CN118184793A - 一种靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白及其用途 - Google Patents
一种靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种靶向TNF‑α与IL‑17A的双特异性融合蛋白、编码其的多核苷酸、其制备方法以及用途等,其中,所述靶向TNF‑α与IL‑17A的双特异性融合蛋白为二聚体,呈左右对称结构,以N端至C端的顺序包括三个结构功能区域:可溶性TNF受体或其部分、人IgG Fc片段以及竞争性结合IL‑17A或抗IL‑17A的功能结构域。该融合蛋白可以同时有效结合TNF‑α与IL‑17A,并起到阻止其信号通路的作用,该融合蛋白具有良好的稳定性、特异性与生物活性。
Description
技术领域
本发明属于医药生物技术领域。具体而言,本发明涉及一种靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白、编码其的多核苷酸、包含其的制剂和药物组合物、其制备方法以及用途。
背景技术
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种重要的炎症因子,主要是由巨噬细胞、单核细胞、T细胞、NK细胞、肥大细胞以及中性粒细胞等细胞产生。TNF-α是大小约为26kDa的暴露于细胞表面的跨膜蛋白。它可以通过TNF转换酶(TACE)进行蛋白酶水解切割而被加工成活化的、大小约为17kDa的可溶性TNF-α。可溶性TNF-α可以形成三聚体,并且可以激活TNFR。TNF-α有两个受体,TNFR1和TNFR2,两种受体介导的功能具有一定的差别。55kDa的TNFR1(p55)在所有细胞都有表达,然而TNFR2(p75)主要在免疫系统细胞和内皮细胞表达。这两种受体也可以从细胞膜上被切割下来,形成可溶的形式。这些可溶性受体可以作为拮抗剂,通过与可溶性TNF-α结合,从而阻止TNF-α与细胞表面的TNFR结合。
在RA(Rheumatoid arthritis)患者的关节滑膜处,活化的巨噬细胞等能够产生TNF-α,而TNF-α可以诱导其他多种促炎因子、趋化因子等的合成,如IL-1β、IL-6与IL-8等。这些因子可以再次激活关节处的巨噬细胞,使其持续产生细胞因子,使FLS(Fibroblast-like synovial cells)异常增殖,粘附因子表达量增加,诱导新血管生成。除此之外,TNF-α可以诱导MMP合成,从而导致软骨与骨组织破坏,而且TNF-α可以刺激软骨细胞分泌Wnt抑制因子DKK-1,抑制组织软骨以及骨组织的生成。作为一个重要的促炎因子,TNF-α还可以在RA的发生、发展中与其他多种细胞因子相互作用,产生协同效应,增加体内炎症反应。TNF-α还可以通过抑制Foxp3的转录从而抑制Treg细胞的分化,降低机体Treg细胞含量,使免疫调节异常,从而加重RA的病情。近年来,TNF-α在RA病理、生理学中的作用得到了深入的研究。而且目前治疗类风湿关节炎的以TNF-α为靶点的生物制剂(例如英夫利西单抗、阿达木单抗、戈利木单抗和赛妥珠单抗)得到了广泛应用,并取得了良好的疗效。尽管抗TNF-α制剂在临床上具有明显的益处,但也存在着诸如无应答、继发性失应答、以及抗TNF制剂不耐受的问题。
白细胞介素-17A(IL-17A)在1995年首次被提到是由T细胞产生的促炎细胞因子。IL-17A通常也被称为IL-17,是IL-17家族六个成员之一。随后研究发现,Th17细胞是IL-17的主要来源,T细胞在IL-6、IL-1β、TGF-β的诱导下产生Th17细胞,并由IL-23使其成熟。Th17细胞是一类高度促炎的T细胞。Th17分泌的IL-17A可以对免疫细胞有着多重的效应,可以刺激免疫细胞产生多种其他的炎症因子如IL-1β、TNF-α、IL-6以及CXC趋化因子等。与正常人相比,RA患者的外周血中可以发现大量的Th17细胞与较高浓度的IL-17A。除此之外,在RA病人的滑膜液中也含有大量Th17细胞。研究表明,在滑膜部位Th17细胞分泌大量IL-17A,而滑膜组织中的IL-17A的转录水平与关节损伤进展成正相关。
DMARDs(如甲氨蝶呤)等目前仍然是治疗如类风湿性关节炎等疾病的主流药物。近几年,TNF-α抑制剂等一系列生物制剂,为DMARDs治疗效果不好的患者带来了新希望。然而,临床研究表明,接受TNF-α抑制剂治疗的类风湿性关节炎患者中有一半的患者无法得到满意的疗效。除此之外,一些类风湿性关节炎患者在接受单一靶点生物药物治疗一段时间后,其药物的疗效会逐渐减弱,必须更换其他药物。
我们在此前研究中(参见CN106892982B)证明了同时靶向TNF-α与IL-17A这两种抗原的融合蛋白的体内、体外药效均能达到较好的效果;但是在融合蛋白以及双特异性抗体的生产工艺中,我们发现存在着产生聚集体、稳定性不好、表达量不高等主要问题,因此需要进一步的研究与探索。
双特异性融合蛋白与双特异性抗体一样,一直面临表达量低、稳定性差、工艺复杂、易产生聚集体等问题,因此,需要开发出比起现有融合蛋白来说具有特异性佳、疗效好且稳定性好等优点的治疗炎症相关疾病的双特异性融合蛋白。
发明内容
通过研究,本发明人开发了不同于现有技术的靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白,其为二聚体、呈左右对称结构、包括三个功能结构域,从而提供了一种结构稳定、特异性佳且易于制备的抗炎症因子的双特异性融合蛋白,该融合蛋白可以同时有效结合TNF-α与IL-17A,并起到阻止其信号通路作用,表现出良好的生物活性。
在一个方面,本发明提供了一种靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:
TNF可溶性受体或其部分;
人IgG Fc片段;以及
竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域。
在又一方面,本发明提供了一种编码上述的双特异性融合蛋白的多核苷酸。
在又一方面,本发明提供了一种重组载体,所述载体包含上述的多核苷酸。
在又一方面,本发明提供了宿主细胞,所述宿主细胞含有上述的多核苷酸或重组载体。
在又一方面,本发明提供了一种制备本文所述的双特异性融合蛋白的方法,所述方法包括:
a)制备编码上述的双特异性融合蛋白的多核苷酸;
b)通过使用所述多核苷酸与表达载体构建重组载体;
c)将所述重组载体转入宿主细胞中,并对转化后的细胞进行培养,得到细胞培养物;
d)对所述细胞培养物进行纯化和分离,获得所述双特异性融合蛋白。
在又一方面,本发明提供了上述的双特异性融合蛋白在制备用于治疗炎症相关疾病的药物中的用途。或者,本发明提供了上述的双特异性融合蛋白在制备结合并抑制TNF-α与IL-17A的试剂中的用途。
在又一方面,本发明提供了一种包含上述的双特异性融合蛋白的制剂,其中,所述制剂还包含缓冲液体系、药学上可接受的辅料和表面活性剂,所述缓冲液体系选自醋酸和醋酸钠溶液、枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或者组氨酸和盐酸组氨酸溶液。
在又一方面,本发明提供了一种药物组合物,所述组合物包括上述的双特异性融合蛋白。
有益效果
本发明的靶向TNF-α与IL-17A的双特异性融合蛋白的结构为二聚体,呈左右对称结构,包括三个结构功能区域。该融合蛋白可以同时有效结合TNF-α与IL-17A,并起到阻止其信号通路的作用,特别是可以抑制这两个信号通路所引起的协同作用,该融合蛋白具有良好的稳定性、特异性与生物活性,可用于个体治疗、预防和/或诊断相关疾病中。
与现有技术(例如,CN 109796534A)相比,本发明通过对融合蛋白进行结构优化,提高了蛋白稳定性并减少了聚集体产生,同时表现出良好的亲和力等效果。进一步通过对制剂的配方进行摸索,使融合蛋白在制剂中更加稳定、聚集体产生更少、成药性更好。
附图说明
图1示出了本发明实施例1中设计的示例性的8种蛋白的结构。
图2示出了本发明实施例1中设计的示例性的8种蛋白经纯化后的SDS-PAGE分析结果。
图3示出了本发明实施例1中设计的示例性的8种蛋白纯化后的SEC-HPLC分析结果。
图4示出了本发明实施例1中设计的示例性的8种蛋白各自对两种抗原的结合响应值,各蛋白对两种抗原的结合比例理论上应为1:2。
图5示出了5号、6号、8号融合蛋白在储存之前和在储存于-80℃下之后的还原与非还原SDS-PAGE分析。
图6为5号蛋白的结构示意图。
图7示出了CHO瞬转表达纯化后的5号蛋白信息。
图8示出了各组中治疗hIL-17A转基因类风湿关节炎后的小鼠骨关节评分。
图9为治疗后各组小鼠足爪部照片。
图10示出了各组中的代表小鼠的足爪MicroCT结果(前左足、前右足、后左足、后右足)。
图11示出了各组小鼠MicroCT骨损伤评分(3个人背对背评分,取平均值)。
具体实施方式
下文将结合具体的实施方式来进一步描述本申请,本领域技术人员将理解的是,这些实施方式仅是示例性的,而并不会将本申请的保护范围束缚于此。本领域技术人员能够在不偏离本申请的精神和范围下对本申请的方案进行各种修饰、修改、替换或组合,由此得到的方案也均落入本申请的保护范围内。
除非另外定义,否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。参见如Singleton等,Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology 2nd ed.,J.Wiley&Sons(New York,NY1994);Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold SpringsHarbor,NY 1989)。
在本文中,除非另有说明,术语“载体”是指用于将目的基因(例如来自同一物种或不同物种的外源基因)转移至受体细胞的能自我复制的DNA分子。
在本文中,除非另有说明,术语“连接肽(linker peptide)”可为用于将本文的融合蛋白中的各部分连接在一起的肽序列。
在本文中,除非另有说明,术语“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸序列”和“基因”可互换使用,其实质是一种化学物质。
在本文中,除非另有说明,术语“治疗”是指以统计学显著的方式治愈、减轻、缓解、减缓、缓和或改进疾病或疾病相关的症状,或者预防、延缓、阻止、中止或停止疾病或相关的症状的发作或进一步发展。
如本文所用,术语“抗体”是指具有至少一个抗原结合结构域的结合蛋白。本申请的抗体和其抗原结合片段可以是整个抗体或其任何抗原结合片段。因此,本申请的抗体和其抗原结合片段包括单克隆抗体或其抗原结合片段、抗体变体或其抗原结合片段、以及免疫缀合物。抗体片段的实例包括Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、分离的CDR区、单链Fv分子(scFv)、单域抗体(sdAb)、Fd片段和本领域已知的其它抗原结合片段。
术语“药学上可接受的”是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言,它们在可靠的医学判断的范围之内,适用于与人类和动物的组织接触使用,而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症,与合理的利益/风险比相称。
在本文中,除非另有说明,否则术语“包含、包括和含有(comprise、comprises和comprising)”或等同物为开放式表述,意味着除所列出的要素、组分和步骤外,还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
在本文中,序列之间的同一性百分比(同源性程度)可以通过例如使用万维网上通常用于此目的的免费可用的计算机程序(例如具有默认设置的BLASTp或BLASTn)对两个以上的序列进行比较来确定。
在一个实施方式中,本发明提供了一种双特异性融合蛋白,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:
TNF可溶性受体或其部分;
人IgG Fc片段;以及
竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域。
在一些实施方式中,所述TNF可溶性受体或其部分可为TNF可溶性受体1(简称为sTNFRI或sTNFR1)或其部分、或TNF可溶性受体2(简称为sTNFRII或sTNFR2)或其部分。在一些优选的实施方式中,从获得更高的表达量以及更优异的针对靶蛋白的亲和力的角度来说,所述TNF可溶性受体或其部分可优选为TNF可溶性受体1或其部分。在更优选的实施方式中,TNF可溶性受体或其部分可为TNF可溶性受体1胞外片段。
在一些实施方式中,所述TNF可溶性受体1胞外片段包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与其具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列,或者其保守修饰(例如,插入、缺失、取代等)变体:REKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCL(SEQ ID NO:1)。
并且,本文所述的TNF可溶性受体1胞外片段或其变体保留了特异性地识别并结合TNFα的能力。
在本文中,保守修饰是指不会明显影响或改变抗体结合特性的氨基酸修饰。例如,保守氨基酸取代可为采用同类(具有类似的化学性质或者功能)的另一种氨基酸进行取代。作为示例,可根据氨基酸的侧链性质将其分为:(1)非极性氨基酸:Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M);(2)不带电荷的极性氨基酸:Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q);(3)酸性氨基酸:Asp(D)、Glu(E);(4)碱性氨基酸:Lys(K)、Arg(R)、His(H)。或者,可基于共同的侧链特性将氨基酸分为:(1)疏水氨基酸:Met、Ala、Val、Leu、Ile;(2)中性亲水氨基酸:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性氨基酸:Asp、Glu;(4)碱性氨基酸:His、Lys、Arg;(5)影响链取向的氨基酸:Gly、Pro;(6)芳香族氨基酸:Trp、Tyr、Phe。
在本文中,在融合蛋白中包含人IgG Fc片段以用于延长半衰期。在一些实施方式中,所述人IgG Fc片段为人IgG1 Fc或IgG4 Fc片段。
在一些实施方式中,所述人IgG Fc片段为IgG4的Hinge-CH2-CH3片段,更优选为具有S228P突变的人IgG4 Fc片段。
在一些实施方式中,所述IgG4 Fc片段包含以SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列:
ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPE
VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK
VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSD
IAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO:2)。
在一些实施方式中,竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域可选自:IL-17A的受体、其变体或它们的部分,或者抗IL-17A抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中,所述抗IL-17A抗体的抗原结合片段包括但不限于来自该抗体的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAb)、分离的CDR区或Fd片段。
在一些实施方式中,竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域可为抗IL-17A单链抗体。
在一些实施方式中,所述抗IL-17A单链抗体包含:
重链CDR1(HCDR1),包含以SEQ ID NO:5示出的氨基酸序列;
重链CDR2(HCDR2),包含以SEQ ID NO:6示出的氨基酸序列;
重链CDR3(HCDR3),包含以SEQ ID NO:7示出的氨基酸序列;
轻链CDR1(LCDR1),包含以SEQ ID NO:8示出的氨基酸序列;
轻链CDR2(LCDR2),包含以SEQ ID NO:9示出的氨基酸序列;
轻链CDR3(LCDR3),包含以SEQ ID NO:10示出的氨基酸序列。
在一些实施方式中,所述抗IL-17A单链抗体包含:以SEQ ID NO:5示出的重链CDR1(HCDR1)、以SEQ ID NO:6示出的重链CDR2(HCDR2)和以SEQ ID NO:7示出的重链CDR3(HCDR3),以SEQ ID NO:8示出的轻链CDR1(LCDR1)、以SEQ ID NO:9示出的轻链CDR2(LCDR2)和以SEQ ID NO:10示出的轻链CDR3(LCDR3):
GYSFTDYHIH(SEQ ID NO:5);
VINPMYGTTDYNQRFKG(SEQ ID NO:6);
YDYFTGTGVY(SEQ ID NO:7);
RSSRSLVHSRGNTYLH(SEQ ID NO:8);
KVSNRFI(SEQ ID NO:9);
SQSTHLPFT(SEQ ID NO:10)。
上述CDR的范围已根据Kabat编号规则进行了定义(参见Kabat,et al.,Ann.NYAcad.Sci.190:382-93(1971);Kabat,et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublicationNo.91-3242(1991)),但是本领域技术人员可以理解的是,根据Chothia编号规则、ImMunoGenTics(IMGT)编号规则、AbM编号规则和Contact编号规则(基于对可用复杂晶体结构的分析)等中任一种或多种进行编号的CDR序列也落入了本发明的保护范围内。
在一些实施方式中,所述抗IL-17A单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:11);
DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRT(SEQ ID NO:12)。
在一些实施方式中,所述抗IL-17A单链抗体包含以SEQ ID NO:3示出的氨基酸序列或与其具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列:
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQGLEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVMTQTPLSLSVTPGQPASIS
CRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRT(SEQ ID NO:3)。
并且,本文所述的抗IL-17A单链抗体的变体保留了特异性地识别并结合IL-17A的能力。
在一些实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或2、或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的重链CDR1(HCDR1)、以SEQ ID NO:6示出的重链CDR2(HCDR2)和以SEQ ID NO:7示出的重链CDR3(HCDR3),以SEQ ID NO:8示出的轻链CDR1(LCDR1)、以SEQ IDNO:9示出的轻链CDR2(LCDR2)和以SEQ ID NO:10示出的轻链CDR3(LCDR3)。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ IDNO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的重链CDR1(HCDR1)、以SEQ ID NO:6示出的重链CDR2(HCDR2)和以SEQ ID NO:7示出的重链CDR3(HCDR3),以SEQ IDNO:8示出的轻链CDR1(LCDR1)、以SEQ ID NO:9示出的轻链CDR2(LCDR2)和以SEQ ID NO:10示出的轻链CDR3(LCDR3)。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ IDNO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ IDNO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体。
在一些实施方式中,所述人IgG Fc片段与所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域通过连接肽进行连接。
在一些实施方式中,所述连接肽可以为柔性连接肽或刚性连接肽。在一些实施方式中,所述连接肽为GS柔性连接肽(例如含GSG重复单元的柔性肽、含G4S重复单元的柔性肽或含二者的柔性肽),更优选(G4S)4(即,GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:4))。
在一些实施方式中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:TNF可溶性受体1或其胞外片段、人IgG4 Fc片段、GS柔性连接肽和抗IL-17A单链抗体。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:TNF可溶性受体1胞外片段,人IgG4 Fc片段,GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的重链CDR1(HCDR1)、以SEQ ID NO:6示出的重链CDR2(HCDR2)和以SEQ ID NO:7示出的重链CDR3(HCDR3),以SEQ ID NO:8示出的轻链CDR1(LCDR1)、以SEQID NO:9示出的轻链CDR2(LCDR2)和以SEQ ID NO:10示出的轻链CDR3(LCDR3)。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ IDNO:5示出的重链CDR1(HCDR1)、以SEQ ID NO:6示出的重链CDR2(HCDR2)和以SEQ ID NO:7示出的重链CDR3(HCDR3),以SEQ ID NO:8示出的轻链CDR1(LCDR1)、以SEQ ID NO:9示出的轻链CDR2(LCDR2)和以SEQ ID NO:10示出的轻链CDR3(LCDR3)。
在优选的实施方式中,本文所述的双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列。
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段、以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段、以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽和以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体。所述双特异性融合蛋白能够特异性地识别并结合IL-17A和TNFα。
在一些优选的实施方式中,所述融合蛋白的多肽链通过其中的Fc片段之间的二硫键作用而形成同源二聚体。在本文中,所述TNF可溶性受体或其部分连接至IgG Fc片段的铰链区,通过铰链区的柔性,保证了所述TNF可溶性受体或其部分的功能,并且通过铰链区产生的二硫键,保证融合蛋白形成二聚体。
在一些优选的实施方式中,所述融合蛋白为左右对称二聚体。
在一些实施方式中,本发明所述的融合蛋白与IL-17A的亲和力常数(KD)为9×10-12M以下、优选7×10-12M以下、更优选6.5×10-12M以下;且与TNFα的亲和力常数(KD)为4×10-11M以下、优选3.8×10-11M以下、更优选3.6×10-11M以下。
本发明的融合蛋白可被制成适用于给予至受试者的任何剂型,例如该融合蛋白可通过静脉给予、肌内给予、胃肠外给予、口服给予、皮下给予、鞘内给予、脑室内给予、椎管内给予、腹膜内给予、子宫内给予、鼻内给予等。在一些优选的实施方式中,所述融合蛋白处于冻干粉或注射液的形式。
在一个实施方式中,本发明提供了一种可编码上述的双特异性融合蛋白的多核苷酸。
在一个实施方式中,本发明提供了一种重组载体,该载体含有可编码该融合蛋白的多核苷酸。
在本文中,可采用本领域已知的任意的表达载体来与上述的编码融合蛋白的多核苷酸构建得到所述重组载体。所述表达载体可采用例如pcDNA系列载体(pcDNA3.1载体、pcDNA3.2载体、pcDNA3.3载体、pcDNA3.4载体(如pcDNA3.4-TOPO TA载体))、pBK-CMV载体、pEGFP-N1载体、pGenHT 1.0-DGV载体等。
在一个实施方式中,本发明提供了一种宿主细胞,所述细胞含有上述的多核苷酸或上述的重组载体,从而表达本发明所述的双特异性融合蛋白。
在优选的实施方式中,表达所述的融合蛋白的宿主细胞为原核或真核细胞,更优选为哺乳动物细胞,例如HEK293细胞(例如293T细胞、293F细胞、293H细胞或293S细胞)、CHO细胞(例如CHOK1-GenS细胞)、BHK细胞、Sp2/0细胞等。
可通过本领域中用于将外源基因转入宿主细胞中的任何合适的已知技术(例如电穿孔、转导、转染等)来将上述的多核苷酸或重组载体转入宿主细胞中,从而由得到的宿主细胞高效率地表达本发明所述的双特异性融合蛋白。
在本文中,转入外源基因后的细胞的培养可由本领域技术人员根据细胞的种类选择常规的培养基和培养条件进行(刘斌主编,《细胞培养(第3版)》,世界图书出版公司,2018年01月;兰容、周珍辉主编,《细胞培养技术》,化学工业出版社,2007年8月;章静波主编,《组织和细胞培养技术(第3版)》,人民卫生出版社,2014年06月等)。
在一个实施方式中,本发明提供了一种制备所述的双特异性融合蛋白的方法,包括:
a)制备编码上述的双特异性融合蛋白的多核苷酸;
b)通过使用所述多核苷酸与表达载体构建重组载体;
c)将所述重组载体转入宿主细胞中,并对转化后的细胞进行培养,得到细胞培养物;
d)对所述细胞培养物进行纯化和分离,获得所述双特异性融合蛋白。
在本文中,所述多核苷酸可根据相应融合蛋白的氨基酸序列通过常规的全基因合成方法或者酶促合成等技术合成得到。
在本文中,可通过常规的酶切和连接而从所述多核苷酸与表达载体构建得到重组载体。
如上文所述,可由本领域技术人员根据细胞的种类选择常规的培养基和培养条件对转化后的细胞进行培养。在一些实施方式中,采用分批补料培养方式或灌流培养方式对所述细胞进行培养,更优选采用高密度分批补料培养方式或灌流培养方式对所述细胞进行培养。
在本文中,可采用常规的蛋白纯化方法对得到的细胞培养物进行纯化,例如但不限于电泳、超速离心、透析、超滤、沉淀、色谱法(例如凝胶过滤色谱法(如体积排阻色谱法SEC)、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、高效液相色谱法、复合层析法)等。在一些优选的实施方式中,利用亲和色谱法以及复合层析法进行所述纯化;例如可以通过蛋白A亲和柱进行所述纯化。在进一步优选的实施方式中,利用羟基磷灰石(CHT)复合填料去除融合蛋白的聚集体。
在一个实施方式中,本发明提供了一种包含上述的双特异性融合蛋白的制剂,其中,所述制剂还包含缓冲液体系、药学上可接受的辅料和表面活性剂,所述缓冲液体系选自醋酸和醋酸钠溶液、枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或者组氨酸和盐酸组氨酸溶液。
在一些实施方式中,所述制剂的pH值为3.0-7.5,优选pH值为3.5-6.5,更优选pH值为4.0-5.0。
在一些实施方式中,所述制剂包含:5mg/mL-100mg/mL的所述双特异性融合蛋白、5mM-50mM(例如5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、40mM或50mM)缓冲液体系、50mg/mL-100mg/mL药学上可接受的辅料和0.01%-0.05%(w/v)表面活性剂。
在一些实施方式中,所述缓冲液体系选自:5mM-20mM(例如10mM)醋酸和醋酸钠溶液、5mM-20mM(例如10mM)枸橼酸和枸橼酸钠溶液、5mM-20mM(例如10mM)组氨酸和盐酸组氨酸溶液,更优选为10mM醋酸和醋酸钠溶液。
在一些实施方式中,所述药学上可接受的辅料为蔗糖或海藻糖中的至少一种,更优选为海藻糖。
在一些实施方式中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂,例如司盘类表面活性剂、聚山梨酯类表面活性剂(例如聚山梨酯-20、聚山梨酯-60、聚山梨酯-80等)等。
在一个实施方式中,本发明提供了一种药物组合物,所述组合物包括上述的双特异性融合蛋白。
在优选的实施方式中,所述药物组合物进一步包含药学上可接受的辅料。所述药学上可接受的药用辅料可选自例如但不限于溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、抗氧剂、渗透促进剂、pH值调节剂、表面活性剂、稀释剂等。关于其它可用的药学上可接受的药用辅料,可参见例如《药用辅料手册》(第4版),R.C.罗等著,郑泽民主译,2005年,化学工业出版社。
在一个实施方式中,本发明提供了上述的双特异性融合蛋白、或上述的包含其的制剂或药物组合物在制备用于治疗炎症相关疾病的药物中的用途。或者,本发明提供了上述的双特异性融合蛋白、或上述的包含其的制剂或药物组合物在制备结合并抑制TNF-α与IL-17A的试剂中的用途。
在一些优选实施方式中,所述试剂用于阻断TNF与IL-17信号通路,包括抑制这两个信号通路所引起的协同作用。
在另一优选实施方式中,所述试剂用于阻断TNF与TNFR和/或IL-17与IL17受体复合物的相互作用。
在一个实施方式中,本发明涉及一种治疗炎症相关疾病的方法,包括向有需要的受试者给予上述的双特异性融合蛋白、或上述的包含其的制剂或药物组合物。
在一些实施方式中,所述受试者是哺乳动物。在优选的实施方式中,所述哺乳动物是人。
在一些实施方式中,所述炎症相关疾病为自身免疫性疾病或细胞因子释放综合征,更优选是类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、病毒感染或免疫调节药物引起的细胞因子释放综合征。
本发明的示例性的技术方案可通过如下编号段落的内容进行说明:
1.一种双特异性融合蛋白,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:
TNF可溶性受体或其部分;
人IgG Fc片段;以及
竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域。
2.如段落1所述的双特异性融合蛋白,其中,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1或其部分、或TNF可溶性受体2或其部分。
3.如段落2所述的双特异性融合蛋白,其中,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1或其部分。
4.如段落1-3中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1胞外片段。
5.如段落4所述的双特异性融合蛋白,其中,所述TNF可溶性受体1胞外片段包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列,或者其保守修饰变体。
6.如段落1-5中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述人IgG Fc片段为人IgG1 Fc或IgG4 Fc片段。
7.如段落1-6中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述人IgG Fc片段为IgG4的Hinge-CH2-CH3片段。
8.如段落1-7中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述人IgG Fc片段为具有S228P突变的人IgG4 Fc片段。
9.如段落1-8中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域选自:IL-17A的受体、其变体或它们的部分,或者抗IL-17A抗体或其抗原结合片段。
10.如段落9所述的双特异性融合蛋白,其中,所述抗IL-17A抗体的抗原结合片段包括所述抗IL-17A抗体的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、分离的CDR区或Fd片段。
11.如段落1-9中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域为抗IL-17A单链抗体。
12.如段落11所述的双特异性融合蛋白,其中,所述抗IL-17A单链抗体包含:以SEQID NO:5示出的HCDR1、以SEQ ID NO:6示出的HCDR2和以SEQ ID NO:7示出的HCDR3,以SEQID NO:8示出的LCDR1、以SEQ ID NO:9示出的LCDR2和以SEQ ID NO:10示出的LCDR3。
13.如段落11或12所述的双特异性融合蛋白,其中,所述抗IL-17A单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列。
14.如段落11-13中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述抗IL-17A单链抗体包含以SEQ ID NO:3示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列。
15.如段落1或2所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或2、或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体。
16.如段落15所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体。
17.如段落16所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的HCDR1、以SEQ ID NO:6示出的HCDR2和以SEQ ID NO:7示出的HCDR3,以SEQ ID NO:8示出的LCDR1、以SEQ ID NO:9示出的LCDR2和以SEQ ID NO:10示出的LCDR3。
18.如段落17所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQID NO:12示出的氨基酸序列。
19.如段落18所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以及(3)以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体。
20.如段落1-9中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述人IgG Fc片段与所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域通过连接肽进行连接。
21.如段落20所述的双特异性融合蛋白,其中,所述连接肽为GS柔性连接肽。
22.如段落1-3中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:TNF可溶性受体1或其胞外片段、人IgG4 Fc片段、GS柔性连接肽和抗IL-17A单链抗体。
23.如段落22所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的HCDR1、以SEQ ID NO:6示出的HCDR2和以SEQ ID NO:7示出的HCDR3,以SEQ ID NO:8示出的LCDR1、以SEQ ID NO:9示出的LCDR2和以SEQ IDNO:10示出的LCDR3。
24.如段落23所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列。
25.如段落24所述的双特异性融合蛋白,其中,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段、以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段、以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽和以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体。
26.如段落1-25中任一段所述的双特异性融合蛋白,其中,所述融合蛋白与IL-17A的亲和力常数KD为9×10-12M以下,且与TNFα的亲和力常数KD为4×10-11M以下。
27.一种编码段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白的多核苷酸。
28.一种重组载体,含有段落27所述的多核苷酸。
29.一种宿主细胞,所述细胞含有段落27所述的多核苷酸或段落28所述的重组载体。
30.一种制备段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白的方法,包括:
a)制备编码所述双特异性融合蛋白的多核苷酸;
b)通过使用所述多核苷酸与表达载体构建重组载体;
c)将所述重组载体转入宿主细胞中,并对转化后的细胞进行培养,得到细胞培养物;
d)对所述细胞培养物进行纯化和分离,获得所述双特异性融合蛋白。
31.一种包含段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白的制剂,其中,所述制剂还包含缓冲液体系、药学上可接受的辅料和表面活性剂,所述缓冲液体系选自醋酸和醋酸钠溶液、枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或者组氨酸和盐酸组氨酸溶液。
32.如段落31所述的制剂,其中,所述制剂的pH值为3.0-7.5。
33.如段落31或32所述的制剂,其中,所述制剂包含:5mg/mL-100mg/mL的所述双特异性融合蛋白、5mM-50mM缓冲液体系、50mg/mL-100mg/mL药学上可接受的辅料和0.01%-0.05%(w/v)表面活性剂。
34.如段落31-33中任一段所述的制剂,其中,所述缓冲液体系选自5mM-20mM醋酸和醋酸钠溶液、5mM-20mM枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或5mM-20mM组氨酸和盐酸组氨酸溶液。
35.如段落31-34中任一段所述的制剂,其中,所述药学上可接受的辅料为蔗糖或海藻糖中的至少一种。
36.如段落31-35中任一段所述的制剂,其中,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
37.一种药物组合物,所述组合物包括段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白。
38.段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白、段落31-36中任一段所述的制剂或段落37所述的药物组合物在制备用于治疗炎症相关疾病的药物中的用途。
39.如段落38所述的用途,其中,所述炎症相关疾病为自身免疫性疾病或细胞因子释放综合征。
40.如段落39所述的用途,其中,所述炎症相关疾病为类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、病毒感染或免疫调节药物引起的细胞因子释放综合征。
41.段落1-26中任一段所述的双特异性融合蛋白、段落31-36中任一段所述的制剂或段落37所述的药物组合物在制备结合并抑制TNF-α与IL-17A的试剂中的用途。
为了描述和公开的目的,以引用的方式将所有的专利、专利申请和其它已确定的出版物在此明确地并入本文。这些出版物仅因为它们的公开早于本申请的申请日而提供。所有关于这些文件的日期的声明或这些文件的内容的表述是基于申请者可得的信息,并且不构成任何关于这些文件的日期或这些文件的内容的正确性的承认。而且,在任何国家,在本中对这些出版物的任何引用并不构成关于该出版物成为本领域的公知常识的一部分的认可。
实施例
接下来,借助实施例对本发明的方案进行了更详细的描述,但是本领域技术人员可以理解的是,本发明的保护范围不限于此。
除非另有说明,如下实施例中使用的各种试剂、材料和设备均可商购得到。除非另有说明,如下实施例中涉及的分子生物学手段可见于例如Sambrook等,MolecularCloning,A Laboratory Manual,Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor,NY1989)。
实施例1:融合蛋白结构的设计、表达与纯化
以NCBI数据库中公开的sTNFRI或sTNFRII的胞外截短区序列以及抗IL-17A scFv或IL-17A Fab为基础,通过IgG4的Fc片段(S228P)进行融合,得到8种结构,为方便叙述,将后续蛋白按顺序进行编号,简称1号-8号蛋白,单数编号的蛋白(即,1号、3号、5号和7号)为含有sTNFRI的结构,双数编号的蛋白(即,2号、4号、6号和8号)为含有sTNFRII的结构,并对应图1中的四种结构。各融合蛋白的结构如图1所示,其中所使用的各序列如下:
sTNFRI氨基酸序列以SEQ ID NO:1示出;
sTNFRII氨基酸序列:
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTV
CDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYC
ALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDIC
RPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGD(SEQ ID NO:13);
抗IL-17A scFv氨基酸序列以SEQ ID NO:3示出;
抗IL-17A Fab氨基酸序列:
重链:QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYSFTDYHIHWVRQAPGQG LEWMGVINPMYGTTDYNQRFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYDYFTGTGVYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV(SEQ ID NO:14);
轻链:DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSRSLVHSRGNTYLHWYLQKPG QSPQLLIYKVSNRFIGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCSQSTHLPFTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:15);
IgG4的Fc片段(S228P)的氨基酸序列以SEQ ID NO:2示出。
利用Expi293系统(购自赛默飞世尔)按照其产品说明书分别对8种蛋白进行瞬时表达,通过蛋白A亲和层析(填料:Praesto Jetted A50;平衡:50mM Tris-HAc,110mM NaCl,pH 7.2;洗脱:50mM NaAc-HAc,pH 3.0)对表达产物分别进行纯化,利用SDS-PAGE(还原/非还原)分别对8种蛋白进行分析,结果如图2所示。
在将8种蛋白均完成蛋白A亲和层析后,利用SEC-HPLC(色谱柱:G3000SWXL;流动相A:100mM PB,100mM Na2SO4,pH6.7±0.1;流动相B:100% H2O;流速:0.7mL/min;进样量:1.5μL)进行分析发现,除7号蛋白纯度较高以外,其他蛋白均存在不同比例的聚集体与降解产物,结果见图3。
实施例2:8种结构蛋白的亲和力评估
为进一步评估实施例1得到的所述8种蛋白,除7号分子纯度可供亲和力分析外,我们又对其余蛋白进行了二步纯化,利用分子排阻层析(填料:Sephadex G-25;缓冲液:PB)得到纯度进一步提高的蛋白,纯化后的8种蛋白的样品量、浓度以及纯度见表1。
表1.纯化后8种蛋白的数据
蛋白名称 | 样品量(mg) | 浓度(mg/mL) | 纯度 | 样品量(mg) |
1号蛋白 | 1.55 | 1.55 | 88.34% | 1.55 |
2号蛋白 | 1.28 | 1.28 | 76.14% | 1.28 |
3号蛋白 | 0.35 | 0.43 | 49.18% | 0.35 |
4号蛋白 | 0.58 | 0.52 | 71.83% | 0.58 |
5号蛋白 | 0.65 | 0.65 | 95.39% | 0.65 |
6号蛋白 | 3.39 | 1.13 | 95.05% | 3.39 |
7号蛋白 | 7.75 | 1.99 | 90.55% | 7.75 |
8号蛋白 | 0.88 | 0.68 | 74.03% | 0.88 |
对上述8种结构蛋白利用SPR技术(Biacore T200)进行抗原亲和力的分析,并与阳性对照药物修美乐(Humira)、恩利(Etanercept)、苏金单抗(Cosentyx)的抗原亲和力进行比较。
将上述8种蛋白与对照药物修美乐、恩利、苏金单抗分别通过Fc片段结合于Biacore T200的蛋白A传感芯片上,再分别利用不同浓度的(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、0nM)TNF或IL-17A作为分析物,通过多循环法检测所述不同的蛋白和对照药物对这两种抗原的亲和力,结果发现7种蛋白(1号、2号、3号、4号、5号、6号、8号蛋白)对于TNF-α的亲和力高于修美乐(TNF单抗)一个数量级,与恩利(TNF受体2)相近,符合理论预期,7号蛋白与修美乐相近;这8种蛋白对于IL-17A的亲和力均高于苏金单抗一个数量级。抗原亲和力测定结果见表2。
表2. 8种蛋白与三种阳性对照药物对响应抗原的亲和力
由于该融合蛋白为双靶点蛋白,故需要考虑两靶点对抗原(TNFα或IL-17A)的结合是否有影响,于是利用Biacore T200进行了后续试验,即利用蛋白A芯片捕获不同蛋白与阳性对照药物,随后用一种抗原去饱和蛋白或对照药物对该抗原的结合,再利用不同浓度(200nM、100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、0nM)的另外一种抗原去检测这种情况下蛋白或阳性对照药物对另外一种抗原的亲和力,结果见表3和表4。结果表明,本发明实施例1得到的8种蛋白在一种抗原结合域饱和的情况下,对另外一种抗原结合的亲和力没有受到影响。
表3. 8种蛋白和对照药物在用IL-17A饱和结合后对TNFα的亲和力
表4. 8种蛋白和对照药物在用TNFα饱和结合后对IL-17A的亲和力
通过结合实施例1中测定的8种蛋白表达纯化结果,以及实施例2中上述的亲和力评价结果,并根据不同蛋白和对照药物对抗原分子结合的芯片响应值推算各个蛋白或对照药物是否能保证对TNF与IL-17A的结合比例,理论上对TNF与IL-17A的结合比例是1:2,按照下式,通过芯片响应值推算相同摩尔数的实施例1制备的8种融合蛋白和阳性对照药物结合抗原TNFα和IL-17A的摩尔数比值(Ratio):
其中,Analyte表示分析物:TNFα或IL-17A;Ligand表示锚定在芯片上的蛋白或阳性药物:8种蛋白与阳性对照抗体;Analyte MW表示分析物的相对分子质量;Ligand MW表示锚定在芯片上蛋白或阳性对照药物的相对分子质量。
上述8种蛋白和对照药物对抗原结合响应值的结果在图4中示出。结合实施例1与实施例2中上述的蛋白样品量、纯度以及亲和力情况,选择5号、6号和8号蛋白进行下一步的质谱检测。
实施例3:5号、6号和8号蛋白的质谱检测分析
经过-80℃冻融,通过SDS-PAGE分析发现,6号与8号蛋白出现大量降解带,结果见图5;通过质谱检测,只有5号蛋白具有完整主峰,6号与8号蛋白均出现未知峰,且实际分子质量与理论值相差很多,结果见表5,故选择5号蛋白为候选分子进行进一步的实验,5号蛋白的结构示意图见图6。
表5.5号、6号和8号蛋白的质谱检测结果
实施例4:5号蛋白的CHO细胞瞬转表达
由于之前为采用Expi293系统对蛋白进行的瞬转表达,蛋白表达最终产物与CHO细胞表达出的产物可能会有不同,按照厂商提供的说明书,通过ExpiCHO系统(购自赛默飞世尔)对5号蛋白进行表达与纯化,得到的蛋白用于药效学研究与成药性分析,表6示出了最终得到的蛋白的相关信息,图7示出了最终得到的蛋白的SEC-HPLC结果与SDS-PAGE结果。
表6.最终得到的蛋白的相关信息
制剂 | PBS,pH 7.4 |
通过还原SDS-PAGE测得的纯度 | >90% |
通过SEC-HPLC测得的纯度 | 97.9% |
内毒素(LAL) | <0.5EU/mg |
蛋白产量 | 248.6mg |
蛋白浓度 | 1.10mg/mL |
体积 | 226.0mL |
瓶数 | 68 |
储存和运输 | -80℃ |
实施例5:5号蛋白的药效学评估
将实施例4得到的蛋白进行融合蛋白的药效学研究。首先,对5号融合蛋白与鼠源TNF-α(mTNFα)和鼠源IL-17A(mIL-17A)的亲和力进行检测,结果发现5号融合蛋白对于mTNFα有结合,亲和力常数为1.630E-10M,对于mIL-17A无结合,故需要采用hIL-17A转基因鼠进行药效学试验。
利用hIL-17A转基因DBA/1小鼠,自由饮水和进食,适应性饲养3-5天后,根据体重随机分为对照组和模型组。模型组小鼠通过尾根部皮下注射给予完全弗氏佐剂配制的II型牛胶原(Chondrex公司)乳液,初次免疫后21天使用不完全弗氏佐剂配制的II型牛胶原乳液进行二次免疫。初次免疫后42-56天,小鼠成模率可达到100%;在小鼠初次免疫后30天分组,模型组4只(给予PB缓冲液),空白组3只,5号融合蛋白组5只,阳性对照药物苏金单抗组4只,为了验证药效,分组时最严重、评分高的成模鼠都分到融合蛋白组,用以观察融合蛋白对该组模型鼠的抑制效果。
分组当天开始治疗,每48h给药一次,5号融合蛋白浓度1.1mg/mL,苏金单抗浓度1.1mg/mL,80μL/只,给药方式为腹腔注射,给药剂量为3mg/kg,每次给药前对小鼠关节肿胀程度评分,评分标准见下表7。
表7关节评分标准
拍照记录并绘制变化曲线。治疗周期为28天,共给药14次,小鼠关节评分结果见图8。
在5号蛋白和苏金单抗的给药组中,5号融合蛋白对类风湿小鼠关节炎具有显著的抑制作用,抑制效果优于阳性对照药物苏金单抗。根据如下公式计算类风湿关节炎抑制率:
T=给药组最终评分-给药组初始评分
C=模型组最终评分-模型组最初评分
类风湿关节炎抑制率=(1-T/C)*100%
计算得出各给药组的类风湿关节炎抑制率,分别为:
5号融合蛋白抑制率:74%;苏金单抗抑制率:40%(各组小鼠足爪部照片在图9中示出)。
对各组小鼠足爪进行取材,并进行MicroCT分析,并对各组小鼠足爪骨损伤程度进行评分,由三名实验员按照表7中的标准对其进行背对背评分,取平均值。各组小鼠的足爪MicroCT结果和评分见图10和图11,结果表明,5号融合蛋白可以显著缓解骨关节损伤,苏金单抗效果也较好(部分原因是由于早期该给药组内的小鼠类风湿关节炎评分比5号蛋白给药组的评分低)。
实施例6:5号融合蛋白的理化性质分析
(1)差示扫描荧光测定(DSF)
差示扫描荧光是在荧光定量PCR仪上缓慢加热样品,在加热的过程中检测荧光染料与结构发生改变的蛋白质相结合的量,来评价蛋白质热稳定性的方法。利用差示扫描荧光测定法来测定5号蛋白,在两个孔中对浓度为1mg/mL的5号蛋白进行检测;平均的Tm值为68.6℃,测定结果见表8,说明样品有着良好的热稳定性;但是在检测开始的时候观测到了荧光,说明在蛋白表面有疏水基团斑块的暴露或者是存在蛋白的错误折叠。
表8.5号蛋白的差示扫描荧光测定结果
(2)FcRn结合能力检测
利用SPR技术采用蛋白A芯片检测5号蛋白在pH 7.4的条件下对FcRn的亲和力,经过分析其亲和力常数为2.52E-06nM,该亲和力测定结果落入了IgG4亚型的抗体对于FcRn亲和力的正常范围内,表明5号蛋白可通过Fc延长融合蛋白在机体内的半衰期。
(3)通过ELISA方法检测5号蛋白的血浆稳定性
将5号蛋白在37℃的人血浆中分别孵育0天(即,孵育前一天)、1天、4天、7天和14天,随后利用ELISA方法检测5号蛋白对hTNF-α和hIL-17A的结合能力(以5号蛋白作为一抗,并利用HRP标记的抗人Fc作为二抗)。结果表明,孵育1天、4天、7天、14天的EC50值与第0天的EC50值几乎没有变化,说明5号蛋白在人的血浆中很稳定。
(4)动态光散射试验(DLS)
动态光散射试验用来检测处于PBS缓冲液(pH 7.4)中浓度为1.10mg/mL的5号蛋白的溶液中的不同大小的蛋白质的分布情况,对处于PBS缓冲液中的5号蛋白的溶液进行两次检测,经过检测,该溶液的PD%(相对分散度)>15%,说明该溶液中有5号蛋白的寡聚体存在,结果见表9。
表9.5号蛋白的DLS结果
(5)5号蛋白的冻融稳定性检测
将5号蛋白第0天(即,孵育前一天)的样品在纯化后于<-60℃下进行一次冻融。其它的样品进行40℃孵育(共孵育14天,第1天、4天、7天、14天进行检测)或3轮冻融(<-60℃)。经A280测定,样品浓度相近,外观无色无颗粒。用SEC-HPLC法(色谱柱:G3000SWXL;流动相A:100mM PB,100mM Na2SO4,pH 6.7±0.1;流动相B:100% H2O;流速:0.7mL/min;进样量:1.5μL))检测,所有样品中均发现高分子量组分(聚集体)的存在。值得注意的是,40℃孵育后,高分子量组分减少,单体组分增加,冻融稳定性测定结果见表10。该结果说明,5号蛋白具有一定的冻融稳定性。
表10.5号蛋白冻融稳定性结果
注:无色(CL)、无颗粒(PF);HMW:高分子量;LMW:低分子量
实施例7:制剂配方筛选
由于之前的实验中发现候选分子有可能在冻融后产生聚集体,故为进一步提高本发明中的融合蛋白的冻融稳定性并进一步减少聚集体的产生,从而进一步改善其成药性,本实施例研究了适用于5号蛋白的不同的制剂配方与pH值。
根据5号融合蛋白的理论等电点(8.07),设计缓冲体系的pH范围(4.5~7.5),同时考察不同种类的缓冲体系(醋酸盐、组氨酸盐、枸橼酸盐和磷酸盐)对蛋白稳定性产生的影响。各候选配方所添加的蛋白、辅料和表面活性剂的种类和用量均相同。通过测试外观及可见异物、DLS和DSC,对比候选分子在不同候选配方中的颗粒、胶体稳定性以及热稳定性的差异,筛选出较优的3~6个配方进行冻融考察。具体方案见表11。
表11.5号蛋白的制剂配方及检测指标
X:外观、可见异物、DSC、DLS(Tagg&kD)。
经过检测,上述制剂配方快筛研究结果显示出,各候选配方样品中B-1~B-3、B-7~B-9的kD值均>0,表明所述各配方的样品分子间均以排斥力为主,其中B-1表现最优;B-1~B-3、B-7~B-10的Tagg(聚集起始温度)值更高,具有相对较高的热稳定性;B-2、B-3、B-5、B-6的Tonset(变性起始温度)值更高,具有相对较高的热稳定性;B-1和B-8配方样品外观及微粒情况相对较好。
综上,B-1~B-3、B-7~B-8更有利于维持本发明5号融合蛋白的稳定性,最终优选此5个配方作为候选制剂体系;另外增加表现最优的B-1配方的“缓冲液体系+蔗糖”的实验组(10mM醋酸/醋酸钠缓冲液(pH 4.5)、80mg/mL蔗糖、0.02%聚山梨酯80),对上述候选制剂体系进行冻融考察。实验方案见表12。
表12.候选制剂体系
冻融考察结果表明,E-1配方(10mM醋酸/醋酸钠缓冲液、87mg/mL海藻糖和0.02%(w/v)聚山梨酯80,pH 4.5)较其它候选制剂体系能够更有利于维持本发明融合蛋白的稳定性,整体表现最优。
Claims (10)
1.一种双特异性融合蛋白,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:
TNF可溶性受体或其部分;
人IgG Fc片段;以及
竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域。
2.如权利要求1所述的双特异性融合蛋白,其中,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1或其部分、或TNF可溶性受体2或其部分;更优选地,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1或其部分;更优选地,所述TNF可溶性受体或其部分为TNF可溶性受体1胞外片段;
优选地,所述TNF可溶性受体1胞外片段包含以SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列或与其具有至少95%同一性的氨基酸序列,或者其保守修饰变体;
优选地,所述人IgG Fc片段为人IgG1 Fc或IgG4 Fc片段;更优选地,所述人IgG Fc片段为IgG4的Hinge-CH2-CH3片段;更优选地,所述人IgG Fc片段为具有S228P突变的人IgG4 Fc片段;
优选地,所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域选自:IL-17A的受体、其变体或它们的部分,或者抗IL-17A抗体或其抗原结合片段;
优选地,所述抗IL-17A抗体的抗原结合片段包括所述抗IL-17A抗体的Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链抗体、单域抗体、分离的CDR区或Fd片段;
优选地,所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域为抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述抗IL-17A单链抗体包含:以SEQ ID NO:5示出的HCDR1、以SEQ ID NO:6示出的HCDR2和以SEQ ID NO:7示出的HCDR3,以SEQ IDNO:8示出的LCDR1、以SEQ ID NO:9示出的LCDR2和以SEQ ID NO:10示出的LCDR3;
优选地,所述抗IL-17A单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列,并且所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列;
优选地,所述抗IL-17A单链抗体包含以SEQ ID NO:3示出的氨基酸序列或与其具有至少80%同一性的氨基酸序列;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或2、或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)TNF可溶性受体1或其胞外片段,(2)人IgG4 Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ IDNO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的HCDR1、以SEQ ID NO:6示出的HCDR2和以SEQID NO:7示出的HCDR3,以SEQ ID NO:8示出的LCDR1、以SEQ ID NO:9示出的LCDR2和以SEQID NO:10示出的LCDR3;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ IDNO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4Fc片段,以及(3)抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:(1)以SEQ IDNO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,(2)以SEQ ID NO:2示出的人IgG4Fc片段,以及(3)以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述人IgG Fc片段与所述竞争性结合IL-17A或抗IL-17A的功能结构域通过连接肽进行连接;
优选地,所述连接肽为GS柔性连接肽;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:TNF可溶性受体1或其胞外片段、人IgG4 Fc片段、GS柔性连接肽和抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含以SEQ ID NO:5示出的HCDR1、以SEQ IDNO:6示出的HCDR2和以SEQ ID NO:7示出的HCDR3,以SEQ ID NO:8示出的LCDR1、以SEQ IDNO:9示出的LCDR2和以SEQ ID NO:10示出的LCDR3;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段,以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段,以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽,以及抗IL-17A单链抗体,所述单链抗体包含重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区包含以SEQ ID NO:11示出的氨基酸序列,所述轻链可变区包含以SEQ ID NO:12示出的氨基酸序列;
优选地,所述双特异性融合蛋白以N端至C端的顺序包括:以SEQ ID NO:1示出的TNF可溶性受体1胞外片段、以SEQ ID NO:2示出的人IgG4 Fc片段、以SEQ ID NO:4示出的GS柔性连接肽和以SEQ ID NO:3示出的抗IL-17A单链抗体;
优选地,所述融合蛋白与IL-17A的亲和力常数KD为9×10-12M以下,且与TNFα的亲和力常数KD为4×10-11M以下。
3.一种编码权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白的多核苷酸。
4.一种重组载体,含有权利要求3所述的多核苷酸。
5.一种宿主细胞,所述细胞含有权利要求3所述的多核苷酸或权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白的方法,包括:
a)制备编码所述双特异性融合蛋白的多核苷酸;
b)通过使用所述多核苷酸与表达载体构建重组载体;
c)将所述重组载体转入宿主细胞中,并对转化后的细胞进行培养,得到细胞培养物;
d)对所述细胞培养物进行纯化和分离,获得所述双特异性融合蛋白。
7.一种包含权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白的制剂,其中,所述制剂还包含缓冲液体系、药学上可接受的辅料和表面活性剂,所述缓冲液体系选自醋酸和醋酸钠溶液、枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或者组氨酸和盐酸组氨酸溶液;
优选地,所述制剂的pH值为3.0-7.5;
优选地,所述制剂包含:5mg/mL-100mg/mL的所述双特异性融合蛋白、5mM-50mM缓冲液体系、50mg/mL-100mg/mL药学上可接受的辅料和0.01%-0.05%(w/v)表面活性剂;
优选地,所述缓冲液体系选自5mM-20mM醋酸和醋酸钠溶液、5mM-20mM枸橼酸和枸橼酸钠溶液、或5mM-20mM组氨酸和盐酸组氨酸溶液;
优选地,所述药学上可接受的辅料为蔗糖或海藻糖中的至少一种;
优选地,所述表面活性剂为非离子型表面活性剂。
8.一种药物组合物,所述组合物包括权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白。
9.权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白、权利要求7所述的制剂或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗炎症相关疾病的药物中的用途;
优选地,所述炎症相关疾病为自身免疫性疾病或细胞因子释放综合征;
更优选地,所述炎症相关疾病为类风湿性关节炎、银屑病、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、病毒感染或免疫调节药物引起的细胞因子释放综合征。
10.权利要求1或2所述的双特异性融合蛋白、权利要求7所述的制剂或权利要求8所述的药物组合物在制备结合并抑制TNF-α与IL-17A的试剂中的用途。
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