JP7326500B2

JP7326500B2 - ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質医薬品製剤

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Publication number: JP7326500B2
Application number: JP2021577193A
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Inventors: 巧玉徐; 壮林李; 雪静姚; 健民房
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Filing date: 2020-12-09
Publication date: 2023-08-15
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Description

本発明は、リンパ球の発生及び分化を調節するための融合タンパク質医薬品製剤に関し、抗自己免疫疾患用医薬品の分野に属する。

リンパ球の発生及び分化プロセスは、サイトカインによって調節されている。Ｂリンパ球刺激因子（Ｂｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ（略称：Ｂｌｙｓ）、Ｂ細胞活性化因子：Ｂｃｅｌｌａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（略称：ＢＡＦＦ）とも言う）及び増殖誘導リガンド（ａｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ、略称：ＡＰＲＩＬ）は、免疫応答の調節に重要な役割を持つサイトカインであり、Ｂリンパ球の発達及び増殖を促進し、血中の免疫グロブリンの発現量を向上することができる。ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬは、Ｔリンパ球の成熟にも肝要な調節作用を有するため、細胞性免疫にも重要な影響を及ぼす。

Ｂｌｙｓ及びＡＰＲＩＬは、リンパ球表面の受容体を介してリンパ球の免疫応答反応を調節する。それらは、細胞膜受容体、ＴＡＣＩ（膜貫通アクチベーター及びＣＡＭＬインタラクター（ＴｒａｎｓｍｅｎｂｒａｎｅＡｃｔｉｖａｔｏｒａｎｄＣＡＭＬ－ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ））及びＢＣＭＡ（Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣｅｌｌＭａｔｕｒａｔｉｏｎＡｎｔｉｇｅｎ））と結合する。また、ＢＬｙＳは別の受容体ＢＡＦＦ－Ｒにも結合することができる。Ｂリンパ球は、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦ－Ｒを発現し、成熟Ｔリンパ球はＴＡＣＩを発現する。ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬは、それらの受容体のシグナル伝達を介してリンパ球の活性化、増殖及び発達を調節し、免疫応答を引き起す。
また、リンパ球腫瘍の場合、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬは、腫瘍細胞分裂を促進して腫瘍細胞のアポトーシスを阻害する作用を有し、腫瘍の進行を促進する。

多くの研究は、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬの過剰発現が多くの自己免疫疾患の起因の一つであることを示している。これらの疾患には、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、シェーグレン症候群などが含まれる。また、臨床研究は、ＢｌｙＳの濃度が自己免疫疾患の重症度と正の相関関係にあることが多いことを示している。従って、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬの産生を阻害するか、又はそれの体内の濃度を下げることは、自己免疫疾患を治療するための効果的な方法になる。また、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬがＢリンパ球腫瘍の進行を加速できるため、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬの阻害は、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂリンパ球性リンパ腫などのＢリンパ球腫瘍を治療にも使用できる。

ＴＡＣＩがＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬに対して高い親和性を持っているため、可溶性ＴＡＣＩ（ＴＡＣＩの細胞外部分）を使用してＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬと細胞膜受容体（ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＡＦＦ－Ｒ）との間の相互作用を防ぎ、ＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬの生物学的活性を遮断し、自己免疫疾患又は腫瘍を治療する目的を達成する。多くの研究により、ＴＡＣＩの細胞外部分とＩｇＧＦｃ断片とを結合する融合タンパク質（ＴＡＣＩ－Ｆｃ）がＢｌｙＳ及びＡＰＲＩＬに関連する疾患を効果的に阻害できることが示されている。例えば、ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ社とＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏ社によって共同研究されたＴＡＣＩ融合タンパク質Ａｔａｃｉｃｅｐｔの臨床結果は、ＳＬＥ、関節リウマチ、リンパ腫などの疾患に治療効果があることを示している。

また、特許ＣＮ１０１３２３６４３Ｂは、短縮されたＴＡＣＩと免疫グロブリンＦｃとからなる融合タンパク質であって、ＴＡＣＩ部分は、ＴＡＣＩ細胞外領域由来のアミノ酸残基１３から始まるアミノ末端領域の配列、システインリッチ領域の完全な配列、及びハンドル領域の一部の配列を含み、免疫グロブリンＦｃは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、ＴＡＣＩ配列及びＦｃ配列は直接融又は連結配列を介して融合される、融合タンパク質を開示している。さらに、そのＴＡＣＩ断片はＴＡＣＩの１３番目から１０８番目のアミノ酸配列或いは１３番目から１１８番目のアミノ酸配列から選ばれ、ここで、連結配列は９Ｇｌｙであり、その免疫グロブリンＦｃ断片はヒト又は動物の免疫グロブリンＦｃからから選ばれ、ヒトまたは動物の免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡから選ばれる。各免疫グロブリンタイプはＩｇＧ１などのサブタイプも含む。特許ＣＮ１０２０８５３６８Ｂは、上記のＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質が例えば全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の治療に用いられることを開示している。特許出願ＣＮ２０１８１０５１２５０８．８は、視神経脊髄炎、再発性視神経炎、縦方向に広範な横断性脊髄炎、視神経脊髄型多発性硬化症、長期横断性脊髄炎、片側性または両側性視神経炎、自己免疫疾患を伴う視神経炎或脊髄炎、症候性または無症候性脳病変を伴う視神経炎又は脊髄炎を含む視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、及び多発性硬化症（ＭＳ）の治療のためのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の適用を証明している。

現在市販されている他の抗体医薬品及び融合タンパク質の製剤は、その処方の一部が以下の通りである。

上記の抗体製剤及び融合タンパク質の添加物成分の組成から分かるように、融合タンパク質及び抗体製剤の組成には特別な特徴がある。一方では、モノクローナル抗体系医薬品の壊れやすい安定性と複雑さのために、そのような医薬品を製造して保管することが非常に困難となる。抗体の構造の異質性、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）とＦｃグリコシル化のため、異なるモノクローナル抗体製剤の開発をケースバイケースで実行する必要がある。抗体製剤の開発では、例えば、酸化、異性化、脱アミド化、凝集、変性、断片化などの、抗体のコンフォメーション、コロイドや化学構造への挑戦がある。ｍＡｂの３次元構造、特に、超可変領域（ＨＶＲ）は、さまざまな温度と湿度、ｐＨ、応力にさらされると、変化する恐れがある。不良品は、活性の低下を示す可能性があり、さらに重要なことに免疫原性が増加して患者を危険にさらす恐れもある。従って、最適な添加物を選択して抗体を保護することが非常に重要である。（文献１：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓｏｆｍａｒｋｅｔｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓａｎｄｒｅｃｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｎｏｖｅｌｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍ，ＹａｎａｎＣｕｉ，ｅｃｔ．，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＰｈａｒｍａｃｙ，４３巻，４号，５１９－５３０頁，２０１７年）。一方、融合タンパク質の製品は凝集しやすく安定性が悪いため、不良免疫応答を引き起こしたり精製プロセスを妨げたりすることがあり、この分野で緊急に解決すべき問題であり、さらに、融合タンパク質の凝集に影響を与える要因も比較的複雑であり、主に温度、物理的圧力、溶媒要因（ｐＨ、イオン強度、濃度、金属イオンなど)を含む外部要因と、主に融合タンパク質の構造の特徴、敏感な残基、不対合システイン残基を含む内部要因とに分かれ、また、これらの全ての要因は融合タンパク質の凝集に影響を与え、その安定性及び保存時間に影響を与える。従って、融合タンパク質の添加物を選択するために、多量の実験的調査が必要である（文献２：ＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎＣｈａｌｌｅｎｇｓｆｏｒＣｏｍｐｌｅｘＢｉｏｌｏｇｉｃｓ：ＦｕｓｉｏｎＰｒｏｔｅｉｎｓ，ＳｔｅｆａｎＲ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，ＡｍｅｒｉｃａｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗ，１－５頁，２０１７年）

したがって、本発明は、生物学的製剤に利用可能な添加物に関する広い範囲のスクリーニング及び濃度範囲の研究を通じて、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の製剤の組み合わせを得、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質が凍結乾燥前後でもよく溶解し、不溶性微粒子や目に見える異物が人用注射液の基準を満たしていると同時に、凍結乾燥や保存中で長期間安定であり、再構成後でも凝集や分解しにくく、良好な生物学的活性を維持するという技術的効果を達成すること、を目的とする。

本発明は、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質と、非還元糖と、アミノ酸とを含むＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の水性液体医薬品製剤であって、前記非還元糖は、マンニトール、スクロース、トレハロース、及びそれらの組み合わせから選ばれ、前記アミノ酸は、ヒスチジン、アラニン、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、及びそれらの組み合わせから選ばれる、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の水性液体医薬品製剤に関する。

いくつかの実施形態において、前記ヒスチジンは、ヒスチジン塩酸塩であり、濃度が１～１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５～５０ｍｍｏｌ／Ｌ、５～２０ｍｍｏｌ／Ｌ、８～１２ｍｍｏｌ／Ｌ、又は約１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、前記アルギニンは、アルギニン塩酸塩であり、濃度が１０～１６０ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは２０～１２０ｍｍｏｌ／Ｌ、５０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、７０～９５ｍｍｏｌ／Ｌ、７５～９０ｍｍｏｌ／Ｌ、約９０ｍｍｏｌ／Ｌ、又は約７５ｍｍｏｌ／Ｌである。

いくつかの実施形態において、前記スクロースの濃度は１～３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは５～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、１０～１００ｍｍｏｌ／Ｌ、３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌ、又は約４０ｍｍｏｌ／Ｌである。

いくつかの実施形態において、前記マンニトールの濃度は、１０～３００ｍｍｏｌ／Ｌであり、好ましくは１０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ、６０～１５０ｍｍｏｌ／Ｌ、８５～１２５ｍｍｏｌ／Ｌ、９０～１２０ｍｍｏｌ／Ｌ、約１２０ｍｍｏｌ／Ｌ、又は約９０ｍｍｏｌ／Ｌである。

いくつかの実施形態において、前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ．１で示される。前記タンパク質は、ＴＡＣＩの１３～１１８番目のアミノ酸と、最適化されたＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果を低減したＦｃ断片とからなる。

ＳＥＱＩＤＮＯ．１に示されるＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質において、膜結合性ＢＬｙＳ又は増殖誘導リガンド（誘導リガンド：ＡＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ－ＩｎｄｕｃｉｎｇＬｉｇａｎｄ、ＡＰＲＩＬ）による抗体依存性細胞介在性細胞傷害（抗体依存性細胞傷害：ＡＤＣＣ）効果を避けるために、ＩｇＧ１に由来するＦｃ断片の配列が最適化されている。Ｆｃ断片におけるＣＨ２領域における１２０～１２３番目のアミノ酸をロイシン（ロイシン（Ｌ）－ロイシン（Ｌ）－グリシン（（Ｇ）－グリシン（Ｇ）からアラニン（Ａ）－グルタミン酸（Ｅ）－グリシン（Ｇ）－アラニン（Ａ））に変異させ、Ｆｃγ受容体の親和力を低下させる。また、Ｆｃ配列のＣＨ２領域も変異し、２１６～２１７番目のアミノ酸残基は、補体結合又は固定を減らすために、アラニン（Ａ）－プロリン（Ｐ）からセリン（Ｓ）－セリン（Ｓ）に変異させることにより、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）効果を低減する。

ＳＥＱＩＤＮＯ：１の配列は、以下の通りである：

液体製剤においては、Ｆｃヒンジ領域が鎖間ジスルフィド結合を形成するため、２つのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質単量体が二重鎖構造を形成することができる。

いくつかの実施形態において、前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、５～２４０ｍｇ／ｍｌであり、好ましくは約５０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌであり、最も好ましくは約８０ｍｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態において、前記非還元糖は、９０～１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び／又は３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、前記アミノ酸は、７５～１２５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩及び／又は８～１２ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩であり、前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、８０～１００ｍｇ／ｍｌであり、ヒスチジン塩酸塩の濃度は、より好ましくは約１０ｍｍｏｌ／Ｌである。

いくつかの実施形態において、約１％から約１０％（ｗ／ｖ、ｇ／１００ｍｌ）のＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含み、好ましくは約６～１０％（ｗ／ｖ、ｇ／１００ｍｌ）のＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含む。

いくつかの実施形態において、前記非還元糖は、約９０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び約４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、前記アミノ酸は、約９０ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩及び約１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩であり、前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態において、前記非還元糖は、約１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び約４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、前記アミノ酸は、約７５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩及び約１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩であり、前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、約８０ｍｇ／ｍｌである。

いくつかの実施形態において、前記製剤のｐＨは、４．０から８．０であり、好ましくは４．５から７．０であり、５．０から６．０であり、又は約５．５である。溶液のｐＨ値は、ＮａＯＨ又は塩酸で調整される。

別の側面では、本発明は、前記水性液体医薬品製剤を凍結乾燥して得られる凍結乾燥医薬品製剤に関する。

幾つかの凍結乾燥医薬品製剤の実施形態においては、前記水性液体医薬品製剤は、約９０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール、約４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、約９０ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩、約１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩、及び約８０ｍｇ／ｍＬのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、ｐＨが５．０から６．０である。

幾つかの凍結乾燥医薬品製剤の実施形態においては、前記水性液体医薬品製剤は、約１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール、約４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、約７５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩、約１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩、及び約８０ｍｇ／ｍＬのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、ｐＨが５．０から６．０である。

幾つかの凍結乾燥医薬品製剤の実施形態においては、前記水性液体医薬品製剤における非還元糖は、濃度がそれぞれ約１６．４ｍｇ／ｍｌ及び約１３．７ｍｇ／ｍｌであるマンニトール及びスクロースであり、前記水性液体医薬品製剤におけるアミノ酸は、濃度がそれぞれ約１９．０ｍｇ／ｍｌ及び約２．１ｍｇ／ｍｌであるアルギニン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩である。

幾つかの凍結乾燥医薬品製剤の実施形態においては、前記水性液体医薬品製剤における非還元糖は、濃度がそれぞれ約２１．９ｍｇ／ｍｌ及び約１３．７ｍｇ／ｍｌであるマンニトール及びスクロースであり、前記水性液体医薬品製剤におけるアミノ酸は、濃度がそれぞれ約１５．８ｍｇ／ｍｌ及び約２．１ｍｇ／ｍｌであるアルギニン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩である。

さらに、本発明は、自己免疫疾患を治療する医薬品の製造における前記医薬品製剤の使用に関する。前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）及びシェーグレン症候群が含まれる。前記視神経脊髄炎スペクトラム障害には、視神経脊髄炎、再発性視神経炎、縦方向に広範な横断性脊髄炎、視神経脊髄型多発性硬化症、長期横断性脊髄炎、片側性または両側性視神経炎、自己免疫疾患を伴う視神経炎或脊髄炎、症候性または無症候性脳病変を伴う視神経炎或脊髄炎を含む。前記リンパ腫は、慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂリンパ球性リンパ腫を含む。

さらに、本発明は、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質医薬品製剤を製造する方法において、（１）上記の医薬品製剤を調製することと、（２）該製剤におけるＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の安定性を評価することとを含む、方法に関する。

別の側面では、本願はさらに上記の医薬品製剤を調製するための方法に関し、前記ステップは、タンバク質ストック溶液の入手、予備凍結、一次乾燥、二次乾燥及び分配を含む。

いくつかの実施形態において、前記タンバク質ストック溶液を得るステップは、
１．ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を発現できる遺伝子組換えＣＨＯ細胞を培養し、細胞生存率が許容される下限値になったら、遠心分離またはろ過により細胞を分離し、上清を採取すること、
２．プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムにより第１ステップの精製を行い、溶出した目的タンパク質を限外ろ過により濃縮し、複合型フィラークロマトグラフィーカラムで第２ステップの精製を行い、目的タンパク質のピークを収集した後、第３ステップのクロマトグラフィーカラムで目的タンバク質透過モードで第３ステップの精製を行うこと、を含む。

いくつかの実施形態において、タンバク質ストック溶液を得るステップは、さらに、精製されたタンパク質が試験に合格した後、「５×製剤緩衝液」と混合し、限外ろ過によって濃縮し、タンバク質ストック溶液を得ることを含む。

いくつかの実施形態において、得られたタンバク質ストック溶液は、タンパク質を含まない製剤緩衝液で所望のタンパク質濃度、即ち、半製品のタンパク質溶液に正確に希釈する必要があり、その後、バイアル瓶に分けて入れ、真空凍結乾燥を行う。本願によって得られる主な技術的効果は、高度に精製されたＴＡＣＩ－Ｆｃタンパク質の純度が非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥの９９％以上に達し、そして、そのＣＨＯ細胞宿主タンパク質、ＣＨＯ細胞宿主ＤＮＡ、細菌内毒素などの指標が「中国の薬局方」（２００５年版）の基準を満たしている。本願により得られたＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含む医薬品製剤は、含水率、粒子数、目に見える異物及び不溶性微粒子数が全て優れた基準に達し、かつ、長期保存安定性を有する。

図１は、水分含有量測定を示す図であり、その結果は、処方１１、１２、１３の凍結乾燥粉末が非常に吸水しやすく、水分含有量が要件を満たしていなく、処方３～処方９は含水率試験の要件を満たしたことを示している。図２は目に見える異物の検出測定を示す図であり、結果は、処方３及び４が目に見える異物検出の要件を満たしていないことを示している。図３は、不溶性微粒子の検出測定を示す図であり、結果は、処方３及び４が不溶性微粒子検出の要件を満たしていないことを示している。

実施例１：ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の取得及び精製
Ｑｉａｇｅｎ社のＲＮＡ精製キットを使用し、ヒト末梢血単核細胞からトータルＲＮＡを精製した。次に、逆転写酵素を使用し、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、プライマー（順：ＡＧＣＣＧＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＡＧＧ、逆：ＧＡＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＧＴＴＣＡＣＴＧ）を使用し、ポリメラーゼ連鎖反応より増幅させて所望のＴＡＣＩ片断を得た。免疫グロブリンＦｃ片断は、クローンされた配列最適化されたＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果が低下したＩｇＧ１ＦｃプラスミドからのＰＣＲ増幅により得られた。最後、ＴＡＣＩとＦｃ配列とをＰＣＲで融合させ、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質のＤＮＡ配列（そのアミノ酸配列がＳＥＱＩＤＮＯ．１である）を構築した。ＴＡｃｌｏｎｉｎｇキットを使用し、ＴＡＣＩ及びＦｃのＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１プラスミドにそれぞれクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉをトランスフェクションし、白いコロニーを選択し、ＬＢ培地を加え、一晩培養した。さらに、Ｑｉａｎｇｅｎプラスミド抽出キットを使用してプラスミドを抽出し、制限酵素消化及びシークエンシングによってＴＡＣＩ及びＦｃの配列を同定した。最後に、スプライシングＰＣＲ法でＴＡＣＩとＩｇＧＦｃｃＤＮＡとを結合した。ＴＡＣＩ－Ｆｃ断片を発見プラスミドに挿入した。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉにトランスフェクトし、陽性コロニーを選択し、プラスミドを抽出した後、制限酵素消化及びシークエンシングによって目的配列を同定した。プラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、この遺伝子組換えされたＣＨＯ細胞を標準的な条件下で培養し、培地中の栄養素が枯渇して細胞が増殖しなくなったら、タンクに入れた。細胞を遠心分離又はろ過により分離し、上清を回収した。ＴＡＣＩ－Ｆｃタンパク質が上清に存在し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムで第１ステップの精製を行い、溶出された目的タンバク質を目的タンバク質の濃度が３０－５０ｍｇ／ｍｌになるまで限外ろ過で濃縮し、複合型フィラークロマトグラフィーカラムで第２ステップの精製を行い、目的タンパク質ピークを回収し、その後、第３ステップのクロマトグラフィーカラムで目的タンバク質透過モードで第３ステップの精製を行った。精製したタンバク質の各指標が試験に合格した後、４：１の体積比で「５×製剤緩衝液」と混合し、次に、限外ろ過により濃縮し、タンパク質の濃度が約１００ｍｇ／ｍｌに達し、タンバク質ストック溶液を得、－８０℃で長期間保存した。

添加物スクリーニング
前期での大量の情報分析と実験的スクリーニングを通じ、スクロース、マンニトール、グリセロール、ヒスチジン、アルギニン、ポリソルベート８０（即ち、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｗｅｅｎ８０）などの添加物を、さらなるスクリーニングする候補添加物として一度決め、以下の測定を実行した。

実施例２：ＴＡＣＩ－Ｆｃタンバク質の可溶化の促進に対するアルギニンの効果に関する研究
アルギニンを含まない緩衝液（例えば、２０ｍｍｏｌ／ＬＮａＨ₂ＰＯ₄－Ｎａ₂ＨＰＯ₄ １２０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中のＴＡＣＩ－Ｆｃタンバク質は、タンパク質の濃度が５ｍｇ／ｍｌ以上であり、４℃の冷蔵庫に一晩置き、容器の底に凝集性の沈殿物が生じ、軽く振るとその沈殿物が浮き、目に見える異物及び不溶性微粒子の検出を行うことができなく、タンパク質濃度が高いほど、タンパク質の沈殿が深刻になる。予備的な実験的研究により、タンパク質溶液にアルギニン塩酸塩を加えると、沈殿物がすぐに消えることを発見した。

更なる実験：
１）精製したＴＡＣＩ－Ｆｃタンバク質７２９０ｍｇを１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン（ｐＨ５．５）緩衝液に透析し、タンパク質の濃度が５ｍｇ／ｍｌであった。
２）次に、タンパク質溶液を９つのグループに分け、グループあたり７部で、合わせて６３部であり、各グループにおける７部のタンバク質の含有量がそれぞれ１０、２０、４０、１００、１６０、２００、３００ｍｇであり、アルギニン塩酸塩の最終濃度がそれぞれ０、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５ｍｍｏｌ／Ｌとなるように、９つのグループに１ｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩（ｐＨ５．５）溶液を添加した。次に、最終体積が２ｍｌとなるように、孔径３０ＫＤの遠心式限外ろ過チューブで濃縮した。まず、タンパク質が明らかに沈殿したかどうかを観察した。明らかな沈殿がある場合には、それ以上の操作は行わず、表に「－」を直接記録する。沈殿が明らかではない場合には、スーパークリーンベンチで０．２２μｍの滅菌シリンジフィルターで２ｍｌの滅菌バイアル瓶にろ過し、滅菌ゴム栓で密封し、アルミ蓋を結び、４℃の冷蔵庫で２４時間保管し、沈殿があるかどうかを観察した。

検査基準：ＹＢ－II型クラリティテスターで観察した。完全に清澄化されているか、又は白点の数が３個以下である場合は、「－」と記した。沈殿がある場合は、沈殿の量によって、それぞれ「＋」、「＋＋」、「＋＋＋」と記し、ここで、「＋」記号が多いほど沈殿が多いことを示す。実験結果は表１に示される。実験結果は、アルギニン塩酸塩の最適濃度が７５ｍｍｏｌ／Ｌ～１２５ｍｍｏｌ／Ｌの間である。

実施例３：凍結乾燥粉末の水分含有量及び外観に対するマンニトールの濃度の影響の決定
実施例２と同様なステップを通じて、様々な濃度のマンニトールの存在下で異なる濃度のＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含有するものから製造された凍結乾燥粉末の水分含有量及び外観の状況を調査した。実験によると、マンニトールの含有量が６０ｍｍｏｌ／Ｌ未満である場合、凍結乾燥粉末の水分含有量及び外観に影響を及ぼした。

実施例４：ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の保護作用に対するスクロースの影響
異なる濃度のスクロースを含有する医薬品製剤の凍結乾燥粉末が４℃、２５℃及び３５℃条件下での安定性を実験により調査した。実験によると、凍結乾燥ストック溶液中のスクロースの濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌ未満である場合、ストック溶液が凍結乾燥プロセスにおいてＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の活性を失い、効果的な凍結乾燥保護作用を発揮できない。

実施例５：処方検証溶液の調製
上記の試験に基づいて、様々な製剤処方を設計してさらなる試験を行った。

ヒスチジン塩酸塩の溶液の調製：
表２に示される処方に従い、処方番号１～１３の１×製剤緩衝液を調製した。表２の番号１の処方を例とする。
１）計算を経て、２．１０ｇのヒスチジン塩酸塩、０ｇのマンニトール、１５．８０ｇのアルギニン塩酸塩、５４．７７ｇのスクロースを秤量し、上記の材料をきれいな１Ｌビーカーに加えた。
２）適量の注射用水を加え、溶解し、溶解後にｐＨ値を調整した。
３）溶液の密度に応じて重量測定法によって容量を決め、容量を決めた後、ｐＨを５．５に微調整した。
他の処方は、各成分の用量に応じて上記のステップに従って調整される。

透析緩衝液の調製：１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩、ｐＨ５．５。

製剤緩衝液の調製：
１×製剤緩衝液：製剤緩衝液の処方表（表２）に従って調製した。
５×製剤緩衝液：処方が表３に示され、ここで、ヒスチジン塩酸塩の濃度が１０ｍｍｏｌ／Ｌであり、アルギニン塩酸塩の濃度がＣＡｒｇ×５ｍｍｏｌ／Ｌであり、マンニトール濃度がＣＭａｎ×５ｍｍｏｌ／Ｌであり、スクロース濃度がＣＳｕｃ×５ｍｍｏｌ／Ｌであり、ｐＨが５．５に保持した。ただし、ＣＡｒｇ、ＣＭａｎ及びＣＳｕｃはそれぞれ１×製剤緩衝液の対応する処方のアルギニン、マンニトール及びスクロースの濃度を表す。

上記の溶液は、６ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム或いは６ｍｏｌ／Ｌの塩酸で溶液のｐＨ値を調整し、１０ＫＤ以下の孔径の限外ろ過膜で限外ろ過してエンドトキシンを除去した後、使用した。

処方設計の説明：
１．ヒスチジン塩酸塩は、ｐＨ緩衝剤であり、初期の実験で確認され、１０ｍｍｏｌ／Ｌを使用し、上記の各実施例に基づいて、各処方におけるマンニトールが最低で６０ｍｍｏｌ／Ｌであり、アルギニン塩酸塩が最低で７５ｍｍｏｌ／Ｌであり、スクロースが最低で１０ｍｍｏｌ／Ｌであると決定した。
２．マンニトール、アルギニン塩酸塩及びスクロースをそれぞれ４つの濃度で組み合わせ、マンニトールが６０、９０、１２０及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌであり、アルギニン塩酸塩が７５、９０、１０５及び１２０ｍｍｏｌ／Ｌであり、スクロースが１０、４０、７０、及び１００ｍｍｏｌ／Ｌであり、合わせて１０種類の異なる組み合わせ（処方４～１３）がある。なお、処方１はアルギニン塩酸塩及びマンニトールのみを含み、処方２はアルギニン塩酸塩のみを含み、処方３はアルギニン塩酸塩及びスクロースのみを含む。

実施例６：真空凍結乾燥
－８０℃の冷蔵庫からタンパク質ストック溶液を取り出して溶かし、「１×製剤緩衝液」でタンパク質の濃度が８０ｍｇ／ｍｌに正確に希釈し、無菌の非発熱性標準２ｍｌ凍結乾燥用バイアル瓶で１本あたり１ｍｌに分けて入れ、真空凍結乾燥を行う。

凍結乾燥の条件：
予備凍結：温度－４５℃、時間５時間；
一回乾燥：温度－２６℃、時間４０時間、真空度１０－１５Ｐａ；
二回乾燥：温度２５℃、時間１０時間、真空度１０－１５Ｐａ。

凍結乾燥後、真空下で、ゴム栓で密封し、凍結乾燥機から取り出し、アルミニウム蓋で閉じた。

実施例７：凍結乾燥粉末の外観及び水分含有量の検査
凍結乾燥粉末の外観の合格基準：均一な色、緻密な細孔、凍結乾燥前の体積及び形状を維持でき、ほとんど変わらず、ブロック状やスポンジ状の塊構造を示す。

実験結果を表４に示した。その結果によると、処方１、処方２、処方１０及び処方１３の凍結乾燥粉末の外観が要件を満していないため、排除された。その以外の処方の凍結乾燥粉末の外観が要件を満たした。

水分含有量測定の試験基準：
凍結乾燥粉末の水分含有量は、ＳＦ－６型微量水分測定計（カールフィッシャークーロン電量法）で測定し、合格基準が３％以下である。

実験結果によると、処方１１、１２、１３凍結乾燥粉末は非常に吸水しやすく、水分含有量が要件を満していないが、処方３～処方９は含水率検出の要件を満した。

実施例８：目に見える異物及び不溶性微粒子の検査
凍結乾燥粉末を注射用滅菌水で再構成した。１本あたり１ｍｌで、再構成する前に真空状態を破り、ボトルの内壁に沿ってゆっくりと水を加えた。

目に見える異物検査は、ＹＢ－II型クラリティテスターを使用し、「中国薬局方」（２００５年版）付録ＶＢ「目に見える異物検査法－ランプ検査法」及び中国食品薬品監督管理局「目に見える異物検査法に関する補足規則の発行の通知」［国食薬監注［２００５］３７号］に記載される関連規則に従って行った。各処方は２０本検査し、１本あたりに目に見える異物の平均含有量を求めった。

目に見える異物検査の合格標準：検査された５本（ボトル）の試験サンプルのいずれかにおいて、ガラスの破片、繊維、カラー点、カラー塊などの目に見える異物が検出されず、検出された他の目に見える異物（白い点、微細なタンパク質フロック又はタンバク質粒子）の数が３つを超えてはならない。

不溶性微粒子の検査は、ＺＷＪ－３型不溶性微粒子検出器を使用し、「中国薬局方」（２００５年版）２部付録IXＣ「不溶性微粒子検査法－光遮蔽法」に従って行った。１ミリリットルあたりのタンパク質溶液における１０ミクロン以上及び２５ミクロン以上の不溶性微粒子数を検査し、各処方は、３本を検査し、１本あたりに不溶性微粒子の平均含有量を求めた。

不溶性微粒子検査の合格標準：各試験製品の容器には、１０ｕｍ以上の粒子の数が６０００を超えてはならず、或いは２５ｕｍ以上の粒子の数が６００を超えてはならない。

表６のデータから分かるように、処方３及び４が目に見える異物及び不溶性微粒子検査の要件を満たさなかった。

実施例９．凍結乾燥粉末の長期（１～１２ヶ月）安定性の調査
凍結乾燥粉末の外観検査は、処方１、２、１０、１３が排除され、水分含有量検査は、処方１１、１２が排除され、目に見える異物及び不溶性微粒子の検査は、処方３及び４が排除され、残りの処方５、６、７、８、９について安定性を調査した。各処方の凍結乾燥粉末をそれぞれ３７℃、２５℃及び４℃で保存し、異なる時間にサンプルを採取してＳＤＳ－ＰＡＧＥ、逆相ＨＰＬＣ、リガンド結合法による生物学的活性、水分含有量、外観、ｐＨ値、目に見える異物及び不溶性微粒子などの検査を行い、結果を表７、表８及び表９に示した。

結果は、スクロースの濃度１０ｍｍｏｌ／Ｌである処方は、安定性が悪く、スクロースの濃度が４０ｍｍｏｌ／Ｌである処方８及び処方９は、良好な長期保存安定性を有することを示した。それらの測定をまとめて見ると、処方８、９は含水率、目に見える異物、外観、不溶性微粒子及び安定性などの検査においてすべての要件を満たしている。

上記の実験データに基づいて、一方、非還元糖、アミノ酸系物質から選択した具体的な添加物が最終の製剤に与える影響は予測できないことが分かる。本発明の融合タンパク質は、良好の製剤配合案を得るために。多量の試験を通じて様々な特性を測定する必要がある。例えば、実験的証拠によると、処方１～１３はすべてヒスチジン塩酸塩、マンニトール、アルギニン塩酸塩及びスクロースを含有するものの、それらの成分の含有量の違いによって最終的な含水率、目に見える異物、外観、不溶性微粒子及び安定性などの検出結果が大きく異なり、処方８及び処方９のみは上記の全部に合格できた。このように、医薬品製剤の添加物成分の種類や含有量の選択が極めて重要であり、かつ、予測可能性も低いことが分かる。

一方、抗体の構造の異質性、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）とＦｃグリコシル化により、異なるモノクローナル抗体製剤の開発は、ケースバイケースで実行する必要がある。抗体製剤を開発する場合、例えば、酸化、異性化、脱アミド化、凝集、変性、断片化などの、抗体のコンフォメーション、コロイド、又は化学構造に挑戦がある。以上の情報から、現在市販されている抗体医薬品や融合タンパク質の製剤成分はいずれも独自性を有し、当業者が抗体医薬品の添加物の選択に直面したとき、従来技術の製品から得られた明確な教示や示唆が不十分であり、適切な製剤プログラムを決定するには、依然として多数の実験に合格する必要があることが分かる。本発明は、多数の長期の実験的研究に基づいて、やっとＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質に適した製剤組成を得たものである。該ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質は、凍結乾燥の前後でもよく溶解し、不溶性微粒子及び目に見える異物がヒト用注射液の標準を満たし、凍結乾燥及び保存中に長期間安定であり、特に、２５℃又は３７℃の高温条件下で長期間保存した後も、良好な安定性を維持し、また、かかる凍結乾燥製剤が再構成後に凝集や分解しにくく、良好な生物学的活性を維持し、予期しない技術的効果を達成する。

Claims

ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質と、非還元糖と、アミノ酸とを含むＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の水性液体医薬品製剤であって、
前記非還元糖は、８５～１２５ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、
前記アミノ酸は、８～１２ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩及び７５～１２５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩であり、
前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は８０～１００ｍｇ／ｍｌであり、
前記ＴＡＣｌ－Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱＩＤＮＯ．１で表される、ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の水性液体医薬品製剤。
前記非還元糖は、９０～１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び３５～４５ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースである、請求項１に記載の水性液体医薬品製剤。
前記ヒスチジン塩酸塩の濃度は、１０ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１に記載の水性液体医薬品製剤。
１％から１０％（ｗ／ｖ、ｇ／１００ｍｌ）のＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含む、請求項１乃至３のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤。
前記非還元糖は、９０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、
前記アミノ酸は、９０ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩及び１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩であり、
前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、８０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は４に記載の水性液体医薬品製剤。
前記非還元糖は、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール及び４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロースであり、
前記アミノ酸は、７５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩及び１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩であり、
前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の濃度は、８０ｍｇ／ｍｌである、請求項１又は４に記載の水性液体医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤のｐＨは、４．０から８．０である、請求項１乃至６のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤の２つの前記ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質は、Ｆｃヒンジ領域に形成されたリンクジスルフィド結合を介して二重鎖構造を形成する、請求項１乃至７のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤。
請求項１乃至８のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤を凍結乾燥して得られる、凍結乾燥医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤は、９０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール、４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、９０ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩、及び８０ｍｇ／ｍＬのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、ｐＨが５．０から６．０である、請求項９に記載の凍結乾燥医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤は、１２０ｍｍｏｌ／Ｌのマンニトール、４０ｍｍｏｌ／Ｌのスクロース、７５ｍｍｏｌ／Ｌのアルギニン塩酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌのヒスチジン塩酸塩、及び８０ｍｇ／ｍＬのＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質を含有し、ｐＨが５．０から６．０である、請求項９に記載の凍結乾燥医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤における非還元糖は、濃度がそれぞれ１６．４ｍｇ／ｍｌ及び１３．７ｍｇ／ｍｌであるマンニトール及びスクロースであり、
前記水性液体医薬品製剤におけるアミノ酸は、濃度がそれぞれ１９．０ｍｇ／ｍｌ及び２．１ｍｇ／ｍｌであるアルギニン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩である、請求項９に記載の凍結乾燥医薬品製剤。
前記水性液体医薬品製剤における非還元糖は、濃度がそれぞれ２１．９ｍｇ／ｍｌ及び１３．７ｍｇ／ｍｌであるマンニトール及びスクロースであり、
前記水性液体医薬品製剤におけるアミノ酸は、濃度がそれぞれ１５．８ｍｇ／ｍｌ及び２．１ｍｇ／ｍｌであるアルギニン塩酸塩及びヒスチジン塩酸塩である、請求項９に記載の凍結乾燥医薬品製剤。
全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）及びシェーグレン症候群を含む自己免疫疾患の治療に使用するための、請求項１乃至１３のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤。
前記視神経脊髄炎スペクトラム障害は、視神経脊髄炎、再発性視神経炎、縦方向に広範な横断性脊髄炎、視神経脊髄型多発性硬化症、長期横断性脊髄炎、片側性または両側性視神経炎、自己免疫疾患を伴う視神経炎或脊髄炎、症候性または無症候性脳病変を伴う視神経炎或脊髄炎を含む、請求項１４に記載の水性液体医薬品製剤。
慢性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、Ｂリンパ球性リンパ腫を含むリンパ腫の治療に使用するための、請求項１乃至１３のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤。
ＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質医薬品製剤を調製する方法であって、（１）請求項１乃至１３のいずれかに記載の水性液体医薬品製剤を調製することと、（２）該水性液体医薬品製剤におけるＴＡＣＩ－Ｆｃ融合タンパク質の安定性を評価することとを含む、方法。