JP7360465B2 - エルゴチオネインを産生する菌株及びそのスクリーニングのための方法 - Google Patents
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(TTGTACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGATGGTACCTTGCTACATGGATAACTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAATTAAGCCCCGACTTCCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCGGCTCGCCGCTCCTTTGGTGATTCATAATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGATGCTTCATTCAAATATCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATATAGGGCTCTTTTGGGTCTTATAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACTTCAGGCCTGGCCGGGCGGTCTGCCTAACGGTATGTACTGTCTGGCCGGGCCTTACCTCCTGGTGAGCCGGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAACCAGGACTTTTACCTTGAGAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCCCGAATACATTAGCATGGAATAATAAAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGAATCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTTGGGGGCATTAGTATTGCGTTGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTTACGCAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAGGTTAGGGGATCGAAAACGATCAGATACCGTTGTAGTCTTAACAGTAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGACCTCAATTTAATGTGTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACATAACTAGGATTGACAGATTGATAGCTCTTTCTTGATTTTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGCCGGCTTTTGCTGGTCGCTGGCTTCTTAGAGGG)
において示されるように、18rRNA遺伝子配列を有する、項目1に従うヤマブシタケ菌。
(TGCGGAAGGATCATTAATGAATTTGAAAGGAGTTGTTGCTGGCCTGAAACCCAGGCATGTGCACGCTCCAATCTCATCCATCTTACACCTGTGCACCCTTGCGTGGGTCCGTCGGCTTTGCGGTCGATGGGCTTGCGTTTTTCATAAACTCTTATGTATGTAACAGAATGTCATAATGCTATAAACGCATCTTATACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCCCCTTGGTATTCCGAGGGGCACGCCTGTTCGAGTGTCGTGAAATTCTCAACTCAATCCTCTTGTTATGAGAGGGCTGGGCTTGGACTTGGAGGTCTTGCCGGTGCTCCCTCGGGAAGTCGGCTCCTCTTGAATGCATGAGTGGATCCCTTTTGTAGGGTTTGCCCTTGGTGTGATAATTATCTACGCCGCGGGTAGCCTTGCGTTGGTCTGCTTCTAACCGTCTTCGGACAACTTTCATCTCAACTTGACCTCGAATCAGGCGGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA)
において示されるように、ITS配列を有する、項目1に従うヤマブシタケ菌。
(1)抗生物質を含むポテトデキストロース寒天培地上にヤマブシタケ菌の組織片を置き、23~28℃で5~12日間培養し、ヤマブシタケ菌糸を入手し;ポテトデキストロース寒天培地上にヤマブシタケ菌糸を播種し、23~28℃で5~12日間培養し、ヤマブシタケ菌株を入手すること;
(2)ステップ(1)において入手したヤマブシタケ菌株を発酵培地に播種し、23~26℃で12~20日間培養し、ここで前駆物質を培養中の7日目から10日目に供給し、発酵ブロスを入手すること;
(3)その発酵ブロスを遠心分離し、その上清をとり、濾過にかけ、その濾過物のエルゴチオネイン量を検出し、そしてエルゴチオネインの産生についてその菌株をスクリーニングすること;のステップを含む方法であって、
好ましくは、さらにそのスクリーニング方法が、ステップ(2)の後に、その菌糸体細胞からその細胞の外側へエルゴチオネインの浸出抽出の、ステップを含んでいるそのスクリーニング方法。
菌糸体のその発酵ブロスをホモジナイズし、そして続けて加熱し、それによってその菌糸体細胞からその細胞の外側へそのエルゴチオネインを抽出すること;又は
菌糸体発酵ブロスの固相-液相分離によってその菌糸体を回収し、水を加えることによって菌糸体懸濁液を調製し、ホモジナイズし、そして続いて加熱し、それによってその菌糸体細胞からその細胞の外側へそのエルゴチオネインを抽出すること:
によって行われる、項目7に従うスクリーニング方法。
(1)ヤマブシタケ菌から約0.5×0.5cmの組織片を切り、そして抗生物質を含むPDA寒天培地上に置き、5~12日間、好ましくは7~10日間、23~28℃で、好ましくは24℃で培養し、ヤマブシタケ菌糸を入手し;PDA寒天培地上にヤマブシタケ菌糸を播種し、5~12日間、好ましくは8日間、23~28℃で、好ましくは24℃で培養し、ヤマブシタケ菌株を入手することであって;
ここで、慣習の固形培地として、そのPDA寒天培地は、半合成培地であって、以下のように処方される:pH調整せずに、200gのジャガイモ、20gのグルコース、15~20gの寒天及び1000mLの水より調製される浸出液である。
(2)ステップ(1)において入手したヤマブシタケ菌を発酵培地に播種し、12~20日間、好ましくは15日間、23~26℃で、好ましくは24℃で培養し、ここで前駆物質を培養中7日目~10日目に供給し、発酵ブロスを入手すること。
(3)発酵ブロスを8000~10000rpmで、好ましくは8000rpmで10~20分間、好ましくは20分間遠心分離し、上清をとり、0.22μmの微小孔性のフィルターを介して濾過し、その濾過物のエルゴチオネイン量を検出し、そしてエルゴチオネインの産物についてその菌株をスクリーニングした。ステップ(1)のヤマブシタケからの組織片は傘、傘と茎との接点、茎の中間部分及び底部、好ましくは傘を意味する。
好ましくは、その発酵培地に含まれる炭素源は、グルコース及びマルトースのいずれか1つ又は2つの組み合わせを含む。
好ましくは、その発酵培地に含まれるビタミン類は、ビタミンB1及びナイアシンのいずれか1つ又は2つの組み合わせを含む。
(2)ステップ(1)から入手した固形の菌株をその発酵培地に播種し、そして24℃で16日間培養し、菌糸体発酵ブロスを入手した。その発酵培地は35g/Lのスクロース、20g/Lのコーンスティープリカー、3g/L KH2PO4、3mg/L ビタミンB1及び水を含んでいた。10日間の発酵後、前駆アミノ酸、システイン、メチオニン及びヒスチジンを各2mMの濃度でそれぞれ供給した。
(3)その発酵の最後に、その菌糸体発酵ブロスを4000rpmで60分間ホモジナイズし、続いてそのホモジナイズした発酵ブロスを80℃で50分間加熱し、そのエルゴチオネインをその発酵ブロス内の菌糸体細胞から浸出抽出し、8000rpmで20分間遠心分離し、その上清をとり、0.22μmの微小孔性のフィルターを介して濾過し、そしてその濾過物の最高のエルゴチオネイン含量を有する菌株をスクリーニングし、ヤマブシタケHT-3(Hericum erinaceus HT-3)と名付けた。
本実施例において、異なる成分、含量及びpH値を有する5つの発酵培地を本試験のために選択した。各発酵培地の組成物及びpHを以下の表1に示した。
Claims (10)
- 寄託番号CCTCC No:M 2018567を有する、ヤマブシタケ菌。
- SEQ ID NO.1において示されるように18rRNA遺伝子配列を有する、請求項1に記載のヤマブシタケ菌。
- SEQ ID NO:2において示されるようにITS配列を有する、請求項1に記載のヤマブシタケ菌。
- 発酵ブロスにおいて41mg/Lより多いエルゴチオネインを産生し、前記発酵ブロスが炭素源、窒素源、無機塩類及びビタミン類を含んでいる発酵培地より産生される、請求項1に記載のヤマブシタケ菌。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヤマブシタケ菌及び発酵ブロスを含む組成物であって、エルゴチオネインを含む前記発酵ブロスであって、ここで前記発酵ブロスのエルゴチオネイン量が41mg/Lより多く、かつここで前記発酵ブロスが炭素源、窒素源、無機塩類及びビタミン類を含んでいる発酵培地から産生される、組成物。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のヤマブシタケ菌のためのスクリーニング方法であって、
(1)抗生物質を含むポテトデキストロース寒天培地上にヤマブシタケ菌の組織片を置き、23~28℃で5~12日間培養し、ヤマブシタケ菌糸を入手し;ポテトデキストロース寒天培地上にヤマブシタケ菌糸を播種し、23~28℃で5~12日間培養し、ヤマブシタケ菌株を入手すること;
(2)ステップ(1)において入手したヤマブシタケ菌株を発酵培地に播種し、23~26℃で12~20日間培養し、ここで前駆物質を培養中の7日目から10日目に供給し、発酵ブロスを入手すること;
(3)前記発酵ブロスを遠心分離し、上清をとり、濾過にかけ、得られた濾液のエルゴチオネイン量を検出し、そしてエルゴチオネインの産生について前記菌株をスクリーニングすること;のステップを含む方法であって、
好ましくは、さらに前記スクリーニング方法が、ステップ(2)の後に、菌糸体細胞から前記細胞の外側へ細胞内エルゴチオネインの浸出抽出の、ステップを含んでいる前記スクリーニング方法。 - 前記菌糸体細胞からのエルゴチオネインの浸出抽出の前記ステップが、
菌糸体の前記発酵ブロスをホモジナイズし、そして続けて加熱し、それによって前記菌糸体細胞から前記細胞の外側へ前記エルゴチオネインを抽出すること;又は
菌糸体発酵ブロスの固相-液相分離によって菌糸体を回収し、水を加えることによって菌糸体懸濁液を調製し、ホモジナイズし、そして続いて加熱し、それによって前記菌糸体細胞から前記細胞の外側へ前記エルゴチオネインを抽出すること:
によって行われる、請求項6に記載のスクリーニング方法。 - ステップ(1)の前記抗生物質がペニシリン、ストレプトマイシン及びクロラムフェニコールのいずれか1つ又は2以上の組み合わせを含む、請求項6に記載のヤマブシタケ菌のためのスクリーニング方法。
- ステップ(2)の前記前駆物質がシステイン、メチオニン及びヒスチジンのいずれか1つ又は2以上の組み合わせを含む、請求項6に記載のヤマブシタケ菌のためのスクリーニング方法。
- 前記発酵培地が20~60g/Lの炭素源、10~30g/Lの窒素源、2~5g/Lの無機塩類、及び0.001~0.005g/Lのビタミン類を含む、請求項6に記載のヤマブシタケ菌のためのスクリーニング方法。
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