JP7361079B2 - 粒子特性評価 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

本発明は粒子特性評価装置、及び適応光子相関分光法を含み得る粒子特性評価法に関する。
光子相関分光法（動的光散乱法、又はＤＬＳともいう）は、試料のある領域から散乱する光の強度の経時的変化によって、粒子の特性を評価する技術である。散乱光の測定値の時系列が、試料中に分散している粒子の粒径又は粒径分布を決定するために用いられる。

国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０９０５６２において論じられているように、照射光の波長より小さい粒子により散乱される光の強度が、粒径に強く関連することは、周知である。粒子半径が照射光の波長の０．１未満であるレイリー散乱限界において、散乱光の強度は粒子半径の６乗に比例する。また、そのような小さい粒子から散乱される光は、ほぼ等方的である。したがって、典型的には粒径０．３ｎｍ～２０ｎｍのタンパク質の分散において、例えば粒径が１００ｎｍを超える凝集体又はフィルタ阻害粒子は、試料中の光学的検出ボリュームから拡散し終わるまで、信号に影響を及ぼし得る。しばしば用いられるキュムラント減少においては、Ｚ平均及び多分散性指数（Ｐｄｉ）の出力が、大きめの断片によって大きく歪められ得る。

この「ダスト」に対する敏感性は、注意深い試料調製の重要性を強調する多くの文献によって知られているが、フィルタ阻害物又は凝集体の存在を完全に回避することは難しい。
主に小径粒子であるが大径粒子も含む試料の光散乱測定は、大径粒子に対して、又は個々の大径粒子に対してさえ、非常に敏感になり得る。大径粒子は、小径粒子が特性評価され得る品質を低下させる可能性がある。このような大径粒子は、望ましくない不純物、つまり一次粒子の凝集体又は何らかの他の物質であるかもしれない。

国際特許出願公開公報ＷＯ２００９／０９０５６２は、複数の光子計数検出器の使用によってこの問題に対処することを提案している。大径粒子がいつ光を散乱させているかを検出するために、低い散乱角度における補助検出器が提案されており、そのため、大径粒子が存在する場合には、ＤＬＳ解析用の検出器からのデータを無視することができる。

これは大きな進歩を表してはいるが、依然として欠点があり、ＤＬＳ用の改良された方法及び装置が望まれる。
試料からの回折光／散乱光のパターンを解析することにより粒子特性評価を行うことも、周知である。その光源は一般にレーザであり、この種の解析は、レーザ回折解析又は静的光散乱（ＳＬＳ）と称されることもある。大径粒子は、静的光散乱測定においても問題となり得る。すなわち、大径粒子からの散乱が、小径粒子から散乱される比較的少量の光を分りにくくし得る。

従来の方法が不純物の問題を考慮する限りにおいては、不純物からの散乱を含むデータは、単に破棄されている。この大雑把なアプローチによりデータが誤って破棄される可能性があり、結果として、不完全な結果が提示されたり、十分な有効データを得るのに長い実行時間が必要になったりする可能性もある。

多分散粒子の信頼性の高い解析を容易にする方法及び装置が、望ましい。
本発明の第１の局面によれば、試料中の粒子を特性評価する方法が提供されており、前記方法は、光線と前記試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、試料セル内の前記試料に前記光線を照射することと、単一の検出器から前記散乱光の測定値の時系列を
取得することと、前記単一の検出器からの前記測定値の時系列から、大径粒子が前記散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断することと、前記大径粒子により散乱された光の補正を含む、前記測定値の時系列から粒度分布を決定することと、を含む方法である。

本発明の別の局面によれば、試料中の粒子を特性評価する方法が提供されており、前記方法は、光線と前記試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、試料セル内の前記試料に前記光線を照射することと、単一の検出器から前記散乱光の測定値の時系列を取得することと、前記単一の検出器からの前記測定値の時系列から、どの測定値が異常データを含むのかを判断することと、異常データの補正含む、前記測定値の時系列から粒度分布を決定することと、を含む。異常データは、拒否／分離基準を参照して特定されてもよい。異常データの補正は、異常データを含む測定値を除外又は分離する（そして、個別に解析する可能性がある）ことを含んでもよい。

別の局面においては、測定値の時系列を２つ以上の検出器から得てもよい。大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断することは、２つ以上の検出器からの測定値を用いることを含んでもよい。粒度分布を決定することは、２つ以上の検出器からの測定値の時系列から行われてもよい。

大径粒子により散乱される光を補正することは、測定値の時系列を処理することを含んでもよい。
粒度分布を決定することは、処理された測定値の時系列に対して動的光散乱相関演算を行うことを含んでもよい。

粒度分布を決定することは、測定値の時系列に対して光回折粒子特性評価解析（例えば、Fraunhofer理論又はMie散乱理論を用いて）を行うことを含んでもよい。本明細書中で
開示される方法は、静的光散乱（ＳＬＳ）、動的光散乱（ＤＬＳ）、電気泳動光散乱（ＥＬＳ）、磁気泳動光散乱（ＭＬＳ）及び、例えば、タンパク質の移動性、表面ゼータ、マイクロレオロジー等を測定するための関連する方法に適用されてもよい。相関光散乱データは、本明細書に記載された他の実施形態の方法で、過渡効果を除去して、マイクロレオロジー測定用に処理することも可能であろう。

複数の大径粒子が存在する可能性もあり、上記の方法は、複数の大径粒子により散乱された光を補正することを含んでもよい。「大径粒子」という用語は、複数の大径粒子を除外しない。「大径粒子」という用語は、所定の閾値サイズより大きい直径を有する粒子を意味し得る。「大径粒子」という用語は、本明細書においては「異常粒子」により置き換えられてもよい。実施形態によっては、それは、例えば、データを参照して決定されるパラメータの解析（例えば、統計的解析）に基づいて特定／補正された、単に異常な（又は一時的な）散乱データである。

いくつかの実施形態において、大径粒子により散乱された光を補正することは、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値を、除外することを含む。残りのデータは、次に、例えば連結されるか、あるいはゼロパディングされて、連続した一連のデータを形成してもよい。

他の実施形態において、大径粒子により散乱された光を補正することは、大径粒子により散乱された光のモデルを決定し、そのモデルを測定値から除去することを含む。例えば、モデルを測定された時系列に当てはめ、測定された時系列のうち大径粒子からの散乱による部分を判断してもよい。その後、そのモデルを測定データから除去してもよく、例えば、そのモデルを測定データから取り去るか、又はデコンボリューション（deconvoluted
）してもよい。モデルは、測定された時系列データ又は動的光散乱相関演算の出力等の処理データに当てはめ、そして除去してもよい。

いくつかの実施形態において、大径粒子と小径粒子とを別々に特性評価できるように、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値を、大径粒子が散乱光に寄与していないときに取得された測定値とは別に処理してもよい。レーザ／光回折解析の精度は、大径粒子が存在する場合の測定値を別に解析することにより、向上し得る。

他の実施形態は、大径粒子により散乱される光を補正する上記の方法を、組み合わせて用いてもよい。
このように、大径粒子からの散乱による信号を補正することにより、複数の光子計数検出器を要することなく、試料中に存在する小径粒子に関するより正確な情報をＤＬＳ測定値から抽出することができる。大径粒子挙動のモデルをデータに当てはめ、大径粒子の予測寄与分をデータから除くことは、測定された信号に大径粒子が影響を及ぼしている期間において、小径粒子データの少なくともかなりの部分が失われないため、非常に有利である。

いくつかの実施形態において、大径粒子が散乱光に寄与しているときにどの測定値が取得されたのかを判断することは、測定値の時系列において大径粒子に対応している低周波変動を検出することを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、不純物である大径粒子は、その散乱への低周波寄与によって大径粒子と特定されてもよい。
代替的に、又は付加的に、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断することは、測定値が光強度のある閾値を超える期間を判断することを含んでもよい。

いくつかの実施形態において、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断することは、時系列を複数の短いサブランに分割することと、次にそのサブランのうちのどれが大径粒子からの散乱寄与を有する測定値を含むかを判断することと、を含んでもよい。

これらの実施形態において、サブランのうちのどれが大径粒子からの散乱寄与を有する測定値を含むかを判断することは、各サブラン中の測定値が光強度の閾値を超えているかどうか、又は各サブランに亘る平均測定値が光強度の閾値を超えているかどうかを評価することを含んでもよい。

あるいは、サブランのうちのどれが大径粒子からの散乱寄与を有する測定値を含むかを判断することは、サブラン中の測定値における低周波変動を検出することを含んでもよい。
いくつかの実施形態において、サブランのうちのどれが大径粒子からの散乱寄与を有する測定値を含むかを判断することは、各サブランに対して相関を実行することを含んでもよい。

各サブランに対して相関を実行することは、動的光散乱により、各サブランに関する多分散性指数（Ｐｄｉ）、粒度分布又はＺ‐平均粒径を決定することを含んでもよい。各サブランは、好ましくはキュムラント法を用いて解析されてもよいが、例えばＣＯＮＴＩＮ法、最大エントロピー法等の他の方法を用いることも可能である。大径粒子により散乱される光を補正するように測定値の時系列を処理することは、相関によって大径粒子が特定されたサブランにおいて、バックグラウンド（background）を補正することを含んでもよ
い。大径粒子により散乱される光を補正するように測定値の時系列を処理することは、大径粒子が散乱光に寄与しているとき（例えば、サブラン）に取得された測定値を除外することを含んでもよい。

大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値を、どのサブランが含むかを特定することは、各サブランから算出されたパラメータを該パラメータの閾値と比較することを含んでもよい。

閾値は、各サブランについて算出されたパラメータの分布から決定してもよい。パラメータが統計的な外れ値であるサブランは、破棄されてもよく、又は個別解析のために分離されてもよい。

パラメータの閾値は、全てのサブランから算出された当該パラメータの平均値から算出してもよい。閾値は、パラメータの標準偏差及び平均値から算出してもよい。閾値は、平均パラメータ値に２、３、４、５、又は６標準偏差を加えることにより決定してもよい。

パラメータは、Ｚ平均、Ｐｄｉ、平均強度、各サブランについて測定された強度のドリフト（drift）及び／又はスプレッド（spread）、及び／又はドップラー周波数幅を含ん
でもよい。

パラメータの平均値は、各サブランについて算出されたパラメータの分布又はヒストグラムへのベストフィットから算出されてもよい。ベストフィットは、正規分布を有してもよい。

拒否又は分離されたデータ（例えば、サブラン）は、大径粒子の特性評価をするために、個別に解析されてもよい。これは、試料中の凝集体、ダスト及び／又は不純物の性質を特定するのに役立ち得る。

時系列がサブランに分割されている実施形態において、各サブランは、５秒以下、２秒以下、１秒以下、０．５秒以下、又は０．１秒以下の継続時間を有してもよい。
この方法は、試料の特性評価をするために、少なくとも１０、２０、５０、又は１００のサブランを用いることを含んでもよい。

本発明の第１の局面による方法の、いくつかの実施形態において、所定の粒径が、１０００μｍ、５００μｍ、１００μｍ、２０μｍ、５μｍ、１μｍ、３００ｎｍ、１００ｎｍ、及び５０ｎｍのうちから選択されてもよい。

大径粒子により散乱された光の補正を含む、処理された測定値の時系列から粒度分布を決定することは、各サブラン（大径粒子からの散乱光への寄与を含むとして破棄されていない）を別々に解析し、その後、各サブラン解析の平均を用いて粒度分布を決定することを含んでもよい。例えば、ＤＬＳ 測定の場合、各サブランのコレログラムが平均化され
、平均化されたコレログラムから粒度分布が決定される。

この方法は、初期回数のサブランを実行し、組み合わせたデータから取得される平均値が収束するまで（例えば、平均コレログラムが収束するまで）、更なるサブランを記録し、先行データに追加することを含んでもよい。収束基準は、組み合わせたデータから取得される平均値が、多数の後続の測定値にわたって変化する量に基づいてもよい。

一般的に、大径粒子からの散乱寄与を識別する基準は、散乱光の測定値の時系列から決定されるパラメータに基づいてもよい。粒子を異常である又は大径であると分類するため
にこのような動的基準を用いることは、この方法が、例えば多分散性の高い可変試料の場合のように、適切であれば、大径粒子からの散乱データを含むために、また、例えば多分散性が低い試料において不純物又は凝集体を拒否するように、適切であれば、大径粒子からの散乱を除外又は補正するために、十分なロバスト性を有し得ることを意味する。

いくつかの実施形態において、どのデータが拒否／分離されるかを判断するために用いられる閾値は、使用者により選択可能であってもよい。情報（例えば、統計的情報、パラメータの分布及び／又は閾値を用いて得られた解析結果）は、使用者が適切な閾値の選択を行うのに役立つよう、使用者に提示されてもよい。

本発明の第２の局面によれば、本開示のいずれかの他の局面又は実施形態の方法に基づいて、粒子を特性評価するための装置が提供されており、前記装置は、光源と、試料セルと、検出器と、プロセッサとを備え、
前記光源は、光線と試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、前記試料セル内の前記試料に前記光線を照射するよう動作可能であり、
前記検出器は、前記散乱光を検出して、測定値の時系列を生成するように構成され、
前記プロセッサは、
前記測定値の時系列を受信し、
単一の検出器からの前記測定値の時系列から、大径粒子が前記散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断し、
前記大径粒子により散乱された光を補正することを含む、前記処理された測定値の時系列に対する動的光散乱相関演算を行うことにより、粒度分布を決定するように構成されている、
装置である。

本発明の第３の局面によれば、本開示のいずれかの局面又は実施形態の方法に基づいて、粒子を特性評価するための装置が提供されており、前記装置は、光源と、試料セルと、検出器と、プロセッサとを備え、
前記光源は、光線と試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、前記試料セル内の前記試料に前記光線を照射するよう動作可能であり、
前記検出器は、前記散乱光を検出して、測定値の時系列を生成するように構成され、
前記プロセッサは、
前記測定値の時系列を受信し、
前記検出器からの前記測定値の時系列から、大径粒子が前記散乱光に寄与しているときに取得された測定値がいずれであるかを判断し、
前記大径粒子により散乱された光を補正することを含む、前記処理された測定値の時系列から粒度分布を決定するように構成されている、
装置である。

この装置のいくつかの実施形態において、大径粒子により散乱された光を補正することは、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値を除外することを含む。別の実施形態において、大径粒子により散乱された光を補正することは、大径粒子により散乱された光のモデルを決定し、そのモデルを測定値から除去することを含む。いくつかの実施形態において、大径粒子と小径粒子とを別々に特性評価できるように、大径粒子が散乱光に寄与しているときに取得された測定値を、大径粒子が散乱光に寄与していないときに取得された測定値とは別に処理してもよい。

いくつかの実施形態において、検出器は、光子計数検出器を備えてもよく、かつ／又は後方散乱光を検出するように構成されてもよい。装置は、散乱光を検出するように構成された複数の検出器を備えてもよい。

装置は、検出器と光源により照射される散乱ボリュームとの間に、光路を提供する光ファイバを更に備えてもよい。
各局面及び全ての局面の特徴は、各局面及び全ての局面の他の特徴と組み合わせてもよい。

以下において、添付の図面を参照し、単なる例として、例示的な実施形態が説明される。

実施形態に係る粒子特性評価装置の概略図である。 実施形態に係る粒子特性評価装置の処理手段の概略図である。 実施形態に係る方法のフロー図である。 実施形態に係る処理に関する結果例を示す。 高散乱粒子からの散乱の結果、データにおいてスパイクが存在する、低品質の試料から得られた、時間の経過に伴う光子計数強度のグラフを示す。 データにおいて大径粒子が低速変動を引き起こしている、低品質の試料から得られた、時間の経過に伴う光子計数強度のグラフを示す。 フィルタ阻害物（不純物）を含有する２２０ｎｍラテックス球の試料に関する、Ｚ平均径の関数としての計数率のグラフを示す。 図７に用いられたものと同一の試料に関する、Ｚ平均径の関数としての多分散性指数（Ｐｄｉ）のグラフを示す。 ダスト類似物又は凝集体を含有する３つの異なる試料に関する、多分散性指数（Ｐｄｉ）のヒストグラムを示す。 多分散性指数に基づくサブランの拒否／分離基準を説明するグラフを示す。 全サブラン、維持されたサブラン、及び拒否／分離されたサブランについてのコレログラムを説明するグラフを示す。 全サブラン、維持されたサブラン、及び拒否／分離されたサブランについての粒径に関する強度分布を示す。 試料が非常に多分散性でありかつ可変であるサブランの拒否／分離基準に基づく、多分散性指数の適用を説明するグラフを示す。 外れ値データを特定して破棄するために、スペクトル幅がどのように用いられ得るかを示す、散乱光の正規化された強度対周波数シフトのグラフである。 散乱検出器における光強度を示す模擬計数率データ、及び（２０ポイントウィンドウを有する）模擬計数率から算出された移動平均のグラフである。 図１５で用いられたものと同一であるが、移動平均が取り除かれている、模擬計数率データのグラフである。 大部分のサブランの維持を示す、可変性が高く多分散性である試料に対する拒否基準の適用を説明するグラフである。

図１は、光源１０２、試料セル１０４、後方散乱検出器１１４、前方散乱検出器１２４、及び光トラップ１０８を備える粒子特性評価装置を示す。
光源１０２は、例えばレーザ等のコヒーレント光源であってもよく、単色光を出力してもよい。あるいは、光源１０２はＬＥＤであってもよい。光源１０２は、試料セル１０４内の試料１０６に対し、光軸に沿って光線１０３を照射するように構成されている。

照射光線１０３と試料１０６との相互作用により、散乱光が生じる。前方散乱光１２１は、照射光軸の方向に対して９０度未満の角度で散乱される光であると定義してもよい。
後方散乱光１１１は、光軸の方向に対して９０度を超える角度で散乱される（すなわち、照射光線とは反対方向における方向成分を有する）光であると定義してもよい。

前方散乱検出器１２４は、前方散乱光１２１を検出するように構成されている。前方散乱光１２１は、散乱光１２１を光ファイバ１２２に結びつける集光レンズ１２０を介して、検出器１２４に向けられる。光ファイバ１２２は、前方散乱検出器１２４への光路を提供する。集光レンズ１２０は、屈折率分布型レンズであってもよく、他の適切なレンズであってもよい。試料１０６の照射領域と前方散乱検出器１２４との間の光路には、更なる光学部品又はより少ない光学部品が備えられてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、光ファイバ１２２が除かれ、代わりに自由空間光通信が用いられてもよい。

後方散乱検出器１１４は、後方散乱光１１１を検出するように構成されている。後方散乱光１１１は、散乱光１１１を光ファイバ１１２に結びつける集光レンズ１１０を介して、センサに向けられる。光ファイバ１１２は、後方散乱検出器１１４への光路を提供する。集光レンズ１１０は、屈折率分布型レンズであってもよく、他の適切なレンズであってもよい。試料１０６の照射領域と後方散乱検出器１１４との間の光路には、更なる光学部品又はより少ない光学部品が備えられてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、光ファイバ１１２が除かれ、代わりに自由空間光通信が用いられてもよい。

いくつかの実施形態において、単一の検出器が設けられてもよく、例えば、（９０度で散乱する光を検出する）側方散乱検出器のみ、又は前方散乱検出器のみ、又は後方散乱検出器のみが存在してもよい。

図１の装置は、例えば単一の検出器（例えば後方散乱検出器１１４など）からの出力を用いて、動的光散乱解析を行うように構成されてもよい。
図２は、検出器１１４、プロセッサ１３０、及び出力装置１３２を示す。プロセッサ１３０は、検出器１１４から光強度測定値の時系列を受信し、測定値に対する相関演算を行って、動的光散乱により試料の粒子を特性評価するように構成されている。プロセッサ１３０は、機械読取り可能な記録媒体、例えばメモリ、ソリッドステートストレージドライブ、ハードディスク、クラウド等に測定値を保存してもよい。プロセッサ１３０は、その後、解析の結果を出力装置１３２に出力してもよく、出力装置１３２は表示画面を備えてもよい。

プロセッサ１３０は、単一の検出器１１４からの測定値の時系列に基づいて、大径粒子が散乱光に寄与したときにどの測定値が取得されたかを判断するように構成されている。単一の検出器からの測定値の時系列に基づき大径粒子からの散乱を検出するプロセッサ１３０のこのような能力は、補助検出器（例えば前方散乱検出器）からの測定値に依存する先行技術とは対照的である。大径粒子という用語は、所定の閾値サイズより大きい直径を有する粒子を意味してもよく、あるいは統計的な外れ値である粒子を指してもよい。所定のサイズは使用者により選択可能であってもよく、また５０ｎｍ、７５ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、３００ｎｍ、５００ｎｍであってもよい。

１つの実施形態に係る装置は、図１及び２に示す（また、これらの図を参照して説明される）特徴を組み合わせてもよく、図３において概略的に示される方法を実施するように構成されてもよい。

図３は、一連の方法ステップ２０１～２０４を示す。ステップ２０１は、光線１０３と試料１０６との相互作用によって散乱光１１１を生じさせるように、試料セル１０４内の試料１０６に光線１０３を照射することを含む。

ステップ２０２は、検出器１１４から散乱光１１１の測定値の時系列を取得することを含み、検出器１１４は単一の検出器であってもよい。本明細書で使用される「単一の検出器」という用語は、特定の光散乱角度（又は、例えば５度以下などのような狭い範囲の光散乱角度）に対応する複数の検出器（例えば、１Ｄ又は２Ｄ検出素子アレイ）を含んでもよい。

ステップ２０３は、検出器１１４からの測定値の時系列から、所定の閾値サイズを超える直径を有する１つの大径粒子（又は複数の大径粒子）が散乱光に寄与したときに取得された測定値がいずれであるかを判断することを含む。以下においてより十分に説明されるように、このために多くの様々な方法を用いることが可能である。

ステップ２０４は、大径粒子が散乱光に寄与した期間中の測定値において、大径粒子（又は複数の大径粒子）により散乱された光の補正を含む、測定値の時系列に対して動的光散乱相関演算を行うことにより、粒度分布を決定することを含む。大径粒子からのこの後方散乱光を測定値から除去することは、ＤＬＳによる粒子の特性評価の品質及び／又は精度を向上させ得る。なぜなら、大径粒子からの比較的強度の高い散乱が、それにより、試料内の小径粒子（最も関心の対象となるであろう粒子）の特性評価を損なうのを防ぐことになろうからである。

図４は、測定結果３２０から得た相関関数３１０のプロットとともに、検出器からの測定結果３２０の時系列を説明している。粒径に対する散乱光強度の粒度分布（ＰＳＤ）プロット３３０も、併せて示されている。測定値３２０の考察は、大径粒子からの散乱に対応するｔ＝８ｓ以降に、光強度が大きく増大することを示している。

これは、大径粒子が光を散乱させているときに取得される測定値を特定する１つの方法である。この場合、例えば、大径粒子からの光散乱を特定するために、毎秒６００カウントの閾値強度値を用い得る。この閾値の超過から所定時間（例えば１秒又は０．５秒）内のデータは、その後のＤＬＳ解析から除外してもよい。例えば、ｔ＝９ｓにおいて閾値が超過される場合、ｔ＝８ｓ以降のデータは除外してもよく、又は大径粒子によるバックグラウンドに適合するモデルは、これらのデータから除いてもよい。強度閾値及び時間窓の正確な値は、装置の構成及び具体的な測定手順に応じて変わりうる。閾値は、強度値の２、３、４、又は５標準偏差であってもよい（それは、測定が完了した後で決定してもよく、測定が行われている際に動的に決定してもよい）。

代替的に、又は付加的に、測定値の時系列における特徴的な周波数を、大径粒子からの光散乱を特定するために用いてもよい：低周波数特性は、大径粒子に対応する可能性が高い。サンプルデータ３２０において、ｔ＝８ｓからの低周波数、大振幅の偏位までは、測定値が比較的安定している。光強度における低周波数と大振幅の変動の組合せは、大径粒子に非常に特徴的であり得るため、大径粒子が散乱させている時間を特定するために用いてもよい。１０、５、４、３、２、又は１Ｈｚ未満、又は０．５Ｈｚ以下の周波数は、大径粒子と関連づけ得る。

ＰＳＤプロット３３０は、ｔ＝８ｓとｔ＝１０ｓとの間の時系列を含む、全時系列データの処理に基づいており、約１０００ｎｍの粒径に対応する光強度のピークを示している。
特定の時間窓内に大径粒子が存在することを識別する１つの方法は、全時系列データ（又はラン）を複数のより短い時間又はサブランに分割した後、各サブランに対して動的光散乱解析を行うことである。例えば、データ３２０が時間１秒の複数のサブランに分割され、ＤＬＳ相関解析が各サブランのデータに対して行われた場合、どのサブランにおいて１つ又は複数の大径粒子が大量の光散乱に寄与しているのかを識別することは、容易であ
ろう（例えば、全散乱光の１％超、５％超又は１０％超の場合、又は所定の閾値を超える粒径で、強度ＰＳＤが１％、５％又は１０％を超える場合）。そうすれば、大径粒子からの大量の散乱を有するサブランは、測定値列から除外することができる。そして、残りの測定データを組合せ、その組み合わせた残りの測定データに基づいてＤＬＳ測定が行われてもよい。あるいは、大径粒子によるバックグラウンドのモデル（a model of the background）を、大径粒子からの大量の散乱を有する各サブラン内でデータに当てはめてもよ
い。そして、適合したモデルに基づいて算出された大径粒子による散乱信号の推定値は、サブラン内のデータから除外されてもよい。次に、残りの補正後のデータを、測定値列におけるその他のサブランからのデータと組み合わせ、組み合わせた補正後のデータ列に対してＤＬＳ測定を行ってもよい。

本発明の実施形態は、大径粒子が問題となる場合に、大幅に向上したＤＬＳ特性評価品質を提供することができる。
図５は、散乱光検出器から得られた経時的な光子計数率のグラフ３５０を示す。データには、スパイク３５１が存在し（図５においては、その全てが表示されているわけではない）、装置の測定ボリューム内に散乱性の高い粒子（すなわち不純物）が存在する期間に対応している。この不純物による寄与に対処する１つの方法は、不純物が光を散乱させているときのデータを拒否することである：つまり、スパイク３５１に対応する期間中のデータを除去することである。

図６は、散乱検出器から得られた経時的な光子計数率のグラフ３６０を示す。図５の短期間の「スパイク」とは対照的に、図６のデータに関する不純物は、測定ボリュームにゆっくり作用する大径粒子であり、その結果、検出される強度における低周波変動が生じる。大径粒子からのこの種の散乱への寄与には、データの低周波成分を除去することにより対処してもよい。

大径粒子が散乱に寄与したサブランを特定できることが望ましい。それを可能にする１つの方法は、各サブランの強度を測定し、平均強度値（例えば、平均値、中央値等）を拒否基準として用いることである。大径粒子はより強い散乱と関連があるため、より高い強度のサブランは、大径粒子と関連する可能性がある。サブラン拒否のための閾値は、全てのサブランの全体的特性から決定してもよい。例えば、閾値平均強度は、全てのサブランの平均をとった平均強度から取得することも可能であろう（例えば、全てのサブランについての平均強度から２標準偏差又は３標準偏差）。

図７は、２２０ｎｍラテックス球及び何らかのフィルタ阻害物（大径微粒子不純物）を含む試料に対して行われた測定から得られた、複数のサブランに関する、Ｚ平均粒径の関数としての平均計数率（強度）のグラフ４１０を示す。Ｚ平均は、ＩＳＯ１３３２１及び／又はＩＳＯ２２４１２で規定されているように、各サブランについて決定されてもよい。平均強度に基づく拒否基準の１つの欠点は、小径粒子に関連していることをＺ平均が示す多くのサブランを、拒否する結果になり得ることである。

１つの代替案は、多分散性指数（Ｐｄｉ）に基づいてサブランを拒否することであり、多分散性指数（Ｐｄｉ）はキュムラント解析から、ＩＳＯ１３３２１及び／又はＩＳＯ２２４１２で規定されているように決定されてもよい。図８は、図７に示すものと同じサブランデータについての、Ｚ平均に対する多分散性指数Ｐｄｉのグラフ４２０を示す。Ｚ平均と多分散性指数との間にはより強い相関関係があり、このことは、多分散性に基づく拒否基準が、大径粒子によって影響されるサブランに対しより選択的である可能性が高いことを意味する。

更なる代替案は、Ｚ平均粒径を拒否基準として用い、閾値を超えるＺ平均粒径を有する
サブランを拒否することである。この場合もやはり、閾値は、全サブランの集合体から算出されるＺ平均値を参照して決定してもよい（例えば、全サブランのＺ平均から３標準偏差を超える値を拒否する）。

図９は、測定に対して、閾値拒否基準がどのように算出され得るかを説明する１組のＰｄｉヒストグラム４３０を示す。リゾチーム、２２０ｎｍラテックス球及び６０ｎｍラテックス球にそれぞれ対応する、Ｐｄｉ値の第１ヒストグラム、第２ヒストグラム、及び第３ヒストグラムが示されている。第１正規分布、第２正規分布、及び第３正規分布４３１、４３２、４３３がそれぞれ各ヒストグラムに当てはめられている（例えば、最小二乗ペナルティ関数を用いて）。各測定のＰｄｉの平均値及び標準偏差σは、各測定のサブランから得られたヒストグラムにベストフィットする正規分布４３１、４３２、４３３から決定してもよい。ベストフィットする正規分布を用いることは、外れ値サブランによる平均値のスキュー（skewing）を回避するのに役立ち、このことは図９（例えば、０．１５を
超えるＰｄｉ値）において見られる。

閾値拒否基準は、サブランのヒストグラムにベストフィットするもの（例えば、Ｚ平均、Ｐｄｉ又は強度）から算出した平均値に、標準偏差の倍数、例えば３（あるいは２、４、５、６等）を加えてもよい。

図１０は、拒否基準がＰｄｉに基づき、閾値が、ベストフィットする正規分布から決定された平均値から３標準偏差である、拒否方法の例を示している。図１０は、ベストフィットする正規分布４４１と、平均Ｐｄｉ４４２（ベストフィットする正規分布４４１から算出）と、閾値拒否基準４４３（平均値＋３σ）とを有するグラフ４４０を示す。維持されたサブラン４４５及び拒否／分離されたサブラン４４４は、同じグラフにプロットされている。閾値より大きいＰｄｉを有するサブランは拒否／分離され、閾値以下であるＰｄｉを有するサブランは、個別解析のために維持される。

図１１は、維持されたサブラン４４５、拒否／分離されたサブラン４５４、及び全てのサブラン４５３のそれぞれについて得られたｇ１相関関数を示すグラフ４５０である。図１２は、維持されたサブラン４６５、拒否／分離されたサブラン４６４、及び全てのサブラン４６３のそれぞれについての強度粒度分布を示すグラフである。維持されたサブランが不純物粒子からのデータを含まないことは、明らかである。全てのサブランが用いられた場合に報告される、小径粒子（すなわち、不純物を除く、関心の対象である粒子）についての平均粒径は、維持されたサブランから得られる平均粒径とは異なる。維持されたサブランからのデータは、大径粒子／不純物からの散乱によって歪曲されないため、より正確である。拒否／分離されたサブランは、大径の（例えば、不純物の）粒子の特性を特定するために用いることができる。維持されたサブラン及び拒否／分離されたサブランについての情報を別々に解析して提示するアプローチは、使用者により多くの情報を提供し、光散乱データの処理に伴い得る曖昧性を取り除く。

パラメータの分布に基づく（例えば、パラメータの標準偏差に基づく）拒否／分離基準の使用は、範囲外データのみが拒否されることを意味し、また拒否／分離が動的であって、測定される試料に対応することを意味する。偶発的な不純物を含む高度に単分散した試料は、かなり狭い分布Ｐｄｉを生じ、結果として、不純物からの散乱データは比較的高い感度で拒否されるであろう。その対極として、高度に多分散である可変試料は、連続するサブランの間でＰｄｉにおける高い標準偏差を有する可能性があり、これはデータがほとんど拒否／分離されないであろうことを意味するため、結果として、試料における粒径の多様性を反映するマルチモーダル粒度分布となるであろう。解析に動的に対応する（例えば、測定中に更新されるパラメータの分布に基づいて）拒否／分離基準を決定するこのアプローチは、測定が種々の試料に対応可能である十分なロバスト性を有することを意味し
、粒子の予想範囲を事前に特定することを使用者に求めない。

図１３は、酸化銅ナノ粒子の高度に多分散である可変試料に適用された、図１１に示す拒否／分離アプローチを表している。この種の高度に可変である分散性試料については、大多数のサブランが非過渡的であると特定され、報告される結果は試料の分散性（すなわち、マルチモーダル／多分散）を示す。図１３はベストフィットする正規分布４４１、平均Ｐｄｉ４４２（ベストフィットする正規分布４４１から算出）、及び閾値拒否基準４４３（平均値＋３σ）を有するグラフ４７０を示す。維持されたサブラン４４５及び拒否／分離されたサブラン４４４も、同じグラフにプロットされている。１つのサブラン（非常に高いＰｄｉを有する）のみが、データセットから拒否／分離されている。

上記の説明はＤＬＳにおける適用に焦点を当てているが、同様な技術は、ＳＬＳ測定及びＥＬＳ測定にも採用することができる。
分子量測定等の用途のための静的光散乱において、関心の対象となるのは時間的特性ではなく測定された散乱強度の大きさであり、ＳＬＳ測定も試料中のダストの影響を受けやすいことを意味する。

相関器を組み込んだＳＬＳ装置において、ＤＬＳにおいて説明されたのと同様な拒否プロセスを適用することは可能であり、維持されたデータの平均強度が次の解析に用いられる。しかし、相関器が利用できない場合であっても、各サブランの測定された散乱を定量化し、拒否パラメータとして用いられる平均値、ドリフト又はスプレッド（あるいはその他の値）と比較することにより、拒否を適用することは可能である。

図１４は、散乱検出器５１２における光強度と、光強度データ５１２（例えば、２０ポイントウィンドウを有する）から算出された移動平均５１１とを示す模擬計数率データを表している。移動平均は、ローパスフィルタとして作用し、関心の高い高周波情報を除去するとともに、低周波変動を監視する。データ５１２から移動平均５１１を取り去ることにより、強度における低速変動が除去された、図１５に示すデータが得られる。移動平均はデータを処理するために用い得る一種のローパスフィルタであるが、他の種類のフィルタリング又はスムージング処理を同様に用いてもよい（例えば、デジタルＩＩＲフィルタもしくはデジタルＦＩＲフィルタ、又はSavitzky-Golayフィルタなど）。

電気泳動光散乱は、電荷に応じて分散粒子における動きを誘導するために、試料に付加する外部電界を用い、この動きが散乱光のドップラー解析により検出される。
計数率トレースの特性のみならず、拒否の根拠となり得る他のパラメータは、スペクトル幅を有するドップラー信号を表すパラメータを含む。

図１３は、外れ値データを特定して破棄するために、スペクトル幅をどのように用い得るかを示す。図１３のグラフ５００は、散乱光の正規化された強度対周波数シフトの多数の曲線を示す。各曲線は、リゾチームを含む試料の電気泳動測定の、異なる測定ラン（又はサブラン）に対応する。スペクトル幅５０２が狭い測定ランは、凝集体が存在する試料に対応する。スペクトル幅５０１が広い測定ランは、凝集体を含まない試料に対応する。したがって、凝集体を含む試料は、複数のサブランを選び、例えば測定されたスペクトル幅の分布（例えば、平均プラス又はマイナス標準偏差数）に基づいて、非常に狭いスペクトル幅（他の測定に比べて）を有するサブランを破棄することによって解析してもよい。

図１７は、サブランの数が増加するにつれて、どのように解析結果が収束し得るかを示すグラフ５５０である。一連のサブランが行われ、蓄積された維持されたデータから取得され、報告されたＺ_average（５サブラン毎に更新される）が、１次ｙ軸上に（ｘ軸上の
サブランの数に対して）おいて、図１６にプロット５３２されている。データ維持率は、
全サブラン数に対する拒否／分離されたサブランの率として定義されており、第１の２次ｙ軸に対して（やはり５サブラン毎に決定される）プロット５３１されている。各データ点におけるＺ_averageの変化は、第２の２次ｙ軸に対してプロット５３３されている。

この例のデータセットにおいて、初期のサブランは大径粒子を含み、相当量のデータが最初の５サブランから除外されているが、報告されるＺ_averageはまだ比較的大きい。サ
ブラン６から１０においては、更に多くのデータが除外され、報告されるＺ_average は低めである。サブラン１０より後は、粒径のよりモノモーダルな分布が検出され、結果として、拒否されるデータはより少なく、Ｚ_averageは、モノモーダル粒子（関心の対象とな
る粒子である可能性が高い）のＺ_averageに収束し始める。Ｚ_averageは４５サブラン以内に１％未満に収束する。

使用者は、測定終了のきっかけとなる収束基準を設定することも可能である。本例の場合、１０％のＺ_average収束公差を設定することにより、信頼性の低い測定を得ることは
可能であり、その結果、約３０サブラン（４５サブランではなく）の後に測定が終了する。

個別に解析された比較的短い一連のサブランを用いることは、収束基準が満たされれば解析を早めに終了することができるため、解析が迅速になり得ることを意味し、それと同時に、過渡的な大径粒子が測定に影響を与えることができず、十分に信頼のおける散乱データが得られるまで測定を続けることができるため、解析の信頼性がより高いことを意味する。整合性のないデータを拒否する向上した性能は、さほど厳格でない試料調製をも可能にし得る、又は従来、解析に適さないと考えられていた試料の解析を可能にし得る。

具体的な例がこれまで説明されたが、これらの例は限定的であることを意図するものではなく、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内において更なる変更が可能であることは、当業者であれば理解されよう。

Claims (19)

1. 試料中の粒子を特性評価する方法であって、
   光線と前記試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、試料セル内の前記試料に前記光線を照射することと、
   前記散乱光の測定値の時系列を取得することと、
   前記測定値の時系列から、異常データを含む測定値がいずれであるかを判断することであって、異常データを含む測定値がいずれであるかを判断することは、前記時系列を複数の短いサブランに分割することと、その後、前記サブランのうちのどれが異常データを含むかを判断することとを含む、前記測定値の時系列から、異常データを含む測定値がいずれであるかを判断することと、
   前記測定値の時系列から粒子特性を決定することであって、異常データの補正を含み、ここで、前記異常データの補正は、異常データを含むサブランを、除外するか、又は個別に解析することを含む、前記測定値の時系列から粒子特性を決定することと、を含み、
   さらにこの方法は、前記異常データを含むサブランが除外されない場合は、初期回数のサブランを実行し、組み合わせたデータから取得された平均値が収束するまで、更なるサブランを記録して先行する測定値に追加すること、
   を含む方法。
2. 異常データの補正を含む、前記測定値の時系列から粒子特性を決定することは、異常データを含むものとして除外されていない各サブランを個別に解析し、その後、前記サブラン解析の平均を用いて前記粒子特性を決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 粒子特性を決定することは、粒子径分布、電気泳動移動度、磁気泳動移動度、分子量、相互作用パラメータ、及びマイクロレオロジー特性のうちの少なくとも１つを決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 粒子特性を決定することは、前記測定値の時系列に対して動的光散乱相関演算又はレーザー回折分析を行うことを含む、請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の方法。
5. 粒子特性を決定することは、前記測定値の時系列における１０Ｈｚ未満の低周波変動を検出及び／又は除去することを含む、請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記サブランのうちのどれが異常データを含むかを判断することは、各サブランに関するパラメータを評価し、前記パラメータが閾値を超えているかを評価することを含み、前記パラメータは、強度、多分散性指数、及びＺ平均から選択される、請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記閾値が、各サブランから算出された前記パラメータの値の分布から算出される、請求項６に記載の方法。
8. 前記閾値が、前記パラメータの平均値及び前記パラメータの標準偏差から算出される、請求項７に記載の方法。
9. 前記サブランのうちのどれが異常データを含むかを判断することは、
   各サブランに関する粒子特性を動的光散乱によって決定することを含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の方法。
10. 各サブランが、５秒以下、２秒以下、１秒以下、０．５秒以下、又は０．１秒以下の継続時間を有する、請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記異常データは、大径粒子からの散乱を含む、請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記大径粒子が１００ｎｍを超える直径を有する、請求項１１に記載の方法。
13. 異常データを識別するための基準が、前記散乱光の測定値の時系列から決定されたパラメータに基づく、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 異常データを識別するための基準が、使用者により入力されたパラメータに基づき、前記パラメータは、強度、多分散性指数、及びＺ平均から選択される請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 粒子を特性評価するための装置であって、前記装置は、光源と、試料セルと、少なくとも１つの検出器と、プロセッサとを備え、
    前記光源は、光線と試料との相互作用により散乱光を生じさせるように、前記試料セル内の前記試料に前記光線を照射するよう動作可能であり、
    前記少なくとも１つの検出器は、前記散乱光を検出して、測定値の時系列を生成するように構成され、
    前記プロセッサは、
    前記測定値の時系列を受信するように構成され、
    前記測定値の時系列から異常データを含む測定値がいずれであるかを判断するように構成され、異常データを含む測定値がいずれであるかを判断することは、前記時系列を複数の短いサブランに分割することと、その後、前記サブランのうちのどれが異常データを含むかを判断することとを含み、
    前記測定値の時系列から粒子特性を決定するように構成され、異常なデータを補正することを含めて、測定値の時系列から粒子特性を決定することは、異常データを含むサブランを、除外するか、又は個別に解析することを含み、
    前記異常データを含むサブランが除外されない場合は、初期回数のサブランを実行し、組み合わせたデータから取得された平均値が収束するまで、更なるサブランを記録して先行する測定値に追加するように構成された、装置。
16. 前記少なくとも１つの検出器が光子計数検出器を備える、請求項１５に記載の装置。
17. 前記少なくとも１つの検出器が後方散乱光を検出するように構成されている、請求項１５又は請求項１６に記載の装置。
18. 前記検出器と前記光源により照射される散乱ボリュームとの間に、光路を提供する光ファイバを更に備える、請求項１５から請求項１７のいずれか１項に記載の装置。
19. 前記散乱光を検出するように構成された複数の検出器を備える、請求項１５から請求項１８のいずれか１項に記載の装置。

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