KR20220054324A - 약제학적 TACI-Fc 융합 단백질 제제 - Google Patents
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Abstract
비-환원당, TACI-Fc 융합 단백질 및 1종 이상의 아미노산의 혼합물을 함유하는 약제학적 제제가 개시된다. 상기 약제학적 제제는 입자형 물질의 감소, 응집체 형성의 감소, 안정성의 개선, 동결-건조된 분말의 외관 개선 등의 특성을 갖는다.
Description
본 개시 내용은 림프구 형성 및 림프구 분화를 조절하는, 융합 단백질 약제학적 제제에 관한 것으로, 항-자가면역 질환 약물 분야에 속하는 것이다.
림프구 형성 및 림프구 분화는 사이토카인에 의해 조절된다. B 림프구 자극제(Blys, 또한 B 세포 활성화 인자, BAFF로도 알려짐) 및 증식-유도 리간드(APRIL)는 인간 면역 반응에 중요한 조절 효과를 갖는 사이토카인이다. 이들은 B 림프구의 발달과 증식을 촉진하고 혈액에서 면역 글로불린의 발현을 증가시킬 수 있다. BlyS와 APRIL은 또한 T 림프구의 성숙에 중요한 조절 효과가 있으므로, 이들은 또한 세포 면역에도 중요한 영향을 미친다.
Blys 및 APRIL은 림프구 표면의 수용체를 통해 림프구의 면역 반응을 조절한다. 이들은 세포막 수용체인 TACI(Transmenbrane Activator and CAML-interactor)와 BCMA(B Cell Maturation Antigen)에 결합한다. 게다가, BLyS는 다른 수용체인 BAFF-R에도 결합할 수 있다. B 림프구는 TACI, BCMA 및 BAFF-R을 발현하고 성숙한 T 림프구는 TACI를 발현한다. BlyS와 APRIL은 이러한 수용체의 신호를 통해 림프구의 활성화, 증식 및 발달을 조절하고 면역 반응을 생성한다. 게다가, 림프구 종양의 경우, BlyS와 APRIL도 종양 세포 분열을 촉진하고 종양 세포의 세포 사멸을 억제하여 종양의 진행을 가속화하는 효과가 있다.
많은 연구는 BlyS 및 APRIL의 과발현은 다양한 자가면역 질환의 원인 중 하나임을 보여주고 있다. 이러한 질병은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 쇼그렌 증후군 및 그의 등가물을 포함한다. 임상 연구는 BlyS의 농도가 종종 자가면역 질환의 중증도와 양의 상관 관계가 있음을 입증하였다. 따라서, BlyS 및 APRIL의 생성을 억제하거나 체내 농도를 낮추는 것은 자가면역질환 치료에 효과적인 방법이 된다. 한편, BlyS 및 APRIL은 B 림프구 종양의 진행을 가속화할 수 있으므로, BlyS 및 APRIL의 억제는 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종 및 B 림프구 림프종과 같은 B 림프구 종양 치료에도 사용할 수 있다.
TACI는 BlyS와 APRIL에 대한 높은 친화력을 가지므로, 가용성 TACI(TACI의 세포외 부분)는 BlyS나 APRIL과 세포막 수용체(TACI, BCMA, BAFF-R) 사이의 상호작용을 방지하기 위해 사용되어, BlyS 및 APRIL의 생물학적 활성을 차단하고 자가면역 질환 또는 종양을 치료하는 목적을 달성하고 있다. 다수의 연구들은 TACI의 세포외 부분이 IgG Fc 단편에 결합하는 융합 단백질(TACI-Fc)은 BlyS 및 APRIL과 관련된 질병을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주고 있다. 예를 들면, 자이모제네틱스(ZymoGenetics)와 머크 세로노(Merck Serono)에 의해 개발된 TACI 융합 단백질 아타시셉트(Atacicept)의 임상 결과는 이것이 SLE, 류마티스 관절염, 림프종 및 기타 질병에 치료 효과가 있음을 보여준다.
또한, 특허 CN101323643B는 절단된 TACI 및 면역글로불린 Fc로 이루어진 융합 단백질을 개시하고 있다. 융합 단백질의 TACI 부분은 TACI의 세포외 영역에서 아미노산 잔기 13으로부터 시작하는 아미노 말단 영역 서열, 전체 시스테인-풍부 영역 및 줄기 영역의 부분 서열을 포함한다. 융합 단백질의 면역글로불린 Fc 부분은 힌지 영역, CH2 영역 및 CH3 영역을 포함한다. TACI 서열 및 Fc 서열은 직접적으로 또는 링커 서열을 통해 융합된다. 또한, 그의 TACI 부분은 TACI의 아미노산 서열의 위치 13-108 또는 13-118로부터 선택되고, 링커 서열은 9Gly이고, 면역글로불린 Fc 단편은 각각, IgG1과 같은 각각의 서브 유형을 포함하는 각각 면역글로불린 유형을 갖는, IgG, IgM, IgD 및 IgA로부터 선택되는 인간 또는 동물 면역글로불린 Fc로부터 선택된다. 특허 CN102085368B는 전신성 홍반성 루푸스와 같은 자가면역 질환의 치료에 유용한 전술한 TACI-Fc 융합 단백질을 개시하고 있다. 특허 출원 CN201810512508.8은 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMOSD) 및 다발성 경화증(MS)의 치료를 위한 TACI-Fc 융합 단백질의 사용을 입증했다. NMOSD는 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 재발성 시신경염(recurrent optic neuritis), 종방향으로 확장된 횡방향 척수염(longitudinally extending transverse myelitis), 다발성 경화증의 시신경학적 형태(optic-spinal form of multiple sclerosis), 장-기간 횡방향 척수염(long-term transverse myelitis), 일측 또는 양측 시신경염(unilateral or bilateral optic neuritis), 자가면역 질환을 동반하는 시신경염 또는 척수염(optic neuritis or myelitis accompanying with autoimmune disease), 유증상 또는 무증상의 두개내 병변을 동반하는 시신경염 또는 척수염(optic neuritis or myelitis accompanying with symptomatic or asymptomatic intracranial lesions)을 포함한다.
시판되고 있는 다른 항체 약물 및 융합 단백질의 제제 중 일부는 다음과 같다:
또한, 상기 항체 제제 및 융합 단백질의 보조제 성분의 조성으로부터 융합 단백질 및 항체 제제의 조성이 고유한 특성을 가짐을 알 수 있다. 한편, 단일클론항체 약물은 안정성이 낮고 구조가 복잡하기 때문에 이러한 약물을 제조 및 보관하는 것이 매우 어렵다. 항체의 이질적인 구조, 특히 상보성 결정 영역(CDR) 및 Fc 글리코실화로 인해, 상이한 단일클론 항체 제형의 개발은 경우에 따라 개별적으로 수행되어야 한다. 항체 제제의 개발에는 산화, 이성질체화, 탈아미드화, 응집, 변성 및 단편화와 같은 항체 형태, 콜로이드 또는 화학 구조에 대한 도전이 있다. 다른 온도, 습도, pH 및 스트레스 조건에 노출되면 mAb의 입체 구조가 특히 초가변 영역(HVR)에서 변경될 수 있다. 불량한 제품은 감소된 활성을 나타낼 수 있으며, 더 중요하게는 증가된 면역원성이 환자를 위험에 빠뜨릴 수 있다. 따라서 항체를 보호하기 위한 최상의 보조제를 선택하는 것이 매우 중요하다(참고 1: Monoclonal antibody: formulations of marketed product and recent advances in novel delivery system, Yanan Cui et al., Drug Development and Industrial Pharmacy, Volume 43, 4호, 페이지 519-530, 2017). 한편, 융합 단백질 제품의 용이한 응집 및 낮은 안정성은 면역 반응을 저해하거나 정제 과정을 방해하여 이 분야에서 항상 해결해야 하는 문제이다. 또한, 융합 단백질의 응집에 영향을 미치는 인자도 복잡하여 외부 인자와 내부 인자로 나눌 수 있다. 외부 요인에는 주로 온도, 물리적 압력 및 용매 요인(pH, 이온 강도, 농도, 금속 이온 등)이 포함된다. 내부 요인은 주로 융합 단백질의 구조적 특성, 민감한 잔기 및 짝을 이루지 않은 시스테인 등을 포함한다. 이러한 요인은 융합 단백질의 응집에 영향을 미치므로 안정성 및 저장 시간에 영향을 미친다. 따라서 융합 단백질용 보조제의 선택에는 많은 실험적 탐색이 필요하다(참고 2: Production Challenges for Complex Biologics: Fusion Proteins, Stefan R. Schmidt, American Pharmaceutical Review, 페이지 1-5, 2017).
따라서, 본 개시 내용의 목적은 생물학적 제제에 이용가능한 보조제에 대한 광범위한 스크리닝 및 농도 범위 연구를 통해 TACI-Fc 융합 단백질의 제제 조합을 획득하여 다음과 같은 기술적 효과를 달성하는 것이다: TACI-Fc 융합 단백질은 동결 건조 전후에 잘 용해될 수 있으며 불용성 미립자 및 육안으로 보이는 이물질이 인체용 주입 기준을 충족하고, 동결 건조 및 보관 과정에서 오랜 시간 동안 안정한 상태를 유지하므로 재용해 후 중합 또는 분해되는 경향이 없어, 좋은 생물학적 활성을 유지한다.
본 개시 내용은 TACI-Fc 융합 단백질, 비-환원당 및 아미노산을 포함하는 TACI-Fc 융합 단백질의 수성의 액상 약제학적 제제에 관한 것이고; 상기 비-환원당은 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 상기 아미노산은 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신, 글루탐산 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 상기 히스티딘은 1-100 mmol/L, 바람직하게는 5-50 mmol/L, 5-20 mmol/L, 8-12 mmol/L, 또는 약 10 mmol/L 농도의 히스티딘 히드로클로라이드이고; 상기 아르기닌은 10-160 mmol/L, 바람직하게는 20-120 mmol/L, 50-100 mmol/L, 70-95 mmol/L, 75-90 mmol/L, 또는 약 90 mmol/L, 또는 약 75mmol/L 농도의 아르기닌 히드로클로라이드이다.
일부 구체예에서, 상기 수크로스의 농도는 1-300 mmol/L, 바람직하게는 5-200 mmol/L, 10-100 mmol/L, 35-45 mmol/L, 또는 약 40 mmol/L이다.
일부 구체예에서, 상기 만니톨의 농도는 10-300 mmol/L, 바람직하게는 10-200 mmol/L, 60-150 mmol/L, 85-125 mmol/L, 90-120 mmol/L, 또는 약 120 mmol/L, 또는 약 90 mmol/L이다.
일부 구체예에서, TACI-Fc 융합 단백질은 서열번호 1에서 표시되는 아미노산 서열을 갖는다. 단백질은 TACI의 13-118의 아미노산, 및 ADCC 및 CDC 효과를 감소시키는 최적화된 Fc 단편을 포함한다.
서열번호 1에서 표시되는 TACI-Fc 융합 단백질에서는, 막-결합된 BLyS 또는 증식-유도 리간드(APRIL)에 의해 생성되는 항체-의존성 세포- 매개 독성(ADCC, antibody-dependent cell-mediated toxicity) 효과를 피하기 위해, IgG1으로부터 유래된 Fc 단편이 서열 최적화되어 있고, Fc 단편의 CH2 영역에서 아미노산 120-123은 류신(L)-류신(L)-글리신(G)-글리신(G)에서 알라닌(A)-글루탐산(E)-글리신(G)-알라닌(A)으로 돌연변이되어 Fcγ 수용체의 친화도를 감소시켰다. 추가적으로, Fc 서열의 CH2 영역도 돌연변이(아미노산 잔기 216~217이 알라닌(A)-프롤린(P)에서 세린(S)-세린(S)로 돌연변이)되어, 보체 결합 또는 고정이 감소되었고, 따라서 보체 의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 효과를 감소시켰다.
서열번호 1의 서열은 다음과 같다:
액상 제제에서, 2개의 TACI-Fc 융합 단백질 단량체는 Fc 힌지 영역에서 사슬간 이황화 결합이 형성되어 이중-가닥 구조를 형성할 수 있다.
일부 구체예에서, TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 5-240 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 약 100 mg/ml이다.
일부 구체예에서, 비-환원당은 90-120 mmol/L의 만니톨 및/또는 35-45 mmol/L의 수크로스이고, 아미노산은 75-125 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및/또는 8-12 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, 및 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 80-100 mg/ml이고; 히스티딘 히드로클로라이드의 농도는 보다 바람직하게는 약 10 mmol/L이다.
일부 구체예에서, 제제는 약 1% 내지 약 10%(w/v, g/100 ml)의 TACI-Fc 융합 단백질, 바람직하게는 약 6-10%(w/v, g/100 ml)의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함한다.
일부 구체예에서, 비-환원당은 약 90 mmol/L의 만니톨 및 약 40 mmol/L의 수크로스이고, 아미노산은 약 90 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, 및 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 약 80 mg/ml이다.
일부 구체예에서, 비-환원당은 약 120 mmol/L의 만니톨 및 약 40 mmol/L의 수크로스이고, 아미노산은 약 75 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 약 80 mg/ml이다.
일부 구체예에서, 제제는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 7.0, 5.0 내지 6.0, 또는 약 5.5의 pH를 갖는다. 용액의 pH 값은 NaOH 또는 염산으로 조절된다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 수성의 액상 약제학적 제제의 동결건조에 의해 수득된 동결건조된 약제학적 제제에 관한 것이다.
동결건조된 약제학적 제제의 일부 구체예에서, 수성의 액상 약제학적 제제는약 90mmol/L의 만니톨, 약 40 mmol/L의 수크로스, 약 90 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드, 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드, 및 약 80 mg/ml의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하고, 수성의 액상 약제학적 제제는 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는다.
동결건조된 약제학적 제제의 일부 구체예에서, 수성의 액상 약제학적 제제는 약 120 mmol/L의 만니톨, 약 40 mmol/L의 수크로스, 약 75 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드, 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드, 및 약 80 mg/ml의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하고, 수성의 액상 약제학적 제제는 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는다.
동결건조된 약제학적 제제의 일부 구체예에서, 수성의 액상 약제학적 제제 중 비-환원당은 각각 약 16.4 mg/ml 및 약 13.7 mg/ml 농도의 만니톨 및 수크로스이고; 수성의 액상 약제학적 제제 중 아미노산은 각각 약 19.0 mg/ml 및 약 2.1 mg/ml 농도의 아르기닌 히드로클로라이드 및 히스티딘 히드로클로라이드이다.
동결건조된 약제학적 제제의 일부 구체예에서, 수성의 액상 약제학적 제제 중 비-환원당은 각각 약 21.9 mg/ml 및 약 13.7 mg/ml 농도의 만니톨 및 수크로스이고; 수성의 액상 약제학적 제제 중 아미노산은 각각 약 15.8 mg/ml 및 약 2.1 mg/ml 농도의 아르기닌 히드로클로라이드 및 히스티딘 히드로클로라이드이다.
본 개시 내용은 추가로 자가면역 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서의 약제학적 제제의 용도에 관한 것이고, 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosus), 류마티스 관절염, 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMOSD), 다발성 경화증(MS) 및 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)을 포함하고, 상기 시신경 척수염 스펙트럼 장애는 시신경 척수염(neuromyelitis optica), 재발성 시신경염(recurrent optic neuritis), 종방향으로 확장된 횡방향 척수염(longitudinally extending transverse myelitis), 다발성 경화증의 시신경학적 형태(optic-spinal form of multiple sclerosis), 장-기간 횡방향 척수염(long-term transverse myelitis), 일측 또는 양측 시신경염(unilateral or bilateral optic neuritis), 자가면역 질환을 동반하는 시신경염 또는 척수염(optic neuritis or myelitis accompanying with autoimmune disease), 유증상 또는 무증상의 두개내 병변을 동반하는 시신경염 또는 척수염(optic neuritis or myelitis accompanying with symptomatic or asymptomatic intracranial lesions)을 포함하고, 림프종은 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 및 B 림프구 림프종을 포함한다.
본 개시 내용은 또한 (1) 상기 기재된 바와 같이 제제를 제조하고; 및 (2) 상기 제제에서 TACI-Fc 융합 단백질의 안정성을 평가하는 것을 포함하는, TACI-Fc 융합 단백질 약제학적 제제의 제조를 위한 방법에 관한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 개시 내용은 또한 하기 단계를 포함하는, 상기 기재된 바와 같은 약제학적 제제의 제조 방법에 관한 것이다: 단백질 스톡 용액을 수득하고, 예비 동결, 1차 건조, 2차 건조 및 서브패키징(subpackaging)하는 것.
특정 구체예에서, 단백질 스톡 용액을 얻는 단계는 다음을 포함한다:
1. TACI-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있는 유전자 재조합 CHO 세포를 배양하고, 세포 생존율이 허용 가능한 하한에 도달하면, 원심분리 또는 여과에 의해 세포를 분리하고 상청액을 수집하는 단계;
2. Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 정제의 제1 단계를 수행하고, 수득된 목적 단백질을 한외여과 및 농축을 위해 용출시킨다. 그런 다음, 복합 패킹 크로마토그래피 컬럼에서 정제의 제2 단계를 수행하고, 표적 단백질 피크를 수집한다. 마지막으로, 표적 단백질 침투 모드에서 세 번째 컬럼에 정제의 제3 단계를 수행한다.
특정 구체예에서, 단백질 스톡 용액을 얻는 단계는 이하의 단계를 추가로 포함한다: 테스트를 통과하면, 정제된 단백질을 한외여과 및 농축을 위해 "5× 제제 완충액"과 혼합하여 단백질 스톡 용액을 수득하는 단계.
특정 구체예에서, 수득된 단백질 스톡 용액은 반제품 단백질 용액을 수득하기 위해 단백질이 없는 제제 완충액을 가지고 요구되는 단백질 농도로 정확하게 희석될 필요가 있고, 이어서 이를 진공 동결건조를 위한 바이알에 분배한다. 본 개시 내용에 의해 달성되는 주요 기술적 효과는 고도로 정제된 후의 TACI-Fc 단백질이 비-환원성 SDS-PAGE에서 99% 이상의 순도를 가지며, CHO 세포 숙주 단백질, CHO 세포 숙주 DNA, 박테리아 엔도톡신 및 기타 지표가 "중국 약전"(2005년판) 표준의 요구 사항을 충족한다는 것이다. 본 개시 내용에서 수득되는 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하는 약제학적 제제는 수분 함량, 입자의 개수, 가시적 이물질 및 불용성 미립자의 개수 면에서 우수한 기준에 도달하였으며, 약제학적 제제는 장-기간 보관 안정성을 갖는다.
도 1: 수분 함량 측정. 그 결과는 제제 11, 12 및 13의 동결건조 분말이 물을 흡수하기에 매우 쉽고, 수분 함량이 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다. 제제 3 내지 9는 수분 함량 테스트의 요구 사항을 충족한다.
도 2: 육안으로 보이는 이물질 검사 분석. 그 결과는 제제 3과 제제 4는 육안으로 보이는 이물질 테스트의 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다.
도 3: 불용성 미립자 검사 분석. 그 결과는 제제 3 및 제제 4는 불용성 미립자 검사의 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다.
도 2: 육안으로 보이는 이물질 검사 분석. 그 결과는 제제 3과 제제 4는 육안으로 보이는 이물질 테스트의 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다.
도 3: 불용성 미립자 검사 분석. 그 결과는 제제 3 및 제제 4는 불용성 미립자 검사의 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다.
실시예 1: TACI-Fc 융합 단백질의 획득 및 정제
Qiagen의 RNA 추출 키트를 사용하여, 인간 말초 혈액 단핵 세포에서 총 RNA가 추출되었다. 그런 다음, 역전사 효소에 의해 RNA로부터 cDNA가 합성된 후, 프라이머(정방향: 
; 역방향: 
)로 중합효소 연쇄 반응이 수행되어, 원하는 TACI 단편을 증폭시켰다. 면역글로불린 Fc 단편은 ADCC 및 CDC 효과가 감소된 클로닝된 서열-최적화된 IgG1 Fc 플라스미드로부터 PCR 증폭에 의해 수득되었다. 마지막으로, TACI와 Fc 서열은 PCR에 의해 융합되어 TACI-Fc 융합 단백질의 DNA 서열(아미노산 서열은 서열번호 1에 표시된다)을 작제하였다. 이후에, TA 클로닝 키트를 이용하여 TACI와 Fc의 PCR 산물은 각각 pCR2.1 플라스미드에 클로닝된 후, 대장균(E. coli)에 형질주입(transfection)되었다. 그 후, 백색 콜로니가 선택되었고, LB 배지가 첨가되어 밤새 배양되었다. 그런 다음, Qiangen의 플라스미드 추출 키트를 사용하여 플라스미드가 추출되었고, TACI 및 Fc 서열은 제한 효소 분해 및 시퀀싱으로 확인되었다. 마지막으로, TACI와 IgG Fc cDNA는 스플라이싱 PCR 방법으로 연결되었다. TACI-Fc 단편은 발현 플라스미드에 삽입되었다. 이어서, 재조합 플라스미드는 대장균을 형질감염시킨 후, 양성 콜로니가 선별되고 플라스미드를 추출하고 제한효소 절단 및 시퀀싱을 통해 표적 서열이 확인되었다. 그런 다음 플라스미드는 CHO 세포를 형질감염시키고, 유전적으로 재조합된 CHO 세포는 표준 조건에서 배양되었다. 배지의 영양소가 고갈되고 세포가 더 이상 성장하지 않으면 배양 혼합물이 수집되었다. 그런 다음, 세포는 원심분리 또는 여과에 의해 분리되었고, TACI-Fc 단백질을 함유하는 상청액은 수집되었고 제1 정제를 위해 단백질 A 친화성 크로마토그래피 컬럼에 로딩되었다. 그런 다음, 용리된 표적 단백질은 한외여과에 의해 30-50 mg/ml의 표적 단백질 농도로 농축되었고, 제2 정제를 위해 복합 패킹 크로마토그래피 컬럼에 로딩되었다. 표적 단백질이 수집된 다음 표적 단백질 침투 모드에서 제3 정제를 위해 세 번째 컬럼에 로딩되었다. 각종 지표에 대한 시험을 통과한 정제된 단백질은 "5× 제제 완충액"과 부피비 4:1로 혼합된 후 한외여과를 통해 농축되어 약 100 mg/ml 농도의 단백질을 얻었으며, 이것이 바로 단백질 스톡 용액이었고, 이것은 -80℃에서 장기간 보관될 수 있다.
보조제(adjuvant)의 스크리닝
초기에 다량의 정보 분석과 실험적 스크리닝을 통하여, 수크로스, 만니톨, 글리세롤, 히스티딘, 아르기닌, 폴리소르베이트 80(즉, 트윈 80) 및 그의 등가물이 추가 스크리닝을 위한 보조제 후보로 미리 확인되었고, 다음과 같은 시험이 추가로 수행되었다.
실시예 2: 아르기닌에 의한 TACI-Fc 단백질 용출 촉진에 관한 연구
아르기닌이 없는 완충액(예를 들면, 20mmol/L NaH2PO4-Na2HPO4 120 mmol/L NaCl, pH 5.5)에서 TACI-Fc 단백질을 5 mg/ml 이상의 단백질 농도로 4℃ 냉장고에서 밤새 배양한 후에는, 용기 바닥에 응집성 침전물이 나타나게 될 것이며, 가볍게 흔들면 부유하는 침전물로 인해 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자의 검사를 수행할 수 없다. 단백질 농도가 높을수록, 단백질 침전이 더 심각하다. 예비 실험 연구는 단백질 용액에 아르기닌 히드로클로라이드를 첨가하는 것은 침전물이 빨리 사라지게 할 수 있음을 보여준다.
추가적인 실험: 1) 7290 mg의 정제된 TACI-Fc 단백질은 5 mg/ml의 단백질 농도를 갖는 10 mmol/L의 히스티딘(pH 5.5) 완충액에 투석되었다. 2) 단백질 용액은 9개의 그룹, 각 그룹 당 7개의 부분, 총 63개의 부분으로 나누어졌고, 각 그룹에서 7개의 부분의 단백질 함량은 각각 10, 20, 40, 100, 160, 200, 300 mg이며, 9개의 그룹 각각에는 아르기닌 히드로클로라이드의 최종 농도가 0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125 mmol/L가 될 때까지 1 mol/L 아르기닌 히드로클로라이드(pH 5.5)가 첨가되었고, 그런 다음, 30KD의 공극 크기를 갖는 원심 한외여과 관으로 2ml의 최종 부피까지 농축되었다. 단백질의 명백한 침전 여부가 관찰되었다. 눈에 띄는 침전이 있다면 추가적인 절차가 필요하지 않으며 표에는 "-"로 바로 표시된다. 침전이 눈에 보이지 않는다면, 단백질 용액은 슈퍼 클린 벤치에서 0.22μm 멸균 주사기 필터가 있는 멸균 2ml 바이알로 여과되었다. 각가의 바이알은 멸균 고무 마개로 밀봉되었고, 알루미늄 캡을 씌워 4℃ 냉장고에서 24시간 보관되어, 임의의 침전 여부가 관찰되었다.
검사 기준: YB-II 투명도 검출기에서 관찰. 완전히 투명하거나 또는 3개 이하의 흰색 점은 "-"로 표시된다. 침전이 있다면, 침전의 함량에 따라서 "+", "++", "+++"로 표시된다. 더 많은 "+" 기호는 더 많은 침전을 나타낸다. 실험 결과는 아르기닌 히드로클로라이드 최적 농도는 75 mmol/L과 125 mmol/L 사이에 있음을 표 1에 나타내었다.
표 1. TACI-Fc 단백질의 용해도에 대한 아르기닌 히드로클로라이드의 농도의 영향
| 아르기닌 히드로클로라이드의 농도(mmol/L) | ||||||||||
| 0 | 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 75 | 100 | 125 | ||
| 단백질의 농도 (mg/ml) |
5 | + | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― |
| 10 | ++ | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | |
| 20 | +++ | + | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | |
| 50 | ― | ++ | + | ― | ― | ― | ― | ― | ― | |
| 80 | ― | ― | ++ | + | + | + | ― | ― | ― | |
| 100 | ― | ― | ― | ++ | ++ | ++ | ― | ― | ― | |
| 150 | ― | ― | ― | ― | ++ | ++ | + | ― | ― | |
실시예 3: 동결건조된 분말의 수분 함량 및 외관에 대한 만니톨 농도의 영향의 결정
실시예 2와 유사한 단계를 거쳐, 서로 다른 만니톨의 농도의 존재 하에, TACI-Fc 융합 단백질의 농도를 달리하여 제조된 동결건조된 분말의 수분 함량 및 외관이 조사되었다. 실험은 만니톨 함량이 60 mmol/L 미만이면, 그것은 동결건조된 분말의 수분 함량 및 외관에 영향을 미침을 보여준다.
실시예 4: TACI-Fc 융합 단백질의 보호 효과에 대한 수크로스의 효과
4℃, 25℃ 및 35℃의 조건에서 다양한 농도의 수크로스를 포함하는 약제학적 제제의 동결건조된 분말의 안정성이 실험을 통해 조사되었으며, 이것은 동결건조된 스톡 용액의 수크로스 농도가 10 mmol/L 미만일 때 스톡 용액은 동결건조 동안 TACI-Fc 융합 단백질의 활성을 잃고 효과적인 동결건조 보호 효과를 발휘하지 못하였음을 보여주었다.
실시예 5: 임시 제제 용액의 제조
위의 실험을 바탕으로 하여 다양한 제제의 공식(formula)이 추가적인 조사를 위해 설계되었다.
히스티딘 히드로클로라이드 용액의 제조:
표 2에서의 제제에 따라, 제제 번호. 1-13의 1× 제제 완충액이 제조되었다. 표 2의 제제 1을 예로 들면:
1) 깨끗한 1L 비이커에 히스티딘 히드로클로라이드 2.10g, 만니톨 0g, 아르기닌 히드로클로라이드 15.80g, 및 수크로스 54.77g을 무게를 달아 계산한다.
2) 적정량의 주사용 물을 첨가하여 용해시키고, 용해시킨 후 pH를 조절한다;
3) 칭량법으로 용액의 밀도에 따라 부피를 조절한 후 pH를 5.5로 미세 조절한다.
다른 제제는 각각의 제제의 양에 따라 상기 단계에 따라 제조되었다.
투석 완충액의 제조: 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드, pH 5.5.
제제 완충제의 제조:
1× 제제 완충액: 이것은 제제 완충액의 제제 표(표 2)에 따라 제조되었다:
5× 제제 완충액: 제제는 표 3에 나타나 있으며, 여기에서 히스티딘 히드로클로라이드의 농도는 10 mmol/L, 아르기닌 히스티딘의 농도는 CArg×5 mmol/L, 만니톨의 농도는 CMan×5 mmol/L, 수크로스의 농도는 CSuc×15 mmol/L이고, pH 5.5로 고정되었다. CArg, CMan 및 CSuc는 각각 1× 제제 완충액의 해당 제제에서 아르기닌, 만니톨 및 수크로스의 농도를 나타낸다.
상기 용액의 pH 값은 모두 6 mol/L 수산화나트륨 또는 6 mol/L 염산으로 조절되었으며, 용액은 엔도톡신을 제거하기 위해 10KD 이하의 기공 크기를 갖는 한외여과 막으로 한외여과 후 사용되었다.
표 2. 1× 제제 완충액의 제제 표
| 제제 번호 |
히스티딘 히드로클로라이드 (mmol/L) |
만니톨 (mmol/L) | 아르기닌 히드로클로라이드 (mmol/L) | 수크로스 (mmol/L) | pH | 삼투압 (mOsm/L) |
| 1 | 10 | 0 | 75 | 160 | 5.5 | 330 |
| 2 | 10 | 0 | 160 | 0 | 5.5 | 330 |
| 3 | 10 | 160 | 75 | 0 | 5.5 | 330 |
| 4 | 10 | 150 | 75 | 10 | 5.5 | 330 |
| 5 | 10 | 120 | 90 | 10 | 5.5 | 330 |
| 6 | 10 | 90 | 105 | 10 | 5.5 | 330 |
| 7 | 10 | 60 | 120 | 10 | 5.5 | 330 |
| 8 | 10 | 120 | 75 | 40 | 5.5 | 330 |
| 9 | 10 | 90 | 90 | 40 | 5.5 | 330 |
| 10 | 10 | 60 | 105 | 40 | 5.5 | 330 |
| 11 | 10 | 90 | 75 | 70 | 5.5 | 330 |
| 12 | 10 | 60 | 90 | 70 | 5.5 | 330 |
| 13 | 10 | 60 | 75 | 100 | 5.5 | 330 |
제제 설계 지침:
1. 히스티딘 히드로클로라이드는 pH 완충제이다. 초기 실험 검증에 따르면 10 mmol/L가 농도로 사용되었고; 상기 실시예에 기초하여, 각 제제에서 만니톨의 최소 농도는 60 mmol/L, 아르기닌 히드로클로라이드의 최소 농도는 75 mmol/L, 수크로스의 최소 농도는 10 mmol/L인 것으로 결정되었다.
2. 4가지 농도의 만니톨, 아르기닌 히드로클로라이드 및 수크로스가 각각 배합되었다. 60, 90, 120 및 150 mmol/L의 만니톨, 75, 90, 105 및 120 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및 10, 40, 70, 100 mmol/L의 수크로스가 10가지 다른 조합을 구성했다(제제 4-13). 또한, 제제 1만 아르기닌 히드로클로라이드 및 만니톨만을 함유하고, 제제 2만 아르기닌 히드로클로라이드만을 함유하고, 제제 3만 아르기닌 히드로클로라이드와 수크로스를 함유한다.
표 3. 5× 제제 완충액의 제제 표
| 제제 번호 | 히스티딘 히드로클로라이드 (mmol/L) | 만니톨 (mmol/L) |
아르기닌 히드로클로라이드 (mmol/L) | 수크로스 (mmol/L) | pH |
| 1 | 10 | 0 | 375 | 800 | 5.5 |
| 2 | 10 | 0 | 800 | 0 | 5.5 |
| 3 | 10 | 800 | 375 | 0 | 5.5 |
| 4 | 10 | 750 | 375 | 50 | 5.5 |
| 5 | 10 | 600 | 450 | 50 | 5.5 |
| 6 | 10 | 450 | 525 | 50 | 5.5 |
| 7 | 10 | 300 | 600 | 50 | 5.5 |
| 8 | 10 | 600 | 375 | 200 | 5.5 |
| 9 | 10 | 450 | 450 | 200 | 5.5 |
| 10 | 10 | 300 | 525 | 200 | 5.5 |
| 11 | 10 | 450 | 375 | 350 | 5.5 |
| 12 | 10 | 300 | 450 | 350 | 5.5 |
| 13 | 10 | 300 | 375 | 500 | 5.5 |
실시예 6: 진공 동결 건조
단백질 스톡 용액은 -80℃ 냉장고에서 꺼내어져 해동되었고, "1× 제제 완충액"을 가지고 80 mg/ml의 단백질 농도로 정확하게 희석되었으며, 멸균되고 발열원이 없는 표준 20ml 동결건조 바이알에 바이알당 1 ml로 서브패키징되었으며, 그런 다음 진공에서 동결 건조되었다.
동결 건조 조건
예비 동결: 5시간 동안 -45℃;
1차 건조: 10-15 Pa의 진공도(vacuum degree)에서 40시간 동안 -26℃; 및
2차 건조: 10-15 Pa의 진공도에서 10시간 동안 25℃.
동결 건조 이후에, 바이알은 진공 상태에서 고무 마개로 밀봉되었고 동결건조기에서 꺼내 알루미늄 캡으로 씌워졌다.
실시예 7: 동결건조된 분말의 외관 및 수분 함량 검사
동결건조된 분말의 외관에 대한 허용 기준은 균일한 색상, 균일하고 조밀한 기공, 동결건조 전후의 부피 및 형태가 기본적으로 변하지 않고, 블록 또는 스폰지 덩어리 구조를 나타내는 것이다.
표 4. 동결건조된 분말의 외관 관찰
| 제제 번호 |
히스티딘 히드로클로라이드 (mmol/L) | 만니톨 (mmol/L) | 아르기닌 히드로클로라이드 (mmol/L) | 수크로스 (mmol/L) | 외관 * |
| 1 | 10 | 0 | 75 | 160 | -- |
| 2 | 10 | 0 | 160 | 0 | - |
| 3 | 10 | 160 | 75 | 0 | ++ |
| 4 | 10 | 150 | 75 | 10 | ++ |
| 5 | 10 | 120 | 90 | 10 | ++ |
| 6 | 10 | 90 | 105 | 10 | + |
| 7 | 10 | 60 | 120 | 10 | + |
| 8 | 10 | 120 | 75 | 40 | ++ |
| 9 | 10 | 90 | 90 | 40 | ++ |
| 10 | 10 | 60 | 105 | 40 | - |
| 11 | 10 | 90 | 75 | 70 | + |
| 12 | 10 | 60 | 90 | 70 | + |
| 13 | 10 | 60 | 75 | 100 | - |
참고: "--"는 덩어리(mass)의 부피가 동결건조 전 부피의 절반 미만으로 감소되었음을 나타낸다; "-"는 덩어리의 부피가 동결건조 전 부피의 절반 이상으로 감소되었음을 나타낸다; "+"는 가장자리 부분만 약간의 수축이 있었고 덩어리의 부피는 기본적으로 동결건조 전의 부피와 동일함을 나타낸다; 및 "++"는 부피 수축이 전혀 없음을 나타내며, 제품의 부피는 동결건조 전과 동일하였음을 나타낸다.
실험 결과는 표 4에서 제제 1, 제제 2, 제제 10 및 제제 13의 동결건조 분말의 외관이 요구 사항을 충족하지 못하고 제거되었음을 나타내었다. 다른 제제의 동결건조 분말의 외관은 요구 사항을 충족한다.
수분 함량 분석을 위한 시험 표준:
동결건조 분말의 수분 함량은 SF-6형 미량수분 분석기(Karl Fischer Coulometric Method)로 측정되었으며, 허용 기준은 3% 이하이다.
표 5. 수분 함량 측정 결과
| 제제 번호 |
히스티딘 (mmol/L) | 만니톨 (mmol/L) | 아르기닌 (mmol/L) | 수크로스 (mmol/L) |
수분 함량(%) |
| 3 | 10 | 160 | 75 | 0 | 0.5 |
| 4 | 10 | 150 | 75 | 10 | 0.8 |
| 5 | 10 | 120 | 90 | 10 | 1.2 |
| 6 | 10 | 90 | 105 | 10 | 1.3 |
| 7 | 10 | 60 | 120 | 10 | 1.3 |
| 8 | 10 | 120 | 75 | 40 | 1.1 |
| 9 | 10 | 90 | 90 | 40 | 1.2 |
| 11 | 10 | 90 | 75 | 70 | 4.3 |
| 12 | 10 | 60 | 90 | 70 | 3.9 |
| 13 | 10 | 60 | 75 | 100 | 6.4 |
실험 결과는 제제 11, 12 및 13의 동결건조 분말은 수분 흡수가 매우 쉽고 수분 함량이 요구 사항을 충족하지 않음을 보여준다. 제제 3-9는 수분 함량 시험의 요구 사항을 충족한다.
실시예 8: 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자의 검사.
동결건조 분말은 각각 1 ml의 부피를 갖는 주사용 멸균수로 재용해되었다. 재용해하기 전에, 진공을 해제한 후, 바이알 내벽을 따라 멸균수가 천천히 첨가되었다.
육안으로 보이는 이물질 검사에는 YB-II 투명도 검출기가 사용되었다. "중국 약전"(2005년 판) 부록 VB의 "가시 이물 검사법(Visible Foreign Matters Inspection Method)-램프 검사법" 및 국가 식품 의약품 안전청 [식품 의약품 안전청 등록[2005] 제37호]의 "가시 이물 검사법 부칙 고시" 관련 규정에 따라, 각각의 제제에 대하여 20개의 바이알이 검사되었으며, 각 바이알에서 육안으로 보이는 이물질의 평균 함량이 계산되었다.
육안으로 보이는 이물 검사 허용 기준: 검사된 5개의 검체(바이알) 중, 유리조각, 섬유, 유색 반점, 유색 블록 등의 이물질이 검출되지 않아야 하며, 기타 눈에 보이는 이물질(백반, 미세한 단백질 덩어리 또는 단백질 입자)가 3개 이하로 검출되어야 한다.
불용성 미립자의 검사는 ZWJ-3 불용성 미립자 검출기를 사용하여 수행되었다. "중국 약전"(2005년 판) 부록 IXC의 "불용성 미립자 검사 방법-감광법"에 따라 각각의 단백질 용액 1밀리리터당 10미크론 이상 및 25미크론 이상의 불용성 미립자 수가 조사되었다. 각 제제에 대해 3개의 바이알이 검사되었고, 각 바이알의 불용성 미립자의 평균 함량이 계산되었다.
불용성 미립자 검사에 대한 허용 기준: 각 시험 용기에는 10μm 이상의 미립자 6,000개 이하, 25μm 이상 미립자 600개 이하가 포함되어야 한다.
표 6. 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자의 검사 결과.
| 제제 번호 |
히스티딘 (mmol/L) | 만니톨 (mmol/L) | 아르기닌 (mmol/L) |
수크로스 (mmol/L) |
육안으로 보이는 이물질의 개수 | 불용성 미립자의 개수 (>10 μm) |
불용성 미립자의 개수 (>25 μm) |
| 1 | 10 | 0 | 75 | 160 | 2 | 2263 | 273 |
| 2 | 10 | 0 | 160 | 0 | 1 | 1252 | 178 |
| 3 | 10 | 160 | 75 | 0 | 20 | 12845 | 1294 |
| 4 | 10 | 150 | 75 | 10 | 12 | 9578 | 985 |
| 5 | 10 | 120 | 90 | 10 | 1 | 1574 | 109 |
| 6 | 10 | 90 | 105 | 10 | 1 | 1483 | 193 |
| 7 | 10 | 60 | 120 | 10 | 0 | 1206 | 143 |
| 8 | 10 | 120 | 75 | 40 | 1 | 1012 | 129 |
| 9 | 10 | 90 | 90 | 40 | 0 | 985 | 116 |
| 10 | 10 | 60 | 105 | 40 | 1 | 939 | 98 |
| 11 | 10 | 90 | 75 | 70 | 1 | 895 | 129 |
| 12 | 10 | 60 | 90 | 70 | 0 | 902 | 137 |
| 13 | 10 | 60 | 75 | 100 | 2 | 1594 | 201 |
상기 표 6에서 얻은 데이터에 따르면, 제제 3 및 제제 4는 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자의 검사 요건을 충족하지 않음을 알 수 있다.
실시예 9. 동결건조된 분말의 장-기간(1-12 개월) 안정성 조사
제제 1, 2, 10, 13은 동결건조 분말의 외관 검사로 제거되었고, 제제 11, 12는 수분 함량 검사로 제거되었으며, 제제 3, 4는 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자의 검사로 제거되었다. 나머지 제제 5, 6, 7, 8, 9에 대해 안정성 조사가 수행되었다. 각 제제의 동결건조 분말은 각각 37℃, 25℃ 및 4℃에서 보관되었고, SDS-PAGE, 역상 HPLC, 리간드 결합법에 의한 생물학적 활성, 수분 함량, 외관, pH, 육안으로 보이는 이물질 및 불용성 미립자와 같은 검사를 위해 서로 다른 시간에 샘플링되었다. 그 결과는 표 7, 표 8 및 표 9에 나와 있다.
그 결과는 수크로스 농도가 10 mmol/L인 제제는 안정성이 좋지 않았고, 수크로스 농도가 40 mmol/L인 제제 8 및 제제 9는 장기 저장 안정성이 더 우수함을 보여주었다. 모든 면에서, 제제 8-9는 수분 함량, 육안으로 보이는 이물질, 외관, 불용성 미립자 및 안정성 측면에서 요구 사항을 충족한다.
표 7. 37℃에서 1개월 동안 보관한 후에 안정성 조사의 결과
| 제제 번호 | 비-환원성 SDS-PAGE (%) |
환원성 SDS-PAGE(%) | 역상 HPLC (%) |
활성 (Х105 U/mg) | 수분 함량 (%) |
외관 | 육안으로 보이는 이물질의 개수 | pH | 불용성 미립자 (>10 μm) |
불용성 미립자 (>25μm) |
| 5 | 97 | 94 | 92 | 2.8 | 1.5 | ++ | 1 | 5.5 | 928 | 149 |
| 6 | 97 | 94 | 92 | 2.9 | 1.4 | ++ | 0 | 5.5 | 1029 | 192 |
| 7 | 97 | 94 | 92 | 2.5 | 1.9 | ++ | 1 | 5.5 | 1320 | 103 |
| 8 | 97 | 94 | 97 | 3.9 | 1.9 | ++ | 1 | 5.5 | 992 | 98 |
| 9 | 97 | 97 | 97 | 4.2 | 1.7 | ++ | 0 | 5.5 | 1302 | 136 |
표 8. 25℃에서 3개월 동안 보관한 후에 안정성 조사의 결과
| 제제 번호 | 비-환원성 SDS-PAGE (%) |
환원성 SDS-PAGE (%) |
역상 HPLC (%) |
활성 (Х105 U/mg) | 수분 함량 (%) | 외관 | 육안으로 보이는 이물질의 개수 | pH | 불용성 미립자 (>10 μm) |
불용성 미립자 (>25μm) |
| 5 | 97 | 93 | 92 | 2.8 | 1.3 | ++ | 0 | 5.5 | 1785 | 210 |
| 6 | 97 | 93 | 92 | 2.9 | 1.6 | ++ | 0 | 5.5 | 1649 | 191 |
| 7 | 97 | 93 | 92 | 2.5 | 1.9 | ++ | 1 | 5.5 | 989 | 189 |
| 8 | 97 | 97 | 97 | 3.5 | 1.8 | ++ | 1 | 5.5 | 1029 | 164 |
| 9 | 97 | 97 | 97 | 3.8 | 1.6 | ++ | 0 | 5.5 | 1258 | 212 |
표 9. 4℃에서 12개월 동안 보관한 후에 안정성 조사의 결과
| 제제 번호 | 비-환원성 SDS-PAGE (%) |
환원성 SDS-PAGE (%) |
역상 HPLC (%) |
활성 (Х105 U/mg) |
수분 함량 (%) |
외관 | 육안으로 보이는 이물질의 개수 | pH | 불용성 미립자 (>10 μm) |
불용성 미립자 (>25μm) |
| 5 | 97 | 92 | 93 | 2.1 | 1.8 | ++ | 0 | 5.5 | 1398 | 206 |
| 6 | 97 | 92 | 93 | 1.9 | 1.6 | ++ | 0 | 5.5 | 1933 | 196 |
| 7 | 97 | 92 | 93 | 2.6 | 1.8 | ++ | 0 | 5.5 | 1578 | 156 |
| 8 | 97 | 97 | 97 | 3.6 | 1.3 | ++ | 1 | 5.5 | 1765 | 168 |
| 9 | 97 | 97 | 97 | 4.1 | 1.6 | ++ | 1 | 5.5 | 1947 | 239 |
위의 실험 데이터에 기초하면, 한편으로는 비-환원당 및 아미노산과 같은 물질 분류에서 특정 보조제의 선택이 최종 제제에 예측할 수 없는 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 본 개시 내용의 융합 단백질의 경우, 최종적으로 성분들의 양호한 조합을 얻기 위해서는 다양한 특성을 시험하기 위한 많은 실험이 필요하다. 예를 들면, 실험적 증거에 따르면, 제제 1-13은 모두 히스티딘 히드로클로라이드, 만니톨, 아르기닌 히드로클로라이드, 수크로스를 함유하고 있음에도 불구하고, 이들 성분의 함량 차이로 인해 수분 함량, 육안으로 보이는 이물질, 외관, 불용성 미립자 및 안정성의 최종 검사 결과는 상당히 다양하며, 제제 8과 제제 9만이 상기 시험을 통과하는데 성공하였다. 이와 같이, 약제학적 제제의 보조제 성분의 유형 및 함량의 선택은 매우 중요하며 예측 가능성이 낮다.
한편, 항체의 이질적인 구조, 특히 상보성 결정 영역(CDR) 및 Fc 글리코실화로 인해, 상이한 단일클론 항체 제제의 개발은 경우에 따라 개별적으로 수행될 필요가 있다. 항체 제제의 개발에는, 산화, 이성질체화, 탈아미드화, 응집, 변성 및 단편화와 같은 항체 형태, 콜로이드 또는 화학 구조에 대한 도전이 있다. 위의 정보를 바탕으로, 기존에 시판되고 있는 항체 의약품과 융합 단백질의 제제 성분은 고유의 특성을 가지고 있음을 알 수 있다. 당업자가 항체 약물을 위한 보조제의 선택에 직면할 때, 선행 기술의 제품에서 얻은 명시적 교시는 충분하지 않고, 적절한 제제 프로토콜을 결정하기 위해 여전히 많은 테스트가 필요하다. 풍부하고 장기적인 실험 연구를 바탕으로, 본 개시 내용은 동결 건조 전후에 잘 용해되는 TACI-Fc 융합 단백질 제제에 적합한 조성물을 수득하고, 불용성 미립자 및 육안으로 보이는 이물질이 인간 사용 주사 기준을 충족시키지만, 동결건조 및 보관 과정에서 25℃ 또는 37℃의 고온 조건에서 장기간 놓아도 오랫동안 안정한 상태를 유지한다. 동결건조된 제형은 재용해 후 중합 또는 분해되는 경향이 없고, 우수한 생물학적 활성을 유지하며, 예상치 못한 기술적 효과를 달성했다.
<110> REMEGEN CO., LTD.
<120> PHARMACEUTICAL TACI-FC FUSION PROTEIN FORMULATION
<130> PCT-CN2020-134782
<150> PCT/CN
<151> 2019-12-10
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RC18 amino acid sequence
<400> 1
Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly
1 5 10 15
Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu
20 25 30
Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg
35 40 45
Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly
50 55 60
Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile
65 70 75 80
Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu
85 90 95
Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Asp Lys Thr His Thr Cys
100 105 110
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu
115 120 125
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
130 135 140
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
145 150 155 160
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
165 170 175
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
180 185 190
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
195 200 205
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
210 215 220
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
225 230 235 240
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
245 250 255
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
260 265 270
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
275 280 285
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
290 295 300
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
305 310 315 320
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
Claims (21)
- TACI-Fc 융합 단백질, 비-환원당, 및 아미노산을 포함하고, 상기 비-환원당은 만니톨, 수크로스, 트레할로스 및 이들의 조합으로부터 선택되고; 상기 아미노산은 히스티딘, 알라닌, 아르기닌, 글리신, 글루탐산 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인, TACI-Fc 융합 단백질의 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항에 있어서, 상기 히스티딘은 1-100 mmol/L, 바람직하게는 5-50 mmol/L, 5-20 mmol/L, 8-12 mmol/L, 또는 약 10 mmol/L 농도의 히스티딘 히드로클로라이드이고; 상기 아르기닌은 10-160 mmol/L, 바람직하게는 20-120 mmol/L, 50-100 mmol/L, 70-95 mmol/L, 75-90 mmol/L, 또는 약 90 mmol/L, 또는 약 75 mmol/L 농도의 아르기닌 히드로클로라이드인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 수크로스의 농도는 1-300 mmol/L, 바람직하게는 5-200 mmol/L, 10-100 mmol/L, 35-45 mmol/L, 또는 약 40 mmol/L인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 만니톨의 농도는 10-300 mmol/L, 바람직하게는 10-200 mmol/L, 60-150 mmol/L, 85-125 mmol/L, 90-120 mmol/L, 또는 약 120 mmol/L, 또는 약 90 mmol/L인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TACI-Fc 융합 단백질은 서열번호 1에서 보여지는 아미노산 서열을 갖는 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 5-240 mg/ml, 바람직하게는 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 가장 바람직하게는 약 80 mg/ml 내지 약 100 mg/ml인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제6항에 있어서, 상기 비-환원당은 90-120 mmol/L의 만니톨 및/또는 35-45 mmol/L의 수크로스이고, 상기 아미노산은 75-125 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및/또는 8-12 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, 상기 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 80-100 mg/ml이고; 상기 히스티딘 히드로클로라이드의 농도는 더 바람직하게는 약 10 mmol/L인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 약 1% 내지 약 10% (w/v, g/100 ml)의 TACI-Fc 융합 단백질, 바람직하게는 약 6-10% (w/v , g/100 ml)의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하는 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 비-환원당은 약 90 mmol/L의 만니톨 및 약 40 mmol/L의 수크로스이고, 상기 아미노산은 약 90 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, 상기 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 약 80 mg/ml인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 비-환원당은 약 120 mmol/L의 만니톨 및 약 40 mmol/L의 수크로스이고, 상기 아미노산은 약 75 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드 및 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드이고, 상기 TACI-Fc 융합 단백질의 농도는 약 80 mg/ml인 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제제는 4.0 내지 8.0, 바람직하게는 4.5 내지 7.0, 5.0 내지 6.0, 또는 약 5.5의 pH를 갖는 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성의 액상 약제학적 제제 내의 상기 TACI-Fc 융합 단백질 2종은 Fc 힌지 영역에서 형성된 연결형 이황화 결합을 통해 이중-가닥 구조를 형성하는 것인, 수성의 액상 약제학적 제제.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 수성의 액상 약제학적 제제의 동결건조에 의해 수득된, 동결건조된 약제학적 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 수성의 액상 약제학적 제제는 약 90 mmol/L의 만니톨, 약 40 mmol/L의 수크로스, 약 90 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드, 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드, 및 약 80 mg/ml의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하고, 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는 것인, 동결건조된 약제학적 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 수성의 액상 약제학적 제제는 약 120 mmol/L의 만니톨, 약 40 mmol/L의 수크로스, 약 75 mmol/L의 아르기닌 히드로클로라이드, 약 10 mmol/L의 히스티딘 히드로클로라이드, 및 약 80 mg/ml의 TACI-Fc 융합 단백질을 포함하고, 5.0 내지 6.0의 pH를 갖는 것인, 동결건조된 약제학적 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 수성의 액상 약제학적 제제 중 상기 비-환원당은 각각 약 16.4mg/ml 및 약 13.7 mg/ml 농도의 만니톨 및 수크로스이고; 상기 수성의 액상 약제학적 제제 중 상기 아미노산은 각각 약 19.0 mg/ml 및 약 2.1 mg/ml 농도의 아르기닌 히드로클로라이드 및 히스티딘 히드로클로라이드인 것인, 동결건조된 약제학적 제제.
- 제13항에 있어서, 상기 수성의 액상 약제학적 제제 중 상기 비-환원당은 각각 약 21.9 mg/ml 및 약 13.7 mg/ml 농도의 만니톨 및 수크로스이고; 상기 수성의 액상 약제학적 제제 중 상기 아미노산은 각각 약 15.8 mg/ml 및 약 2.1 mg/ml 농도의 아르기닌 히드로클로라이드 및 히스티딘 히드로클로라이드인 것인, 동결건조된 약제학적 제제.
- 자가면역 질환의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 제제의 용도로서, 상기 자가면역 질환은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염, 시신경척수염 스펙트럼 장애(NMOSD), 다발성 경화증(MS) 및 쇼그렌 증후군을 포함하는 것인, 용도.
- 제18항에 있어서, 상기 시신경 척수염 스펙트럼 장애는 시신경 척수염, 재발성 시신경염, 종방향으로 확장된 횡방향 척수염, 다발성 경화증의 시신경학적 형태, 장-기간 횡방향 척수염, 일측 또는 양측 시신경염, 자가면역 질환을 동반하는 시신경염 또는 척수염, 유증상 또는 무증상의 두개내 병변을 동반하는 시신경염 또는 척수염을 포함하는 것인, 용도.
- 림프종의 치료를 위한 의약의 제조에서 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 제제의 용도로서, 상기 림프종은 만성 림프구성 백혈병, 다발성 골수종, 및 B 림프구 림프종을 포함하는 것인, 용도.
- (1) 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 제제를 제조하고; 및
(2) 상기 제제에서 TACI-Fc 융합 단백질의 안정성을 평가하는 것을 포함하는 것인, TACI-Fc 융합 단백질 약제학적 제제의 제조 방법.
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