクグラウンドケイ光を生ずることがある。天然
に存在するケイ光体から発せられるバツクグラウ
ンドケイ光を減少させる１方法は、比較的長波長
で吸収を行うケイ光化合物を提供することであ
る。このような化合物はストークスシフトが大き
く、分析条件下で安定で、溶液状態の物質および
このケイ光体が結合する相手方の化合物の両方か
らの非特異的防害を比較的受けず、量子収率が高
いという要件を満足するのが望ましい。更に、用
途によつては、消光剤分子、すなわち一定の距離
内にあるときにそのケイ光体の励起状態のエネル
ギーを吸収して、ケイ光体がケイ光を発しないよ
うにすることができる分子とケイ光体をカツプリ
ングさせるのが望ましい。 文献には多数のフルオレセイン誘導体が報告さ
れている。下記は本発明に最も関連性があると考
えられる従来化合物であり、ケミカルアブストラ
クツ（C.A.）における引用で述べる。位置番号
は基本分子である3′，6′−ジヒドロキシスピロ
［イソベンゾフラン−１（3H）、9′−（9H）キサン
テン］−３−オンに基づく。 2′，7′−ジ（ｎ−ヘキシル）またはジ（ｎ−ヘ
プチル）−4′，5′−ジブロモ−４，７−ジクロロ
−，C.A.31，1621（に製造が報告されている、以
下同じ）；2′，7′−ジ（ｎ−ヘキシル）−，C.A.
31，1621；2′，7′−ジ（アルキル）−，C.A.31，
1388；2′，7′−ジエチルまたは2′，7′−ジブチル
−，C.A.27，5056；2′，7′−ジメチル，C.A.83，
1897s；2′，4′，5′，7′−テトラブロモ−５または
６−カルボキシ−，C.A.63，13210h。 本発明の化合物は、リガンドと受容体からなる
特異的結合対の構成成分との新規なケイ光複合体
（conjugate）を包含する。この複合体は、特に免
疫分析における試薬として多用な用途を有する。
本発明の化合物は、普通少なくとも２個のクロロ
置換基を有する２，７−ジ脂肪族−９−置換−６
−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オン類で
あり、その前駆物質はキサンテンの２位または９
位に結合している脂肪族または芳香族の基に結合
基または官能基を有している。 より具体的には、本発明はフルオレセインの類
似物であるケイ光化合物、特に２，７−ジ脂肪族
−置換−９−置換−６−ヒドロキシ−3H−キサ
ンテン−３−オン類が特異結合対の一方又は担体
に結合した複合体に関する。この化合物は通常
１，８−位置以外の位置に少なくとも２個のクロ
ロ置換基を有し、２位または９位、特に９位の炭
化水素置換基に結合している特異的結合対の１成
分への結合のための結合用の官能基を有する。 この複合体は特異的結合対の構成要素の分析に
おける試薬として特に有用である。 本発明の複合体のケイ光性前駆物質は炭素数が
約15以上、通常は21以上で、約40以下、特に炭素
数約22〜36である。これは１，８−位置以外に位
置に少なくとも２個、最大６個程度までの塩素原
子（クロロ基）を有しているのが好ましい。塩素
のほかに存在しうるヘテロ原子は臭素、カルコゲ
ン（特に酸素とイオウ）および窒素であり、ヘテ
ロ原子は少なくとも４個、通常は20個以下、特に
約16個以下、好ましくは約12個以下の範囲内で存
在する。塩素以外のヘテロ原子としては、酸素が
少なくとも３個、通常は少なくとも５個存在し、
キサンテン環の一部を構成する酸素以外の酸素原
子は非オキソ型カルボニルまたはオキシ、特に
酸、エステルまたはエーテル（普通は炭素と水素
だけに結合）として存在する。ここで非オキソ型
カルボニルとは、ヘテロ原子（例えば酸素原子）
に結合されているカルボニル（−Ｃ（Ｏ）−）の意
味である。イオウは一般にスルホニル、チオエー
テルまたはメルカプトとして存在し、窒素は一般
にアミノまたはアミド（炭素と水素のみに結合）
として存在する。 このケイ光化合物は、0.05Mリン酸緩衝液（PH
８）中で約500nmより長波長に吸収極大を有し、
同じ媒質中での吸光係数が少なくとも約65000、
通常は少なくとも70000であり、同じ媒質中での
ストークスシフトが少なくとも約10nm、通常は
少なくとも約12nmであるという特徴を更に有す
る。 本発明の９−置換−２，７−ジアルキル置換キ
サンテンは、一般に下記一般式で表わされる。 上記式中 ρは脂肪族基、一般に脂肪族ヒドロカルビレン
（炭素と水素のみからなる；飽和または不飽和、
分岐鎖または直鎖の何れでもよい）、特にアルキ
レン、より具体的には（CH₂）εであり（εは１
〜12、通常は１〜６、特に１〜４の数値）；ρの
炭素数は一般に１〜12、通常１〜６、特に１〜４
であり； ２個のψ′は同一でも異別でもよいが、一般にα
に結合している場合を除いて同一であり、それぞ
れ水素または非オキソ型カルボニル官能基である
か、または一方のψ′のみが非オキソ型カルボニル
結合官能基であつてもよく； Ｌはキサンテン骨格の９位とψの間の直接結合
または炭素数１〜20、通常は１〜16、特に１〜10
の一般に有機の２価の基であり、ここで該２価基
は通常炭素数約２〜６の脂肪族鎖または炭素数約
６〜12、通常６〜10の芳香族鎖或いはこの両者か
らなる炭素水素鎖を有し；Ｌは芳香族の場合に
は、ハロ、特にクロロ；非オキソ型カルボニル；
不活性イオウ酸、エステルおよびアミドを含むチ
オ；アミノ、特に第三アミノまたはアミド；なら
びにオキシから選ばれた置換基を一般に０〜４
個、通常は１〜４個、特に２〜４個有しており、
この置換基は一般に炭素数０〜４のもので、飽和
炭素原子に結合しているヘテロ原子間には少なく
とも２個の炭素原子が介在しており； αは特異的結合対を構成しうる有機化合物、す
なわちリガンドまたは受容体の何れかであり； αがψまたはψ′に共有結合しており、この共有
結合は一般にアミド、メチレン第二アミノ、エー
テル、チオエーテルまたはアゾ結合を含み； ψは、αに結合していない場合には末端がヘテ
ロ原子含有官能基となる基であり、この末端のヘ
テロ原子含有官能基は、Ｌの炭素原子に直接結合
しているか、或いは炭素数１〜４、通常は２〜４
のアミノ酸、アルキレンアミノまたはアルキレン
オキシ基を１単位とする１〜４単位のオリゴマー
を介して結合していてもよく；上記末端官能基は
一般に、オキソ型カルボニルおよび非オキソ型カ
ルボニルを含むオキソ；アミノ；オキシ；チオ；
または活性ハロゲン；特に非オキソ型カルボニル
であり、ここでオキソ型カルボニルとは、炭素又
は水素に結合されているカルボニル（−Ｃ（Ｏ）
−）の意味であり； PHは、平均で少なくとも１からαの分子量を
500、通常は1000で割つた値までの数値である。 ケイ光性の基（カツコ内の基）には、キサンテ
ノンの１，８−位置を除いた位置に結合した２〜
６個のクロロ置換基が存在しているのが望まし
い。また、４，５−位置は非置換でもよいが、一
方または両方（通常は両方）がブロモ、クロロま
たは炭素数１〜６、通常は１〜３のアルキルで置
換されていてもよい。 このケイ光化合物又は有機化合物（α）との複
合体は、担体（support）に共有結合または非共
有結合により結合させうる。この担体はケイ光体
または有機化合物の何れかを介して結合させるこ
とができる。担体については後で詳述する。 一般に、９−フエニル置換基を有する本発明の
化合物は下記一般式で表わされる： 上記式中、 Ｒは、炭素数１〜８、通常は１〜６、特に１〜
４、好ましくは１〜３の、置換または非置換、飽
和または不飽和の脂肪族基、特に炭素数１〜６、
通常１〜４のアルキルまたはカルボキシアルキル
であり； Ｚはカルボキシであり； ＷはＹへの直接結合または１〜16、すなわち０
であるか、通常は１〜16、特に１〜８個の炭素原
子と１〜10、通常は２〜８個のヘテロ原子を含有
する２価の基であり；該ヘテロ原子はカルコゲン
（酸素とイオウ）または窒素であつて、カルコゲ
ンは炭素のみに結合した状態で存在し（すなわち
オキシまたはオキソ型）、窒素は炭素と水素のみ
に結合した状態で存在し（アミノおよびアミ
ド）；炭素は一般にエチレン性不飽和結合を０〜
２個有する芳香族または脂肪族のもの、特に脂肪
族不飽和結合を有しないものであり；Ｗは好都合
には炭素数１〜４の単位（例、アルキレン、アミ
ノ酸、オキシアルキレン、アミノアルキレンな
ど）のモノマーまたはオリゴマーであり； Ｙは、Ａと一緒になつて、アミノ、ヒドロキ
シ、メルカプトのようなＡがＹと一緒になつてい
ないときにＡに存在していたヘテロ官能基（ヘテ
ロ原子含有官能基）と共有結合を形成することの
できる活性官能基、例えばオキソ型および非オキ
ソ型カルボニル、オキシ、チオ、アミノ、活性ハ
ロゲン、活性オレフイン、無機アシル基（例、ス
ルホニル）などを形成していてもよく、或いはＹ
はメチレンまたはヘテロ原子含有の何れかの結合
官能基として作用し； Ａは、特異的結合対の一方、すなわちリガンド
または受容体であり、リガンドはハプテン性また
は抗原性のものでよく、一般に分子量は約125か
ら上限は無限であり、大ていはリガンドまたは受
容体の性質に応じて範囲は変動するけれども大部
分のリガンドの分子量の上限は10000000より普通
には2000000であり； ｍは０〜３、より普通には０〜２であり； ｎは、平均で１からＡの分子量を500で、より
一般には1000で、しばしば2000で割つた値までの
数値であり、分子量が600000をこえる特異的結合
対では、ｎは一般にＡの分子量を5000で割つた値
をこえないであろう。更に、通常は少なくとも２
個のクロロ置換基が、特定の原子が指示されてい
ない任意の利用可能な位置に結合して存在してい
る。また、４，５−位置は既述のように置換され
ていてもよい。更に、この複合体またはケイ光体
前駆物質は分子量が少なくとも約10000から無限
までの担体に結合していてもよい。 好ましい群の化合物は一般に下記一般式を有す
る。 上記式中、 R′は炭素数１〜６、通常は１〜４、好ましく
は１〜３のアルキレンであり； Ｄは水素またはカルボキシであり； Z′はカルボキシであり； m′は０〜３、通常は０〜２であり； Y′は、A′と一緒になつて、非オキソ型カルボ
ニル（そのイオウ類似物を含む）、少なくとも１
個の水素原子に結合したアミノ、メルカプト、活
性エチレン（通常はα−カルボニルを有する）、
ハロメチルカルボニル（ハロゲンは原子番号17〜
53のもの）、スルホニルなどの活性官能基を形成
してもよく；A′と一緒にならない場合には、
Y′はメチレンまたはヘテロ原子含有型の結合官
能基であり、ヘテロ原子含有型は通常アミド、エ
ステル、エーテルまたはアゾ結合であり； W′は、Y′への直接結合、または水素以外の原
子（炭素と窒素と酸素とイオウ、好ましくは炭素
と窒素と酸素）の数が１〜16、通常は１〜12、好
ましくは１〜８であり、０〜８個の炭素原子と０
〜８個のヘテロ原子が存在し、炭素およびヘテロ
原子の数の合計が少なくとも１である結合基であ
り、ここで窒素は水素と炭素のみに結合するアミ
ノまたはアミドの何れかであり、酸素とイオウは
オキシ（チオ）またはオキシ（チオノ）として炭
素のみに結合し、炭素は一般にエチレン不飽和結
合を０〜１個含有する脂肪族基として存在し、通
常脂肪族不飽和結合は含有せず；W′は炭素数１
〜８、通常１〜４のアルキレンもしくはアルケニ
レン、炭素数１〜８、通常１〜４のオキソアルキ
レンもしくはオキソアルケニレン、イミノ
（NH）、Ｎ−ホルミルアミノ酸もしくはＮ−ホル
ミルポリアミノ酸（例、グリシンもしくはポリグ
リシン、このアミノ酸は約１〜４単位存在し、末
端カルボキシはY′A′ある）などでよく； n′は、平均で少なくとも１からA′の分子量を
500で、通常は1000で、より普通には2000で割つ
た値までの数値であり、A′の分子量が500000を
こえる場合には、n′の上限はより通常にはA′の分
子量を5000で割つた値であり； 合計で最大５個、通常は４個以下のカルボキシ
ル基と０〜６個、好ましくは２〜５個のクロロ基
が利用可能な炭素原子に結合しており； A′は特異的結合対の一方の要素、すなわちリ
ガンドまたは受容体であり、ここでリガンドはハ
プテンまたは抗原でよく、ハプテン性リガンドに
は医薬、ホルモン、汚染物質、化学工業の対象と
なる化合物、農薬、代謝産物などの対象となる化
合物が含まれ；抗原は細胞、ウイルス、フアージ
などに存在するように、主にタンパク質、多糖類
または核酸単独、またはこれらが相互にもしくは
他物質と組合わさつたものである。ハプテンは分
子量が一般に約125〜2000、より普通には1000以
下であるのに対し、抗原は分子量が一般に約
2000、より普通には約5000から、上限は無限、通
常は10000000以下、より普通には2000000以下で
ある。 ４，５−位置は好ましくは非置換か、クロロ置
換である。 さらに、上記の複合体は担体に結合させてもよ
い。各種の担体、例えば可溶性または不溶性、水
性もしくは有機溶媒で膨潤性または非膨潤性、天
然または合成、有機または無機、多孔性または非
多孔性などの何れの担体も使用できる。各種の重
合体型の物質には、ビニルポリマーおよびコポリ
マー、多糖類、シリコーン、ガラス、短素粒子
（国鉛、炭など）、金属もしくは金属化合物、ポリ
アミノ酸、核酸などが含まれる。 一般に、複合体形成に使用される前駆物質であ
るケイ光化合物は下記一般式で表わされる： 上記式中、 R¹は炭素数１〜６、通常１〜４、好ましくは
１〜２のアルキレンであり； D¹は水素またはカルボキシ、好ましくは水素
であり； Z¹はカルボキシであり； E^aは水素、炭素数１〜６、通常は１〜３のア
ルキルまたはクロロであり； E¹はクロロであり； W¹は結合、または水素以外の原子（すなわち、
炭素と窒素とイオウ、特に炭素と窒素と酸素）の
数が１〜12、通常１〜８で、鎖中の原子数が一般
に１〜８、通常１〜６である結合基であり；ここ
で炭素は脂肪族であり、窒素は炭素と水素のみに
結合したアミドまたはアミノ、特にアミノとして
存在し、酸素とイオウは炭素のみに結合したオキ
シ、オキソまたはこれらのイオウ類似物として存
在し； W¹は一般にエチレン性不飽和結合を０〜１個
有する飽和または不飽和、一般に飽和の脂肪族基
であつて、例えば炭素数１〜８、通常は１〜４の
アルキレンもしくはアルケニレン、Ｎ−ホルミル
アミノ酸もしくはＮ−ホルミルポリアミノ酸（末
端カルボキシはY′A′から誘導）、アミノ、メルカ
プトなどであり； Y′A′は一緒になつて炭素または窒素のみに結
合している結合用の官能基を形成し、ただしY¹
とA¹が窒素に結合している場合にはY¹A¹はカル
ボニル（その窒素およびイオウ類似物も含む）で
あり；窒素に二重結合していてもよく； Y¹A¹は非オキソ型カルボニル、ハロアセチル、
原子番号９〜53のハロゲン、特にクロロまたはブ
ロモ、マレイミド、メルカプト、アミノまたは中
心原子としてリンまたはイオウを含有する無機ア
シルであつてもよく； m¹は０〜３、通常は０〜２であり、分子内に
はY¹A¹以外のカルボキシル基が合計で５個以下、
通常は４個以下、好ましくは約２個以下存在し； ｘは０〜４、好ましくは２〜４であり、分子内
にはクロロ基が合計で６個以下、通常は４個以下
存在し、ｘ＋m¹の和は４以下である。 一般的に、リガンド受容体または担体に結合し
た本発明の組成物は下記の一般式を有する： 上記式中、 E^bは水素またはクロロ、ブロモ又はC₁〜₃アル
キル基であり； E²はクロロであり； Z²はカルボキシであり； R²は炭素数１〜６、通常は１〜３、好ましく
は１〜２のアルキレンであり； D²は水素またはカルボキシ、好ましくは水素
であり； W²はY²への直接結合または結合鎖であり、後
者の場合、結合鎖は水素以外の原子数が１〜12、
通常は１〜10、好ましくは約１〜８で、鎖中の原
子数が約１〜10、通常約１〜８、好ましくは約１
〜６のものであり；該水素以外の原子は炭素素と
酸素と窒素とイオウ、特に鎖中においては炭素と
酸素と窒素であり；ここで酸素とイオウはオキシ
またはオキソとして炭素のみに結合し、窒素はア
ミノまたはアミドとして炭素および水素のみに結
合しており、飽和炭素原子に結合しているヘテロ
原子は少なくとも２個の炭素原子によつて離間さ
れており； W²は特にアルキレンまたは式（−CONH−ア
ルキレン−）ａのカルボキサミドアルキレンもし
くはポリ（カルボキサミドアルキレン）であり、
ここでアルキレンの炭素数は約１〜２であり、ａ
は約１〜４、通常１〜３の範囲内であり； Y²は、非オキソ型カルボニル、カルバモイル、
チオカルバモイル、メチレン、アミノまたはチ
オ、特に非オキソ型カルボニル基もしくはそのイ
オウ類似基を有する官能基であり； x²は０〜４であり； m²は０〜３、特に１〜２であり； n²は１からA²の分子量を500、通常は1000、よ
り普通には2000で割つた値までの数値であり、
A²が分子量約125〜2000のリガンドである場合に
は、n²は一般に約１〜20の範囲内であり、A²が
分子量約2000〜600000のリガンドである場合には
n²は一般に約１〜100、より普通には約２〜50の
範囲内であり； A²は分子量が少なくとも約125から10000000或
いはそれ以上に及びうるハプテンまたは抗原性の
リガンドであり、ハプテンの場合は分子量が約
125〜2000であり、抗原は分子量が一般に約5000
から10000000まで、より普通には約5000ないし
2000000、特に5000〜600000の範囲内であり、リ
ガンドは、少なくとも１個の決定群またはエピト
ープ（epitopic）サイトを有する化合物であり、
この決定群サイトを識別することのできる受容体
と共に特異的結合対を構成するものであり；或い
はA²は分子量が約10000〜1000000の受容体であ
つてもよい。 最後に、場合によつては、ケイ光化合物または
これとリガンドとの複合体と、担体に結合させる
のが望ましいこともある。この場合、結合はケイ
光化合物またはリガンドの何れかから、一般には
リガンドから引用されうる。このような場合、結
合基は、ケイ光化合物またはリガンドに既に存在
している任意の好都合な官能基、或いは特にリガ
ンドの方に新たな導入した官能基でよい。このよ
うな担体と結合した組成物は一般に下記一般式
（各符号は大体において複合体に対する前出の一
般式から誘導されている）で表わされる。 上記式中、 下記を除くすべての符号は既に定義した通りで
あり； n³は少なくとも１からA²の分子量を500、通常
は1000、より普通には1500で割つた値までの数値
であり、ただしｑが０のときn³は１であり； ｑは０または１であり； ｐは少なくとも１から担体の分子量を500、担
体の分子量が500000をこえる場合にはより普通に
は1000で割つた値までの数値であり、ｐの上限は
一般には担体の分子量を5000、より普通には
10000で割つた値であり： “担体”は、分子量が少なくとも約10000で、
複数の結合用官能基（例、カルボキシ、ヒドロキ
シまたはアミノ）を有し、通常は多糖類または付
加ポリマーのように重合体である天然または合成
の高分子担体であり、この担体はA²またはカツ
コ内の複合体に残つている任意の好都合な官能基
により複合体に結合している。すなわち結合様式
は本発明にとつて重要ではない。例えば、A²が
ポリアミノ酸である場合には、担体のカルボキシ
ル基を利用してアミド結合を形成してもよいし、
或いはマレイミド基を導入してメルカプト基に結
合させてもよい。 当然ながら、本発明の化合物は、その特性に顕
著影響を及ぼさずに、上記の各種の一般式の範囲
内から逸脱するように変性させることもできる。
例えば、１または２以上の酸性アニオン基をエス
テル化またはアミド化してもよく、或いはフエニ
ル環をアルキル基ならびにシアノ、ニトロなどの
他の基で置換することもできる。しかし、このよ
うな変化は多くの場合に追加の合成工程を必要と
し、これは得られた生成物の分光学的または化学
的性質に向上があつたとしても、その向上の程度
により正当化されるほどのことはない。 次に本発明の各成分について考慮すると、まず
フルオレセイン誘導体に関しては、本発明の範囲
内に包含されるフルオレセイン誘導体前駆物質の
例として下記のものが挙げられる。 第１表 ２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−９−
（2′，4′，5′−トリカルボキシフエニル）−６−ヒ
ドロキシ−３−キサンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−９−
（2′，4′，5′−トリカルボキシ−3′，6′−ジクロ
ロ
フエニル）−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−
３−オン； ２，７−ジヘキシル−９−（2′，4′，5′−トリカ
ルボキシフエニル）−６−ヒドロキシ−3H−キサ
ンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−９−
（2′−カルボキシ−4′−イソチオシアナト3′，5′−
ジクロロフエニル）−６−ヒドロキシ−3H−キサ
ンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−９−（2′−カルボキシ−
4′−イソシアナト−3′，5′，6′−トリクロロフエ
ニル）−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−
オン； ２，７−ジメチル−９−（4′−カルボキシ−
5′−カルボキシフエニル）グリシルグリシルグリ
シンアミド−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン
−３−オン； ２，７−ジ（カルボキシメチル）−９−（4′，
5′−ジカルボキシ−2′，3′，6′−トリクロロフエ
ニル）−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−
オン； ２，７−ジ（カルボキシプロピル）−４，５−
ジクロロ−９−（3′，4′−ジカルボキシフエニル）
−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オ
ン； ２，７−ジエチル−９−（2′−カルボキシ−
4′−アミノ−3′，5′−ジクロロフエニル）−６−ヒ
ドロキシ−3H−キサンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−９−（2′−カルボキシ−
4′−メルカプトフエニル）−６−ヒドロキシ−3H
−キサンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−９−（2′−カルボキシ−
4′−カルボキシメチルフエニル）−６−ヒドロキ
シ−3H−キサンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−９−［2′−カルボキシ−
4′−（4″−カルボキシブチル）フエニル］−６−ヒ
ドロキシ−3H−キサンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−９−
［2′，4′−ジカルボキシ−5′−（カルボキサミドメ
チレン）フエニル］−６−ヒドロキシ−3H−キサ
ンテン−３−オン； ２，７−ジメチル−４，５−ジクロロ−９−
（3′−カルボキシプロピル）−６−ヒドロキシ−
3H−キサンテン−３−オン。 既に述べたように、フルオレセイン誘導体前駆
物質はリガンドおよび／または担体と結合させて
複合体を形成させる。次に適用可能なリガンドに
ついて説明する。 被分析物（Analyte） 本発明のリガンド被分析物はモノエピトープま
たはポリエピトール性であるという特徴を有す
る。ポリエピトープ性リガンド被分析物は一般に
ポリアミノ酸、すなわちポリペプチドおよびタン
パク質、多糖類、核酸ならびにこれらの混合物で
ある。このような集合混合物には細菌、ウイル
ス、染色体、遺伝子、ミトコンドリア、細胞核、
細胞膜などがある。 たいていは、本発明で使用するポリエピトープ
性リガンド被分析物は分子量が少なくとも約
5000、より普通には少なくとも約10000である。
ポリアミノ酸の類では、対象となるポリアミノ酸
は一般に分子量が5000〜5000000、より普通には
約20000〜1000000であり；対象となるホルモンは
分子量が通常は約5000〜60000の範囲内である。 多様なタンパク質を、類似の構造特徴を有する
タンパク質、特定の生物学的機能を有するタンパ
ク質、特定の微生物、特に病気の原因となる微生
物に関連するタンパク質などの分類で考慮するこ
とができる。 下記は構造により分類したタンパク質の種類で
ある。 プロタミン類 ヒストン類 アルブミン類 グロブリン類 硬タンパク質類 リンタンパク質類 ムコタンパク質類 色素タンパク質類 リポタンパク質類 核タンパク質類 糖タンパク質類 プロテオグリカン類 上記に分類されないタンパク質（例、ソマトロ
ピン、プロラクチン、インシユリン、ペプシン） 人に血漿中に存在する多数のタンパク質は臨床
的に重要であり、これらには次のものが含まれ
る。 プレアルブミン アルブミン α₁−リポタンパク質 α₁−酸糖タンパク質 α₁−抗トリプシン α₁−糖タンパク トランスコルチン ４，6S−ポストアルブミン トリプトフアン欠乏α₁−糖タンパク質 α₁x−糖タンパク質 チロキシン結合性グロブリン インター−α−トリプシン阻害因子 Ge−グロブリン （Ge １−１） （Ge ２−１） （Ge ２−２） ハプトグロビン （Hp １−１） （Hp ２−１） （Hp ２−２） セルロプラスミン コリンエステラーゼ α₂−リポタンパク質 ミオグラビン Ｃ−反応性タンパク質 α₂−マクログロブリン α₂−HS−糖タンパク質 Zn−α₂−糖タンパク質 α₂−ノイラミノ−糖タンパク質 エリスロポイエチン β−リポタンパク質 トランスフエリン ヘモペキシン フイブリノーゲン プラスミノーゲン β₂−糖タンパク質 β₂−糖タンパク質 免疫グロブリンＧ，（IgG）又はγG−グロブリ
ン 分子式：γ₂κ₂又はγ₂λ₂ 免疫グロブリンＡ，（IgA）又はγA−グロブリ
ン 分子式：（α₂κ₂）ｎ又は（α₂λ₂）ｎ 免疫グロブリンＭ，（IgM）又はγM−グロブリ
ン 分子式：（μ₂κ₂）⁵又は（μ₂λ₂）⁵ 免疫グロブリンＤ，（IgD）又はγD−グロブリ
ン（γD） 分子式：（δ₂κ₂）又は（δ₂λ₂） 免疫グロブリンＥ，（IgE）又はγE−グロブリ
ン（γE） 分子式：（ε₂κ₂）又は（ε₂λ₂） 遊離κおよびλL鎖（light chains） 相補因子： C′1 C′1q C′1r C′1s C′2 C′3 β₁A α₂D C′4 C′5 C′6 C′7 C′8 C′9 重要な血液凝固因子には下記のものがある。 血液凝固因子 国際記号 名 称 フイブリノーゲン プロトロンビン ａ トロンビン 組織性トロンボプラスチン と プロアクセレリン、促進剤グロブリ プロコンバーチン 抗血友病性グロブリン（AHG） クリスマス因子、血漿トロンボプラ
スチン成分（PTC） スチユアートプロワー因子、 アウトプロトロンビン XI 血漿トロンボブラスチン前駆体
（PTA） XII ハゲマン因子 フイブリン安定化因子 重要なタンパク質ホルモンには次のものがある。 ペプチドおよびタンパク質ホルモン 上皮小体ホルモン チロカルシトニン インシユリン グルカゴン レラキシン エリスロポイエチン メラノトロピン（黒血球刺激ホルモン、インテ
ルメジン） ソマトトロピン（成長ホルモン） コルチコトロピン（向副腎皮質性ホルモン） チロトロピン（向甲状腺性ホルモン） 卵胞刺激ホルモン 黄体形成ホルモン（間質細胞刺激ホルモン） 黄体乳腺刺激ホルモン（ルテオトロピン、プロ
ラクチン） ゴナドトロピン（胎盤性性腺刺激ホルモン） 組織ホルモン セクレチン ガストリン アンギオテンシンおよび ブラデイキニン 人胎盤性ラクトゲン 下垂体後葉からのペプチドホルモン オキシトシン バンプレツシン 放出因子（RF） CRT、LRF、TRF、ソマトトロピン−RF、
GRF、FSH−RF、PIF、MIF 対象となる他の重合体物質はムコ多糖類および
多糖類である。 微生物から誘導される抗原性多糖類の例を次に
示す。 【表】 【表】 【表】 分析を受ける微生物は、そのままでも、或いは
溶解、粉砕その他の破砕処理したものでもよく、
得られた組成物または部分（例、抽出によるも
の）を分析する。対象となる微生物は下記を含
む。 コリネバクテリウム属（Corynebacteria） ジフテリア菌（Corynebacterium diptheriae） 肺炎球菌（Pneumococci） 肺炎双球菌（Diplococcus pheumoniae） 連鎖球菌属（Streptococci） 化膿連鎖球（Streptococcus pyogenes） 睡液連鎖球菌（Streptococcus salivarus） ブドウ球菌属（Staphylococci） 黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus） 白色ブドウ球菌（Staphylococcus albus） ナイセリア属（Neisseriae） 髄膜炎菌（Neisseria meningitidis） 淋菌（Neisseria gonorrheae） 腸内菌科 大腸菌群細菌： 大腸菌（Escherichia coli） アエロゲネス菌（Aerobacter aerogenes） 肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae） サルモネラ属： 腸チフス菌（Salmonella typhosa） 豚コレラ菌（Salmonella choleresuis） ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium） シゲラ属： シガ赤痢菌（Shigella dysenteriae） シユミツツ赤痢菌（Shigella schmitzii） シゲラ・アラビノタルダ（Shigella
arabinotarda） フレクスナー赤痢菌（Shigella flexneri） ボイド赤痢菌（Shigella boydii） ソンネ赤痢菌（Shigella sonnei） その他の腸内菌 プロテウス属： 尋常変形菌（Proteus vulgaris） 奇怪変形菌（Proteus mirabilis） モルガン変形菌（Proteus morgani） 縁濃菌（Pseudomonas aeruginosa） アルカリ大便菌（Alcaligenes faecalis） コレラ菌（Vibrio cholerae） ヘモフイルス−ボルデテラ族 インフルエンザ菌（Hemophilus influezae） ヘモフイルス・ドウクレイ（H.ducreyi） ヘモフイルス・ヘモフイルス（H.
hemophilus） ヘモフイルス・アエギプチクス（H.
aegypticus） パラインフルエンザ菌（H.parainfluenzae） 百日咳菌（Bordetella pertussis） パスツレラ属 ペスト菌（Pasteurella pestis） 野兎病菌（Pasteurella tulareusis） ブルセラ属 マルタ熱菌（Brucella melitensis） 牛流産菌（Brucella abortus） 豚流産菌（Brucella suis） 好気性胞子形成菌 炭ソ菌（Bacillus anthracis） 枯草菌（Bacillus subtilis） 巨大菌（Bacillus megaterium） セレウス菌（Bacillus cereus） 嫌気性胞子形成菌 ボツリヌス菌（Clostridium botulinum） 破傷風菌（Clostridium、tetani） ウエルチ菌Ａ型（Clostridium perfringens） ノービ菌（Clostridium novyi） セプチツクス菌（Clostridium septicum） ヒストリチクス菌（Clostridium histolytium） 第三型ロデラ菌（Clostridium tertium） クロストリジウム・ビフエルメンタンス
（Clostridium bifermentans） スポロゲネス菌（Clostridium sporogenes） ミコバクテリウム属 人型結核菌（Mycobacterium
tuberculosishominis） 牛型結核菌（Mycobacterium bovis） 鳥型結核菌（Mycobacterium avium） ライ菌（Mycobacterium leprae） パラ結核性腸炎菌（Mycobacterium
paratuberculosis） 放線菌類（真菌様細菌） 牛放線菌（Actinomyces israelii）および （Actinomyces bovis） アクチノマイセン・ネスルソデイ （Actinomyces naesiundii） ノカルジア・アステロイデス（Nocardia
asteroides） ノカルジア・ブラジリエンシス（Nocardia
brasiliensis） スピロヘータ目 梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum） フランベジア・トレポネーマ（Treponema
pertenue） ピンタ・トレポネーマ（Treponema
carateum） 小スピリルム（Spirillum minus） ストレプトバチルス・モニリホルミル （Streptobacillus moniliformis） オーベルマイエ回帰熱スピロヘータ Borrelia recurrentis） 黄ソ出血病レプトスピラ （Leptospira icterohemorrhagiae） 犬レプトスピラ（Leptospira canicola） マイコプラズマ属 マイコプラズマ・ニユーモニアエ （Mycoplasma pneumoniae） その他の病原菌 単球病リステリア（Listeria monocytogenes） 豚丹毒菌（Erysipelothrix rhusiopathiae） ソ径肉芽腫菌（Donvania granulomatis） バチルス型バルトネラ（Bartonlla
bacilliformis） リケツチア属（細菌様寄生虫） 発疹熱リケツチア（Rickettsia prowazekii） リケツチア・ムーセリ（Rickettsia mooseri） 班点熱リケツチア（Rickettsia rickettsii） コノリ・リケツチア（Rickettsia conori） リケツチア・オーストラリア（Rickettsia
australis） リケツチア・シビリクス（Rickettsia
sibiricus） リケツチア・アカリ（Rickettsia akari） つつが虫リケツチア（Rickettsia
tsutsugamushi） Ｑ熱リケツチア（Rickettsia burnetii） リケツチア・キンタナ（Rickettsia quintana） クラミジア（分類不可能な寄生虫、細菌／ウイル
ス性） クラミジア薬剤（名称未確定） 真菌類 クリプトコツクス・ネオフオルマンス （Cryptococcus neoformans） プラストマイセス・デルマチジス （Blastomyces dermatidis） ヒストプラズマ・カプスラツム （Histoplasma capsulatum） コクシジオイデス・イミチス （Coccidioides immitis） パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス （Paracoccidioides brasiliensis） ガロ瘡カンジダ（Candida albicans） アスペルギルス・フミガツス （Aspergillus fumigatus） かさ状ケカビ（Mucor corymbifer（Absidia
corymbifera）） 藻菌類： リゾプス・オリザエ（Rhizopus oryzae） リゾプス・アルリスズ（Rhizopus arrhizus） リゾプス・ニグリカンス（Rhizopus
nigricans） スポロトリカム・シエンキイ（Sporotrichum
schenkii） フオンセカエア・ペトロゾイ（Fonsecaea
pedrosoi） フオンセカエア・コンパクタ（Fonsecaea
compacta） フオンセカエア・デルマチジス（Fonsecaea
dermatidis） クラドスポリウム・カルリオニイ
（Cladosporium carrionii） フイアロフオラ・ベルルコサ（Phialophra
verrucosa） アスペルギルス・ニズランス（Aspergillus
nidulans） マゼレラ・マイセトミ（Madurella
mycetomi） マゼレラ・グリセア（Madurella grisea） アレシエリア・ボイジイ（Allescheria
boydii） フイアロスホラ・ゼアンセルメイ
（Phialosphora jeanselmei） ミクロスポルム・ギプセイム
（Microsporum gypseum） トリコフイトン・メンタグロフイテス
（Trichophyton mentagrophytes） ケラチノマイセス・アジエルロイ
（Keratinomyces ajelloi） ミクロスポルム・カニス（Microsporum
canis） トリコフイトン・ルブルム（Trichophyton
rubrum） ミクロスポルム・アンドウイニ
（Microsporum andouini） ウイルス アデノウイルス類 ヘルペスウイルス類 単純性庖疹 水痘 帯状庖疹 ウイルスＢ シトメガロウイルス 痘疹ウイルス類 天然痘（痘瘡） 種痘 牛痘ウイルス 変態痘 伝染性軟属腫 ピコルナウイルス（Picornavirus）類 ポリオウイルス コツクスサツキーウイルス エコーウイルス（Echovirus） リノウイルス（Rhinovirus） 粘液ウイルス類 インフルエンザ（Ａ，ＢおよびＣ） パラインフルエンザ（１〜４） 耳下腺炎ウイルス ニユーカツスル病ウイルス 麻疹ウイルス 牛疫ウイルス 犬ジステンパーウイルス 呼吸シンシチウムウイルス 風疹ウイルス アルボウイルス（Arbovirus）類 東部馬脳炎ウイルス 西部馬脳炎ウイルス シンドビス（Sindbis）ウイルス チクグンヤ（Chikugunya）ウイルス セムリキ森林ウイルス マヨラ（Mayora）ウイルス セントルイス脳炎ウイルス カリフオルニア脳炎ウイルス コロラドチツク熱ウイルス 黄熱病ウイルス デング熱ウイルス レオウイルス（Reovirus）類 レオウイルス１〜３型 肝炎ウイルス類 Ａ型肝炎ウイルス Ｂ型肝炎ウイルス 腫瘍ウイルス類 ラウシヤー（Rauscher）白血病ウイルス グロス（Gross）ウイルス マロニー（Maloney）白血病ウイルス モノエピトープ性リガンド被分析物は一般に分
子量が約100〜2000、より普通には125〜1000であ
る。対象となる被分析物には薬物、代謝産物、殺
虫剤、汚染物質などがある。 対象となる薬物に含まれるものとして、まずア
ルカロイドがある。アルカロイドには、モルフイ
ンアルカロイド（モルヒネ、コデイン、ヘロイ
ン、デキストロメトルフアン、これらの誘導体お
よび代謝産物を含む）、コカインアルカロイド
（コカイン、ベンゾイルエクゴニン、これらの誘
導体および代謝産物を含む）、麦角アルカロイド
（リゼルグ酸のジエチルアミドを含む）、ステロイ
ドアルカロイド、イミナゾイルアルカロイド、キ
ナゾリンアルカロイド、イソキノリンアルカロイ
ド、キノリンアルカロイド（キニーネおよびキニ
ジンを含む）、ジテルペンアルカロイド、ならび
にこれらの誘導体および代謝産物がある。 別の群の薬物はステロイドであり、これはエス
トロゲン、ゲストロゲン、アントロゲン、副腎皮
質ステロイド、胆汁酸、強心剤グリコシドおよび
アグリコン（ジゴキシンおよびジゴキシゲニン、
サポニンおよびサポゲニンを含む）、ならびにこ
れらの誘導体および代謝産物がある。ジエチルス
チルベストロールのような擬ステロイド物質も包
含される。 次の群の薬物は５または６員環のラクタムであ
り、これにはバルビツール酸化合物（例、フエノ
バルビタール、セコバルビタール）、ジフエニル
ヒダントイン、プリミドン、エトスクシミドおよ
びこれらの代謝産物がある。 次の群の薬物はアルキルの炭素数が２〜３のア
ミノアルキルベンゼンであり、これにはアンフエ
タミン、カテコールアミンの類が包含され、具体
的にはエフエドリン、Ｌ−ドーパ、エピネフリ
ン、ナルセイン、パパベリン、これらの代謝産物
および誘導体が含まれる。 次の群の薬物は、ベンゾ複素環化合物であり、
これにはオキサゼパム、クロルプロマジン、テグ
レトール、イミプラミン、これらの誘導体および
代謝産物が含まれ、複素環はアゼピン、ジアゼピ
ンおよびフエノチアジンである。 次の群の薬物はプリンであり、これにはテオフ
イリン、カフエイン、これらの代謝産物および誘
導体が含まれる。 次の群の薬物はマリフアナから誘導されるもの
であつて、これにはカンナビノールおよびテトラ
ヒドロカンナビノールが含まれる。 次の群の薬物は、ビタミンＡ，Ｂ（B₁₂など）、
Ｃ，Ｄ，ＥおよびＫ、葉酸、チアミンのようなビ
タミン類である。 次の群の薬物はプロスタグランジンであつて、
これはヒドロキシル化および不飽和の程度と位置
で各種の種類に分かれる。 次の群の薬物は抗生物質であり、これにはペニ
シリン、クロロマイセチン、アクチノマイセチ
ン、テトラサイクリン、テラマイシン、これらの
代謝産物および誘導体が含まれる。 次の群の薬物はヌクレオシドおよびヌクレオチ
ドであり、これにはATP、NAD、FMN、アデ
ノシン、グアノシン、、チミジンおよびシチジン
ならびにこれらの適当な糖およびリン酸置換生成
物が含まれる。 次の群の薬物はその他の雑多な薬物であり、こ
れにはメタドン、メプロバメート、セロトニン、
メペリジン、アミトリプチリン、ノルトリプチリ
ン、ライドカイン、プロカインアミド、アセチル
プロカインアミド、プロプラノロール、グリセオ
フルビン、バルプロ酸、ブチロフエノン、抗ヒス
タミン剤、抗コリン剤（例、アトロピン）、これ
らの代謝産物および誘導体がある。 次の群の化合物はアミノ酸および小ペプチドで
あり、これにはポリヨードチロニン（例、チロキ
シンおよびトリヨードチロニン）、オキシトシン、
ACTH、アンギオテンシン、メチオニン−およ
びロイシン−エンケフアリン、これらの代謝産物
ならびに誘導体が含まれる。 疾病病状に関係する代謝産物にはスペルミン、
ガラクトース、フエニルピルビン酸およびポルフ
イリン１型がある。 次の群の薬物は、ゲンタマイシン、カナマイシ
ン、トブラマイシンおよびアミカシンのようなア
ミノグリコキシドである。 対象となる殺虫剤にはポリハロゲン化ビフエニ
ル、リン酸エステル、チオホスフエート、カルバ
メート、ポリハロゲン化スルフエナミド、これら
の代謝産物および誘導体がある。 受容体型の被分析物に関しては、分子量は一般
に10000ないし２×10⁶、より普通には10000ない
し10⁶の範囲内である。免疫グロブリンIgA、
IgG、IgEおよびIgMについては、分子量は一般
に約160000〜10⁶の範囲内である。酵素の分子量
は一般に約10000〜6000000である。天然受容体は
多岐にわたり、一般に分子量は約25000以上であ
つて、10⁶またはそれ以上に達することもあり、
アビジン、チロキシン結合性グロブリン、チロキ
シン結合性プレアルブミン、トランスコルチンな
どの物質を包含する。 本発明のフルオレセイン誘導体の多くの応用に
おいて、リガンドを担体に結合させることが望ま
しい。この結合は、直接、リガンドを中間に介在
させて、またはリガンドに結合させながら担体直
接に行われる。 多用な担体が使用できる。担体すなわち粒子は
天然物、天然物を合成手段により変性したもの、
および合成物から得ることができる。特に重要な
ものは、多糖類、特に架橋多糖類、例えばアガロ
ース（Sepharoseとして市販）、デキストラン
（SephadexおよびSephacylとして市販）、セルロ
ース、でんぷんなどである。その他の材料にはポ
リアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルア
ルコール、ヒドロキシエチルメタクリレートとメ
チルメタクリレートのコポリマー、シリコーン、
ガラス（Bioglasとして市販）、核酸、ポリアミ
ノ酸、菌体などがある。固体粒子のほかに、内部
液体を収容し、或る空間を区画する作用をする親
油性または両親媒性膜を有する液状粒子も使用で
きる。このような粒子には小胞、細胞およびリポ
ゾームがある。 粒子は、多孔質または非多孔質、水性または有
機媒質で膨潤性または非膨潤性、架橋または非架
橋、表面が平滑または粗面などの点に関して何れ
でもよく、一般にヒドロキシル、アミノ、カルボ
キシなどの多様な官能基を有し、これらの官能基
は主鎖に直接結合しているか、または結合鎖によ
つて結合している。 多孔性粒子は多様なカツト
オフ（cut off）値を有し、分子量は一般に約
10000から数百万以上にも達するが、通常は
20000000をこえない。 既に述べたように、フレオレセイン化合物とリ
ガンドおよび／または担体との間には多様な結合
鎖が使用できる。結合基の選択は、利用可能な、
もしくは容易に導入できる官能基の種類、結合鎖
の所望の長さ、結合鎖を特定に環境に備えさせる
ことが望ましいかどうか、化学的または物理的性
質（例、正または負への帯電、溶解度の増大、双
極子効果）などに応じて大幅に変動しよう。 次の表は、フレオレセイン化合物をリガンドに
結合するのに使用できる多様な結合基を示す。 【表】 上の表において、 Ｇは炭素数１〜８、通常は１〜６のアルキレン
であり；G′は炭素数２〜６、通常は２〜４のア
ルキレンであり；ｇとg′はそれぞれ１〜６、通常
は１〜４である。上の表は単により普通の結合基
の例示にすぎず、他の結合基も特殊な情況では利
用できる。例えば、チロシルのようにフエノール
基が存在する場合にはアリールジアゾニウム官能
基を使うことができる。また、フルオレセイン化
合物とリガンドの官能基を逆にする（それに伴な
つて結合基の方向も逆向きになる）ことができる
ことも理解されよう。 本発明の前駆体化合物は多くの望ましい性質を
有する。この生成物は顕著な水溶性を有し、それ
によりこれを多様なポリペプチドに結合して複合
体を形成しても、ポリペプチドの水溶性に顕著な
悪影響を及ぼしたり、ポリペプチドが本発明の前
駆体化合物の分光学的性質に悪影響を及ぼすこと
がない。 本発明の化合物の分光学的性質に関しては、こ
の化合物は一般に500nm、より普通には510nmを
こえた比較的長波長で吸光する。すなわち、生理
的液体を扱うときに見られるような天然のケイ光
は、この天然ケイ光体を著しく励起しない波長範
囲の励起光線を使用することにより実質的に避け
られる。また、本発明の化合物は比較的急峻な吸
光ピークおよび発光ピークを示す。そのため、ケ
イ光体と消光体の間で効率的な重なりを得ること
ができ、約70Åの距離までで効率的な消光が可能
となる。本発明のケイ光化合物はまたストークシ
フトが大きいので、吸光帯と発光帯のピークが少
なくとも10nm、しばしば少なくとも15nmは離れ
る。この大きなストークスシフトにより、観測さ
れるケイ光に対するバツクグラウンドの防害が最
小限ですむ。 本発明の前駆体化合物は慣用手段によつて製造
される。適当なレソルシノールとカルボン酸もし
くは無水物をルイス酸（例、塩化亜鉛）の存在下
に混合し、混合物を目的生成物を形成するのに十
分な時間加熱する。その後、生成物を常法により
精製してもよい。 本発明の前駆体化合物は、特にタンパク結合分
析におけるリガンドおよび／または担体への複合
体形成材料として、多様な用途がある。この複合
体は、検体中の対象化合物の存在を定性的、半定
量的または定量的に測定するのに使用できる。被
検出化合物が生理的液体中に含まれている場合、
この種の液体としては、血清、尿、唾液、リンパ
液などがある。対象化合物が化学工業または環境
問題に関連する物質である場合、試料（検体）は
水性媒質、有機媒質、土壌、無機混合物などであ
ることがある。 免疫分析または他の診断的応用に使用するため
には、分光学的に活性な前駆体化合物を、被分析
物の受容体またはリガンドを含む対象化合物に結
合させる（ここで、受容体とは或る空間的および
極性分子構造に特異的に結合する分子を意味し、
リガンドはこのような構造を有する有機分子であ
る）。被分析物は一般にハプテンまたは抗原であ
る。使用化合物が結合のための利用可能な官能基
を有していない場合には、このような官能基を導
入し、しかも得られた生成物に免疫学的性質が残
るように変性を行う。リガンドとなりうる被分析
物の類似物質である化合物は、リガンド類似物と
呼ばれる。 既述のように、本発明の前駆体化合物は、既知
の免疫分析法により測定しうる化合物に結合させ
てもよい。得られた複合体は、免疫媒質中で検体
中の対象化合物すなわち被分析物と競合する試薬
である。従つて、複合体は、受容体（通常は抗
体）に対して対象化合物と競争することのできる
対象化合物の構造の実質的部分をなお保有してい
る。 分光学的に活性な前駆体化合物に結合される被
分析物もしくはその類似物、受容体またはリガン
ドはモノエピトープ性またはポリエピトープ性と
いう特徴を有する。 分析は一般に、分光学的に活性な前駆体化合物
の周囲環境の変化またはケイ光体−消光体の対が
その消光体がケイ光体と相互作用するのに十分な
近さの範囲内まで近ずくことによる分光学的性質
の変化に基づく。或いは、対になつているケイ光
体とそうでないケイ光体を分離し、この２種の画
分の一方または両方のケイ光体を検出する方法も
採用できる。 第１の分析法においては、リガンドおよびケイ
光体に対する受容体または抗体を使用し、リガン
ドに対する受容体およびケイ光体に対する受容体
の同時結合が阻止されるという立体排除を利用す
る。更に、ケイ光体に対する受容体（抗ケイ光
体）がケイ光体に結合した場合には、そのケイ光
体のケイ光は実質的に減少する。ケイ光の阻害が
完全でない場合には、抗ケイ光体に消光体を結合
させておくことによりケイ光のより一層の減少を
達成することができる。この分析法は米国特許第
3998943号明細書に詳述されている。この文献で
使用されるフルオレセインを本発明のケイ光性前
駆体化合物に代えても構わない。この分析法は該
特許の３〜５欄に記載されている。 一般に、この方法は、被分析物を含有すること
が疑われる検体を、リガンド−ケイ光体複合体、
抗ケイ光体およびリガンドの受容体または抗リガ
ンド（リガンドが被分析物である場合）と混合す
ることからなる。これらの材料をpHが約５〜10、
通常は約６〜９の範囲内の水性媒質中で、約10〜
45℃の範囲内の温度において混合し、ケイ光を変
化率（rate）方式または平衡方式の何れかで測定
する。変化率方式では全部の材料を混合してから
約１秒ないし１時間以内に測定を行うのに対し、
平衡方式では約24時間まで、またはそれ以上の長
時間にわたつて測定を行うこともある。 別の免疫分析法では、ケイ光体−消光体の対を
使用し、この対の一方をリガンドと抗リガンドか
らなる特異的結合対の一方の成分に結合してお
き、他方の発色成分はその特異的結合対の同一ま
たは異なる成分に結合しておく。例えば、ケイ光
体と消光体を抗リガンドの異なる分子に結合させ
てもよい。こうすると、得られた２種類の抗リガ
ンド複合体を抗原と混合すると、ケイ光体と消光
体が消光距離の範囲内に近づく。或いは、発色物
質の対の一方をリガンドに結合し、他方の発色物
質を抗リガンドに結合することもできる。この分
析法は米国特許第3996345号明細書の第17欄から
第23欄に詳述されている。発色物質とリガンドお
よび受容体との比率は、該特許の第４〜６欄に記
載されている。 この分析法は上述した第１の方法と実質的に同
様に行われるが、ただしこの分析ではケイ光体複
合体と消光体複合体を検体と共に加え、ケイ光の
測定は既知量の被分析物を含有する分析媒質との
比較により行う。 本発明の前駆体化合物を利用してその他の分析
法も実施できる。その例としては、米国特許出願
連続番号824576号明細書に記載の重原子消光を利
用する方法または生理的液体その他の分析すべき
検体中に本来的に存在するケイ光化合物が発する
光より実質的に長波長の光を発するケイ光分子を
必要とするその他の分析法が挙げられる。 また、本発明の複合体は、米国特許出願連続番
号964099号明細書に記載のように担体と組合わせ
て使用することもできる。この分析法は、ケイ光
体分子がバルク溶液（bulk solution）状態で信
号変調物質との相互作用に利用でき、または粒子
に結合される（その場合に粒子の周囲環境はこの
相互作用を妨げる）ことに基づく。或いは、ケイ
光体複合体が粒子に結合されたときにケイ光信号
を変調する環境を粒子が与えることもできる。 実 験 以下の参考例及び実施例は、制限を目的とする
ものでなく、単に例示のために挙げたものであ
る。 参考例及び実施例において、特に指定のない限
り、温度はすべて℃であり、部と％はすべて重量
による。ただし、液体の混合物では、部と％は容
量による。参考例又は実施例で使用した略号は次
の通りである。 TLC−薄層クロマトグラフイー THF−テトラヒドロフラン DCC−ジシクロヘキシルカルボジイミド NHS−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド T₃−トリヨードチロニン 参考例 １ ２，７−ジメチル−９−（3′，4′−ジカルボキ
シ−2′，5′，6′−トリクロロフエニル）−６−ヒ
ドロキシ−3H−キサンテン−３−オンの製造 Ａ １−メチル無水フタル酸（20.0ｇ）を20％発
煙流酸（25ml）に溶解し、粉末ヨウ素（0.5ｇ）
を加えた混合物を90〜100℃に加熱し、塩素ガ
スをこの溶液中に連続的に吹き込んだ。24時間
加熱した後、更に0.5ｇのヨウ素を加え、加熱
を更に24時間続けた。２日間の加熱後に、白色
の固体が析出した。反応混合物を冷却し、100
mlの氷冷水中に投入し、過して、白色の固体
を得た。この固体を冷水（20ml）で洗浄した
後、真空乾燥した。生成物である３，５，６−
トリクロロ−４−メチルフタル酸および無水物
（）の試料を加水分解して、白色粉末、融点
226−228℃を得た。 Ｂ 機械的撹拌機と水凝縮器を備えた１の三ツ
口フラスコに上記の生成物（）（20ｇ、0.075
モル）を入れ、10％K₂CO₃400mlを加えた。得
られたスラリーを120℃の油浴で固体がすべて
溶解するまで（約１時間）還流加熱した。ｔ−
ブタノール10mlを加えた後、粉末状の
KMnO₄33.0ｇ（0.2モル）をこの高温撹拌溶液
に少しづつ加えた。KMnO₄の堆積を避けるよ
うに注意する必要がある。更に100mlの10％
K₂CO₃を使用して、KMnO₄を洗浄した。
KMnO₄を全部添加し終つた後、反応をTLCで
検査した。 ［TLCは次の方法により行つた。反応混合物
の試料を6M H₂SO₄で酸性化した。過剰の
KMnO₄をシユウ酸の飽和溶液と反応させ；得
られた溶液をエーテルで抽出した。このエーテ
ル溶液をジアゾメタンのエーテル溶液と反応さ
せ、N₂下に濃縮した。このメチルエステルの
100％ベンゼンでのTLCを測定した。R_f＝0.3。
（）から誘導されたジカルボン酸のメチルエ
ステルのR_fは0.5であつた］。 TLCですべてのジカルボン酸が消失してし
まつた後、反応を止めた。ｔ−ブタノールを留
去し、撹拌しているスラリーを6M H₂SO₄で
PH１に酸性化した。過剰のKMnO₄を固体シユ
ウ酸との反応により除去した。シユウ酸の添加
中に6M硫酸を加えて混合物のPHを１に保つた。
得られた溶液をRotovapで濃縮して、白いスラ
リーを得た。6M塩酸を全容積が約300mlになる
まで加えて固体をすべて溶解させた。得られた
溶液を室温で30分間撹拌して、微細な白色沈殿
を生じさせた。このスラリーをエーテル（３×
400ml）で抽出した。白い無機塩が水層の方に
残つた。エーテル抽出液をRotovapで蒸発さ
せ、残留する油状物をRotovapで乾燥ベンゼン
を使用して共沸蒸留により乾燥した。白い粉末
（20ｇ）が単離された。この粉末を酢酸エチル
−四塩化炭素から再結晶して、19.5ｇの３，
５，６−トリクロロトリメリツト酸（）、融
点238〜240℃を得た。 Ｃ 250mlの丸底フラスコで、上記のトリクロロ
カルボン酸（）（10ｇ）を30mlの無水酢酸に
溶解し、この混合物を窒素下で140〜145℃に45
分間加熱した。冷却後、Rotovapで高真空下、
35〜40℃加熱して無水酢酸を除去した。無水酢
酸を完全に除去した後、フラスコをそのまま高
真空下に１晩放置して、無水酢酸の最後の痕跡
を除去し、得られた生成物（）を次の工程に
そのまま使用した。 Ｄ 上で得たトリクロロ酸無水物（）（9.5ｇ）
を広口管の中で粉末状の４−メチルレソルシノ
ール（8.5ｇ、高真空で１晩乾燥したもの）と
混合し、185〜190℃の予熱された油浴で加熱し
た。無水ZnCl₂（１ｇ）をこの混合物に加え、
時々スパチユラで混合しながら加熱を1.5時間
続けた。赤色の硬い魂状物が得られた。内容物
を冷却し、赤色の固体を管からかき集めた。 この固体を８％NaOH水溶液300mlに撹拌し
ながら溶解し、氷浴で冷却し、１：1HClでPH
１に酸性化した。黄色の固体が析出した。この
沈殿を別し、水（150ml）で洗浄し、高真空
下で１晩乾燥した。乾燥後の黄色固体の量は約
15.5ｇであつた。 乾燥した黄色粉末を酢酸エチル200mlと共に
１晩撹拌し、混合物を過し、固体を15mlの酢
酸エチルで洗浄した。液の酢酸エチル溶液を
Rotovapで約35〜40℃の温度でほぼ乾固状態ま
で濃縮した。残渣を200mlのベンゼンと共に２
時間撹拌し、過した。別された固体を200
mlのCH₂Cl₂と共に３〜４時間撹拌し、また
過した。残留する固体は9.0ｇであつた。その
THF：CH₂Cl₂（１：１）中でのTLCは、これ
が殆んど純枠で、TLCでの主要スポツトは１
個だけであり、一対の小スポツトがほぼ溶媒前
面と共に移動することを示した。この黄色の固
体をこれ以上精製せずに次の反応に使用した。 上記の黄色固体混合物（6.0ｇ）を、新たに
蒸留したTHF（CaH₂上で蒸留）150mlに溶解
し、3.0ｇのDCCを加えた。得られた誘明溶液
を１晩撹拌した。翌日、生成した白色固体を
別し、この固体を15mlの乾燥THFで洗浄した
後、液と洗液を合わせて室温でRotovapによ
り蒸発乾固した。固体残渣に200mlのｎ−ヘキ
サンを加え、混合物を２時間撹拌して、過剰の
DCCを除去した。黄色固体を過し、50mlの
ｎ−ヘキサンで洗浄した。残つた固体は、
TLC（溶媒系THF：CH₂Cl₂＝60：40）が示す
ところによると、未反応物質（）と無水物
（）の混合物である。［：２，７−ジメチル
−９−（2′，4′−ジカルボキシ−3′，5′，6′−ト
リクロロフエニル）−６−ヒドロキシ−3H−キ
サンテン−３−オン；：２，７−ジメチル−
９−（3′，4′−ジカルボキシ無水物−2′，5′，
6′−トリクロロフエニル）−６−ヒドロキシ−
3H−キサンテン−３−オン］。 参考例 ２ ２，７−ジメチル−９−（3′または4′−カルボ
キサミド−4′または3′−カルボキシ−2′，5′，
6′−トリクロロフエニル）−６−ヒドロキシ−
3H−キサンテン−３−オン酢酸の製造 参考例１で得た黄色固体を乾燥THF（300ml）
に溶解し、３−β−コレスタニルグリシネート
8.5ｇと混合し、この混合物を室温で１晩撹拌し
た。次いで溶媒を除去し、残留する固体を水
（150ml）と共に２時間撹拌した。得られた混合物
を希塩酸でPH１に酸性化し、低温室で撹拌を更に
１時間続けた。析出した黄色固体を別し、100
mlの氷冷水で洗浄し、真空乾燥した。そのTLC
（THF：CH₂Cl₂＝１：１）は、これが主要化合
物２種類だけの混合物であることを示した。この
黄色固体をTHFと共にシリカゲル（30ｇ）に吸
収させ、乾燥した。乾燥粉末をシリカゲル（200
ｇ）の乾燥カラム上に投じ、THF：CH₂Cl₂混合
物（１：４）で溶離し、この溶離の状況をTLC
で追跡した。スポツトの移動速度が速い方の溶離
液を集め、溶媒を除去して、上記目的化合物のコ
レスタニルエステル誘導体を黄色粉末（2.6ｇ）
として得た。 上記エステルの加水分解は、上記エステル1.5
ｇをTHF10mlに溶解し、NaOH水溶液（水70ml
中１ｇ）を加え、得られた溶液を室温で24時間撹
拌することにより行つた。白色固体が析出した。
このアルカリ性溶液をエーテル（３×50ml）で抽
出し、水溶液を濃塩酸でPH２に酸性化した。黄色
の固体が析出した。この溶液をエーテル（３×
100ml）で抽出し、エーテル溶液を食塩水（２×
15ml）で洗浄し、エーテル除去後に得られた黄色
固体を４時間真空乾燥した。残留する固体を
CH₂Cl₂（45ml）と共に１晩撹拌すると、黄色粉末
の析出を生じた。これを別し、更にCH₂Cl₂（20
ml）で洗浄し、最終的に真空乾燥して黄色固体
（700mg）を得た。 実施例 １ 参考例２の生成物のヒトIgGへの結合 (a) この色素の活性化NHS誘導体の製造 参考例２の生成物（色素）（60mg）を乾燥THF
（１ml）に溶解し、NHS（30mg）を加えた後、
DCC（30mg）を加え、室温で３時間撹拌を行つ
た。析出した白色固体を去した。液を真空濃
縮し、残渣を10mlのｎ−ヘキサンと共に30分間撹
拌して過剰のDCCを除去した。得られた黄体粉
末を別して、そのまま使用した。 (b) 色素のNHSエステルとヒトIgGとの反応 ヒトIgG（10mg）をPH8.0の0.05Mリン酸緩衝液
1.2mlに溶解し、氷冷浴で０〜５℃に冷却した。
このタンパク質溶液を高速撹拌しながら、これに
上で調製したNHSエステル1.2mgの乾燥DMF
（40μ）中の溶液を20分間かけて添加した
（NHSエステルの添加中に溶液のPHは痕跡量の固
体Na₂CO₃の添加により8.0に保持した）。添加完
了後、混合物を室温で1.5時間撹拌し、次に
2NN・H₂OH（PH8.1に調整）１mlを加え、混合物
を低温室で更に１時間撹拌した。反応混合物を遠
心分離機にかけ、上澄み液をセフアデツクス
（Sephadex）Ｇ−25のカラムに通して、PH8.0の
0.05Mリン酸緩衝液を使用して精製した。移動速
度がより速い複合体は、吸光のλmaxが521〜
522nmで、発光のλmaxが537〜538nmであるこ
とが見出された。この複合体の色素／タンパク質
比はUV計算に基いて7.56であることが判明した。 実施例 ２ 参考例２の生成物とトリヨードチロニン（T₃）
およびデキストランの複合体 一般に、下記の反応工程の全工程において化合
物の露光を避けるように特に注意を払つた。 Ａ T₃（１ｇ）を乾燥メチルアルコール（15ml）
に懸濁させ、塩化水素ガスの緩慢な流れをこの
懸濁液に20分間通した。透明な溶液が得られ
た。Rotovapで室温において溶媒を除去し、残
渣の白色固体を真空乾燥して、そのまま使用し
た。 Ｂ トリエチルアミン（100μ）を含有する乾
燥DMF（１ml）中の上記エステル（70mg）の混
合物に、参考例２の生成物のNHSエステル
（70mgから上記の方法にしたがつて調製したも
の）を加え、この溶液を１晩撹拌した。DMF
を真空除去し、残渣を希塩酸で処理して黄色の
固体を析出させ、これを別し、水洗し、真空
乾燥した。そのTLC（THF：CH₂Cl₂＝40：60）
は、その主スポツトが１個であることを示し
た。この生成物を16プレート（20×20cm）およ
び上記の溶媒系を使用した調製用TLCにより
精製した。主スポツトをメタノールで溶出さ
せ、メタノールを除去して約40mgを得た。 Ｃ 上記生成物（30mg）のIN NaOH（２ml）中
の溶液を室温で２時間撹拌した。この溶液を希
塩酸で酸性化し、析出した黄色固体を別し、
乾燥した。この酸を更に調製用TLC（CH₂Cl₂：
MeOH：AcOH＝75：25：１）で精製し、生
成物をシリカゲルからメタノールで溶出させ
た。メタノールを除去した後、残渣を1N
NaOHに溶解し、溶液を別し、希塩酸で酸
性化した。析出した黄色沈殿を別し、水洗
し、１晩65℃で真空乾燥して、目的とする酸生
成物（13mg）を得た。その0.05Mリン酸緩衝液
中でのUVスペクトルは吸光のλmax＝519nm、
発光のλmax＝533〜534nmであつた。 Ｄ 関連出願の米国特許出願連続番号017，874号
明細書（1979，3.3出願）に記載のようにして
BHP活性化デキストラン70（シグマ社）からア
ミノデキストランを調製した。すなわち、
BHP活性化デキストラン70（500mg）を緩衝液
（0.15M NH₄OHと0.1MNaHCO₃−Na₂CO₃，
PH9.0）10mlと共に室温で１晩撹拌した。β−
メルカプトエタノール（70μ）を加え、撹拌
を室温で10時間続けた。週末にかけて室温で水
に対して透析すると、透析後の全体積は約14ml
（約500mgのデキストラン70を含有する）になつ
た。 Ｅ 上記のＣで得た酸10mgを、DCC（９mg）と
NHS（５mg）を含有する乾燥THF（１ml）にと
かし、この溶液を１晩撹拌した。白色の固体が
析出した。過後、液を真空濃縮した。残渣
をｎ−ヘキサン（10ml）で冷浸し、黄色固体
（約20mg）を分離した。THF：CH₂Cl₂（１：
１）中でのTLC検査によると、この黄色固体
は殆んどがNHSエステル（R_f大）で、少量の
出荷物質（R_f小）が共存することが示された。 Ｆ 上で製造したアミノデキストラン溶液
（300μ）を0.1N NaHCO₃−Na₂CO₃溶液（PH
9.0）300μで希釈し、これにＥで調製した
NHSエステル0.5mgのTHF25μ中の溶液を
加えた。得られた溶液を室温で1.5時間撹拌し
た。この溶液に3N NH₂OH溶液（PH8.0）0.3
mlを加え、混合物を室温で45分間撹拌した。２
分間の遠心分離後、上澄み液をセフアデツクス
Ｇ−25のカラム（１×30cm）で0.1N NaHCO₃
−Ｎ Na₂CO₃緩衝液（PH9.0）を使用して精製
した。移動がより速い複合体を捕集した（クロ
マトグラフ後の複合体溶液の全量は約２ml）。
その吸光のλmax＝521〜522nmで、発光の
λmax＝537〜538nmであつた。量子収率は参
考例２の基本フルオレセイン誘導体に比較して
43％であつた（共に500nmで励起したときの発
光ピーク面積に基づいて）。 参考例 ３ ２，７−ジメチル−９−（2′，4′または5′−ジカ
ルボキシフエニル）−６−ヒドロキシ−3H−キ
サンテン−３−オンと４，５−ジクロロ誘導体
の製造 Ａ 反応フラスコで、４−メチルレソルシノール
1.35ｇ、無水トリメリツト酸１ｇおよび
ZnCl₂100mgを混合し、この混合物を195〜200
℃に15分間加熱した。得られた固体を水で冷浸
し、過した。この沈殿を５％NaOHに溶解
し、５分間撹拌、過し、液を希塩酸でPH２
に酸性化した。析出した固体を取得後、メタノ
ールから再結晶して、橙赤色の固体、融点＞
280℃を得た。 Ｂ 上記生成物の一部をDMFに溶解し、氷酢酸
中2.2当量の塩素を加えた。反応がもはや起ら
なくなるように思われた後、生成物を単離し、
CHCl₃：MeOH（80：20）を使用した調製用
TLCで精製した。 参考例 ４ ２，７−ジ（2″−カルボキシエチル）−９−
（2′−カルボキシフエニル）−６−ヒドロキシ−
3H−キサンテン−３−オンの製造 反応フラスコに４−（2′−カルボキシエチル）
レソルシノール1.1ｇ、無水フタル酸0.45ｇおよ
びZnCl₂250mgを入れ、この混合物を160〜170℃
に0.5時間加熱した。水で処理して過した後、
得られた固体を５％NaOHに溶解し、この溶液
を15分間撹拌し、過し、液を希塩酸でPH２に
酸性化し、析出した黄色固体を別し、乾燥し
た。生成物を酢酸エチルで冷浸し、更に調製用
TLC（CHCl₃：MeOH：氷AcOH＝80：20：0.5）
で調製した。 参考例 ５ ２，７−ジ（3″−カルボキシプロピル）−９−
（2′，4′および3′，4′−ジカルボキシ−3′，5′，
6′および2′，5′，6′−トリクロロフエニル）−６
−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オンの
製造 前記と同様の方法により、反応フラスコに４−
（3′−カルボキシプロピル）レソルシノール2.6
ｇ、３，５，６−トリクロロ−１，２，４−ベン
ゼントリカルボン酸1.95ｇおよびZnCl₂100mgを入
れ、この混合物を180〜185℃に40分間加熱した。
混合物を前述と同様に処理し、最後の調製用
TLCによる生成物の精製をCHCl₃：MeOH：
AcOH＝80：20：１を使用して行つた。 次の表は、各参考例で得られたケイ光化合物の
分光学的性質を示す。 【表】 【表】 １ 0.05Mリン酸緩衝液（PH8.0）中での測定値。 ２ 0.05Mリン酸緩衝液中で475nmで励起して測
定した発光ピークに基づくフルオレセインとの
比較。 前出の参考例から、本発明の前駆体化合物が多
くの望ましい性質を有することは明らかである。
これらの化合物は500nmまたはこれより長波長で
吸光し、ストークスシフトが大きく、その分光学
的性質はタンパク質に複合化（結合）することに
より悪影響を受けない。 参考例 ６ ２，７−ジメチル−９−（カルボキシエチル）−
６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オン
の製造 トリクロロ酸無水物（）の代わりにコハク酸
無水物を使用した以外は実施例１と同様な方法に
より、上記の化合物を製造した。該化合物の吸光
λmaxは約494nmであり、発光λmaxは約512nm
であつた。 参考例 ７ ２，７−ジメチル−４，５−ジメチル−９−
（カルボキシエチル）−６−ヒドロキシ−3H−
キサンテン−３−オンの製造 トリクロロ酸無水物（）の代わりにコハク酸
無水物を使用し、適切に置換したレソルシノール
を使用した以外は実施例１と同様な方法により、
上記の化合物を製造した。該化合物の吸光λmax
は約509nmであり、発光λmaxは約526nmであつ
た。 実施例 ３ 式： を有する複合体の製造 ジメチルホルムアミド中でパラジウム（Ｏ）触
媒存在下で、５−ヨード−2′，3′−ジデオキシウ
リジンをＮ−トリフルオロアセチルプロパルギル
アミンに結合させることにより、上記複合体を製
造した。得られたヌクレオシド誘導体を、その
5′−三燐酸塩体に変換し、脱アシル化して５（３
−アミノ−１−プロピニル）−2′，3′−ジデオキ
シウリジン三燐酸塩を得た。このアミンは上記複
合体−サルコシンのＯ−アシル保護体と結合され
たものであり、次いで脱保護体化した。得られた
生成物は、約538nmの発光λmaxであつた。 実施例 ４ 式： を有する複合体の製造 相当するアデノシンを使用する以外は、実施例
10で記載したと同様な方法で上記の複合体を製造
した。 参考例 ８ ２，７−ジメチル−９−（2′−カルボキシ−３，
６−ジクロロフエニル）−６−ヒドロキシ−3H
−キサンテン−３−オンの製造 参考例１と同様の方法により標記の化合物を得
た。吸光λmaxは513nmであり、発光λmaxは529
〜531nmであつた。 参考例 ９ ２，７−ジメチル−４，5′−ジブロモ−９−
（3′または4′−カルボキサミド−4′−または3′−
カルボキシ−2′，5′，6′−トリクロロフエニル）
−６−ヒドロキシ−3H−キサンテン−３−オ
ン酢酸の製造 参考例２の化合物をブロム化することにより、
上記の化合物を得た。該化合物の吸光λmaxは
532〜533nmであり、発光λmaxは547〜550nmで
あつた。 実施例 ５ 参考例２の生成物のBSA（牛血清アルブミン）
への結合 実施例１の方法に従つて、参考例２の化合物
を、BSAに結合させた。得られた生成物の吸光
λmaxは522〜524nmであつた。 本発明の有用性を更に実証するために、本発明
の範囲内の化合物をケイ光前駆体化合物として使
用して免疫分析を行つた。この分析は免疫グロブ
リンＧ（IgG）に関するものであつた。この分析
を行うための試薬類の調製において下記の溶液を
使用した。 緩衝液：0.01M Na₂HPO₄、0.15M NaCl、２％
PEG 6000、0.05％NaN₃、PH8.0； 試薬Ｂ希釈剤：0.05M トリズマベース
（trizmabase）、0.02Mグリシン、0.01Mベ
ンズアミジン−HCl、0.15M NaCl、0.05
％ NaN₃、PH8.0； 試薬Ａ希釈剤：0.05M トリズマベース、１％胆
汁酸塩、0.01M ベンズアミジン−HCl、
0.05％ NaN₃、PH8.0； 検定剤希釈剤：0.01M Na₂HPO₄、0.15M NaCl、
0.01Mベンズアミジン−HCl、0.01％
NaN₃、PH7.2。 試薬Ａは、ローダミン−抗（hIgG）複合体
（ローダミン／タンパク質の比は11）を試薬Ａ希
釈剤で１：30まで希釈したものである。試薬Ｂは
２，７−ジメチル−９−（2′，5′，6′−トリクロロ
−3′または4′−カルボキサミドグリシン−4′また
は3′−カルボキシフエニル）−６−ヒドロキシ−
3H−キサンテン−３−オンとhIgGとの複合体
（ケイ光体／タンパク質の比は約２）を試薬Ｂ希
釈剤で１：26.7まで希釈したものである。 検定剤はフレオン−硫酸デキストラン処理した
血清を検定剤希釈剤で希釈して得たものである
が、ただし24mg／ml検定剤は未希釈の血清を使
用している。負（ネガチブ）検定剤は分析用緩衝
液である。 分析は、Varian Fluorichromケイ光計（改
造）を使用して25℃で行い、ゲインとしてはケイ
光体自体の3.8×10^-9M濃度の標準溶液を使用し
て1600に設定されたケイ光信号を用いた。 分析は、検定剤または試料16μを分析用緩衝
液100μで希釈したものに試薬ＡおよびＢ各50μ
を加え、更に400μの分析用緩衝液を加える
ことにより行つた。５秒後に、ケイ光の変化を６
秒間にわたつて測定して、ケイ光の変化速度（変
化率）を求めた。 ０，1.6，5.6，11.2，17.6および24.0mg／mlの各
hIgG濃度を利用して標準曲線を調製した。 次いで、多数の試料（検体）を使用してhIgG
濃度を測定し、一般に利用されているRIDまたは
比濁法による結果と比較した。次の表にその結果
を示す。 【表】 上の結果から明らかなように、本発明の複合体
を使用した分析法と他の一般に利用されている分
析方法の間に確固たる関係が存在する。即ち、相
関係数の欄からわかるように、本発明の複合体を
使用した分析法は、RID法（0.97）及び比濁法
（0.91及び0.96）と非常に良い相関を示し、本発
明の複合体を使用した分析法が非常にすぐれてい
ることを示す。２種類の比濁法の結果に明らかな
ずれがあるが、これは恐らく各方法でそれ自体の
評価法を採用したことに起因しよう。 本発明は、長波長で吸光が起り、吸光係数が高
く、吸収帯およびケイ光帯が急峻で、吸収帯とケ
イ光帯の間が実質的に離間しているという重要な
分光学的性質を有する新規前駆体化合物及びその
複合体を提供する。このような性質は、ケイ光法
の発展および多様な物質の検出にとつて特に望ま
しく重要である。 以上に本発明を詳述したが、本発明の範囲を逸
脱せずに或る種の変更・修正が可能であることは
当然である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： ［式中、E^bは水素、クロロ、ブロモ又はC₁〜₃
   アルキル基であり； R²はC_1〜3のアルキレン基であり； D²は水素又はカルボキシル基であり；そして
   Lψは、 (i) 式： ｛式中、E²はクロロであり、Z²はカルボキ
   シル基であり、W²はY²への直接結合又はカル
   ボキサミドアルキレン基（該アルキレン基は
   C_1〜2である。）であり、Y²は水素又はカルボキ
   シル基であり、m²は０〜３であり、そしてx²
   は０〜４である。但し、D²及びY²のうちの一
   つはカルボキシル基である。｝又は (ii) Ｌは、C_1〜6のアルキレン基であり、そしてψ
   はカルボキシル基である。］を有する化合物
   と； 上記式のD²，Y²又はψを介して結合されて
   いるリガンド、受容体又は担体或いはこれらの
   組合せと； から構成される複合体。 ２ リガンドが分子量約2000〜600000のポリアミ
   ノ酸である、特許請求の範囲第１項記載の複合
   体。 ３ 担体が多糖類である特許請求の範囲第１項記
   載の複合体。 ４ リガンドが分子量約2000までのハプテンであ
   る、特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載
   の複合体。 ５ リガンドがヌクレオシド又はヌクレオチドで
   ある、特許請求の範囲第１項記載の複合体。 ６ タンパク質結合ケイ光分析を実施する方法に
   おいて、式： ［式中、E^bは水素、クロロ、ブロモ又はC_1〜3ア
   ルキル基であり； R²はC_1〜3のアルキレン基であり； D²は水素又はカルボキシル基であり；そしてLψ
   は、 (i) 式： ｛式中、E²はクロロであり、Z²はカルボキ
   シル基であり、W²はY²への直接結合又はカル
   ボキサミドアルキレン基（該アルキレン基は
   C_1〜2である。）であり、Y²は水素又はカルボキ
   シル基であり、m²は０〜３であり、そしてx²
   は０〜４である。但し、D²及びY²のうちの一
   つはカルボキシル基である。｝又は (ii) Ｌは、C_1〜6のアルキレン基であり、そしてψ
   はカルボキシル基である。］を有する化合物
   と； 上記式のD²，Y²又はψを介して結合されて
   いるリガンド、受容体又は担体或いはこれらの
   組合せと； から構成される複合体をケイ光試薬として使用
   することを含む、前記分析方法。