JPH01109260A - 体液成分の酵素的定量におけるビリルビンの影響の回避方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、体液成分を酵素的に測定するに際してビリル
ビンの影響を効果的に回避することができるようにした
方法に関する。

（従来の技術） 中性脂肪、尿酸、総コレステロール等の体液成分を、過
酸化水素を生成させてペルオキシダーゼの存在下で比色
定置する場合、ビリルビンの干渉が大き〈従来から問題
とされていた。上記測定におけるビリルビンの影響はそ
れ自身の色のかぶりとペルオキシダーゼ反応にかかわる
ビリルビンの還元力に由来する還元性の影響とがある。

血液中のビリルビン量は、正常では１　ｍ　ｇ　／　ａ
以下であるが、肝疾患等の場合２０ｍｇ／ｄ１を超える
ことがあり、ビリルビン量が多い程妨害を考えなければ
ならない、ビリルビンの影響は、ビリルビンの黄色色素
のかぶりと還元力の２つを考慮することになるが、色の
かぶりは長波長側（青色の発色）で発色する色源体を用
いることによって、その正の誤差を免れる。しかし、長
波長側で測定しようとする場合、波長を長波長側にする
程ビリルビンの還元性め影響が目立つようになり、負の
誤差を与える。

従来、ビリルビンの影響を回避する方法として、フェロ
シアニン化化合物を用いる方法（ｃｌｉｎ、ｃｈｅｍ、
２６／２，２２７−２３１．Ｐ。

Ｆｏｓｓａｔｉ他、１９８０）が知られている。

この方法によれば、フェロシアン化化合物を加えること
によりビリルビンの還元性の影響を効果的に回避できる
。しかし、周知の通り、フェロシアン化合物は、分解さ
れるとシアンを生成するので、公害管理上、廃液には十
分注意を払わなければならないため、病院、検査所での
日常検査には好ましくなかった。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明者は、上記の問題点を解決すべく研究を重ねた結
果、これまで用いられていたフエロシア力化化合物を使
わずに、全く毒性のない鉄錯体を用いることによってビ
リルビンの影響を効果的に回避できることを見いだし、
本発明を完成したものである。

（問題を解決するための手段） 本発明の要旨は、過酸化水素を生成させてペルオキシダ
ーゼの存在下で発色させて体液成分を酵素的に測定する
方法において、鉄錯体を添加することによってビリルビ
ンの影響を回避することを特徴とする生体成分の酵素的
定量におけるビリルビンの影響の回避方法に存する。

本発明で用いられる鉄錯体としては、ニトリロ三酢酸（
ＮＴＡ）、エチレンジアミンニ酢酸（ＥＤＤＡ）、エチ
レンジアミンニプロピオンｆｆ１（ＥＤＤＰ）、　　ヒ
ドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＥＤＴＡ−Ｏ
Ｈ）、　ジアミノプロパン四酢酸（Ｍｅｔｈｙｌ−ＥＤ
ＴＡ）　、グリコールエーテルジアミン四酢酸（Ｃ；Ｅ
ＤＴＡ）、　　ヒドロキシエチルイミノニ酢ｆｆｉ　（
ＨＩＤＡ）、　イ？、／二酢Ｍ（ＩＤＡ）、ニトリロニ
酢酸プロピオン酸（ＮＤＡＰ）、ニトリロ三プロピオン
酸（ＮＴＰ）、エチレンジアミンスルホン酸（ＥＤＳ）
、　グルコン酸エチレンジアミン、ジヒドロキシエチル
グリシン（ＢＩＣｉｎ）、）ランス−シクロヘキサンジ
アミン四酢酸（Ｃ）ｌＤＴＡ）等との鉄錯体をあげるこ
とができる。これらの例示した化合物に限らず、鉄と錯
体を形成しろるものであれば本発明方法に有効に用いる
ことができることは勿論である。

これらの鉄錯体は、０．０５〜１０ｍＭ程度添加するこ
とができ、好ましくは０．５〜２ｍＭ程度添加するのが
よい。

本発明方法は、これまでいわれていたビリルビンの影響
を受けるペルオキシダーゼ発色系の中性脂肪、尿酸、総
コレステロール、遊離コレステロール、クレアチニン、
グルコース、ジアール酸、遊離脂肪酸等の測定に利用で
きる。

鉄錯体を試薬に加えて測定する際に、ｌ試薬系として加
えてもよいし、また２試薬系に分けていずれか一方に又
は両方に加えてもよい、いずれの場合も、効果的にビリ
ルビンの影響を回避できるが、試薬の安定性及びその他
干渉物質の影響を考慮した場合、後者の２試薬系が有利
である。

（実施例） 以下に本発明の実施例をあげて説明する。

実施例１、尿酸の測定 第一試薬 リン酸緩衝液・・・・・１００ｍＭ、ｐＨ６，０ＮＴＡ
・Ｆｅ　　・・・・・・・・・・・・１ｍＭアスコルビ
ン酸オキシターゼ・・１．４Ｕ／ｍｊ４・アミノアンチ
ピリン・・・・０．３８ｒｎＭトリトンＸ・１００・・
・・・・・・０，１％第二試薬 リン酸緩衝液・・・・・１００ｍＭ、ｐＨ６，０ウリカ
ーゼ・・・・・・・・・・・・・０．２Ｕペルオキシダ
ーゼ・・・・・・・・・２．６ＵＴＯＯ８・・・・・・
・・・・・・１．　６ｍＭトリトンＸ・１ｏｏ　・・・
・・・・・・０．１％注）ＴＯＯ３はＮ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−１−ル
イジンナトリウムをあられす。

ＮＴＡ−Ｆｅを添加した第一試薬３５０ＩＪｌに検体を
１０μ２加え、３７℃５分間加温後°、第二試薬１７５
μ！加え、さらに３７℃５分間反応させる。５７０ｎｍ
で吸光度を測定し、尿酸量を求める。

ヒト血清にビリルビンを添加し、とりルピンＯ〜２０■
／ｄ１添加について、ビリルビンの影響を調べ、第１図
に示した。

比較例１ 実施例１の第一試薬からＮＴＡ−Ｆｅを除いたものを用
いて実施例１と同様の操作を行い、その結果を第１図に
示した。

実施例２ 実施例１の第一試薬と第二試薬を４＝１に混合したもの
を５００μｌ用いて、検体ヒト血清をｌＯμ！加えてビ
リルビンの影響を調べたが、実施例１の２試薬系と同様
のＮＴＡ−Ｆｅの効果を示した。

実施例３、中性脂肪の測定 第一試薬 ＰＩＰＥＳ・・・・・・・・・・・・・５０ｍＭリボプ
ロティンリパーゼ・・・・３００Ｕ／ｍＩＩＮＴＡ・Ｆ
ｅ　　・・・・・・・・・・・１ｍＭアスコルビン酸オ
キシターゼ・・１，５Ｕ／ｍＡ４・アミノアンチピリン
・・・・・０．４ｍＭトリトンＸ・１００・・・・・・
ｏ、ｏｔｓ％第二試薬 ＰＩＰＥＳ　・・・・・・・・・・５０ｍＭアデノシン
三リン酸・・・・・・・・・・１ｍＭグリセロリン酸オ
キシダーゼ・・４．８Ｕ／ｍｊｌグリセロキナーゼ・・
・・・・０．２４Ｕ／ｍ１ペルオキシダーゼー・・・・
・・０．６Ｕ／ｍｆＭ　ｇ　ＣＩ！２・・・・・・・・
・・・・・・４ｍＭトリトンＸ　・１００・＝・・＝・
＝・０、０１５％ＴＯＯ３・・・・・・・・・・・・１
．２ｍＭ注）ＰＩＰＥＳはピペラジン−Ｎ、Ｎ’　−ｂ
ｉｓ（２−エタンスルホン酸）をあられす。

ＮＴＡ−Ｆｅを添加した第一試薬２５０μβに検体を５
μ！加え、３７℃５分間加温後、第二試薬２５０μ！加
え、さらに３７℃５分間反応させる。５７０ｎｍで吸光
度を測定し、中性脂肪量を求める。

ヒト血清にビリルビンを添加し、ビリルビンＯ〜２０ｔ
ｇ／ａ添加について、ビリルビンの影響を調べ、第２図
に示した。

比較例２ 実施例３の第一試薬からＮＴＡ−Ｆｅを除いたものを用
いて実施例３と同様の操作を行い、その結果を第２図に
示した。

実施例４〜９ 実施例１の尿酸の測定において、ＮＴＡ−Ｆｅ０代わり
に下記の種々の鉄錯体を用いて実施例１と同様に測定し
、その結果を実施例１及び比較例１の結果と併せて第１
表に示す。

第１表 注）第１表の影響率％は、実施例１の鉄錯体だけを変え
た時の２０■／ｄｌのビリルビンによる影響率％を示し
た。

【図面の簡単な説明】 第１図は本発明の実施例１の測定結果を示すグラフ及び
第２図は実施例３の測定結果を示すグラフである。 特許出願人　　　三光純薬株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）過酸化水素を生成させてペルオキシダーゼの存在
   下で発色させて体液成分を酵素的に測定する方法におい
   て、鉄錯体を添加することによってビリルビンの影響を
   回避することを特徴とする生体成分の酵素的定量におけ
   るビリルビンの影響の回避方法。