JP7303238B2 - 荷電栄養タンパク質および方法 - Google Patents

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Description

関連出願の参照
本出願は、２０１２年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６１／６１５，８１６
号に対する優先権を主張するものであり、参照により、その全体が本明細書に組み込まれ
る。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含み、参照に
より、その全体が本明細書に組み込まれる。２０１３年３月１２日に作成された上記ＡＳ
ＣＩＩコピーは、１００５．００４－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、１，１９
４，６６６バイトのサイズである。
序文
食事性タンパク質は、ヒトの健康および成長のための必須栄養素である。世界保健機関
は、エネルギーバランスがとれている場合および体重が安定している場合、食事性タンパ
ク質は、エネルギー摂取量の約１０～１５％に寄与するべきであると推奨している。様々
な国々におけるタンパク質の１日平均摂取量は、これらの推奨が世界中で消費されている
タンパク質の量と一致することを示唆している。エネルギーバランスがとれた状態で摂取
される場合、タンパク質からのエネルギーの平均２０～３０％を含む食事が、高タンパク
食の代表的なものである。
体は、健康および成長に必要な特定のアミノ酸を合成することができないため、代わり
に食物からそれらを得なければならない。「必須アミノ酸」と称されるこれらのアミノ酸
は、ヒスチジン（Ｈ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、メチオニ
ン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、スレオニン（Ｔ）、トリプトファン（Ｗ）、および
バリン（Ｖ）である。すべての必須アミノ酸を提供する食事性タンパク質は、「高品質タ
ンパク質」と称される。肉、魚、鶏肉、卵、および乳製品等の動物性食品は、一般的に、
良好な必須アミノ酸のバランスを提供する高品質タンパク質源であると考えられている。
カゼイン（哺乳類の乳に一般的に見出されるタンパク質であり、牛乳中のタンパク質の８
０％を占める）および乳清（乳を凝固させて濾した後に残る液体のタンパク質）は、高品
質の食事性タンパク質の主な源である。良好な必須アミノ酸のバランスを提供しない食物
は、「低品質タンパク質」と称される。ほとんどの果物および野菜は、タンパク質の源と
して十分ではない。マメ、エンドウ、レンズマメ、ナッツ類、および穀物（コムギ等）を
含むいくつかの植物性食品は、より良好なタンパク質源である。大豆から製造される植物
性タンパク質であるソイを高品質タンパク質であるとする見解もある。
ヒトにおける大量のタンパク質摂取の急性効果に関する研究により、食事にタンパク質
を取り入れること、また場合によってはタンパク質含有量を増加させることが、有益な効
果を及ぼし得ることが示されている。例えば、研究により、タンパク質の経口摂取が、ヒ
ト対象において、食後の満腹感（空腹感を抑制することによることを含む）を誘導し、熱
発生を誘導し、血糖反応を低減し得ることが示されている。
体重減少のための高タンパク質食に関する研究により、タンパク質が、エネルギー消費
量および除脂肪体重に好影響を及ぼすことが示されている。さらなる研究により、タンパ
ク質からのエネルギーの少なくとも５％を含有する食事において、過食による体重増加は
著しく少なく、高タンパク質食がエネルギー摂取量を減少させることが示されている。
臨床試験は、タンパク質が加齢または床上安静による筋力低下を防止するという証拠を
提供している。具体的には、研究により、タンパク質の補給が、長期床上安静中の筋タン
パク質合成速度（ＦＳＲ）を増加させ、長期床上安静中に脚質量および強度を維持し、除
脂肪体重を増加させ、歩行およびバランスの機能測定値を改善すること、ならびに不動お
よび長期床上安静のためにサルコペニアのリスクがある個体に対する実行可能な治療介入
としての役割を果たし得ることが示されている。
運動選手における筋肉タンパク同化作用の増加に関する研究は、運動後に供給されるタ
ンパク質が、運動単独で達成されるより大きな程度まで筋肥大を促進することを示してい
る。また、運動後に供給されるタンパク質が、タンパク質分解を一切増加させることなく
タンパク質合成を支持し、正味の正のタンパク質バランスおよび筋肉量増加をもたらすこ
とも示されている。筋肉のタンパク質合成は、必須アミノ酸の補給に対して用量反応様式
で反応するが、すべてのタンパク質が筋肉増強において等しいわけではない。例えば、乳
タンパク質は、レジスタンストレーニングによる筋肉量増加を支持する上でソイよりも優
れていると考えられるが、どちらも炭水化物単独よりも優れている。アミノ酸ロイシンは
、筋肉のタンパク質合成を刺激する上で重要な因子である。
食物中に一般に見出される全タンパク質は、ヒト等の哺乳動物のアミノ酸要求量を満た
すアミノ酸組成物を必ずしも効果的に提供するとは限らない。その結果として、各必須ア
ミノ酸の最低要求量を得るために、食事性タンパク質の質がより高い場合に必要とされる
であろうよりも多くの総タンパク質量が食事中に摂取されなければならない。食事中のタ
ンパク質の質を向上させることによって、より質の低いタンパク質を含む食事と比較して
摂取されなければならない総タンパク質量を減少させることが可能である。
一般に、より高いタンパク質の質を有するタンパク質は、それを有しない他のタンパク
質よりも哺乳動物の食事においてより有益であると考えられる。そのようなタンパク質は
、例えば、哺乳動物の食事の構成要素として有用である。特定の状況下において、そのよ
うなタンパク質は、とりわけ、筋肉量、健全なボディマス指数、および血糖バランスの維
持を促進する。したがって、高いタンパク質の質を有するタンパク質源の必要性が存在す
る。
従来、必須アミノ酸を含む混合物等の望ましいアミノ酸の混合物は、乳清タンパク質等
の比較的高いレベルの必須アミノ酸を用いてタンパク質を加水分解することにより、およ
び／または乳清等の加水分解されたタンパク質も任意選択的に含む混合物中に遊離アミノ
酸を合わせることにより提供されてきた。この種類の混合物は、苦みを有する場合があり
、特定の使用には不適切または望ましくないと見なされるかもしれない。その結果として
、そのような混合物は、遊離アミノ酸および／または加水分解されたタンパク質の味を隠
すための香味剤を含むことがある。場合によっては、ポリペプチドまたはタンパク質によ
ってある割合のアミノ酸含有量が提供される組成物が、遊離アミノ酸および／または特定
の加水分解されたタンパク質として提供される高い割合の全アミノ酸を有する組成物より
も美味であることがある。しかしながら、従来、栄養製剤は、牛乳から単離された乳清、
または大豆から単離された大豆タンパク質等の自然食品から単離されたタンパク質から作
製されてきたため、そのような組成物の利用可能性は限定されていた。これらのタンパク
質のアミノ酸プロファイルは、必ずしも哺乳動物のアミノ酸要求量を満たすとは限らない
。加えて、汎用タンパク質は、典型的には、タンパク質組成の異なり得るタンパク質およ
び／またはタンパク質加水分解物の混合物から構成されるため、それらの栄養価に関する
予測不可能性の原因となる。さらに、そのような高品質タンパク質源の数が限られている
ということは、タンパク質の形態での大規模な経口摂取には特定のアミノ酸の組み合わせ
のみが利用可能であることを意味していた。
カゼインおよび乳清、卵、ならびに肉等の高品質動物タンパク質源だけでなく、ソイ等
の植物性タンパク質を供給するために必要とされる農法も、著しいエネルギー入力を必要
とし、潜在的に有害な環境影響を有する。したがって、特定の状況において、哺乳類によ
る摂取のためにタンパク質を供給する代替の源および方法を有することが有用であるかも
しれない。
理論上は、実験室環境において、所望のアミノ酸混合物を含む合成ポリペプチド配列を
設計し、生成することが可能である。しかしながら、このアプローチは、種々の懸念を引
き起こす可能性があり、それゆえに、必ずしも適用可能とは限らない。第１に、当業者は
、そのような合成配列の高レベルの生成は、非常に困難であり得るということを認識して
いる。第２に、たとえそのような合成タンパク質が合成されたとしても、栄養製品に使用
するためのその適合性は不確実であろう。例えば、そのような天然に存在しないポリペプ
チドは、アレルゲンまたは毒素であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、
本開示は、天然のタンパク質もしくはポリペプチド配列、またはそれらの改変体を提供す
る。
栄養タンパク質の有用性を高めることができる１つの特徴は、その溶解性である。溶解
性の高い栄養タンパク質は、安定性の増加、抗凝集性、および望ましい味覚プロファイル
等の望ましい特徴を呈することができる。例えば、高い溶解性を示す栄養タンパク質は、
比較的少ない体積の溶液中に高濃度の栄養タンパク質を含む飲料または液体製剤に製剤化
することができるため、単位体積当たり大量のタンパク栄養を送達する。可溶性栄養タン
パク質は、ユーザ（例えば、運動選手）が身体的活動の前、最中、または後に栄養タンパ
ク質を経口摂取したいと所望する場合、スポーツ飲料または回復飲料において有用であり
得る。高い溶解性を示す栄養タンパク質はまた、対象（例えば、患者または高齢者）がタ
ンパク栄養を必要としているが、固形食または大量の液体を摂取することができない臨床
設定において特に有用であり得る。
本開示は、生成について従来の農業だけに依存しない、アミノ酸の有用な組み合わせか
らなるタンパク質を提供する。例えば、本発明者は、全アミノ酸に対する分枝鎖アミノ酸
の割合、全アミノ酸に対するアミノ酸ロイシンの割合、および全アミノ酸に対する必須ア
ミノ酸の割合のうちの少なくとも１つの有用なレベルを含有するアミノ酸の組み合わせか
らなる天然に存在するポリペプチド配列を発見し、本開示において提供する。本開示はま
た、ポリペプチド配列を含む栄養タンパク質も提供する。いくつかの実施形態において、
栄養タンパク質は、少なくとも２４％の全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割
合、少なくとも１１％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、および少なくとも４
９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合のうちの少なくとも１つを含む。
本開示はまた、とりわけ、タンパク質をコードする核酸、タンパク質を産生する組換え
微生物、組換え微生物を使用してタンパク質を作製する方法、タンパク質を含む組成物、
およびタンパク質を使用する方法を提供する。
第１の態様において、本開示は、第１のポリペプチド配列を含む単離された栄養タンパ
ク質を提供し、第１のポリペプチド配列は、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解
性を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、ｐＨ７で少なく
とも５０ｇ／Ｌの水溶解性を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド
配列は、ｐＨ７で少なくとも１００ｇ／Ｌの水溶解性を有する。いくつかの実施形態にお
いて、第１のポリペプチド配列は、ａ．少なくとも８％の全アミノ酸残基に対する分岐鎖
アミノ酸残基の割合、ｂ．少なくとも４％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、
およびｃ．少なくとも１９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合を含む。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、各必須アミノ酸のうちの少な
くとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、ａ
．少なくとも２４％の全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基の割合、ｂ．少なくと
も１１％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、およびｃ．少なくとも４９％の全
アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合のうちの少なくとも１つを含む。いくつか
の実施形態において、第１のポリペプチド配列は、天然に存在する栄養タンパク質の少な
くとも５０個のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有する。いくつかの実施形
態において、第１のポリペプチド配列は、天然に存在する栄養タンパク質の少なくとも５
０個のアミノ酸に対して少なくとも９５％の相同性を有する。いくつかの実施形態におい
て、第１のポリペプチド配列は、天然に存在する栄養タンパク質に対して少なくとも７０
％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、天然に
存在する栄養タンパク質に対して少なくとも９５％の相同性を有する。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、天然に存在する栄養タンパ
ク質からなる。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、天然に存在す
る栄養タンパク質ではない。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、アレルゲンではない。いく
つかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、既知のアレルゲンに対して５０％
未満の全体的相同性(global homology)を有する。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、毒素ではない。いくつかの
実施形態において、第１のポリペプチド配列は、既知の毒素に対して５０％未満の全体的
相同性を有する。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、６０分未満の模擬胃内消化
半減期(simulated gastric digestion half-life)を有する。いくつかの実施形態におい
て、第１のポリペプチド配列は、３０分未満の模擬胃内消化半減期を有する。いくつかの
実施形態において、第１のポリペプチド配列は、１０分未満の模擬胃内消化半減期を有す
る。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、模擬胃液中で完全に消化
される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、ペプシン認識部位、
トリプシン認識部位、およびキモトリプシン認識部位から選択される少なくとも１つのプ
ロテアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、
システイン残基を含まない。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、
ジスルフィド結合を含まない。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は
、Ｎ結合型グリコシル化を含まない。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド
配列は、Ｏ結合型グリコシル化を含まない。
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、凝集に耐性を示す。いくつ
かの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、ｐＨ７でアニオン性である。いくつ
かの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、－２０以下の計算上の溶媒和スコア
を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、－３０以下の計算
上の溶媒和スコアを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は、
０．７５以下の計算上の凝集スコアを有する。いくつかの実施形態において、第１のポリ
ペプチド配列は、０．５以下の計算上の凝集スコアを有する。いくつかの実施形態におい
て、第１のポリペプチド配列は、０．３以下の計算上の凝集スコアを有する。いくつかの
実施形態において、第１のポリペプチド配列は、ｉ．配列番号１～配列番号４９０から選
択されるアミノ酸配列、ｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配列
の修飾された誘導体、およびｉｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ
酸配列のムテインから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第
１のポリペプチド配列ｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配列、ｉ
ｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配列の修飾された誘導体、およ
びｉｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配列のムテインから選択
されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド配列は
、配列番号１～配列番号４９０から選択される少なくとも１つの基準アミノ酸配列と、少
なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、
８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、
９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％相同である。
別の態様において、本開示は、第１のポリペプチド配列を含む単離された栄養タンパク
質を提供し、単離された栄養タンパク質は、ｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解
性を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、ｐＨ７で少な
くとも５０ｇ／Ｌの水溶解性を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タ
ンパク質は、ｐＨ７で少なくとも１００ｇ／Ｌの水溶解性を有する。いくつかの実施形態
において、単離された栄養タンパク質は、ａ．少なくとも８％の全アミノ酸残基に対する
分岐鎖アミノ酸残基の割合、ｂ．少なくとも４％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の
割合、およびｃ．少なくとも１９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合を
含む。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、各必須アミノ酸のう
ちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態に
おいて、単離された栄養タンパク質は、ａ．少なくとも２４％の全アミノ酸残基に対する
分岐鎖アミノ酸残基の割合、ｂ．少なくとも１１％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基
の割合、およびｃ．少なくとも４９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合
のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク
質は、天然に存在する栄養タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸に対して少なくとも
７０％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、
天然に存在する栄養タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸に対して少なくとも９５％
の相同性を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、天然に
存在する栄養タンパク質に対して少なくとも７０％の相同性を有する。いくつかの実施形
態において、単離された栄養タンパク質は、天然に存在する栄養タンパク質に対して少な
くとも９５％の相同性を有する。
いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、天然に存在する栄養タン
パク質からなる。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、天然に存
在する栄養タンパク質ではない。
いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、アレルゲンではない。い
くつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、既知のアレルゲンに対して５
０％未満の全体的相同性を有する。
いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、毒素ではない。いくつか
の実施形態において、単離された栄養タンパク質は、既知の毒素に対して５０％未満の全
体的相同性を有する。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、６０分未満の模擬胃内消化半減期を
有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、３０分未満の模擬胃内消化半
減期を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、１０分未満
の模擬胃内消化半減期を有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク
質は、模擬胃液中で完全に消化される。いくつかの実施形態において、単離された栄養タ
ンパク質は、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、およびキモトリプシン認識部位か
ら選択される少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。いくつかの実施形態におい
て、単離された栄養タンパク質は、システイン残基を含まない。いくつかの実施形態にお
いて、単離された栄養タンパク質は、ジスルフィド結合を含まない。いくつかの実施形態
において、単離された栄養タンパク質は、Ｎ結合型グリコシル化を含まない。いくつかの
実施形態において、単離された栄養タンパク質は、Ｏ結合型グリコシル化を含まない。
いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、凝集に耐性を示す。いく
つかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、ｐＨ７でアニオン性である。い
くつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、－２０以下の計算上の溶媒和
スコアを有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、－３０以
下の計算上の溶媒和スコアを有する。いくつかの実施形態において、単離された栄養タン
パク質は、０．７５以下の計算上の凝集スコアを有する。いくつかの実施形態において、
単離された栄養タンパク質は、０．５以下の計算上の凝集スコアを有する。いくつかの実
施形態において、単離された栄養タンパク質は、０．３以下の計算上の凝集スコアを有す
る。
いくつかの実施形態において、単離された栄養タンパク質は、ｉ．配列番号１～配列番
号４９０から選択されるアミノ酸配列、ｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択され
るアミノ酸配列の修飾された誘導体、およびｉｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選
択されるアミノ酸配列のムテインから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形
態において、単離された栄養タンパク質は、ｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択さ
れるアミノ酸配列、ｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配列の修
飾された誘導体、およびｉｉｉ．配列番号１～配列番号４９０から選択されるアミノ酸配
列のムテインから選択されるアミノ酸配列からなる。いくつかの実施形態において、単離
された栄養タンパク質は、配列番号１～配列番号４９０から選択される少なくとも１つの
基準アミノ酸配列と、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７
０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９
２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％相
同である。
いくつかの実施形態において、本開示の単離された栄養タンパク質は、親和性精製のた
めのポリペプチドタグをさらに含む。いくつかの実施形態において、親和性精製のための
タグは、ポリヒスチジンタグである。
別の態様において、本開示は、本開示の栄養タンパク質をコードする核酸配列を含む単
離された核酸を提供する。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、ゲノムＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、センスＲＮＡ、およびアンチセンスＲＮＡから選択される。いくつかの実
施形態において、単離された核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態において
、単離された核酸は、ｃＤＮＡである。いくつかの実施形態において、単離された核酸は
、栄養タンパク質をコードする核酸配列と作動可能に連結された発現制御配列をさらに含
む。いくつかの実施形態において、ベクターが提供される。
別の態様において、本開示は、開示の栄養タンパク質をコードする核酸配列を含むベク
ターを提供する。いくつかの実施形態において、ベクターは、栄養タンパク質をコードす
る核酸配列と作動可能に連結された発現制御配列をさらに含む。
別の態様において、本開示は、本開示の核酸および本開示のベクターのうちの少なくと
も１つを含む組換え微生物を提供する。いくつかの実施形態において、組換え微生物は、
原核生物である。いくつかの実施形態において、原核生物は、従属栄養性である。いくつ
かの実施形態において、原核生物は、独立栄養性である。いくつかの実施形態において、
原核生物は、細菌である。
別の態様において、本開示は、本開示の栄養タンパク質を作製する方法を提供し、該方
法は、組換え微生物による栄養タンパク質の生成に十分な条件下で本開示の組換え微生物
を培養することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、培養物から栄養タンパク
質を単離することをさらに含む。
別の態様において、本開示は、本開示の単離された栄養タンパク質と、少なくとも１つ
の第２の構成成分とを含む栄養組成物を提供する。いくつかの実施形態において、少なく
とも１つの第２の構成成分は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭
水化物、脂質、ミネラルまたはミネラル源、ビタミン、栄養補助食品、生物、医薬品、お
よび賦形剤から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２の構成
成分は、タンパク質である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２の構成
成分は、栄養タンパク質である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２の
構成成分は、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、分枝鎖アミノ酸、非標準アミノ酸、および
修飾アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態において、少なく
とも１つの第２の構成成分は、必須アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である。いくつ
かの実施形態において、少なくとも１つの第２の構成成分は、分枝鎖アミノ酸から選択さ
れる遊離アミノ酸である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２の構成成
分は、Ｌｅｕである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの第２の構成成分は
、脂質である。いくつかの実施形態において、脂質は、脂肪、油、トリグリセリド、コレ
ステロール、リン脂質、および脂肪酸から選択される。いくつかの実施形態において、少
なくとも１つの第２の構成成分は、ミネラルおよびビタミンから選択される。いくつかの
実施形態において、少なくとも１つの第２の構成成分は、栄養補助食品である。いくつか
の実施形態において、少なくとも１つの第２の構成成分は、生物である。いくつかの実施
形態において、少なくとも１つの第２の構成成分は、医薬品である。いくつかの実施形態
において、少なくとも１つの第２の構成成分は、賦形剤である。いくつかの実施形態にお
いて、少なくとも１つの賦形剤は、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、
分散促進剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤から選択される。いくつかの実施形態にお
いて、栄養組成物は、液体溶液、スラリー、懸濁液、ゲル、ペースト、粉末、または固体
として製剤化される。
別の態様において、本開示は、本開示の栄養タンパク質を提供することと、栄養タンパ
ク質と少なくとも１つの第２の構成成分とを組み合わせることとを含む、本開示の栄養組
成物を作製する方法を提供する。
別の態様において、本開示は、対象において筋肉量、筋力、および機能的能力のうちの
少なくとも１つを維持するかまたは増加させる方法を提供し、該方法は、対象に、十分な
量の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製さ
れる栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、高齢者、
医学的に重症である、およびタンパク質エネルギー栄養障害に罹患している、のうちの少
なくとも１つである。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の
栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、運動の遂行(perform
ance)に合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施形態において、対象は肥満で
ある。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、ま
たは本開示の方法によって作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対
象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、対象において望ましいボディマス指数を維持するかまた
は達成する方法を提供し、該方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本開
示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物を提供することを含
む。いくつかの実施形態において、対象は、高齢者、医学的に重症である、およびタンパ
ク質エネルギー栄養障害に罹患している、のうちの少なくとも１つである。いくつかの実
施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法に
よって作製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつ
かの実施形態において、対象は肥満である。いくつかの実施形態において、本開示の栄養
タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は
、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、タンパク質エネルギー栄養障害を有する対象にタンパク
質を提供する方法を提供し、該方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本
開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物を提供することを
含む。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、ま
たは本開示の方法によって作製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって
摂取される。いくつかの実施形態において、対象は肥満である。いくつかの実施形態にお
いて、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製
される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、対象において熱発生を増加させる方法を提供し、該方法
は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の
方法によって作製される栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態において
、対象は肥満である。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の
栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせ
て対象によって摂取される。いくつかの実施形態において、対象は肥満である。いくつか
の実施形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方
法によって作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取
される。
別の態様において、本開示は、対象において心的飽和反応および満腹反応のうちの少な
くとも１つを誘導する方法を提供し、該方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパ
ク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物を提供す
ることを含む。いくつかの実施形態において、対象は肥満である。いくつかの実施形態に
おいて、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作
製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施
形態において、対象は肥満である。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク
質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、経口、
経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、対象において悪液質、サルコペニア、および虚弱のうち
の少なくとも１つを治療する方法を提供し、該方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養
タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物を
提供することを含む。いくつかの実施形態において、対象は肥満である。いくつかの実施
形態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によ
って作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される
。
溶媒和スコア（Ｙ軸）と凝集スコア（Ｘ軸）の関数として大腸菌発現スクリーンにおいて発現されたタンパク質の相対的確率（対数スケールで）を示す２次元ヒストグラムを示す。 溶媒和スコア（Ｙ軸）と凝集スコア（Ｘ軸）の関数として大腸菌発現スクリーンにおいて可溶性に発現されたタンパク質の相対的確率（対数スケールで）を示す２次元ヒストグラムを示す。
本明細書において別途定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および
技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈
上別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形の用語を含むものとし、複数形の用語
は単数形の用語を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される生化学、酵素学、分
子生物学および細胞生物学、微生物学、遺伝子学、ならびにタンパク質および核酸化学、
そしてハイブリダイゼーションに関して使用される命名法、およびそれらの技術は、当該
技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。本明細書に引用される特
定の参考文献および他の文書は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。さらに、
本明細書に引用されるすべてのＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔの記録は、参照によ
り本明細書に組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書が優先する。材料
、方法、および例は、例示に過ぎず、限定的であることは意図されない。
本開示の方法および技術は、別途指示されない限り、当該技術分野において周知の従来
の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され、論じられる種々の一般的なおよ
びより具体的な参考文献に記載されるように、一般的に行われる。例えば、Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，３ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１）
、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）、Ｔａｙｌｏｒ
ａｎｄ Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（２００３）、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ
Ｅｎｚｙｍｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ
ｒｐ．，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，Ｎ．Ｊ．、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ Ｉ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９
７６）、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｅｃｔｉｏｎ Ａ Ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ ＩＩ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９７６）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ
ｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）を参照のこと。シアノバクテリアに適用可能な
多くの分子生物学および遺伝学的技術は、Ｈｅｉｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈ
ｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎ
ｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９７，Ｃｈ．２４（２０１１）に記載され、
参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、インターネット上で公開されている特定のタンパク質および遺伝子配列に関
する配列データベースエントリ（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔの記録）
、ならびにインターネット上の他の情報を参照する。当業者は、配列データベースエント
リを含むインターネット上の情報は時々更新されるため、例えば、特定の配列を指すため
に使用される参照番号が変更になる場合があることを理解する。配列情報の公開データベ
ースまたは他のインターネット上の情報に対して言及がなされる場合、そのような変更が
起こる可能性があり、インターネット上の情報の特定の実施形態は変化しやすいことを理
解されたい。当業者は、インターネット上で検索を行うことにより同等の情報を見つける
ことができるため、インターネットのウェブページアドレスまたは配列データベースエン
トリに対する言及は、該当する情報の利用可能性および公的普及を裏付ける。
本発明のタンパク質、組成物、方法、および他の実施形態を開示および説明する前に、
本明細書において使用される専門用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず
、限定的であることを意図するものではないことを理解されたい。本明細書および付属の
特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は
、文脈上、別途明確に指示されない限り、複数形の指示対象を含むことに留意されなけれ
ばならない。
本明細書において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎ
ｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的また
は非制限的であり、付加的な記載されていないメンバー、要素、または方法ステップを除
外しない。
本開示は、アミノ酸について言及する。アミノ酸の完全名称は、標準的３文字コードお
よび１文字略語と交換可能に使用される。不確かさを回避するために、それらは、アラニ
ン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラ
ギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グル
タミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイ
シン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍ
ｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅ
ｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙ
ｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）である。
本明細書において使用される場合、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物
、または微生物）の中ではなく、人工環境において、例えば、試験管もしくは反応容器中
、細胞培養中、ペトリ皿中等で起こる事象を指す。
本明細書において使用される場合、用語「ｉｎ ｖｉｖｏ」は、生物（例えば、動物、
植物、または微生物）の中で起こる事象を指す。
本明細書において使用される場合、用語「単離された」は、（１）最初に生成された時
にそれが会合していた構成成分の少なくともいくつかから分離された（天然において、も
しくは実験環境においてのいずれか）、および／または（２）人間の手によって生成、調
製、および／もしくは製造された物質または実体を指す。単離された物質および／または
実体は、それらが最初に会合していた他の構成成分の少なくとも約１０％、約２０％、約
３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、またはそれ以
上から分離されてもよい。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％超
、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５
％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、または約９９％超純粋である
。本明細書において使用される場合、物質が実質的に他の構成成分を含まない場合、それ
は「純粋」である。
本明細書において使用される場合、「分枝鎖アミノ酸」は、ロイシン、イソロイシン、
およびバリンから選択されるアミノ酸である。
本明細書において使用される場合、「必須アミノ酸」は、ヒスチジン、イソロイシン、
ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、およ
びバリンから選択されるアミノ酸である。
本明細書において使用される用語「ペプチド」は、例えば、典型的には約５０個未満の
アミノ酸、より典型的には、約３０個未満のアミノ酸を含有する、短いポリペプチドを指
す。該用語は、本明細書において使用される場合、構造機能、ひいては生物学的機能を模
倣する類似体および模倣体を包含する。
用語「ポリペプチド」は、天然に存在するタンパク質および天然に存在しないタンパク
質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体および類似体を包含する。ポリペプチドは
、単量体または重合体であり得る。さらに、ポリペプチドは、多数の異なるドメインを含
んでもよく、それらの各々は、１つ以上のはっきりと異なる活性を有する。不確かさを回
避するために、「ポリペプチド」は、２アミノ酸長よりも長い任意の長さであってもよい
。
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または
誘導源に基づいて、（１）その天然の状態でそれに付随する自然に結合した成分に結合し
ていない、（２）天然では見られない純度（純度は他の細胞物質の存在に関して判断され
得る）で存在する（例えば、同種の他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種の細胞
によって発現される、または（４）天然に存在しない（例えば、それは天然に見出される
ポリペプチドの断片であるか、あるいは天然に見出されないアミノ酸類似体もしくは誘導
体、または標準的なペプチド結合以外の結合を含む）タンパク質またはポリペプチドであ
る。よって、化学合成された、または天然でそれが由来する細胞とは異なる細胞系で合成
されたポリペプチドは、その天然で結合する構成成分から「単離」されている。また、ポ
リペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単
離により、天然で結合する成分を実質的に含まないようにすることも可能である。そのよ
うに定義される場合、「単離された」は、そのように記載されているタンパク質、ポリペ
プチド、ペプチド、またはオリゴペプチドが、合成された細胞から物理的に取り出されて
いることを必ずしも必要としない。
本明細書において使用される用語「ポリペプチド断片」は、天然に存在するタンパク質
等の完全長ポリペプチドと比較した場合に、欠失、例えば、アミノ末端および／またはカ
ルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。一実施形態において、ポリペプチド断
片は、該断片のアミノ酸配列が、天然に存在する配列における対応する位置と同一である
、連続した配列である。断片は、典型的には、少なくとも５、６、７、８、９、もしくは
１０アミノ酸長、少なくとも１２、１４、１６、もしくは１８アミノ酸長、または少なく
とも２０アミノ酸長、または少なくとも２５、３０、３５、４０、もしくは４５アミノ酸
長、または少なくとも５０もしくは６０アミノ酸長、または少なくとも７０アミノ酸長、
または少なくとも１００アミノ酸長である。
用語「融合タンパク質」は、異種アミノ酸配列に連結したポリペプチドまたは断片を含
むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質に由来し得る２
つ以上の所望の機能要素を含有するように構築することができるため、有用である。融合
タンパク質は、該当するポリペプチドからの少なくとも１０個の連続するアミノ酸、また
は少なくとも２０もしくは３０個のアミノ酸、または少なくとも４０、５０、もしくは６
０個のアミノ酸、または少なくとも７５、１００、もしくは１２５個のアミノ酸を含む。
融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチドは、通常、少なくとも６アミノ酸長、または
少なくとも８アミノ酸長、または少なくとも１５、２０、もしくは２５アミノ酸長である
。ＩｇＧ Ｆｃ領域等のより大きなポリペプチドを含む融合体、およびさらには緑色蛍光
タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質等の全タンパク質を含む融合体は、特定
の有用性を有する。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核
酸配列とインフレームでポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次
いで融合タンパク質を発現させることにより、組換えによって生成することができる。代
替として、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質と架橋させ
ることによって化学的に生成することもできる。
本明細書において使用される場合、あるタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタ
ンパク質をコードする核酸配列に類似した配列を有する場合、該タンパク質は、第２のタ
ンパク質に対して「相同性」を有するか、または「相同」である。代替として、２つのタ
ンパク質が類似したアミノ酸配列を有する場合、該タンパク質は第２のタンパク質に対し
て相同性を有する。（よって、用語「相同なタンパク質」は、２つのタンパク質が類似し
たアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。本明細書において使用される場
合、アミノ酸配列の２つの領域間の相同性（特に、予測される構造上の類似性に関する）
は、機能における類似性を暗示するものであると解釈される。
「相同」が、タンパク質またはペプチドに関して使用される場合、同一ではない残基の
位置は、しばしば、保存的なアミノ酸置換によって異なることを認識されたい。「保存的
なアミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似した化学特性（例えば、電荷または疎水
性）を有する側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されるものである。一
般に、保存的なアミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変化させない。２つ以
上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、配列同一性パーセントまたは
相同性の程度は、置換の保存的な性質によって補正するように上方調整されてもよい。こ
の調整を行うための手段は、当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７－３１ ａｎｄ ２５：３６５－８９
を参照のこと。
以下の６つの群は、それぞれ、互いに保存的な置換であるアミノ酸を含有する：１）セ
リン、スレオニン；２）アスパラギン酸、グルタミン酸；３）アスパラギン、グルタミン
；４）アルギニン、リジン；５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリ
ン；および６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
配列同一性パーセントとも称されるポリペプチドの配列相同性は、典型的には、配列分
析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ（９１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５）の配列分析ソフトウェアパッ
ケージＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）のを参照のこと。タ
ンパク質分析ソフトウェアは、保存的なアミノ酸置換を含む種々の置換、欠失、およびこ
の他の修飾に割り当てられた相同性の尺度を使用して、類似する配列をマッチングさせる
。例えば、ＧＣＧは、「Ｇａｐ」および「Ｂｅｓｔｆｉｔ」等のプログラムを含有し、こ
れらは、異なる生物種に由来する相同ポリペプチド等の密接に関連するポリペプチド間、
または野生型タンパク質とそのムテインとの間の、配列相同性または配列同一性を決定す
るためのデフォルトパラメータを用いて使用することができる。例えば、ＧＣＧ Ｖｅｒ
ｓｉｏｎ ６．１を参照のこと。
特定のポリペプチド配列を、異なる生物に由来する多数の配列を含有するデータベース
と比較する場合の例示的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔ
ｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０（１９９０
）、Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２
（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３
１－１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅ
ｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐま
たはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））を使用して比較することができる。
ＢＬＡＳＴｐのための例示的なパラメータは次の通りである：期待値：１０（デフォル
ト）、フィルタ：ｓｅｇ（デフォルト）、ギャップ開始コスト：１１（デフォルト）、ギ
ャップ伸長コスト：１（デフォルト）、最大アラインメント：１００（デフォルト）、ワ
ードサイズ：１１（デフォルト）、表示数：１００（デフォルト）、ペナルティマトリッ
クス：ＢＬＯＷＳＵＭ６２。相同性のために比較されるポリペプチド配列の長さは、一般
的に、少なくとも約１６アミノ酸残基、または少なくとも約２０残基、または少なくとも
約２４残基、または少なくとも約２８残基、または約３５残基超である。多数の異なる生
物からの配列を含有するデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが有
用であるかもしれない。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、当該技術分野にお
いて既知であるｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって測定することができる。例えば
、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１の中のプログラムであるＦＡＳ
ＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列と間の最
適なオーバーラップ領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅ
ａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３－９８（１９９０）。例え
ば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれるＧＣ
Ｇ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１の中に提供されるように、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラ
メータ（ワードサイズ２、およびＰＡＭスコアリングマトリックス２５０）で使用して決
定することができる。
いくつかの実施形態において、高分子（例えば、ポリペプチド配列または核酸配列）は
、それらの配列が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくと
も４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％
、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なく
とも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一である
場合に、互いに「相同」であると見なされる。いくつかの実施形態において、高分子は、
それらの配列が、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも
４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、
少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくと
も８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％類似する場合
に、互いに「相同」であると見なされる。用語「相同の」は、少なくとも２つの配列（ヌ
クレオチド配列またはアミノ酸配列）間の比較を必然的に指す。いくつかの実施形態にお
いて、２つのヌクレオチド配列は、それらがコードするポリペプチドが、少なくとも約２
０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチと、少なくとも約５０％同一、少なくとも
約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、または少なくとも約
９０％同一である場合に、相同であると見なされる。いくつかの実施形態において、相同
なヌクレオチド配列は、少なくとも４～５個の一意に特定されたアミノ酸のストレッチを
コードする能力によって特徴づけられる。これらのアミノ酸の互いに対する同一性および
近似間隔の両方が、相同であると見なされるヌクレオチド配列について考慮されなければ
ならない。６０ヌクレオチド長未満のヌクレオチド配列のいくつかの実施形態において、
相同性は、少なくとも４～５個の一意に特定されたアミノ酸のストレッチをコードする能
力によって決定される。いくつかの実施形態において、２つのタンパク質配列は、それら
のタンパク質が、少なくとも約２０個のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチと、少な
くとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約
８０％同一、または少なくとも約９０％同一である場合に、相同であると見なされる。
本明細書において使用される場合、「修飾された誘導体」は、一次構造配列において基
準ポリペプチドと実質的に相同であるが、例えば、インビボもしくはインビトロの化学的
および生化学的な修飾を含むか、または基準ポリペプチドには見出されないアミノ酸が組
み込まれたポリペプチドもしくはその断片を指す。そのような修飾は、例えば、当業者に
よって容易に認識されるような、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化
、ユビキチン化、例えば放射性核種による標識、および種々の酵素修飾を含む。ポリペプ
チドを標識するための様々な方法、およびそのような目的のために有用な置換基または標
識は、当該技術分野において周知であり、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、および３Ｈ等の放
射性同位体、標識されたアンチリガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオロ
フォア、化学発光剤、酵素、ならびに、標識されたリガンドに対する特異的結合対メンバ
ーとしての役割を果たすことができるアンチリガンドを含む。標識の選択は、必要とされ
る感度、プライマーを用いたコンジュゲーションの容易さ、安定性要件、および利用可能
な機器に依存する。ポリペプチドを標識するための方法は、当該技術分野において周知で
ある。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ
ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｓ（１９９２，ａｎｄ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ｔｏ ２００２）を
参照のこと。
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド変異体」または「ムテイン」は、そ
の配列が、天然または野生型タンパク質等の参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ
酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再編成、または置換を含有
するポリペプチドを指す。ムテインは、ある位置の単一のアミノ酸が別のアミノ酸に変更
された１つ以上のアミノ酸点置換、１つ以上のアミノ酸が、参照タンパク質の配列におい
て、それぞれ挿入もしくは欠失される１つ以上の挿入および／もしくは欠失、ならびに／
またはアミノ末端もしくはカルボキシ末端のいずれかもしくは両方におけるアミノ酸配列
の切断を有してもよい。ムテインは、参照タンパク質と比較して、同じかまたは異なる生
物学的活性を有してもよい。
いくつかの実施形態において、ムテインは、例えば、そのカウンターパートである参照
タンパク質に対して少なくとも８５％の全体配列相同性を有する。いくつかの実施形態に
おいて、ムテインは、野生型タンパク質に対して少なくとも９０％の全体配列相同性を有
する。他の実施形態において、ムテインは、少なくとも９５％の配列同一性、または９８
％、もしくは９９％、もしくは９９．５％、もしくは９９．９％の全体配列同一性を示す
。
本明細書において使用される場合、「親和性精製のためのポリペプチドタグ」は、第１
の「タグ」ポリペプチドに融合した該当する第２のタンパク質またはポリペプチド配列を
単離または精製するために使用することができる結合パートナーを有する任意のポリペプ
チドである。いくつかの例は、当該技術分野において周知であり、Ｈｉｓ－６タグ、ＦＬ
ＡＧエピトープ、ｃ－ｍｙｃエピトープ、Ｓｔｒｅｐ－ＴＡＧＩＩ、ビオチンタグ、グル
タチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルト
ース結合タンパク質（ＭＢＰ）、または金属親和性タグを含む。
本明細書において使用される場合、「組換え体」は、（１）その天然の環境から取り出
された、（２）遺伝子が天然に見出されるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と結合し
ていない、（３）天然では連結していないポリヌクレオチドと作動可能に連結された、ま
たは（４）天然に存在しない、生体分子、例えば、遺伝子もしくはタンパク質を指す。用
語「組換え体」は、クローン化ＤＮＡ単離体、化学的に合成されるポリヌクレオチド類似
体、または異種系によって生物学的に合成されるポリヌクレオチド類似体、ならびにその
ような核酸によってコードされるタンパク質および／またはｍＲＮＡに関連して使用する
ことができる。よって、例えば、タンパク質が、細胞中に存在する組換え遺伝子から合成
されたｍＲＮＡから合成される場合、例えば、微生物によって合成されるタンパク質は組
換え体である。
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」、または「核酸配列」は、少なく
とも１０塩基長のヌクレオチドからなる重合形態を指す。この用語は、ＤＮＡ分子（例え
ば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍ
ＲＮＡもしくは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然ヌクレオチド類似体、変性ヌクレオシド間
結合、またはその両方を含有するＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含む。核酸は、任意の位
相幾何学的構造であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分二
本鎖、分枝型、ヘアピン型、環状、または南京錠型の立体構造であってもよい。核酸（ポ
リヌクレオチドとも称される）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖およびア
ンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態および混合ポリマーを含み得る。当業者に
よって容易に認識されるように、これらは、化学的もしくは生化学的に修飾されてもよい
か、または非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。そのよ
うな修飾は、例えば、標識、メチル化、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の
類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネ
ート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメート等）、荷電結合（例えば
、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）
、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤
、および修飾された結合（例えば、αアノマー核酸等）を含む。また、水素結合および他
の化学相互作用を介して指定された配列に対するそれらの結合能においてポリヌクレオチ
ドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は、当該技術分野において既知であり
、例えば、ペプチド結合が、分子の骨格内のリン酸結合の代わりとなるものを含む。他の
修飾は、例えば、リボース環が「ロックされた」核酸に見出される修飾のような架橋部分
または他の構造を含有する類似体を含むことができる。
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーは、細胞外で作製されるものであり、例
えば、化学的に合成されるものである。
本明細書において使用される用語「核酸断片」は、完全長の基準ヌクレオチド配列と比
較して、欠失、例えば、５’末端または３’末端の欠失を有する核酸配列を指す。一実施
形態において、核酸断片は、該断片のヌクレオチド配列が、天然に存在する配列における
対応する位置と同一である、連続した配列である。いくつかの実施形態において、断片は
、少なくとも１０、１５、２０、もしくは２５ヌクレオチド長、または少なくとも２０、
３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０
、もしくは１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸配列の断片
は、オープンリーディングフレーム配列の断片である。いくつかの実施形態において、そ
のような断片は、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列によってコードされ
るタンパク質のポリペプチド断片（本明細書において定義されるような）をコードする。
本明細書において使用される場合、生物のゲノム中の内在性核酸配列（またはその配列
のコードされたタンパク質産物）は、この内在性核酸配列の発現が改変されるように、異
種配列が内在性核酸配列に隣接して配置される場合に、本明細書において「組換え体」で
あると見なされる。これに関連して、異種配列は、異種配列自体が内在性（同じ宿主細胞
もしくはその子孫に由来する）または外因性（異なる宿主細胞もしくはその子孫に由来す
る）であろうとなかろうと、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例と
して、プロモーター配列は、この遺伝子が改変された発現パターンを有するように、（例
えば、相同組換えによって）宿主細胞のゲノム内の遺伝子の天然プロモーターに取って代
わることができる。この遺伝子は、天然でそれにフランキングする配列のうちの少なくと
もいくつかから分離されるため、今度は「組換え体」になる。
また、核酸は、天然ではゲノム内の対応する核酸に生じない任意の修飾を含有する場合
に、「組換え体」であると見なされる。例えば、内在性コード化配列は、例えば、ヒトの
介入によって、人工的に導入された挿入、欠失、または点突然変異を含有する場合に、「
組換え体」であると見なされる。「組換え核酸」はまた、異種部位で宿主細胞の染色体に
組み込まれた核酸、およびエピソームとして存在する核酸構築物も含む。
本明細書において使用される場合、基準核酸配列の「縮重改変体」という句は、基準核
酸配列から翻訳されるものと同一のアミノ酸配列を提供するように、標準的な遺伝暗号に
従って翻訳することができる核酸配列を包含する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」また
は「縮重プライマー」は、配列は必ずしも同一ではないが、１つ以上の特定のセグメント
内で互いに相同である標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチ
ドを表すために使用される。
核酸配列に関連して用語「配列同一性パーセント」または「同一」とは、最大に一致す
るようにアラインされた場合に同じである２つの配列内の残基を指す。配列同一性比較の
長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２０ヌクレオチド、より一
般的に少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より
典型的には少なくとも約３２、さらにより典型的には少なくとも約３６以上のヌクレオチ
ドのストレッチにわたってもよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用するこ
とができる、当該技術分野において既知の異なるアルゴリズムが存在する。例えば、ポリ
ヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０．０
（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉ
ｓ）のプログラムであるＦＡＳＴＡ、Ｇａｐ、またはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較する
ことができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列と検索配列と間の最適なオーバーラップ領域
のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３－９８（１９９０）。例えば、核酸配列間の配列同
一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１
の中に提供されるように、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトパラメータで使用して（ワードサ
イズ６、およびスコアリングマトリックス用のＮＯＰＡＭ因子）、またはＧａｐをそのデ
フォルトパラメータで使用して決定することができる。代替として、配列は、コンピュー
タプログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
１５：４０３－４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ ａｎｄ Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ
Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ
．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７）、
Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６（１９
９７））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．
，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２（１９９７））を使
用して比較することができる。
用語「実質的な相同性」または「実質的な類似性」は、核酸またはその断片を言及する
場合、適切なヌクレオチドの挿入または欠失によってもう１つの核酸（またはその相補鎖
）と最適にアラインされた時に、前述のようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、またはＧａｐ等
の任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって測定すると、ヌクレオチド塩基の少な
くとも約７６％、８０％、８５％、もしくは少なくとも約９０％、または少なくとも約９
５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のヌクレオチド配列同一性が存在するこ
とを意味する。
代替として、核酸またはその断片が、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
下で別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖にハイブリダイズする場合、実質的な相
同性または類似性が存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関連する「ストリンジ
ェントなハイブリダイゼーション条件」および「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数
の異なる物理的パラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって
容易に認識されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補
的な領域の長さ、およびハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数等
の条件によって影響を受ける。当業者は、特定のハイブリダイゼーションのストリンジェ
ンシーを実現するためにこれらのパラメータを変化させる方法を理解している。
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定の一連の条件下で、
特定のＤＮＡハイブリッドの熱的融点（Ｔｍ）よりも約２５℃低い温度で行われる。「ス
トリンジェントな洗浄」は、特定の一連の条件下で、特定のＤＮＡハイブリッドのＴｍよ
り約５℃低い温度で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブ
にハイブリダイズする温度である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），ｐａｇｅ ９．５１を参照のこと。本
明細書における目的のために、液相ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件
」は、６ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣが、３．０Ｍ ＮａＣ１および０．３Ｍクエン酸ナトリ
ウムを含有する）、１％ ＳＤＳ中、６５℃で８～１２時間の水性ハイブリダイゼーショ
ン（すなわち、ホルムアミドを含まない）、その後の０．２ｘＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ
、６５℃で２０分の洗浄２回と定義する。当業者は、６５℃でのハイブリダイゼーション
が、ハイブリダイズしている配列の長さおよび同一性パーセントを含む多数の要因に応じ
て異なる速度で起こることを認識するであろう。
本明細書において使用される場合、「発現制御配列」は、それらが作動可能に連結され
たコード配列の発現に影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配
列は、核酸配列の転写、転写後事象、および翻訳を調節する配列である。発現制御配列は
、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシン
グシグナルおよびポリアデニル化シグナル等の効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細
胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）
；タンパク質の安定性を高める配列；所望により、タンパク質の分泌を高める配列を含む
。そのような制御配列の性質は、宿主生物によって異なり、原核生物では、そのような制
御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列を含む。用
語「制御配列」は、最低でも、その存在が発現に不可欠な任意の成分を包含し、その存在
が有利である付加的な成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も包含でき
ることを意図する。
本明細書において使用される場合、「作動可能に連結された」または「動作可能に連結
された」発現制御配列は、該当する遺伝子を制御するために発現制御配列が該当する遺伝
子と隣接している結合、および該当する遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れて
作用する発現制御配列を指す。
本明細書において使用される場合、「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送
することができる核酸分子を指すことを意図する。１つの種類のベクターは「プラスミド
」であり、これは、一般に、付加的なＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖
ＤＮＡループを指すが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から生じる
か、または環状プラスミドの制限酵素による処理等から生じる線形二重鎖分子も含む。他
のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、および酵母人工染色体（ＹＡＣ）
を含む。別の種類のベクターは、付加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲー
トされ得るウイルスベクターである（より詳細に後述する）。あるベクターは、それらが
導入される宿主細胞内で自己複製することができる（例えば、宿主細胞において機能する
複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞内に導入すると、宿主細胞のゲ
ノムに組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、あ
るベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を司ることができる。そのよ
うなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクタ
ー」）と称される。
用語「組換え宿主細胞」（または単に「組換え細胞」もしくは「宿主細胞」）は、本明
細書において使用される場合、組換えベクター等の組換え核酸が導入された細胞を指すこ
とを意図する。ある場合には、「細胞」という単語は、ある種類の細胞を特定する名称に
置き換えられる。例えば、「組換え微生物」は、微生物宿主細胞である組換え宿主細胞で
ある。このような用語は、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も指すこ
とを意図することを理解されたい。突然変異または環境の影響のいずれかに起因して、後
続世代において特定の修飾が起こり得るため、そのような子孫は、実際は親細胞と同一で
はないかもしれないが、本明細書において使用されるような用語「組換え宿主細胞」、「
組換え細胞」、および「宿主細胞」の範囲内になおも含まれる。組換え宿主細胞は、単離
された細胞もしくは培養物中で増殖させた細胞株であり得るか、または生組織もしくは生
物に存在する細胞であり得る。
本明細書において使用される場合、用語「従属栄養性」は、炭素を固定することができ
ず、成長のために有機炭素を用いる生物を指す。
本明細書において使用される場合、用語「独立栄養性」は、光からのエネルギー（光合
成による）または無機化学反応（化学合成）を利用して、単純な無機分子から複雑な有機
化合物（炭水化物、脂肪、およびタンパク質等）を生成する生物を指す。
本明細書において使用される場合、「筋肉量」は、対象の体内の筋肉の重量を指す。筋
肉量は、骨格筋、平滑筋（心筋および消化器系の筋肉等）、およびこれらの筋肉に含まれ
る水分を含む。特定の筋肉の筋肉量は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）（Ｐ
ａｄｄｅｎ－Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００４）を用いて決定することができる。総
除脂肪体重（脂肪を含まない）、総体重、および骨塩量も、ＤＥＸＡによって測定するこ
とができる。いくつかの実施形態において、対象の特定の筋肉の筋肉量における変化は、
例えば、ＤＥＸＡによって決定され、該変化は、対象の筋肉量における全体的な変化の代
理として用いられる。よって、例えば、対象が、本明細書に開示されるような栄養タンパ
ク質を摂取し、特定の筋肉または筋肉群の筋肉量において一定期間にわたる増加を経験す
る場合、対象は筋肉量の増加を経験したと結論付けることができる。
本明細書において使用される場合、「筋力」は、単一の最大努力により筋肉が生成する
ことができる力の量を指す。筋力には、静的強度と動的強度の２種類がある。静的強度と
は、筋肉の等尺性収縮を指し、筋肉が力を発生させるが、その間筋長は一定のままであり
、かつ／またはその時に関節運動は起こらない。例として、物体を把持するもしくは運ぶ
こと、または壁を押すことが挙げられる。動的強度とは、筋肉が運動を生じる力を発生す
ることを指す。動的強度は等張性収縮であり得、一定負荷時または等速性収縮すると筋肉
が短縮し、その場合、筋肉は一定の速度で収縮および短縮する。動的強度は、等慣性強度
も含む。
特定されない限り、「筋力」は、最大動的筋力を指す。最大強度は、「１回最大挙上重
量」（１ＲＭ）と称される。これは、失敗または損傷することなく、完全に１回動かすこ
とができる（持ち上げる、押す、または引く）最も大きな負荷（キログラム）の尺度であ
る。この値は、直接測定することができるが、それを行うには、対象がその活動を完遂す
ることができなくなるまで重量を増加する必要がある。代替として、１ＲＭは、対象が動
かすことができる最大量よりも少ない負荷を用いて対象が動かすことができる最大運動反
復数を数えることによって推定される。脚伸展および脚屈曲が、臨床試験においてしばし
ば測定される（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ，ｓｔｒｅ
ｎｇｔｈ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ，”Ｃ
ｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００８；２７：１８９－１９５、Ｐａｄｄｏｎ－Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ
ａｌ．，“Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒ
ａｔｅ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ ｍｕｓｃｌｅ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｌｏｓｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ２８ ｄａｙｓ ｂｅｄ
ｒｅｓｔ，”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００４；８９：４
３５１－４３５８）。
本明細書において使用される場合、「機能的能力」は、日常活動をシミュレートする機
能試験を指す。「機能的能力」は、時間計測式の踏み台昇降テスト（４インチの台から５
回できるだけ速く昇り降りする）、時間計測式の床上体位変換テスト（できるだけ早く、
床の上で立位置から仰臥位になり、その後、再び立位に戻る（１回反復））、および身体
能力バッテリーテスト（静的バランステスト、椅子立ち上がりテスト、および歩行テスト
）を含む、任意の好適な許容される試験によって測定される（Ｂｏｒｓｈｅｉｍ ｅｔ
ａｌ．，“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏ
ｎ ｏｎ ｍｕｓｃｌｅ ｍａｓｓ，ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｐｈｙｓｉｃａｌ ｆ
ｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｅｌｄｅｒｌｙ，”Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００８；２７：１８
９－１９５）。
本明細書において使用される場合、「ボディマス指数」または「ＢＭＩ」または「ケト
レー指数」は、対象の体重（キログラム）を体重の身長（メートル）の二乗で除したもの
である（ｋｇ／ｍ２）。
成人の場合、自分と同じ身長の人物にとって正常であるかまたは望ましい体重から、そ
の個体の体重がどれくらい逸脱しているかを評価するために頻繁にＢＭＩが使用される。
体重過多または体重不足は、一部、体脂肪によって説明され得るが、筋肉質等の他の要因
もＢＭＩに大きく影響する。世界保健機関は、ＢＭＩ１８．５未満である場合を低体重と
し、栄養失調、摂食障害、または他の健康問題を示唆する可能性があり、２５を超えるＢ
ＭＩは過体重であると見なされ、３０を超えると肥満であると見なされる（Ｗｏｒｌｄ
Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．ＢＭＩ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ａ
ｃｃｅｓｓｅｄ Ｍａｒｃｈ １９，２０１２ ｈｔｔｐ：／／ａｐｐｓ．ｗｈｏ．ｉｎ
ｔ／ｂｍｉ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｉｎｔｒｏＰａｇｅ＝ｉｎｔｒｏ＿３．ｈｔｍｌ）。
本明細書において使用される場合、「望ましいボディマス指数」は、約１８．５～約２５
のボディマス指数である。よって、対象が約１８．５未満のＢＭＩを有する場合、対象の
ＢＭＩの増加が、対象のＢＭＩの望ましさの増加である。代わりに、対象が約２５を超え
るＢＭＩを有する場合、対象のＢＭＩの減少が、対象のＢＭＩの望ましさの増加である。
本明細書において使用される場合、「高齢の」哺乳動物は、ボディマス指数および筋肉
量のうちの少なくとも１つにおける加齢に伴う変化（例えば、加齢性筋肉減弱症）を経験
する哺乳動物である。いくつかの実施形態において、「高齢」のヒトは、少なくとも５０
歳、少なくとも６０歳、少なくとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少な
くとも８０歳、少なくとも８５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、または少なく
とも１００歳である。いくつかの実施形態において、高齢の動物、哺乳動物、またはヒト
は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なく
とも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５
％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、または少なくとも６０％のピーク生涯筋肉量
からの筋肉量の損失を経験したヒトである。ボディマス指数および筋肉量のうちの少なく
とも１つに対する加齢に伴う変化は、年齢の増加に相関していることが分かっているため
、いくつかの実施形態において、高齢の動物は、単純に年齢に基づいて同定または定義さ
れる。よって、いくつかの実施形態において、「高齢」のヒトは、ボディマス指数および
筋肉量のうちの少なくとも１つの測定に頼らずに、単純に年齢が少なくとも６０歳、少な
くとも６５歳、少なくとも７０歳、少なくとも７５歳、少なくとも８０歳、少なくとも８
５歳、少なくとも９０歳、少なくとも９５歳、または少なくとも１００歳であるという事
実によって同定または定義される。
本明細書において使用される場合、患者が、医学的疾患のために、ボディマス指数およ
び筋肉量のうちの少なくとも１つにおける変化（例えば、筋肉減弱症）を経験する場合、
その患者は「医学的に重症」である。いくつかの実施形態において、患者は、覚醒時間の
少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくと
も８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％寝たきりである。いく
つかの実施形態において、患者は意識不明である。いくつかの実施形態において、患者は
、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、１０日、２週間、３週間、４週間、５週間
、１０週間、またはそれ以上、本段落に記載されるように寝たきりである。
本明細書において使用される場合、「タンパク質エネルギー栄養障害」は、タンパク質
の摂取量が不十分である栄養失調の一形態である。その種類として、クワシオルコル（タ
ンパク質栄養不良優位）、マラスムス（熱量およびタンパク質栄養の両方が不足）、およ
び消耗性クワシオルコル（著しいタンパク質欠乏および著しい熱量不足の兆候を呈し、栄
養失調の最も重篤な形態と称されることもある）が挙げられる。
本明細書において使用される場合、「悪液質」は、消耗および体重減少を引き起こす多
面的な臨床症候群を指す。これは、タンパク質異化作用がタンパク質同化作用を超過し、
筋肉消耗がこの状態の主な特徴となる複雑な状態である。タンパク質代謝における代謝異
常に加えて、これは、食欲不振および炎症によっても特徴づけられる。これらの異常およ
びタンパク質代謝障害は、栄養療法に様々な程度で反応する。
本明細書において使用される場合、「熱発生」は、哺乳動物における熱生成プロセスで
ある。熱発生は、エネルギー消費量の増加を伴う。熱発生は、具体的には、食物成分（タ
ンパク質等）の代謝後に燃やされるエネルギーである。これは、食物の熱効果と称されて
もよい。個体による総エネルギー消費量は、安静時エネルギー消費量（基本代謝を支持す
るために空腹状態で安静時に消費されるエネルギー）、食物の熱効果、および身体活動に
よるエネルギー摂取量の和と等しい。安静時エネルギー消費量は、ヒトにおける総エネル
ギー消費量の約６５～７５％を占める。筋肉量の量および活性は、安静時エネルギー消費
量に影響を与えるものの１つである。筋肉を支持するための十分なタンパク質の摂取も、
安静時エネルギー消費量に影響を与える。タンパク質の経口摂取は、食後のエネルギー消
費量を増加させる傾向がある：これが、食物の熱効果である。食物の熱効果は、ヒトにお
ける総エネルギー消費量の約１０％を占める。これは、総エネルギー消費量のうちの少な
い割合だが、この値のわずかな増加が体重に影響を及ぼし得る。タンパク質は、脂肪また
は炭水化物よりも高い熱効果を有する：この効果は、タンパク質の他の代謝影響と相まっ
て、タンパク質を体重管理、糖尿病の管理、および他の状態に有用な物質にする。
本明細書において使用される場合、「心的飽和」は、食べている間に満腹になる行為、
または食べたいという欲求の減少である。これにより摂食が停止または減少される。
本明細書において使用される場合、「満腹感」は、食後に満腹な状態に留まる行為であ
り、食事後の摂食しない期間として現れる。
本明細書において使用される場合、「運動」は、最も広義に、体力ならびに全体的な健
康および健康状態を増強または維持する任意の身体的活動である。運動は、筋肉および心
血管系の強化、運動技能の修練、体重の減少または維持、ならびに楽しむ目的を含む種々
の理由から行われる。
本明細書において使用される場合、「十分な量」とは、所望の効果をもたらすのに十分
な、本明細書に開示されるタンパク質またはポリペプチドの量である。例えば、筋肉量の
増加が所望される場合、十分な量は、一定期間にわたって対象の筋肉量の増加をもたらす
量である。タンパク質またはポリペプチド断片の十分な量は、直接的に、すなわち、タン
パク質もしくはポリペプチド断片を対象に投与することにより提供されてもよいか、また
はタンパク質もしくはポリペプチド断片を含む組成物の一部として提供されてもよい。投
与の様式については本明細書の他の箇所で論じる。
本明細書において使用される場合、用語「哺乳動物」は、胎盤性哺乳動物および有袋類
哺乳動物を含む、分類上の綱である哺乳綱の任意のメンバーを指す。よって、「哺乳動物
」は、ヒト、霊長類、家畜、および実験用哺乳動物を含む。例示的な哺乳動物として、げ
っ歯類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ラマ、ウシ、霊長
類、ブタ、および任意の他の哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、哺乳
動物は、トランスジェニック哺乳動物、遺伝子操作された哺乳動物、およびクローン哺乳
動物のうちの少なくとも１つである。
Ａ．栄養タンパク質
本開示の目的のために、「栄養タンパク質」は、望ましい量の必須アミノ酸を含有する
タンパク質である。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、少なくとも３０重
量％の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、少なくと
も４０重量％の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、
少なくとも５０重量％の必須アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、栄養タンパ
ク質は、食用種において自然に生じるタンパク質またはタンパク質の断片を含むかまたは
それらからなる。その最も広義において、「食用種」は、少なくとも１種類の哺乳動物に
よって有害な影響なく食されることが分かっている任意の種を包含する。有害な影響は、
毒性効果および毒作用を含む。いくつかの実施形態において、食用種は、有害な影響なく
ヒトによって食されることが分かっている種である。限定された地理的地域において、あ
る種類の哺乳動物の小さなグループのみの食事の、希少ではあるが既知である構成要素で
ある食用種もあれば、世界中ほとんどの地域で主食となっている食用種もある。他の実施
形態において、食用種は、いずれかの哺乳動物によって以前に食されたことは分かってい
ないが、試験時に食用であることが明らかになる種である。食用種は、限定されないが、
以下を含むワタ（ｔｕｒｎｅｒｉ）、シロノタモギタケモドキ、グリシンマックス、アジ
アイネ、メバチ、ブリストルコーンモミ、トゲネズミ、タクヨウレンリソウ、インドヤギ
ュウ、ケープグリスボック、タテゴトアザラシ、カラチョウザメ、ジャワジャコウネコ、
ヒマラヤヒラタケ、ダッタンソバ、ストローブマツ、アサガオ、キャラボク、フウリンア
サガオ、オオノガイ、キウイフルーツ、グラントガゼル、ヨーロッパヤマナラシ、セイヨ
ウスモモ、セグロカモメ、ビロードクサフジ、ホシエビス、ヒロハノマンテマ、サラワク
イルカ、アメリカウバガイ、クシマンセ、アズキ、ツルナシレリンソウ、カラフトマス、
ミシシッピワニ、アレッポマツ、カモメ、セイヨウアブラナ、シラタマソウ、クラカケア
ザラシ、インディアンガゼル、テーダマツ、カナダイチイ、ヒロハザミア、ウンナンマツ
、ヒマラヤゴヨウマツ、アスパラガス、アヒ・アマリージョ、イガゴヨウマツ、ヨーロッ
パイチイ、シベリアマツ、オレンジ、ハワイアンスコーレルフィッシュ、アメリカバイソ
ン、トムソンガゼル、ヤハズエンドウ、カナダガン、セロリ、コブカエデ、コリアンダー
、ヒメシラタマソウ、レタス、カプシカム・シネンゼ、シラビソ、カプラ・ヒルクス、ス
ペックガゼル、サケ、ヒメノアサガオ、シロウリ、ワモンアザラシ、アカギツネ、ルコウ
ソウ、ソラナム（ｈａｂｒｏｃｈａｉｔｅｓ）、ポプラ種、リギダマツ、オーバーカップ
オーク、ベニバナインゲン、ユリカモメ、トガリエビス、タイセイヨウクロマグロ、ホッ
キョクギツネ、インディアンバイソン、イタリアン・メープル、イロハモミジ、セイヨウ
ヒイラギガシ、モンタナマツ、オオヅル、カギミヤママツ、ウメ、マスノスケ、コウジョ
ウセンガゼル、フェネック、シシマツ、ワタ（ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、シカモアカエデ
、ベニザケ、ヒゲイノシシ、ソバ亜種アンセストラル、カルドン、ヤエナリ、セイコウハ
コヤナギ、ワタ（ｓｃｈｗｅｎｄｉｍａｎｉｉ）、ソラナム（ｃｈａｃｏｅｎｓｅ）、ア
カガシワ、キュウリ、サバンナシマウマ、ギンザケ、ラジアータパイン、ゼニガタアザラ
シ、オグロヅル、アメリカオオモミ、サクラマス、ホウレンソウ、ソラナム（ｃｈｉｌｅ
ｎｓｅ）、アダックス、サツマイモ、グレビーシマウマ、トドマツ、イタリアカサマツ、
オオカグラコウモリ、オータム・クロッカス、ブンタン、シロチョウザメ、ワタ（ｇｏｓ
ｓｙｐｉｏｉｄｅｓ）、インドジャコウネコ、ターキー・オーク、インドガン、フォック
ステールパイン、スパニッシュムシトリナデシコ、オンコリンクス属種、ビルマジャコウ
ネコ、ヤク、スラッシュマツ、インドノロバ、アイベックス、ニンニク、ラディッシュ、
エキナタマツ、ブラックチェリー、ニジエビス、シロバナマンテマ、ヤセイカンラン、ノ
ラニンジン、ニジマス、カイラン、ワタ（ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、ヨーロッパモミ、シトラ
ス・レティキュラータ、チコリー、コープレイ、ラマ、トウモロコシ、セキショウ、キッ
トギツネ、アルタイアルガリ、シャープグリスボック、コントルタマツ、コブウシ、シベ
リアアイベックス、ポンデローサマツ、アーモンド、ソラナム（ｓｏｇａｒａｎｄｉｎｕ
ｍ）、ヨウサイ、ハナジロカマイルカ、ビッグホーン、セイヨウミザクラ、ダマガゼル、
ビンナガ、マンテマ、スイスマツ、サフラン、スイカ、アカガゼル、ハリゲナタネ、マー
コール、ミンドロスイギュウ、ダイオウマツ、セイヨウバクチノキ、マナヅル、マルバア
サガオ、チワワマツ、ハラジロカマイルカ、スタインボック、ブラッシカ・ラパ亜種ペキ
ネンシス、アメリカセンニチコウ、ホシアサガオ、パツラマツ、マスクメロン、バージニ
アマツ、ソラナム（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、アカマツ、アパッチパイン、ヨーロッ
パナラ、イポメア・セトーサ、トキイロヒラタケ、ハチマキカグラコウモリ、ヒツジ、ヒ
メエビス、ブロッコリー、カフカスツール、キタカミハクヨウ、プレーリーオニオン、ソ
ラマメ、フツウソバ、ステップバイソン、コルクガシ、ラゴフィラ・ラモシッシマ、マダ
ガスカルボア、シベリアチョウザメ、カプシクム・アンヌウム、パンコムギ、アフリカツ
メガエル、バイカルアザラシ、アドリアチョウザメ、オニマタタビ、ドールシープ、ソラ
ナム（ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、カラバオ、ザボン、ヨーロッパバイソン、ヌビアノロバ、
アノア、エリンギ、ソラナム（ｄｅｍｉｓｓｕｍ）、ウリアル、トウモロコシ亜種パルビ
グルミス、ハットクマメ、ウェルウィッチア、オーストラリアヅル、マルバルコウ、タマ
ネギ、ゼメリングガゼル、ブラッシカ・ラパ、ビクーニャ、ソラナム（ｐｅｒｕｖｉａｎ
ｕｍ）、アフリカツメガエル、カフカスアイベックス、キハダマグロ、ヤマシマウマ、セ
キショクヤケイ、ソラナム（ｂｕｌｂｏｃａｓｔａｎｕｍ）、テラソカグラコウモリ、タ
イセイヨウカマイルカ、カバ、チョウセンゴヨウ、フランスモミジ、アメリカクロポプラ
、ブラック・コットンウッド、ロシアチョウザメ、クロマツ、キャベツ、カジカ（ｋｏｒ
ｏｔｎｅｆｆｉ）、エドミガゼル、ウラジロモミ、マンシュウモミ、マウンテンガゼル、
ゴヨウマツ、ハボタン、ペポカボチャ、カザンマツ、オオシラビソ、タイセイヨウクロマ
グロ、ウンシュウミカン、ソラナム（ｃｈｅｅｓｍａｎｉｉ）、カマイルカ、ノルウェー
カエデ、レモン、デュメリルボア、ソラナム（ｃｏｍｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ワタ（ａｒｂ
ｏｒｅｕｍ）、モモ、ヒラタケ、モミ、リムガゼル、タイセイヨウサケ、アメリカウミザ
リガニ、カリフォルニアアカモミ、バンテン、ゴマフアザラシ、フィリピンヒゲイノシシ
、ナス、ゼニガタアザラシ、ヨーロッパアカマツ、ザミア、コサックギツネ、リーキ、カ
スピカイアザラシ、ケープギツネ、チュウゴクイチイ、カリフラワー、キバシハイイロガ
ン、ライマメ、ブラッシカ・カンペストリス、サトウカエデ、ハイマツ、ソラナム（ｐｅ
ｎｎｅｌｌｉｉ）、ピニョンマツ、イモネノホシアサガオ、ウラジロハコヤナギ、ノドキ
リマス、フユナラ、スンダイボイノシシ、プルツワルスキーモウコノウマ、コトカケヤナ
ギ、アフリカツメガエル、タイヘイヨウイチイ、グアナコ、バンクスマツ、イヌホオズキ
、セレベスイノブタ、カラシナ、ダンダラカマイルカ、アメリカヤマナラシ、コロラドト
ウヒ、ヤマアノア、カシ（ｇａｍｅｌｌｉｆｌｏｒａ）、アジアムフロン、アジアスイギ
ュウ、リュウキュウマツ、フィリピンヒゲイノシシ、インゲンマメ、ブラウントラウト、
ペルシャチョウザメ、ソラナム（ｂｒｅｖｉｄｅｎｓ）、レジノーサマツ、セーブルアン
テロープ、ヌビアアイベックス、シーアスパラガス、イポメア・プラテンシス、ブタ、パ
サン、ガラスマメ、アオスジエビス、タイセイヨウオヒョウ、アメリカショウブ、ウマ、
コブウシ、ツケバナ、アルパカ、フランスカイガンショウ、マダコ、ソラナム（ｃｒｉｓ
ｐｕｍ）、ローンアンテロープ、チャップマンシマウマ、アレキサンダークシマンセ、ヨ
ルガオ、ヒトツブコムギ、アラビアバルサムノキ、ミナミカマイルカ、ドルカスガゼル、
ケルメスオーク、ハクガン、トウ、ヒマラヤマツ、マンシュウクロマツ、フィッシェリ、
ホオカザリヅル、カイロトゲマウス、ネットメロン、セイロンヤケイ、ピスム・サティヴ
ム、ノブコーンパイン、サンドパイン、サウジガゼル、キャプラアイベックス、イポメア
・トリフィーダ、テオシント、ベトナムマツ、ウイルソントゲマウス、パセリ、ピンオー
ク、コムギ（ｔｉｍｏｐｈｅｅｖｉ）、シチメンチョウ、ヤセイカンラン、ヤセイカンラ
ン、ビーツ、ソラナム（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、インゲンマメ、メカジキ、ストラ
イプドバス、オオクチバス、マゼランツキヒガイ、ヨーロピアン・スプラト、タイセイヨ
ウニシン、モトカタクチイワシ、セイヨウカボチャ、アガリクス・ビスポルス、キングバ
ナナ、マルス・ドメスティカ、ヒヨコマメ、マガモ、ヒメツルコケモモ、ラズベリー、ロ
ーブッシュ・ブルーベリー、イチゴ、セイヨウヤブイチゴ、マスクメロン、パイナップル
、ペポカボチャ、二ホンカボチャ、ブタ、バジル、ローズマリー、ウイキョウ、ダイオウ
、パパイヤ、マンゴー、キウイフルーツ、アンズ、セイヨウミザクラ、ココヤシ、オリー
ブ、セイヨウナシ、イチジク、クダモノトケイソウ、アジアイネ亜種ジャポニカ、アジア
イネ亜種インディカ、ヨーロッパウズラ、サッカロマイセス・セレビシエ。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、食用種において自然に生じるタンパ
ク質またはタンパク質の断片の誘導体またはムテインを含むかまたはそれらからなる。そ
のような栄養タンパク質は、「遺伝子操作された栄養タンパク質」と称されてもよい。そ
のような実施形態において、天然のタンパク質またはその断片は、「参照」タンパク質ま
たはポリペプチドであり、遺伝子操作された栄養タンパク質またはその第１のポリペプチ
ド配列は、参照タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列にと比較して少なくとも１
つの配列修飾を含む。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子操作された栄養タン
パク質またはその第１のポリペプチド配列は、少なくとも１つの基準栄養タンパク質アミ
ノ酸配列と、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７
５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９
３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％相同である
。典型的には、遺伝子操作された栄養タンパク質またはその第１のポリペプチド配列に存
在する全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基、全アミノ酸残基に対する必須アミノ
酸残基、および全アミノ酸残基に対するロイシン残基のうちの少なくとも１つの割合は、
基準栄養タンパク質またはポリペプチド配列に存在する全アミノ酸残基に対する分枝鎖ア
ミノ酸残基、全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基、および全アミノ酸残基に対する
ロイシン残基のうちの少なくとも１つの対応する割合よりも高い。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、食物またはその誘導体もしくはムテ
イン中の豊富なタンパク質であるか、あるいは、食物またはその誘導体もしくはムテイン
中の豊富なタンパク質の断片である。豊富なタンパク質は、食物中に存在する他のタンパ
ク質と比べて、より高い濃度で食物中に存在するタンパク質である。限定された地理的地
域において、ある種類の哺乳動物の小さなグループのみの食事の既知の構成要素であり得
る食物もあれば、世界のほとんどの地域で主食となり得るものもある。いくつかの実施形
態において、食物中の豊富なタンパク質は、鶏卵タンパク質、例えば、卵白アルブミン、
オボトランスフェリン、およびオボムコイド；食肉タンパク質、例えば、ミオシン、アク
チン、トロポミオシン、コラーゲン、およびトロポニン；穀物タンパク質、例えば、カゼ
イン、α１カゼイン、α２カゼイン、βカゼイン、κカゼイン、βラクトグロブリン、α
ラクトグロブリン、グリシン、βコングリシニン、グルテリン、プロラミン、グリアジン
、グルテニン、アルブミン、グロブリン；ニワトリ筋タンパク質、例えば、アルブミン、
エノラーゼ、クレアチンキナーゼ、ホスホグリセリン酸ムターゼ、トリオースリン酸イソ
メラーゼ、アポリポタンパク質、オボトランスフェリン、ホスホグルコムターゼ、ホスホ
グリセリン酸キナーゼ、グリセロール－３－リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド３リ
ン酸脱水素酵素、ヘモグロビン、コフィリン、グリコーゲンホスホリラーゼ、フルクトー
ス－１，６－ビスホスファターゼ、アクチン、ミオシン、トロポミオシンα鎖、カゼイン
キナーゼ、グリコーゲンホスホリラーゼ、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ、
アルドラーゼ、チューブリン、ビメンチン、エンドプラスミン、乳酸脱水素酵素、デスト
リン、トランスサイレチン、フルクトース二リン酸アルドラーゼ、炭酸脱水酵素、アルデ
ヒド脱水素酵素、アネキシン、アデノシルホモシステイナーゼ；ブタ筋タンパク質、例え
ば、アクチン、ミオシン、エノラーゼ、タイチン、コフィリン、ホスホグリセリン酸キナ
ーゼ、エノラーゼ、ピルビン酸脱水素酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、トリオースリ
ン酸イソメラーゼ、ミオキナーゼ；ならびに魚類タンパク質、例えば、パルブアルブミン
、ピルビン酸脱水素酵素、デスミン、およびトリオースリン酸イソメラーゼから選択され
る。
一般的に、高品質アミノ酸の良好な源であると考えられる３つの天然タンパク質源は、
乳清タンパク質、卵タンパク質、および大豆タンパク質である。各源は、複数のタンパク
質を含む。表１は、パーセンテージとして表したタンパク質源中の各アミノ酸を重量比で
表示したものを示す（ｇ ＡＡ／タンパク質ｇ数）。
Figure 0007303238000001
表１に示したパーセンテージに基づいて、各タンパク質源、すなわち、必須アミノ酸、
分枝鎖アミノ酸（Ｌ、Ｉ、およびＶ）、ならびにロイシン（Ｌ）の重量比を表２に示す。
Figure 0007303238000002
乳清のアミノ酸含有量を決定するための信頼できる情報源は次の通りである：Ｂｅｌｉ
ｔｚ ＨＤ．，Ｇｒｏｓｃｈ Ｗ．，ａｎｄ Ｓｃｈｉｅｂｅｒｌｅ Ｐ．Ｆｏｏｄ Ｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ（４ｔｈ Ｅｄ）．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ
Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ ２００９、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｎｃ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕ
ｃｔ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ？ｐｒｏｄｕｃｔＩｄ＝２９８６０２７、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ
ｗ．ｎｕｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｗｈｅｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｃｏｎ
ｃｅｎｔｒａｔｅ．ｈｔｍ、およびｈｔｔｐ：／／ｎｕｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｄ
ｕｃｔｓ／ｗｈｅｙ＿ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｉｓｏｌａｔｅ．ｈｔｍ．。これらの情報源から
のアミノ酸含有量の値を平均化して表１および２に示す数値を得た。大豆タンパク質の情
報源は、Ｅｇｇ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ｓ
ｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｒｅｌｅａｓｅ ２４（ｈｔｔｐ：／／ｎｄｂ．
ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ｎｄｂ／ｆｏｏｄｓ／ｌｉｓｔ）である。大豆タンパク質の
情報源はＳｅｌｆ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｄａｔａ（ｈｔｔｐ：／／ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ
ｄａｔａ．ｓｅｌｆ．ｃｏｍ／ｆａｃｔｓ／ｌｅｇｕｍｅｓ－ａｎｄ－ｌｅｇｕｍｅ－ｐ
ｒｏｄｕｃｔｓ／４３８９／２）である。
本明細書において使用される場合、「乳清タンパク質」または「乳清」は、表１および
２に記載のアミノ酸組成を含むタンパク質混合物を意味する。本明細書において使用され
る場合、乳清タンパク質は、４９重量％の必須アミノ酸、２４重量％の分枝鎖アミノ酸、
および１１重量％のロイシンを含む。
本明細書において使用される場合、「卵タンパク質」または「卵」は、表１および２に
記載のアミノ酸組成を含むタンパク質混合物を意味する。本明細書において使用される場
合、卵タンパク質は、５１重量％の必須アミノ酸、２０重量％の分枝鎖アミノ酸、および
９重量％のロイシンを含む。
本明細書において使用される場合、「大豆タンパク質」または「大豆」は、表１および
２に記載のアミノ酸組成を含むタンパク質混合物を意味する。本明細書において使用され
る場合、大豆タンパク質は、４０重量％の必須アミノ酸、１８重量％の分枝鎖アミノ酸、
および８重量％のロイシンを含む。
可溶性栄養タンパク質は、ある場合に特に有用である。乳清タンパク質、卵タンパク質
、および大豆タンパク質を含む多くのタンパク質の限界は、タンパク質が、特定の目的の
ために十分に可溶性ではないことである。いくつかの実施形態において、本開示は、乳清
タンパク質、卵タンパク質、および大豆タンパク質のうちの少なくとも１つよりも可溶性
の高い栄養タンパク質を提供する。
特定の目的に有用な溶解性の程度を有する、十分に特徴づけられたタンパク質の１つは
、ゼラチンである。市販の骨ゼラチンは、１８％の必須アミノ酸、７．７６％パーセント
の分枝鎖アミノ酸、および３．４５％のロイシンを含む（Ｅａｓｔｏｗ，Ｊ．Ｅ．，“Ｔ
ｈｅ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｃｏｍｐｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｏ
ｌｌａｇｅｎ ａｎｄ Ｇｅｌａｔｉｎ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，Ｖｏｌ．６１，ｐｐ
．５８９－６００（１９５５）。本明細書において使用される場合、「ゼラチンタンパク
質」または「ゼラチン」は、１８重量％の必須アミノ酸、８重量％の分枝鎖アミノ酸、お
よび４重量％のロイシンを含むタンパク質混合物を意味する。これらのアミノ酸含有量の
数値を乳清タンパク質、卵タンパク質、および大豆タンパク質と比較すると、少なくとも
ゼラチンの場合、溶解性と栄養アミノ酸含有量のトレードオフが存在することが分かる。
多くの実施形態において、本開示は、有用な溶解性プロファイルを有し、１８重量％の必
須アミノ酸、８重量％の分枝鎖アミノ酸、および４重量％のロイシンのうちの少なくとも
１つを含むタンパク質を提供する。
本明細書におけるある場合には、ポリペプチド、タンパク質、または組成物中の特定の
種類のアミノ酸（複数可）の一部が、該当するポリペプチド、タンパク質、または組成物
中に存在するアミノ酸の総重量に対する該種類のアミノ酸（複数可）の重量比に基づいて
定量化される。この値は、ポリペプチド、タンパク質、または組成物中の特定のアミノ酸
（複数可）の重量を、ポリペプチド、タンパク質、または組成物中に存在するすべてのア
ミノ酸の重量で除すことによって算出される。
他の場合において、該当するポリペプチドまたはタンパク質中に存在するアミノ酸の合
計数に対する、ポリペプチドまたはタンパク質中に存在する特定の種類のアミノ酸（複数
可）残基の割合が用いられる。この値は、ポリペプチドまたはタンパク質の各分子中に存
在する該当するアミノ酸（複数可）の数を、ポリペプチドまたはタンパク質の各分子中に
存在するアミノ酸残基の合計数で除すことによって算出される。当業者は、これら２つの
方法が類似しており、ポリペプチドまたはタンパク質中に存在するある種類のアミノ酸（
複数可）の重量比を特定の種類のアミノ酸残基（複数可）の割合に変換することができる
こと、またその逆も同じであることを認識する。
本明細書における特定の実施形態において、乳清、卵、大豆、またはゼラチン中の分枝
鎖アミノ酸、ロイシン、および／または必須アミノ酸の重量比は、ポリペプチド、タンパ
ク質、またはポリペプチドおよびタンパク質のうちの少なくとも１つを含む組成物のアミ
ノ酸組成を測定するための基準として使用される。それらの実施形態において、２つの測
定は完全に同等ではないことを理解されたいが、測定は、この目的に使用するのに十分に
類似した測定値をもたらすこともまた理解されたい。例えば、該当するタンパク質が、２
４％以上の全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割合（乳清中に存在する分枝鎖
アミノ酸残基の重量比）を有すると特徴づけられる場合、それは、タンパク質の分枝鎖ア
ミノ酸含有量の正確な説明である。同時に、そのタンパク質中に存在する分枝鎖アミノ酸
残基の重量比は、必ずしも正確に２４％と等しくなくてもよい。たとえそうであっても、
当業者は、これが有用な比較であることを理解する。該当するタンパク質中に存在するア
ミノ酸残基の合計数とともに提供される場合、当業者は、該当するタンパク質中の分枝鎖
アミノ酸残基の重量比も決定することができる。
いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、乳清タンパク質、卵タ
ンパク質、大豆タンパク質、およびゼラチンタンパク質のうちの少なくとも１つに存在す
る全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割合以上の全アミノ酸残基に対する分枝
鎖アミノ酸残基の割合を含む。よって、そのような実施形態において、栄養タンパク質は
、２４％、２０％、１８、および８％から選択される割合以上の全アミノ酸残基に対する
分枝鎖アミノ酸残基の割合を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、乳清タンパク質、卵タ
ンパク質、および大豆タンパク質のうちの少なくとも１つに存在する全アミノ酸残基に対
するＬ残基の割合以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を含む。よって、そのよう
な実施形態において、栄養タンパク質は、１１％、９％、８、および４％から選択される
割合以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を含む。
いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、乳清タンパク質、卵タ
ンパク質、大豆タンパク質、およびゼラチンタンパク質のうちの少なくとも１つに存在す
る全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合以上の全アミノ酸残基に対する必須ア
ミノ酸残基の割合を含む。よって、そのような実施形態において、栄養タンパク質は、４
９％、５１％、４０、および１８％から選択される割合以上の全アミノ酸残基に対する必
須アミノ酸残基の割合を含む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、乳清タンパク質、卵タンパク質、大
豆タンパク質、およびゼラチンタンパク質のうちの少なくとも１つに存在する全アミノ酸
残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割合以上の全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残
基の割合を含み、また、乳清タンパク質、卵タンパク質、大豆タンパク質、およびゼラチ
ンタンパク質のうちの少なくとも１つに存在する全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合以
上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を含む。いくつかのそのような実施形態におい
て、栄養タンパク質は、乳清タンパク質、卵タンパク質、大豆タンパク質、およびゼラチ
ンタンパク質のうちの少なくとも１つに存在する全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残
基の割合以上の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合をさらに含む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２４％以上の全アミノ酸残基に対す
る分枝鎖アミノ酸残基の割合、および１１％以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合
を含む。いくつかのそのような実施形態において、栄養タンパク質は、４９％以上の全ア
ミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合をさらに含む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２０％以上の全アミノ酸残基に対す
る分枝鎖アミノ酸残基の割合、および９％以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を
含む。いくつかのそのような実施形態において、栄養タンパク質は、５１％以上の全アミ
ノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合をさらに含む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、１８％以上の全アミノ酸残基に対す
る分枝鎖アミノ酸残基の割合、および８％以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を
含む。いくつかのそのような実施形態において、栄養タンパク質は、４０％以上の全アミ
ノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合をさらに含む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、８％以上の全アミノ酸残基に対する
分枝鎖アミノ酸残基の割合、および４％以上の全アミノ酸残基に対するＬ残基の割合を含
む。いくつかのそのような実施形態において、栄養タンパク質は、１８％以上の全アミノ
酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合をさらに含む。
栄養タンパク質の溶解性は、当該技術分野において既知のいずれの方法によって測定さ
れてもよい。いくつかの実施形態において、溶解性は、遠心濃縮の後にタンパク質濃度ア
ッセイにより調べることができる。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＢｉｃｉｎ
ｃｈｏｎｉｎｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＣＡ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌ
ｄｒｉｃｈ）の２つの方法を用いて、プロトコルに従って、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ
７．５）中の栄養タンパク質の試料をタンパク質濃度について検査する。これらの測定値
に基づいて、１０ｍｇのタンパク質をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ遠心濾過器（
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に添加する。１０，０００Ｘｇで３０分間の遠心分離により試料を
濃縮する。最終的な、今や濃縮された試料を、沈殿したタンパク質について調べ、次いで
ＢｒａｄｆｏｒｄおよびＢＣＡの２つの方法を用いて上記のようにタンパク質の濃度につ
いて検査する。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、生理的ｐＨで少なくとも５ｇ／Ｌ、
１０ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、または１００ｇ／Ｌの
最終溶解限度を有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、５０％超、６
０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超、９
９％超、または９９．５％超可溶性であり、生理的ｐＨで５ｇ／Ｌ、または１０ｇ／Ｌ、
または２０ｇ／Ｌ、または３０ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌ、または５０ｇ／Ｌ、または１
００ｇ／Ｌを超える濃度では、タンパク質の沈殿が観察されない。いくつかの実施形態に
おいて、栄養タンパク質の溶解性は、乳清（１２．５ｇ／Ｌ；Ｐｅｌｅｇｒｉｎｅ ｅｔ
ａｌ．，Ｌｅｂｅｎｓｍ．－Ｗｉｓｓ．Ｕ．－Ｔｅｃｈｎｏｌ．３８（２００５）７７
－８０）および大豆（１０ｇ／Ｌ；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＯＣＳ ８０（１）（２
００３）８５－９０）の溶解限度を調べる試験で典型的に報告されているものよりも高い
。
栄養タンパク質の有用性を高めることができる１つの特徴は、その電荷（またはアミノ
酸当たりの電荷）である。より高い電荷を有する栄養タンパク質は、いくつかの実施形態
において、溶解性の増加、安定性の増加、抗凝集性、および望ましい味覚プロファイル等
の望ましい特徴を呈することができる。例えば、高い溶解性を示す荷電栄養タンパク質は
、比較的少ない体積の溶液中に高濃度の栄養タンパク質を含む飲料または液体製剤に製剤
化することができるため、単位体積当たり大量のタンパク栄養を送達する。高い溶解性を
示す荷電栄養タンパク質は、例えば、ユーザ（例えば、運動選手）が身体的活動の前、最
中、または後に栄養タンパク質を経口摂取したいと所望する場合、スポーツ飲料または回
復飲料において有用であり得る。高い溶解性を示す荷電栄養タンパク質はまた、対象（例
えば、患者または高齢者）がタンパク栄養を必要としているが、固形食または大量の液体
を経口摂取することができない臨床設定において特に有用であり得る。
例えば、ｐＨ７でのポリペプチドの正味電荷（電荷Ｐ）は、以下の式を用いて算出する
ことができる：
電荷Ｐ＝－０．００２－（Ｃ）（０．０４５）－（Ｄ）（０．９９９）－（Ｅ）（０．９
９８）＋（Ｈ）（０．０９１）＋（Ｋ）（１．０）＋（Ｒ）（１．０）－（Ｙ）（－０．
００１）
式中、Ｃは、ポリペプチド中のシステイン残基の数であり、Ｄは、アスパラギン酸残基
の数であり、Ｅは、グルタミン酸残基の数であり、Ｈは、ヒスチジン残基の数であり、Ｋ
は、リジン残基の数であり、Ｒは、アルギニン残基の数であり、Ｙは、チロシン残基の数
である。ポリペプチドのアミノ酸当たりの電荷（電荷Ａ）は、正味電荷（電荷Ｐ）をアミ
ノ酸残基の数（Ｎ）で除すことによって算出することができ、すなわち、電荷Ａ＝電荷Ｐ
／Ｎである。（Ｂａｓｓｉ Ｓ（２００７），“Ａ Ｐｒｉｍｅｒ ｏｎ Ｐｙｔｈｏｎ
ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓ．”ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐ
ｕｔ Ｂｉｏｌ ３（１１）：ｅ１９９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐ
ｃｂｉ．００３０１９９を参照のこと）。
所与のタンパク質の親水性および潜在的溶解性を評価するための１つの測定基準は、溶
媒和スコアである。溶媒和スコアは、各残基を独立して溶媒和させた場合のすべてのアミ
ノ酸側鎖の溶媒和の全自由エネルギー（すなわち、気相から希薄溶液への移行に関連した
自由エネルギーの変化）を、配列中の残基の合計数によって正規化したものとして定義さ
れる。側鎖溶媒和の自由エネルギーは、真空の誘電率１と水の誘電率８０との間の静電エ
ネルギーの差を算出することにより（ポアソン・ボルツマン方程式を解くことによって）
、また線形溶媒露出表面積モデルを用いて非極性のファンデルワールスエネルギーを算出
することにより計算的に得られる（Ｄ．Ｓｉｔｋｏｆｆ，Ｋ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｂ．Ｈｏ
ｎｉｇ．“Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒａｔｉｏｎ Ｆ
ｒｅｅ Ｅｎｅｒｇｉｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｃｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｍ
ｏｄｅｌｓ”．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８，１９９４）。イオン化できる側鎖を有す
るアミノ酸の場合（Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、およびＴｙｒ）
、平均溶媒和自由エネルギーは、指定されたｐＨでの各イオン化状態の相対的確率に基づ
いて用いられる。溶媒和スコアは、０から始まって負の値へと続き、溶媒和スコアがより
マイナスであるほど、タンパク質は、より親水性であり、潜在的に可溶性であると予測さ
れる。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、ｐＨ７で－１
０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タ
ンパク質は、ｐＨ７で－１５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの
実施形態において、栄養タンパク質は、ｐＨ７で－２０以下の溶媒和スコアを有する。栄
養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、ｐＨ７で－２５以下の
溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質
は、ｐＨ７で－３０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態
において、栄養タンパク質は、ｐＨ７で－３５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパ
ク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、ｐＨ７で－４０以下の溶媒和ス
コアを有する。
溶媒和スコアは、以下のヘンダーソン・ハッセルバルヒ式によって定義されるように、
共役塩基（［Ａ－］）に対する非解離弱酸（［ＨＡ］）のモル比のｐＨ依存性に基づくｐ
Ｈの関数である：
Figure 0007303238000003
すべての弱酸は、それらの共役塩基と比較して異なる溶媒和自由エネルギーを有し、所
与のｐＨで溶媒和スコアを算出する際に所与の残基について用いられる溶媒和自由エネル
ギーは、これら２つの値の重み付け平均である。
したがって、栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、酸性
ｐＨで－１０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態におい
て、栄養タンパク質は、酸性ｐＨで－１５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質
のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、酸性ｐＨで－２０以下の溶媒和スコ
アを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、酸性ｐ
Ｈで－２５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において
、栄養タンパク質は、酸性ｐＨで－３０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質の
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、酸性ｐＨで－３５以下の溶媒和スコア
を有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、酸性ｐＨ
で－４０以下の溶媒和スコアを有する。
したがって、栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、塩基
性ｐＨで－１０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態にお
いて、栄養タンパク質は、塩基性ｐＨで－１５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパ
ク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、塩基性ｐＨで－２０以下の溶媒
和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、
塩基性ｐＨで－２５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態
において、栄養タンパク質は、塩基性ｐＨで－３０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タ
ンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、塩基性ｐＨで－３５以下の
溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質
は、塩基性ｐＨで－４０以下の溶媒和スコアを有する。
したがって、栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２～
３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、および
１１～１２から選択されるｐＨ範囲で－１０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク
質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２～３、３～４、４～５、５～６
、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、および１１～１２から選択されるｐ
Ｈ範囲で－１５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態にお
いて、栄養タンパク質は、２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、
９～１０、１０～１１、および１１～１２から選択されるｐＨ範囲で－２０以下の溶媒和
スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２
～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、およ
び１１～１２から選択されるｐＨ範囲で－２５以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパ
ク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２～３、３～４、４～５、５～
６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、および１１～１２から選択される
ｐＨ範囲で－３０以下の溶媒和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態に
おいて、栄養タンパク質は、２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９
、９～１０、１０～１１、および１１～１２から選択されるｐＨ範囲で－３５以下の溶媒
和スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、
２～３、３～４、４～５、５～６、６～７、７～８、８～９、９～１０、１０～１１、お
よび１１～１２から選択されるｐＨ範囲で－４０以下の溶媒和スコアを有する。
凝集スコアは、所与のタンパク質の疎水性および凝集の可能性を評価するための、配列
に基づく主要な測定基準である。疎水性残基に正の値、親水性残基に負の値を与えるカイ
トおよびドゥーリトルの疎水性指標（Ｋｙｔｅ Ｊ，Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ ＲＦ（Ｍａｙ
１９８２）“Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈ
ｅ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ ｃｈａｒａｃｔｅｒ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ”．Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５－３２）を使用して、タンパク質配列の平均疎
水性は、５つの残基の移動平均を用いて算出される。ゼロを上回る値の曲線下面積を決定
し、タンパク質の全長によって正規化することによって得られたプロットから凝集スコア
を導き出す。根底にある仮説は、２つ以上の疎水性パッチが集まって水を排除し、表面露
出を軽減することの結果が凝集であるというものであり、タンパク質が凝集する可能性は
、その疎水性（すなわち、凝集を起こしやすい）残基がいかに高密度に密集しているかの
関数である。凝集スコアは、０から始まって正の値へと続き、凝集スコアが小さいほど、
タンパク質は、より疎水性が低く、潜在的に凝集を起こしにくいと予測される。栄養タン
パク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２以下の凝集スコアを有する
。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、１．５以下の凝集
スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、１
以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパ
ク質は、０．９以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態におい
て、栄養タンパク質は、０．８以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの
実施形態において、栄養タンパク質は、０．７以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク
質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、０．６以下の凝集スコアを有する
。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、０．５以下の凝集
スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、０
．４以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タ
ンパク質は、０．３以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつかの実施形態に
おいて、栄養タンパク質は、０．２以下の凝集スコアを有する。栄養タンパク質のいくつ
かの実施形態において、栄養タンパク質は、０．１以下の凝集スコアを有する。
場合によっては、栄養タンパク質の量および／または収率を増加させ、栄養タンパク質
の単離および精製のうちの１つ以上を促進することができるため、可溶性発現が望ましい
。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、宿主生物において可溶性に
発現される。溶媒和スコアおよび凝集スコアは、宿主生物における組換え栄養タンパク質
の可溶性発現を予測するために使用することができる。実施例８に示すように、本開示は
、≦－２０の溶媒和スコアおよび≦０．７５の凝集スコアを有する栄養タンパク質が、特
定の大腸菌発現系において組換えで発現される確率が高いことを示唆する証拠を提供する
。さらに、データは、≦－２０の溶媒和スコアおよび≦０．５の凝集スコアを有する栄養
タンパク質が、この系において可溶性に発現される確率が高いことも示唆する。したがっ
て、いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、－２０以下の溶媒和スコ
アを有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、０．７５以下の凝集スコ
アを有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、０．５以下の凝集スコア
を有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、－２０以下の溶媒和スコア
および０．７５以下の凝集スコアを有する。いくつかの実施形態において、栄養タンパク
質は、－２０以下の溶媒和スコアおよび０．５以下の凝集スコアを有する。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、配列番号１～４９０から選択される
。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、配列番号１～４９０の修飾された誘
導体から選択される。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、配列番号１～４
９０のムテインから選択される。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、卵タンパク質、例えば、卵白アルブ
ミン、オボトランスフェリン、およびオボムコイド；食肉タンパク質、例えば、ミオシン
、アクチン、トロポミオシン、コラーゲン、およびトロポニン；乳タンパク質、例えば、
乳清およびカゼイン；穀物タンパク質、例えば、カゼイン、α１カゼイン、α２カゼイン
、βカゼイン、κカゼイン、βラクトグロブリン、αラクトグロブリン、グリシン、βコ
ングリシニン、グルテリン、プロラミン、グリアジン、グルテニン、アルブミン、グロブ
リン；ニワトリ筋タンパク質、例えば、アルブミン、エノラーゼ、クレアチンキナーゼ、
ホスホグリセリン酸ムターゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、アポリポタンパク質、オ
ボトランスフェリン、ホスホグルコムターゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ、グリセロー
ル－３－リン酸脱水素酵素、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素、ヘモグロビン、コ
フィリン、グリコーゲンホスホリラーゼ、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ、
アクチン、ミオシン、トロポミオシンα鎖、カゼインキナーゼ、グリコーゲンホスホリラ
ーゼ、フルクトース－１，６－ビスホスファターゼ、アルドラーゼ、チューブリン、ビメ
ンチン、エンドプラスミン、乳酸脱水素酵素、デストリン、トランスサイレチン、フルク
トース二リン酸アルドラーゼ、炭酸脱水酵素、アルデヒド脱水素酵素、アネキシン、アデ
ノシルホモシステイナーゼ；ブタ筋タンパク質、例えば、アクチン、ミオシン、エノラー
ゼ、タイチン、コフィリン、ホスホグリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、ピルビン酸脱水
素酵素、グリコーゲンホスホリラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ミオキナーゼ；
ならびに魚類タンパク質、例えば、パルブアルブミン、ピルビン酸脱水素酵素、デスミン
、およびトリオースリン酸イソメラーゼから選択される少なくとも１つの栄養タンパク質
以外の栄養タンパク質である。
フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）は、肝酵素フェニルアラニン水酸化酵素（ＰＡＨ）の遺
伝子における突然変異によって特徴づけられる常染色体劣性の遺伝性代謝疾患であり、そ
の遺伝子を非機能性にする。この酵素は、フェニルアラニンを代謝してチロシンにするた
めに必要である。ＰＡＨの活性が低下すると、フェニルアラニンが蓄積してフェニルピル
ビン酸（フェニルケトンとしても知られる）に変換され、尿中に検出される。未治療の小
児は、出生時は正常であるが、初期発達の節目に到達することができず、小頭症を発症し
、進行性能機能障害を示す。多動、ＥＥＧ異常および発作、ならびに学習障害が、後に起
こる主な臨床上の問題である。皮膚、毛髪、汗、および尿の特徴的な臭い（フェニル酢酸
の蓄積による）、ならびに色素沈着低下の傾向および湿疹も観察される。すべてのＰＫＵ
患者は、フェニルアラニンの少ない特別な食事制限を忠実に守る必要がある。したがって
、少数のＰｈｅ残基を含むかまたは全く含まない栄養タンパク質が、ＰＫＵ患者には望ま
しい。そのようなタンパク質は、Ｐｈｅ残基をわずかに有するかまたはまったく有しない
本明細書において提供される栄養タンパク質を選択することによって得ることができる。
したがって、いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、５％、４％、３％、２％
、または１％以下の全アミノ酸残基に対するＰｈｅ残基の割合を含む。いくつかの実施形
態において、栄養タンパク質は、１０個以下のＰｈｅ残基、９個以下のＰｈｅ残基、８個
以下のＰｈｅ残基、７個以下のＰｈｅ残基、６個以下のＰｈｅ残基、５個以下のＰｈｅ残
基、４個以下のＰｈｅ残基、３個以下のＰｈｅ残基、２個以下のＰｈｅ残基、１個のＰｈ
ｅ残基、または０個のＰｈｅ残基を含む。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質
は、Ｐｈｅ残基を含まない。
アルギニンは、条件付きで非必須アミノ酸である、すなわち、ほとんど常に人体によっ
て製造され得るため、食事を通して直接的に得る必要はない。栄養不良の個体、高齢者、
または特定の身体的条件（例えば、敗血症）を有する人々は、十分な量のアルギニンを生
成しない場合があり、したがって、アルギニンを含有する食物の摂取量を増加させる必要
がある。アルギニンは、創傷治癒時間の短縮（特に骨）、および血圧低下、特にハイリス
ク妊娠中の高血圧（子癇前症）の低下を含む、有益な健康特性を有すると考えられている
。さらに、研究により、Ｌ－アルギニンの食事補給は、自然発生型の子宮内発育遅延を伴
うブタの繁殖成績の向上、授乳中の仔ブタのタンパク質の沈着および出生後の発育の向上
、ストレプトゾトシン糖尿病ラットにおける血漿グルコース値の正常化、ズッカー糖尿病
肥満（ＺＤＦ）ラットにおける体脂肪量の減少、および糖尿病ラットにおける血管機能の
向上に有益であることが示されている。これらの利点を本明細書に開示される栄養タンパ
ク質の少なくとも１つの有用性と組み合わせるために、本明細書に開示される栄養タンパ
ク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、３％以上、４％以上、５％以上
、６％以上、７％以上、８％以上、９％以上、１０％以上、１１％以上、または１２％以
上の栄養タンパク質中の全アミノ酸残基に対するアルギニン残基の割合を含む。
消化率は、栄養タンパク質の栄養上の利点および有用性に関するパラメータである。消
化の相対的完全性に関する情報は、ペプチドの生物学的利用能の予測因子として機能する
ことができる（Ｄａｎｉｅｌ，Ｈ．，２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｎｔｅ
ｇｒａｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌｕｍｅ ６６，ｐｐ．３６１－３８４）。いくつかの実施形態において、本明細書に
開示される栄養タンパク質は、それらの消化率を評価するためにスクリーニングされる。
栄養タンパク質の消化率は、当該技術分野において既知のいずれの好適な方法によって評
価されてもよい。いくつかの実施形態において、消化率は、模擬胃内消化および模擬腸内
消化といったタンパク質消化の一方または両方の段階を含む、生理的に適切なインビトロ
消化反応によって評価される（例えば、Ｍｏｒｅｎｏ，ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｓｔ
ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ
２Ｓ ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂｅｒ ｅ １）ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒ
ｅｌｅｖａｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔ
ｉｏｎ．ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｐ．３４１－３５２、Ｍａｒｔｏｓ，Ｇ．，Ｃｏ
ｎｔｒｅｒａｓ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｅ．＆Ｌｏｐｅｚ－Ｆａｎｄｉｎｏ，Ｒ．，２０
１０．Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ Ｍｉｍｉｃｋｉ
ｎｇ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．５６４０－５
６４８、Ｍｏｒｅｎｏ，Ｆ．Ｊ．，Ｍａｃｋｉｅ，Ａ．Ｒ．＆Ｃｌａｒｅ Ｍｉｌｌｓ，
Ｅ．Ｎ．，２００５．Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｔ
ｅｃｔ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ａｌｌｅｒｇｅｎ ａ－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ
ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ，ｐｐ．９８１０－９８１６を参照のこと）。端的に述べると、試験タンパク質を、連
続的に模擬胃液（ＳＧＦ）に１２０分間曝露し（流動食の９０％が胃から小腸に通過する
のに必要な時間の長さ、Ｋｏｎｇ，Ｆ．＆Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｐ．，２００８．Ｄｉｓｉｎ
ｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｆｏｏｄｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｏｍａｃ
ｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．６７－８０を参照のこと
）、次いで、模擬十二指腸液（ＳＤＦ）に移してさらに１２０分消化させる。異なる消化
段階（例えば、２、５、１５、３０、６０、および１２０分）にある試料を電気泳動（例
えば、チップ電気泳動またはＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により分析し、インタクトなタンパク質
だけでなく任意の大きな消化断片（例えば、４ｋＤａ超）のサイズおよび量をモニタリン
グする。経時的なタンパク質の消失は、アッセイ中にタンパク質が消化される速度を示す
。観察されるインタクトなタンパク質の量を経時的にモニタリングすることにより、ＳＧ
Ｆについて消化の半減期（τ１／２）を算出し、ＳＧＦによる処置の後にインタクトなタ
ンパク質が検出された場合、ＳＩＦについて消化のτ１／２を算出する。このアッセイは
、相対的な消化率（すなわち、乳清等の基準タンパク質に対する）を評価するため、また
は絶対的な消化率を評価するために使用することができる。いくつかの実施形態において
、栄養タンパク質の消化率は、乳清タンパク質よりも高い（すなわち、ＳＧＦ τ１／２
および／またはＳＩＦ τ１／２がそれより短い）。いくつかの実施形態において、栄養
タンパク質は、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、４分以下
、３分以下、２分以下、または１分以下のＳＧＦ τ１／２を有する。いくつかの実施形
態において、栄養タンパク質は、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５
分以下、４分以下、３分以下、２分以下、または１分以下のＳＩＦ τ１／２を有する。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２分、５分、１５分、３０分、６０分
、または１２０分まで、ＳＧＦおよびＳＩＦアッセイの一方または両方において検出不可
能である。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、ＳＧＦおよびＳＩＦの一方
または両方において一定速度および／または制御された速度で消化される。そのような実
施形態において、栄養タンパク質の消化の速度は、最大限の消化速度のために最適化され
ていないかもしれない。そのような実施形態では、ＳＧＦおよびＳＩＦの一方または両方
においてより迅速な初期速度で消化される同様のアミノ酸組成物の栄養タンパク質の場合
と比べて、哺乳動物による経口摂取後のタンパク質の吸収速度はより緩徐である場合があ
り、経口摂取後に吸収が起こる合計時間はより長い場合がある。いくつかの実施形態にお
いて、栄養タンパク質は、完全にまたは実質的に完全にＳＧＦ中で消化される。いくつか
の実施形態において、栄養タンパク質は、ＳＧＦによって実質的に消化されないかまたは
消化されない：ほとんどのそのような実施形態において、タンパク質はＳＩＦ中で消化さ
れる。消化プロテアーゼに耐性を示すタンパク質またはタンパク質の大きな断片は、アレ
ルギー反応を引き起こすより高いリスクを有し得るため、タンパク質の消化率を評価する
ことにより、タンパク質の潜在的なアレルゲン性についても理解することができる（Ｇｏ
ｏｄｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓｅ
ｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｒｏｐｓ － ｗ
ｈａｔ ｍａｋｅｓ ｓｅｎｓｅ？Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．
７３－８１）。チップ電気泳動分析には小さ過ぎるペプチドを検出および同定するために
、液体クロマトグラフィーおよび質量分析法を使用することができる。ＳＧＦ試料中で、
ＬＣ／ＭＳによりペプチドを直接的に検出および同定することができる。ＳＩＦによるタ
ンパク質消化は、ＬＣ／ＭＳによる検出および同定の前に胆汁酸を除去するための精製を
必要とする場合がある。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質の消化率は、タンパク質アミノ酸配列の
消化性プロテアーゼ認識部位の同定および定量化によって評価される。いくつかの実施形
態において、栄養タンパク質は、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、およびキモト
リプシン認識部位から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む。
本明細書において使用される場合、「ペプシン認識部位」は、ペプシンによって切断さ
れることが実験的に分かっているポリペプチド配列中の任意の部位である。いくつかの実
施形態において、それは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｇｌｕ、およびＧ
ｌｎから選択されるアミノ酸残基の後の（すなわち、その下流の）ペプチド結合であるが
、但し、それに続く残基は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、およびＶａｌから選択されるアミノ酸残基
ではない。
本明細書において使用される場合、「トリプシン認識部位」は、トリプシンによって切
断されることが実験的に分かっているポリペプチド配列中の任意の部位である。いくつか
の実施形態において、それは、ＬｙｓまたはＡｒｇから選択されるアミノ酸残基の後のペ
プチド結合であるが、但し、それに続く残基はプロリンではない。
本明細書において使用される場合、「キモトリプシン認識部位」は、キモトリプシンに
よって切断されることが実験的に分かっているポリペプチド配列中の任意の部位である。
いくつかの実施形態において、それは、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＬｅｕから選択
されるアミノ酸残基の後のペプチド結合である。
タンパク質中のジスルフィド結合したシステイン残基は、ジスルフィド結合が存在しな
い場合と比較してタンパク質の消化速度を低下させる傾向がある。例えば、タンパク質ｂ
－ラクトグロブリンの消化速度は、そのジスルフィド架橋が切断されると増加することが
示されている（Ｉ．Ｍ．Ｒｅｄｄｙ，Ｎ．Ｋ．Ｄ．Ｋｅｌｌａ，ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｋｉｎ
ｓｅｌｌａ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓ
ｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ｂ－Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ
ｔｏ Ｐｅｐｔｉｃ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔｒｙｐｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ”．Ｊ．
Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．１９８８，３６，７３７－７４１）。したがって、よ
り少ないジスルフィド結合を有する栄養タンパク質の消化率は、より多い数のジスルフィ
ド結合を有する同等の栄養タンパク質よりも高い傾向がある。いくつかの実施形態におい
て、本明細書に開示される栄養タンパク質は、それぞれに存在するシステイン残基の数を
同定するために、具体的には、比較的少ない数のシステイン残基を含む栄養タンパク質の
選択を可能にするためにスクリーニングされる。例えば、天然に存在する栄養タンパク質
または断片は、Ｃｙｓ残基を含まないか、または比較的少ない数のＣｙｓ残基、例えば、
１０個以下のＣｙｓ残基、９個以下のＣｙｓ残基、８個以下のＣｙｓ残基、７個以下のＣ
ｙｓ残基、６個以下のＣｙｓ残基、５個以下のＣｙｓ残基、４個以下のＣｙｓ残基、３個
以下のＣｙｓ残基、２個以下のＣｙｓ残基、１個のＣｙｓ残基、もしくは０個のＣｙｓ残
基を含むと同定されてもよい。いくつかの実施形態において、天然に存在する栄養タンパ
ク質またはその断片の１つ以上のＣｙｓ残基が、欠失により、および／または別のアミノ
酸との置換により除去される。いくつかの実施形態において、１個のＣｙｓ残基が欠失も
しくは置換されるか、１個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、２個以上のＣ
ｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、３個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換される
か、４個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、５個以上のＣｙｓ残基が欠失も
しくは置換されるか、６個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、７個以上のＣ
ｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、８個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換される
か、９個以上のＣｙｓ残基が欠失もしくは置換されるか、または１０個以上のＣｙｓ残基
が欠失もしくは置換される。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、
５％、４％、３％、２％、または１％以下の全アミノ酸残基に対するＣｙｓ残基の割合を
含む。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、１０個以下のＣｙｓ残基、９個
以下のＣｙｓ残基、８個以下のＣｙｓ残基、７個以下のＣｙｓ残基、６個以下のＣｙｓ残
基、５個以下のＣｙｓ残基、４個以下のＣｙｓ残基、３個以下のＣｙｓ残基、２個以下の
Ｃｙｓ残基、１個のＣｙｓ残基、または０個のＣｙｓ残基を含む。いくつかの実施形態に
おいて、栄養タンパク質は、１個以下のＣｙｓ残基を含む。いくつかの実施形態において
、栄養タンパク質は、Ｃｙｓ残基を含まない。
代替的にまたは付加的に、栄養タンパク質中に存在するかまたは存在し得るジスルフィ
ド結合が除去されてもよい。ジスルフィドは、βメルカプトエタノール、ジチオスレイト
ール（ＤＴＴ）、またはトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）等の還
元剤を用いてジスルフィドを２つのチオール基に還元することにより、化学的方法を用い
て除去することができる。次いで、ヨードアセトアミド、Ｎ－エチルマレイミド、または
亜硫酸ナトリウム等の試薬を用いて、チオールを共有結合的に修飾するかまたは「キャッ
ピング」することができる（例えば、Ｃｒａｎｋｓｈａｗ，Ｍ．Ｗ．ａｎｄ Ｇｒａｎｔ
，Ｇ．Ａ．２００１．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｙｓｔｅｉｎｅ．Ｃｕｒｒｅ
ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１５．１．１－１
５．１．１８を参照のこと）。
真核生物のタンパク質は、しばしばグリコシル化され、タンパク質に付着した炭水化物
鎖が種々の機能を果たす。Ｎ結合型およびＯ結合型グリコシル化は、タンパク質に起こる
最も一般的な２つのグリコシル化の形態である。Ｎ結合型グリコシル化は、タンパク質の
アミノ酸残基における糖分子の窒素原子への付着である。Ｎ結合型グリコシル化は、アス
パラギンおよびアルギニン残基で起こる。Ｏ結合型グリコシル化は、タンパク質のアミノ
酸残基における糖分子の酸素原子への付着である。Ｏ結合型グリコシル化は、スレオニン
およびセリン残基で起こる。
グリコシル化タンパク質は、非グリコシル化形態よりも可溶性が高いことが多い。タン
パク薬物に関して、適切なグリコシル化は、通常、血液における高い活性、適切な抗原結
合、さらなる安定性等を付与する。しかしながら、グリコシル化は、糖部分を「それと一
緒に担持する」タンパク質を必然的に意味する。そのような糖部分は、組換え栄養タンパ
ク質を含む本開示の栄養タンパク質の有用性を低下させ得る。例えば、実施例に示される
ように、同じタンパク質のグリコシル化形態と非グリコシル化形態の消化の比較は、非グ
リコシル化形態がグリコシル化形態よりも迅速に消化されることを示している。これらの
理由から、いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、低グリコシル
化を含むかまたは全くグリコシル化を含まない。例えば、いくつかの実施形態において、
栄養タンパク質は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくと
も９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも
９９％の全アミノ酸残基に対する非グリコシル化の割合を含む。いくつかの実施形態にお
いて、栄養タンパク質は、いずれのグリコシル化も含まない。
いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、生成された後または単
離された後で脱グリコシル化される。低グリコシル化されたまたは全くグリコシル化され
ていない栄養タンパク質は、当該技術分野で既知のいずれの方法によって作製されてもよ
い。例えば、酵素的および／または化学的方法が用いられてもよい（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ
．（２００３）３７６，ｐ３３９－３５０）。酵素は、Ｎ結合型およびＯ結合型オリゴ糖
の除去のために研究規模で商業的に生成されている。化学的方法は、Ｎ結合型およびＯ結
合型ペプチド－糖結合を選択的に破壊するためのトリフルオロメタンスルホン酸の使用を
含む。この方法は、酵素的方法の使用よりもさらに完全な脱グリコシル化をもたらすこと
が多い。
他の実施形態において、本開示による栄養タンパク質は、宿主生物による低グリコシル
化によりまたは全くグリコシル化しないことにより生成される。ほとんどの細菌および他
の原核生物は、タンパク質、特に異種タンパク質をグリコシル化する能力が非常に限られ
ている。したがって、本開示のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、組換え
タンパク質のグリコシル化のレベルが低くなるかまたは全くグリコシル化されないように
、微生物において組換えによって作製される。いくつかの実施形態において、組換え栄養
タンパク質のグリコシル化のレベルは、それが誘導される生物において起こるようなタン
パク質のグリコシル化のレベルよりも低い。
いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質またはポリペプチドは、全
アミノ酸に対するＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択されるアミノ酸の２０
％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、
１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６
％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下の割合を含む。いくつかの
実施形態において、本開示による栄養タンパク質またはポリペプチドは、Ａｓｎ、Ａｒｇ
、Ｓｅｒ、およびＴｈｒから選択されるアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態におい
て、本開示による栄養タンパク質またはポリペプチドは、２０個未満、１９個未満、１８
個未満、１７個未満、１６個未満、１５個未満、１４個未満、１３個未満、１２個未満、
１１個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、６個未満、５個未満、４個未
満、３個未満、２個未満、１個未満、または０個のＡｓｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、およびＴｈ
ｒから選択されるアミノ酸を含む。
本明細書において使用される場合、「安定な」タンパク質は、該当するタンパク質の生
物物理学的形質（例えば、溶解性）、生物学的形質（例えば、消化率）、または組成上の
形質（例えば、ロイシンアミノ酸の割合）を改変する変化（例えば、アンフォールディン
グ、酸化、凝集、加水分解等）に抵抗を示すタンパク質である。
タンパク質の安定性は、当該技術分野で既知の種々のアッセイを用いて測定することが
でき、本明細書に開示される栄養タンパク質および閾値を上回る安定性を有する栄養タン
パク質を選択することができる。いくつかの実施形態において、乳清タンパク質の熱安定
性に匹敵するかまたはそれよりも良好な熱安定性を示すタンパク質が選択される。熱安定
性は、栄養タンパク質の寿命を予測するのに役立ち得る特性である。栄養タンパク質試料
のアッセイ安定性のいくつかの実施形態において、極端な温度に曝露した後にサイズ排除
クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して凝集形成をモニタリングすることにより試料が
決定される。検査されるタンパク質の水性試料を９０℃の加熱ブロックに配置し、０、１
、５、１０、３０、および６０分後にＳＥＣ分析のために試料を採取する。タンパク質は
、２１４ｎｍで吸光度をモニタリングすることにより検出され、凝集体は、該当するタン
パク質よりも迅速に溶出するピークとして特徴づけられる。ピーク面積に全体的な変化が
見られないことは、加熱処理中にタンパク質の沈殿がないことを示唆する。乳清タンパク
質は、そのようなアッセイにおいて９０℃に曝露されると約８０％の凝集体を急速に形成
することが示されている。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質の熱安定性は、温度の上昇に伴ってタン
パク質が変性するにつれて形成される凝集タンパク質に結合する疎水性色素（例えば、Ｐ
ｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商標）Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａ
ｓｓａｙ ｋｉｔ，Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下で、２５℃から９
５℃まで徐々に試料を加熱することによって決定される（Ｎｉｅｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．，Ｂｅ
ｒｇｌｕｎｄ，Ｈ．＆Ｖａｄａｄｉ，Ｍ．，２００７．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｆｆ
ｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｍｏｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐｐ．
２２１２－２２２１）。結合すると色素の蛍光が著しく増加するので、それをｒｔＰＣＲ
機器により記録し、タンパク質の溶融曲線によって表す（Ｌａｖｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｊ．，
Ｈａｒｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｕｉｌｌｉｖａｎ，Ｂ．Ｊ．＆Ｍａｇｉｌｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．，２
００９．Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ：Ａ Ｇ
ｅｎｅｒａｌ，Ｒａｐｉｄ Ｄｙｅ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓ
ｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ｐｐ．３７９４－３
７９５）。熱シフトが終了した後、試料を不溶性沈殿物について調べ、分析用のサイズ排
除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに分析する。
いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、抗凝集性を示し、例えば、
高温（例えば、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、または９５℃）で８
０％未満の凝集、１０％の凝集、または検出不能な凝集を示す。
本明細書に開示されるような安定な栄養タンパク質の１つの利点は、ある場合には、冷
蔵または冷却の必要なしに、使用前に長期間保存できる場合があることである。いくつか
の実施形態において、栄養タンパク質は、（例えば、凍結乾燥により）乾燥形態に加工さ
れる。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、凍結乾燥すると安定である。い
くつかの実施形態において、そのような凍結乾燥した栄養タンパク質は、再構成すると（
例えば、液体製剤）それらの安定性を維持する。
ほとんどの実施形態の場合、栄養タンパク質が不適切に高いアレルゲン性を示さないこ
とが好ましい。したがって、いくつかの実施形態において、栄養タンパク質の潜在的なア
レルゲン性が評価される。これは、当該技術分野において既知のいずれの好適な方法によ
って行われてもよい。いくつかの実施形態において、アレルゲン性スコアが算出される。
アレルゲン性スコアは、あるタンパク質が任意の既知のアレルゲンにどれほど類似するか
を評価するための、ＷＨＯの推奨（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆａｏ．ｏｒｇ／ａｇ／ａｇ
ｎ／ｆｏｏｄ／ｐｄｆ／ａｌｌｅｒｇｙｇｍ．ｐｄｆ）を基準とした配列に基づく主要な
測定基準であり、主要仮説は、標的と既知のアレルゲンとの間の高い同一性パーセントは
交差反応を示唆する可能性が高いというものである。所与のタンパク質の場合、アレルギ
ー反応を誘発する可能性は、配列相同性に基づく試験の相補的な対の一方または両方によ
り評価することができる。最初の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックス、ギャップ
オープンペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ２を用いてＦＡＳＴＡアルゴリ
ズムを使用して、既知のアレルゲンのデータベースに対するグローバル－グローバル配列
アラインメントにより配列全体にわたるタンパク質の同一性パーセントを決定する。５０
％未満の全体的相同性を有するタンパク質は、アレルゲン性である可能性が低いことが示
唆されている（Ｇｏｏｄｍａｎ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ ａ
ｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｒｏｐｓ－
ｗｈａｔ ｍａｋｅｓ ｓｅｎｓｅ？Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，７３－８１（２０
０８）、Ａａｌｂｅｒｓｅ Ｒ．Ｃ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ａ
ｌｌｅｒｇｅｎｓ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０６，２２８－
２３８（２０００））。
栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、分析に使用される
データベース中の任意の既知のアレルゲンに対して５０％未満の全体的相同性を有する。
いくつかの実施形態において、４０％未満の相同性のカットオフが用いられる。いくつか
の実施形態において、３０％未満の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形
態において、２０％未満の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態におい
て、１０％未満の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、４０
％～５０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３０％～５０％の
カットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、２０％～５０％のカットオフが
用いられる。いくつかの実施形態において、１０％～５０％のカットオフが用いられる。
いくつかの実施形態において、５％～５０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施
形態において、０％～５０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、
分析に使用されるデータベース中の任意の既知のアレルゲンに対して５０％を超える全体
的相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、５０％～６０％のカ
ットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、５０％～７０％のカットオフが用
いられる。いくつかの実施形態において、５０％～８０％のカットオフが用いられる。い
くつかの実施形態において、５０％～９０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施
形態において、５５％～６０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において
、６５％～７０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、７０％～７
５％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、７５％～８０％のカット
オフが用いられる。
第２の試験は、ＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックス、ギャップオープンペナルティ１０
、およびギャップ伸長ペナルティ２を用いてＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、各断片
の既知のアレルゲンのデータベースに対するグローバル‐ローカル配列アラインメントに
より、すべての可能性のある連続する８０個のアミノ酸断片の局所的アレルゲン性を決定
することによってタンパク質配列に沿った局所的アレルゲン性を評価する。任意のアレル
ゲンを有する任意の８０個のアミノ酸ウィンドウの最も高い同一性パーセントを、該当す
るタンパク質の最終スコアとして採用する。ＷＨＯのガイドラインは、この断片試験には
３５％の同一性カットオフを用いることを提案している。栄養タンパク質のいくつかの実
施形態において、栄養タンパク質のすべての可能性のある断片は、この試験を用いる分析
に使用されるデータベース中の任意の既知のアレルゲンに対して３５％未満の局所的相同
性を有する。いくつかの実施形態において、３０％未満の相同性のカットオフが用いられ
る。いくつかの実施形態において、３０％～３５％の相同性のカットオフが用いられる。
いくつかの実施形態において、２５％～３０％の相同性のカットオフが用いられる。いく
つかの実施形態において、２０％～２５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつか
の実施形態において、１５％～２０％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実
施形態において、１０％～１５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形
態において、５％～１０％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態にお
いて、０％～５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３
５％を超える相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～
４０％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、４０％～４５
％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、４５％～５０％の
相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、５０％～５５％の相同
性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、５５％～６０％の相同性の
カットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、６５％～７０％の相同性のカッ
トオフが用いられる。いくつかの実施形態において、７０％～７５％の相同性のカットオ
フが用いられる。いくつかの実施形態において、７５％～８０％の相同性のカットオフが
用いられる。
当業者は、この目的に好適な既知のアレルゲンのデータベースを特定および使用するこ
とができる。いくつかの実施形態において、１つより多くのデータベースソースからタン
パク質を選択することにより、データベースがカスタムメイドされる。いくつかの実施形
態において、カスタムデータベースは、Ｆｏｏｄ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ
ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍによって収集された統合アレルゲンリスト（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎｏｎｌｉｎｅ．ｏｒｇ／）、ＵＮＩＰＲＯＴ注
釈（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｄｏｃｓ／ａｌｌｅｒｇｅｎ）、
およびＳｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃ Ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ（ＳＤＡＰ，ｈｔｔｐ：／／ｆｅｒｍｉ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ＳＤＡＰ／ｓｄ
ａｐ＿ｌｎｋ．ｈｔｍｌ）を含む。このデータベースは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｉｔｉｅｓ（ＩＵＩＳ、ｈ
ｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｌｌｅｒｇｅｎ．ｏｒｇ／）によって現在認識されているすべて
のアレルゲン、および正式には名付けられていない多数のさらなるアレルゲンを含む。い
くつかの実施形態において、データベースは、既知のデータベースで入手可能な既知のア
レルゲンタンパク質のサブセットを含む：すなわち、このデータベースは、既知のアレル
ゲンタンパク質のカスタム選択されたサブセットである。いくつかの実施形態において、
既知のアレルゲンのデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個
のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なく
とも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタン
パク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくと
も５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタン
パク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくと
も１，０００個のタンパク質、少なくとも１，１００個のタンパク質、少なくとも１，２
００個のタンパク質、少なくとも１，３００個のタンパク質、少なくとも１，４００個の
タンパク質、少なくとも１，５００個のタンパク質、少なくとも１，６００個のタンパク
質、少なくとも１，７００個のタンパク質、少なくとも１，８００個のタンパク質、少な
くとも１，９００個のタンパク質、または少なくとも２，０００個のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態において、既知のアレルゲンのデータベースは、１００～５００個の
タンパク質、２００～１，０００個のタンパク質、５００～１，０００個のタンパク質、
５００～１，０００個のタンパク質、または１，０００～２，０００個のタンパク質を含
む。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質の異なる長さの連続するアミノ酸ウィン
ドウ（例えば、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、８、または６アミノ酸ウィ
ンドウ）のすべて（または選択されたサブセット）をアレルゲンデータベースに対して検
査し、１００％の同一性、９５％以上の同一性、９０％以上の同一性、８５％以上の同一
性、８０％以上の同一性、７５％以上の同一性、７０％以上の同一性、６５％以上の同一
性、６０％以上の同一性、５５％以上の同一性、または５０％以上の同一性マッチを有す
るペプチド配列を、潜在的なアレルゲン性のさらなる調査のために同定する。
タンパク質のアレルゲン性を予測する別の方法は、ヒト起源のタンパク質に対するタン
パク質の相同性を評価することである。ヒト免疫系は、可能性のある数多くのアレルゲン
性タンパク質に定期的に曝露され、宿主の体のタンパク質と外来性タンパク質とを区別す
る固有の能力を有する。この能力の正確な性質は常に明確であるわけではなく、体が自身
を非自身から区別することに失敗した結果として生じる多くの疾患が存在する（例えば、
関節炎）。それにもかかわらず、基本的仮説は、ヒトタンパク質とある程度の配列相同性
を共有するタンパク質は、免疫反応を引き起こす可能性が低いというものである。特に、
これは、既知のアレルゲンメンバー（トロポミオシン、パルブアルブミン、カゼイン）を
有するいくつかのタンパク質ファミリーについて示されており、既知のアレルゲンタンパ
ク質と比べてそれらのヒトのカウンターパートに対するより多くの配列相同性を有するこ
れらのタンパク質は、アレルゲン性ではないと考えられる（Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｊ．Ａ．ｅ
ｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈｏ
ｍｏｌｏｇｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｉｍｃａｌ
ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２
０（２００７）：１３９９－１４０５）。所与のタンパク質の場合、ＢＬＯＳＵＭ５０置
換マトリックス、ギャップオープンペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ２を
用いてＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、グローバル－ローカルアラインメントからの
ヒトタンパク質のデータベース（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース）に対するタンパ
ク質の最大同一性パーセントを決定することによりヒト相同性スコアが測定されるＪｅｎ
ｋｉｎｓら（Ｊｅｎｋｉｎｓ Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｄｉｓ
ｔａｎｃｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｓ ｒｅｆｌｅｃｔｓ ａｌｌｅｒ
ｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｆｏｏｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ．Ａｌｌｅｒ
ｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０（２００７）：１３９９－１４０５）によれば
、約６２％を超えるヒトタンパク質に対する配列同一性を有するタンパク質は、アレルゲ
ン性である可能性が低い。当業者は、例えば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース（ｈｔｔｐ：
／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索することにより、この目的に好適な既知の
ヒトタンパク質のデータベースを特定および使用することができる。いくつかの実施形態
において、１つより多くのデータベースソースからタンパク質を選択することにより、デ
ータベースがカスタムメイドされる。当然、データベースは、包括的であってもよいが、
そうである必要はない。いくつかの実施形態において、データベースは、ヒトタンパク質
のサブセットを含む：すなわち、このデータベースは、ヒトタンパク質のカスタム選択さ
れたサブセットである。いくつかの実施形態において、ヒトタンパク質のデータベースは
、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個の
タンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくと
も１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタン
パク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくと
も６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタン
パク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少な
くとも２，０００個のタンパク質、少なくとも３，０００個のタンパク質、少なくとも４
，０００個のタンパク質、少なくとも５，０００個のタンパク質、少なくとも６，０００
個のタンパク質、少なくとも７，０００個のタンパク質、少なくとも８，０００個のタン
パク質、少なくとも９，０００個のタンパク質、または少なくとも１０，０００個のタン
パク質を含む。いくつかの実施形態において、データベースは、１００～５００個のタン
パク質、２００～１，０００個のタンパク質、５００～１，０００個のタンパク質、５０
０～１，０００個のタンパク質、１，０００～２，０００個のタンパク質、１，０００～
５，０００個のタンパク質、または５，０００～１０，０００個のタンパク質を含む。い
くつかの実施形態において、データベースは、すべての既知のヒトタンパク質の少なくと
も９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％を含む。
栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、ヒトタンパク質と
少なくとも２０％相同である。いくつかの実施形態において、少なくとも３０％の相同性
のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも４０％の相同性の
カットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも５０％の相同性のカ
ットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも６０％の相同性のカッ
トオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも７０％の相同性のカット
オフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも８０％の相同性のカットオ
フが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも６２％の相同性のカットオフ
が用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも２０％の相同性～少なくとも３
０％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも３０
％の相同性～少なくとも４０％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態
において、少なくとも５０％の相同性～少なくとも６０％の相同性のカットオフが用いら
れる。いくつかの実施形態において、少なくとも６０％の相同性～少なくとも７０％の相
同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、少なくとも７０％の相同
性～少なくとも８０％の相同性のカットオフが用いられる。
ほとんどの実施形態の場合、栄養タンパク質が不適切に高い毒性を示さないことが好ま
しい。したがって、いくつかの実施形態において、栄養タンパク質の潜在的な毒性が評価
される。これは、当該技術分野において既知のいずれの好適な方法によって行われてもよ
い。いくつかの実施形態において、既知の毒性タンパク質（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴデー
タベースから特定された毒性タンパク質）のデータベースに対するタンパク質の同一性パ
ーセントを決定することにより毒性スコアが算出される。ＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリッ
クス、ギャップオープンペナルティ１０、およびギャップ伸長ペナルティ２を用いてＦＡ
ＳＴＡアルゴリズムを使用して、既知の毒素のデータベースに対する該当するタンパク質
のグローバル－グローバルアラインメントが行われる。栄養タンパク質のいくつかの実施
形態において、栄養タンパク質は、既知の毒素と３５％未満相同である。いくつかの実施
形態において、３５％未満の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態にお
いて、３０％～３５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において
、２５％～３５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、２
０％～３５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、１５％
～３５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、１０％～３
５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、５％～３５％の
相同性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、０％～３５％の相同性
のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％を超える相同性のカッ
トオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～４０％の相同性のカットオ
フが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～４５％の相同性のカットオフが
用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～５０％の相同性のカットオフが用い
られる。いくつかの実施形態において、３５％～５５％の相同性のカットオフが用いられ
る。いくつかの実施形態において、３５％～６０％の相同性のカットオフが用いられる。
いくつかの実施形態において、３５％～７０％の相同性のカットオフが用いられる。いく
つかの実施形態において、３５％～７５％の相同性のカットオフが用いられる。いくつか
の実施形態において、３５％～８０％の相同性のカットオフが用いられる。当業者は、例
えば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）
を検索することにより、この目的に好適な既知の毒素のデータベースを特定および使用す
ることができる。いくつかの実施形態において、１つより多くのデータベースソースから
毒素として同定されたタンパク質を選択することにより、データベースがカスタムメイド
される。いくつかの実施形態において、データベースは、既知の毒性タンパク質のサブセ
ットを含む：すなわち、このデータベースは、既知の毒性タンパク質のカスタム選択され
たサブセットである。いくつかの実施形態において、毒性タンパク質のデータベースは、
少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０個のタンパク質、少なくとも３０個のタ
ンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少なくとも５０個のタンパク質、少なくとも
１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタンパク質、少なくとも３００個のタンパ
ク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なくとも５００個のタンパク質、少なくとも
６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタンパク質、少なくとも８００個のタンパ
ク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なくとも１，０００個のタンパク質、少なく
とも２，０００個のタンパク質、少なくとも３，０００個のタンパク質、少なくとも４，
０００個のタンパク質、少なくとも５，０００個のタンパク質、少なくとも６，０００個
のタンパク質、少なくとも７，０００個のタンパク質、少なくとも８，０００個のタンパ
ク質、少なくとも９，０００個のタンパク質、または少なくとも１０，０００個のタンパ
ク質を含む。いくつかの実施形態において、データベースは、１００～５００個のタンパ
ク質、２００～１，０００個のタンパク質、５００～１，０００個のタンパク質、５００
～１，０００個のタンパク質、１，０００～２，０００個のタンパク質、１，０００～５
，０００個のタンパク質、または５，０００～１０，０００個のタンパク質を含む。
いくつかの実施形態の場合、栄養タンパク質が抗栄養活性（「抗栄養性」（ａｎｔｉ－
ｎｕｔｒｉｃｉｔｙ））（すなわち、食物からの栄養素の吸収を妨げる可能性を有するタ
ンパク質）を示さないことが好ましい。抗栄養因子の例として、トリプシン、ペプシン、
および他の腸内プロテアーゼの活性を阻害し、タンパク質の消化およびその後の吸収を妨
げるプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態において、栄養
タンパク質の潜在的な抗栄養性が評価される。これは、当該技術分野において既知のいず
れの好適な方法によって行われてもよい。いくつかの実施形態において、既知のプロテア
ーゼ阻害剤（例えば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベースから特定されたプロテアーゼ阻害剤）
のデータベースに対するタンパク質の同一性パーセントを決定することにより抗栄養性ス
コアが算出される。栄養タンパク質が既知の抗栄養タンパク質に相同であるかどうかを同
定するために、ＢＬＯＳＵＭ５０置換マトリックス、ギャップオープンペナルティ１０、
およびギャップ伸長ペナルティ２を用いてＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用して、既知のプ
ロテアーゼ阻害剤のデータベースに対する該当するタンパク質のグローバル－グローバル
アラインメントが行われる。栄養タンパク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパ
ク質は、分析に使用されるデータベース中の任意の既知の抗栄養タンパク質（例えば、任
意の既知のプロテアーゼ阻害剤）に対して３５％未満の全体的相同性を有する。いくつか
の実施形態において、３５％未満の同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形
態において、３０％～３５％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、
２５％～３５％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、２０％～３５
％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、１５％～３５％のカットオ
フが用いられる。いくつかの実施形態において、１０％～３５％のカットオフが用いられ
る。いくつかの実施形態において、５％～３５％のカットオフが用いられる。いくつかの
実施形態において、０％～３５％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態におい
て、３５％を超える同一性のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３
５％～４０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～４５％
のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～５０％のカットオフ
が用いられる。いくつかの実施形態において、３５％～５５％のカットオフが用いられる
。いくつかの実施形態において、３５％～６０％のカットオフが用いられる。いくつかの
実施形態において、３５％～７０％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態にお
いて、３５％～７５％のカットオフが用いられる。いくつかの実施形態において、３５％
～８０％のカットオフが用いられる。当業者は、例えば、ＵＮＩＰＲＯＴデータベース（
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）を検索することにより、この目的に好
適な既知のプロテアーゼ阻害剤のデータベースを特定および使用することができる。いく
つかの実施形態において、１つより多くのデータベースソースからプロテアーゼ阻害剤と
して同定されたタンパク質を選択することにより、データベースがカスタムメイドされる
。いくつかの実施形態において、データベースは、データベースで入手可能な既知のプロ
テアーゼ阻害剤のサブセットを含む：すなわち、このデータベースは、既知のプロテアー
ゼ阻害剤のカスタム選択されたサブセットである。いくつかの実施形態において、既知の
プロテアーゼ阻害剤のデータベースは、少なくとも１０個のタンパク質、少なくとも２０
個のタンパク質、少なくとも３０個のタンパク質、少なくとも４０個のタンパク質、少な
くとも５０個のタンパク質、少なくとも１００個のタンパク質、少なくとも２００個のタ
ンパク質、少なくとも３００個のタンパク質、少なくとも４００個のタンパク質、少なく
とも５００個のタンパク質、少なくとも６００個のタンパク質、少なくとも７００個のタ
ンパク質、少なくとも８００個のタンパク質、少なくとも９００個のタンパク質、少なく
とも１，０００個のタンパク質、少なくとも１，１００個のタンパク質、少なくとも１，
２００個のタンパク質、少なくとも１，３００個のタンパク質、少なくとも１，４００個
のタンパク質、少なくとも１，５００個のタンパク質、少なくとも１，６００個のタンパ
ク質、少なくとも１，７００個のタンパク質、少なくとも１，８００個のタンパク質、少
なくとも１，９００個のタンパク質、または少なくとも２，０００個のタンパク質を含む
。いくつかの実施形態において、既知のプロテアーゼ阻害剤のデータベースは、１００～
５００個のタンパク質、２００～１，０００個のタンパク質、５００～１，０００個のタ
ンパク質、５００～１，０００個のタンパク質、または１，０００～２，０００個のタン
パク質、または２，０００～３，０００個のタンパク質を含む。
他の実施形態において、ある程度のプロテアーゼ阻害剤活性を示す栄養タンパク質が用
いられる。例えば、いくつかの実施形態において、そのようなタンパク質は、栄養タンパ
ク質が摂取されると、栄養タンパク質が消化される前に消化管内でより長い距離を横切り
、したがって吸収を遅らせるようにプロテアーゼ消化を遅らせるため、そのようなタンパ
ク質が有用である場合がある。例えば、いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は
、胃内消化を阻害するが、腸内消化は阻害しない。
Ｄｅｌａｎｅｙ Ｂ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｓａｆｅｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｆｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．４６（２００８：Ｓ７
１－Ｓ９７））は、可能性のある食物タンパク質の安全性を評価する場合、既知の毒性タ
ンパク質および抗栄養タンパク質の両方を避けるべきであると提案している。栄養タンパ
ク質のいくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、本明細書において定義されるよ
うに、既知の毒性タンパク質のデータベースに対して好ましく低いレベルの全体的相同性
を有し、かつ／または既知の抗栄養タンパク質（例えば、プロテアーゼ阻害剤）のデータ
ベースに対して好ましく低いレベルの全体的相同性を有する。
特定の遊離アミノ酸および遊離アミノ酸の混合物は、苦味またはさもなければ不快な味
を有することが分かっている。さらに、一般的なタンパク質（例えば、乳清および大豆）
の加水分解物は、苦味または不快な味を有することが多い。いくつかの実施形態において
、本明細書に開示および記載される栄養タンパク質は、苦味またはさもなければ不快な味
を有しない。いくつかの実施形態において、本明細書に開示および記載される栄養タンパ
ク質は、遊離アミノ酸、遊離アミノ酸の混合物、および／またはタンパク質加水分解物の
うちの少なくとも１つと比較して、より許容できる味を有する。いくつかの実施形態にお
いて、本明細書に開示および記載される栄養タンパク質は、乳清タンパク質のうちの少な
くとも１つに等しいかまたはそれを超える味を有する。
タンパク質は、甘味、酸味、辛味、塩味、および旨味の確立された５つの味覚モダリテ
ィを有することが分かっている。特定のタンパク質の味（またはその欠如）は、タンパク
質の一次構造、荷電側鎖の存在、ならびに電子および立体構造特性を含むいくつかの要因
に起因し得る。いくつかの実施形態において、本明細書に開示および記載される栄養タン
パク質は、望ましい味（例えば、甘味、塩味、旨味）を有するように、かつ／または望ま
しくない味（例えば、苦味、酸味）を有しないように設計される。この文脈において、「
設計」は、例えば、望ましい味覚性を実現する特性を具現化する天然に存在するタンパク
質を選択すること、および望ましい味覚性を有する天然に存在するタンパク質のムテイン
を作製することを含む。例えば、栄養タンパク質は、甘味受容体（Ｔ１Ｒ２－Ｔ１Ｒ３
ヘテロ二量体）または旨味受容体（Ｔ１Ｒ１－Ｔ１Ｒ３ ヘテロ二量体、ｍＧｌｕＲ４、
および／もしくはｍＧｌｕＲ１）等の特定の味覚受容体と相互作用するように設計するこ
とができる。さらに、栄養タンパク質は、苦味受容体（Ｔ２Ｒ受容体）等の他の味覚受容
体と相互作用しないように、または微弱な相互作用を有するように設計されてもよい。
本明細書に開示および記載される栄養タンパク質はまた、経口摂取されると、口内に「
食感」と称されることもある異なる身体的感覚を引き出すこともできる。栄養タンパク質
の食感は、タンパク質の一次構造、荷電側鎖の存在、ならびに電子および立体構造特性を
含む１つ以上の要因に起因し得る。いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、経
口摂取されると、バターのようなまたは脂肪のような食感を引き出す。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、２０～５，０００個のアミノ酸、２
０～２，０００個のアミノ酸、２０～１，０００個のアミノ酸、２０～５００個のアミノ
酸、２０～２５０個のアミノ酸、２０～２００個のアミノ酸、２０～１５０個のアミノ酸
、２０～１００個のアミノ酸、２０～４０個のアミノ酸、３０～５０個のアミノ酸、４０
～６０個のアミノ酸、５０～７０個のアミノ酸、６０～８０個のアミノ酸、７０～９０個
のアミノ酸、８０～１００個のアミノ酸、少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０
個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも
２４５５個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも５５個のアミノ酸、少
なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも６５個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸
、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも８５個のアミ
ノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少なくとも９５個のアミノ酸、少なくとも１００個
のアミノ酸、少なくとも１０５個のアミノ酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくと
も１１５個のアミノ酸、少なくとも１２０個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸
、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なくとも１３５個のアミノ酸、少なくとも１４０個
のアミノ酸、少なくとも１４５個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくと
も１５５個のアミノ酸、少なくとも１６０個のアミノ酸、少なくとも１６５個のアミノ酸
、少なくとも１７０個のアミノ酸、少なくとも１７５個のアミノ酸、少なくとも１８０個
のアミノ酸、少なくとも１８５個のアミノ酸、少なくとも１９０個のアミノ酸、少なくと
も１９５個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２０５個のアミノ酸
、少なくとも２１０個のアミノ酸、少なくとも２１５個のアミノ酸、少なくとも２２０個
のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ酸、少なくとも２３０個のアミノ酸、少なくと
も２３５個のアミノ酸、少なくとも２４０個のアミノ酸、少なくとも２４５個のアミノ酸
、または少なくとも２５０個のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、栄養タン
パク質は、２０～５，０００個のアミノ酸、２０～２，０００個のアミノ酸、２０～１，
０００個のアミノ酸、２０～５００個のアミノ酸、２０～２５０個のアミノ酸、２０～２
００個のアミノ酸、２０～１５０個のアミノ酸、２０～１００個のアミノ酸、２０～４０
個のアミノ酸、３０～５０個のアミノ酸、４０～６０個のアミノ酸、５０～７０個のアミ
ノ酸、６０～８０個のアミノ酸、７０～９０個のアミノ酸、８０～１００個のアミノ酸、
少なくとも２５個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも３５個のアミノ
酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも２４５５個のアミノ酸、少なくとも５０個
のアミノ酸、少なくとも５５個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも６
５個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも７５個のアミノ酸、少なくと
も８０個のアミノ酸、少なくとも８５個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、少な
くとも９５個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１０５個のアミノ
酸、少なくとも１１０個のアミノ酸、少なくとも１１５個のアミノ酸、少なくとも１２０
個のアミノ酸、少なくとも１２５個のアミノ酸、少なくとも１３０個のアミノ酸、少なく
とも１３５個のアミノ酸、少なくとも１４０個のアミノ酸、少なくとも１４５個のアミノ
酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも１５５個のアミノ酸、少なくとも１６０
個のアミノ酸、少なくとも１６５個のアミノ酸、少なくとも１７０個のアミノ酸、少なく
とも１７５個のアミノ酸、少なくとも１８０個のアミノ酸、少なくとも１８５個のアミノ
酸、少なくとも１９０個のアミノ酸、少なくとも１９５個のアミノ酸、少なくとも２００
個のアミノ酸、少なくとも２０５個のアミノ酸、少なくとも２１０個のアミノ酸、少なく
とも２１５個のアミノ酸、少なくとも２２０個のアミノ酸、少なくとも２２５個のアミノ
酸、少なくとも２３０個のアミノ酸、少なくとも２３５個のアミノ酸、少なくとも２４０
個のアミノ酸、少なくとも２４５個のアミノ酸、または少なくとも２５０個のアミノ酸か
らなる。
Ｂ．核酸
栄養ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸も、本明細書において提供される
。いくつかの実施形態において、核酸は、単離される。いくつかの実施形態において、核
酸は、精製される。
核酸のいくつかの実施形態において、核酸は、上記セクションＡに開示される第１のポ
リペプチド配列をコードする核酸配列を含む。核酸のいくつかの実施形態において、核酸
は、上記セクションＡに開示される第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列からな
る。核酸のいくつかの実施形態において、核酸は、上記セクションＡに開示される栄養タ
ンパク質をコードする核酸配列を含む。核酸のいくつかの実施形態において、核酸は、上
記セクションＡに開示される栄養タンパク質をコードする核酸配列からなる。核酸のいく
つかの実施形態において、第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列は、少なくとも
１つの発現制御配列と作動可能に連結される。例えば、核酸のいくつかの実施形態におい
て、第１のポリペプチド配列をコードする核酸配列は、下のセクションＤに記載されるプ
ロモーターのようなプロモーターと作動可能に連結される。
したがって、いくつかの実施形態において、本開示の核酸分子は、それ自体が栄養ポリ
ペプチドまたはタンパク質であるポリペプチドまたはタンパク質をコードする。そのよう
な核酸分子は、「栄養核酸」と称されてもよい。いくつかの実施形態において、栄養核酸
は、それ自体が、ａ）少なくとも２４％の全アミノ酸残基に対する分岐鎖アミノ酸残基の
割合、ｂ）少なくとも１１％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、およびｃ）少
なくとも４９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合のうちの少なくとも１
つを含むポリペプチドまたはタンパク質をコードする。いくつかの実施形態において、栄
養核酸は、少なくとも１０個のヌクレオチド、少なくとも２０個のヌクレオチド、少なく
とも３０個のヌクレオチド、少なくとも４０個のヌクレオチド、少なくとも５０個のヌク
レオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも７０個のヌクレオチド、少なく
とも８０個のヌクレオチド、少なくとも９０個のヌクレオチド、少なくとも１００個のヌ
クレオチド、少なくとも２００個のヌクレオチド、少なくとも３００個のヌクレオチド、
少なくとも４００個のヌクレオチド、少なくとも５００個のヌクレオチド、少なくとも６
００個のヌクレオチド、少なくとも７００個のヌクレオチド、少なくとも８００個のヌク
レオチド、少なくとも９００個のヌクレオチド、少なくとも１，０００個のヌクレオチド
を含む。いくつかの実施形態において、栄養核酸は、１０～１００個のヌクレオチド、２
０～１００個のヌクレオチド、１０～５０個のヌクレオチド、または２０～４０個のヌク
レオチドを含む。いくつかの実施形態において、栄養核酸は、天然に存在する栄養ポリペ
プチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの全部または一部を
含む。いくつかの実施形態において、栄養核酸は、天然に存在する栄養タンパク質の断片
をコードするオープンリーディングフレームからなり、オープンリーディングフレームは
、完全な天然に存在する栄養タンパク質をコードしない。
いくつかの実施形態において、栄養核酸は、ｃＤＮＡである。
いくつかの実施形態において、天然に存在する栄養核酸に少なくとも５０％、６０％、
７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９
９．９％同一な配列を含む核酸分子が提供される。いくつかの実施形態において、少なく
とも１つの基準栄養核酸を用いるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハ
イブリダイズする核酸が提供される。
本開示において提供される栄養核酸およびその断片は、様々なシステムおよび方法にお
いて有用性を示す。例えば、断片は、種々のハイブリダイゼーション法においてプローブ
として使用されてもよい。方法に応じて、標的核酸配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれ
かであってもよい。標的核酸配列は、ハイブリダイゼーションの前に（例えば、ゲル電気
泳動により）分画されてもよいか、またはハイブリダイゼーションは、インサイツで試料
に対して行われてもよい。当業者は、既知の配列の核酸プローブが、染色体構造の決定（
例えば、サザンブロット法による）および遺伝子発現の測定（例えば、ノーザンブロット
法による）に有用性を見出すことを認識するであろう。そのような実験において、配列断
片は、好ましくは検出可能に標識され、そのため、標的配列に対するそれらの特異的ハイ
ブリダイゼーションが検出可能となり得、任意選択的に定量化され得る。当業者は、本開
示の核酸断片が、本明細書に具体的に記載されていない様々なブロット法に使用され得る
ことを認識するであろう。
また、本明細書に開示される核酸配列断片は、マイクロアレイに固定されると、プロー
ブとしての有用性も見出すことも理解されたい。支持基質上での核酸の蒸着および固定化
によるマイクロアレイの作製法は、当該技術分野で周知である。Ｒｅｖｉｅｗｅｄ ｉｎ
ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒ
ａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ．），Ｏｘｆ
ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０１９９６３７７
６８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（ｓｕｐｐｌ）：１－６０（１９９９）
、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
，Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ．），Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／Ｂｉ
ｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２０００）（ＩＳＢＮ：１８
８１２９９３７６）：これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
例えば、本明細書に開示される核酸配列断片等の核酸配列断片を含むマイクロアレイを用
いた遺伝子発現の分析は、細胞生物学および分子生物学の分野で配列断片に関する有用性
が十分に確立されている。マイクロアレイに固定化した配列断片の他の使用法は、Ｇｅｒ
ｈｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２４：１６８－１７
３（１９９９）ａｎｄ Ｚｗｅｉｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：
４２９－４３６（１９９９）、ＤＮＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ），Ｓｃ
ｈｅｎａ（ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９９）（
ＩＳＢＮ：０１９９６３７７６８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．２１（１）（ｓｕｐｐ
ｌ）：１－６０（１９９９）、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｂｉｏｃｈｉｐ：Ｔｏｏｌｓ ａ
ｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｃｈｅｎａ（ｅｄ．），Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉ
ｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ／ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｂｏｏｋｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（
２０００）（ＩＳＢＮ：１８８１２９９３７６）に開示されている。
Ｃ．ベクター
本明細書においてさらに記載されるように、本明細書に開示される核酸分子のうちの少
なくとも１つを含む発現ベクターを含むベクターもまた提供される。いくつかの実施形態
において、ベクターは、本明細書に開示されるような栄養タンパク質をコードする少なく
とも１つの単離された核酸分子を含む。代替の実施形態において、ベクターは、１つ以上
の発現制御配列に動作可能に連結されたそのような核酸分子を含む。ベクターは、したが
って、組換え微生物宿主細胞において少なくとも１つの組換えタンパク質を発現させるた
めに使用することができる。
微生物における核酸の発現に好適なベクターは、当業者に周知である。シアノバクテリ
アにおいて使用するための好適なベクターは、例えば、Ｈｅｉｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，
“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ｅｎｇｉ
ｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，”Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４９７，Ｃｈ．２４（２０１１）
に記載されている。本明細書に開示されるようなシアノバクテリアを遺伝子操作するため
に使用することができる例示的な複製ベクターは、ｐＰＭＱＡＫ１、ｐＳＬ１２１１、ｐ
ＦＣ１、ｐＳＢ２Ａ、ｐＳＣＲ１１９／２０２、ｐＳＵＮ１１９／２０２、ｐＲＬ２６９
７、ｐＲＬ２５Ｃ、ｐＲＬ１０５０、ｐＳＧ１１１Ｍ、およびｐＰＢＨ２０１を含む。
本明細書に開示される核酸配列を受容することができるｐＪＢ１６１等の他のベクター
もまた使用されてもよい。ｐＪＢ１６１等のベクターは、特定の光合成微生物に内在する
プラスミド（例えば、特定のシネココッカス種のプラスミドｐＡＱ１、ｐＡＱ３、および
ｐＡＱ４）に存在する配列と相同な配列を含む。そのようなベクターの例およびその使用
方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ：Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｓ Ｐｌａｔｆｏｒｍｓ ｆｏｒ
Ｈｉｇｈ－Ｌｅｖｅｌ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｐ．ＰＣＣ ７００２，”Ｃｈａｐｔｅｒ ２１ ｉｎ Ｒｏｂｅｒｔ Ｃａ
ｒｐｅｎｔｉｅｒ（ｅｄ．），“Ｐｈｏｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐ
ｒｏｔｏｃｏｌｓ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖ
ｏｌ．６８４，２０１１（参照により、本明細書に組み込まれる）に提供される。ｐＪＢ
１６１と内在性プラスミドとの間のインビボでの組換えにより、それらの内在性プラスミ
ドから該当する遺伝子を発現する遺伝子操作された微生物がもたらされる。代替として、
宿主細胞染色体と組み合わさるようにベクターを遺伝子操作することができるか、または
宿主細胞染色体もしくは宿主細胞の内在性プラスミドのいずれとも関係なく、該当する遺
伝子を複製および発現するようにベクターを遺伝子操作することができる。
組換えタンパク質の生成に好適なベクターのさらなる例は、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａ
ｇｅｎ（登録商標））である。このシステムは、大腸菌および微生物における使用のため
に広範囲に特徴づけられている。このシステムでは、標的遺伝子が、強力なバクテリオフ
ァージＴ７転写および（任意選択的に）翻訳シグナルの制御下でｐＥＴプラスミド中にク
ローニングされる：発現は、宿主細胞中にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの源を提供すること
によって誘導される。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼは、非常に選択的かつ能動的であるため
、完全に誘導されると、ほぼすべての微生物の源が標的遺伝子発現に変換される：所望の
生成物は、誘導の数時間後に全細胞タンパク質の５０％超を含むことができる。また、単
純にインデューサーの濃度を低下させることによって発現レベルを減衰させることも可能
である。発現レベルの減少は、いくつかの標的タンパク質の可溶性収率を向上させる場合
がある。いくつかの実施形態において、このシステムはまた、標的遺伝子を転写的にサイ
レントな非誘導状態に維持することもできる。
このシステムを使用するいくつかの実施形態において、標的遺伝子は、Ｔ７ ＲＮＡポ
リメラーゼ遺伝子を含有しない宿主を用いてクローニングされ、よって、潜在的に宿主細
胞に毒性を示すタンパク質の生成に起因するプラスミドの不安定性に関連する潜在的な問
題を軽減する。一旦、非発現宿主中に確立されると、λ ｐＬおよびｐＩプロモーターの
制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するファージであるλＣＥ６を用いて宿
主を感染させることにより、またはｌａｃＵＶ５の制御下でＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子の染色体コピーを含有する発現宿主にプラスミドを導入することにより、標的タンパ
ク質の発現を開始させることができる。第２の場合には、細菌培養にＩＰＴＧまたはラク
トースを添加することによって、または自己誘導培地を用いることによって発現を誘導す
る。ｌａｃオペレーターによって制御されるが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を必要
とせず、かつ大腸菌の天然ＲＮＡポリメラーゼに依存する他のプラスミド系は、ｐＴｒｃ
プラスミドのスイート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＱＥプラスミドのスイート（Ｑ
ＩＡＧＥＮ）を含む。
他の実施形態において、発現宿主に直接クローニングすることが可能である。２種類の
Ｔ７プロモーター、および基礎発現レベルを抑制するストリンジェンシーが異なるいくつ
かの宿主が利用可能であり、高い柔軟性および多様な標的遺伝子の発現を最適化するため
の能力を提供する。
哺乳類細胞における核酸の発現に好適なベクターは、典型的には、ウイルスの調節エレ
メントにおって提供される制御機能を含む。例えば、一般的に用いられるプロモーターは
、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、サイトメガウイルス、またはサルウイルス４
０に由来する。
Ｄ．プロモーター
本明細書に記載される組換え遺伝子を発現させるために有用なプロモーターは、構成的
プロモーターおよび誘導性／抑制可能プロモーターの両方を含む。誘導性／抑制可能プロ
モーターの例として、ニッケル誘導性プロモーター（例えば、ＰｎｒｓＡ、ＰｎｒｓＢ：
例えば、Ｌｏｐｅｚ－Ｍａｕｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２００２）ｖ．４３：２４７
－２５６を参照）およびＰｎｉｒＡ等の尿素抑制性プロモーター（例えば、Ｑｉ ｅｔ
ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ
ｇｙ（２００５）ｖ．７１：５６７８－５６８４に記載される）が挙げられる。誘導性／
抑制可能プロモーターのさらなる例として、ＰｎｉｒＡ（硝酸によって誘導され、尿素に
よって抑制される、ｎｉｒＡ遺伝子の発現を駆動するプロモーター、）およびＰｓｕｆ（
鉄ストレスによって誘導される、ｓｕｆＢ遺伝子の発現を駆動するプロモーター）が挙げ
られる。構成的プロモーターの例として、Ｐｃｐｃ（ｃｐｃオペロンの発現を駆動するプ
ロモーター）、Ｐｒｂｃ（ルビスコの発現を駆動するプロモーター）、ＰｐｓｂＡＩＩ（
ＰｐｓｂＡＩＩの発現を駆動するプロモーター）、Ｐｃｒｏ（ｃｒｏの発現を駆動するλ
ファージプロモーター）が挙げられる。他の実施形態において、ＰａｐｈＩｌおよび／ま
たはｌａｃｌｑ－Ｐｔｒｃプロモーターは、発現を制御するために使用することができる
。遺伝子操作された微生物において複数の組換え遺伝子が発現される場合、異なる遺伝子
が、異なるプロモーターによってもしくは別個のオペロンの同一のプロモーターによって
制御されてもよいか、または２つ以上の遺伝子の発現が、オペロンの一部としての単一の
プロモーターによって制御されてもよい。
誘導性プロモーターのさらなる非限定的な例として、限定されないが、外来性タンパク
質（例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）の発現によって
、小分子の存在（例えば、ＩＰＴＧ、ガラクトース、テトラシクリン、ステロイドホルモ
ン、アブシジン酸）によって、小分子（例えば、ＣＯ２、鉄、窒素）の欠如によって、金
属または金属イオン（例えば、銅、亜鉛、カドミウム、ニッケル）によって、および環境
因子（例えば、熱、低温、応力、光、暗さ）によって、ならびに増殖期によって誘導され
るものを挙げることができる。いくつかの実施形態において、非誘導時にプロモーターに
よる転写が実質的に開始されないように、誘導性プロモーターは厳密に調節される。いく
つかの実施形態において、プロモーターの誘導は、他のプロモーターによる転写を実質的
に変化させない。また、一般的に言って、誘導性プロモーターを誘導する化合物または条
件は、発現が求められる生物または環境に天然では存在しない。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、シアノバクテリア培養物へのＣ
Ｏ２の供給を制限することによって誘導される。非限定的な例として、誘導性プロモータ
ーは、ＣＯ２制限条件下で上方制御されるシネコシスティスＰＣＣ ６８０３のプロモー
ター配列、例えば、ｃｍｐ遺伝子、ｎｔｐ遺伝子、ｎｄｈ遺伝子、ｓｂｔ遺伝子、ｃｈｐ
遺伝子、およびｒｂｃ遺伝子、またはその改変体もしくは断片であってもよい。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、鉄飢餓により、または定常期に
突入することにより誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、
鉄飢餓条件下で上方制御されるシアノバクテリア遺伝子のプロモーター配列の改変体配列
、例えば、ｉｓｉＡであってもよいか、または培養物が定常期に突入する場合、例えば、
ｉｓｉＡ、ｐｈｒＡ、ｓｉｇＣ、ｓｉｇＢ、およびｓｉｇＨ遺伝子、またはその改変体も
しくは断片であってもよい。
いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、金属または金属イオンによって
誘導される。非限定的な例として、誘導性プロモーターは、銅、亜鉛、カドミウム、水銀
、ニッケル、金、銀、コバルト、およびビスマスまたはそのイオンによって誘導され得る
。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ニッケルまたはニッケルイオン
によって誘導される。いくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｎｉ２＋等
のニッケルイオンによって誘導される。別の例示的な実施形態において、誘導性プロモー
ターは、シネコシスティス ＰＣＣ ６８０３由来のニッケル誘導性プロモーターである
。別の実施形態において、誘導性プロモーターは、銅または銅イオンによって誘導され得
る。さらに別の実施形態において、誘導性プロモーターは、亜鉛または亜鉛イオンによっ
て誘導され得る。さらに別の実施形態において、誘導性プロモーターは、カドミウムまた
はカドミウムイオンによって誘導され得る。さらに別の実施形態において、誘導性プロモ
ーターは、水銀または水銀イオンによって誘導され得る。代替の実施形態において、誘導
性プロモーターは、金または金イオンによって誘導され得る。別の代替の実施形態におい
て、誘導性プロモーターは、銀または銀イオンによって誘導され得る。さらに別の代替の
実施形態において、誘導性プロモーターは、コバルトまたはコバルトイオンによって誘導
され得る。さらに別の代替の実施形態において、誘導性プロモーターは、ビスマスまたは
ビスマスイオンによって誘導され得る。
いくつかの実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターを含む細胞を金属
または金属イオンに曝露することによって誘導される。細胞は、微生物増殖培地に金属を
添加することにより金属または金属イオンに曝露されてもよい。特定の実施形態において
、微生物増殖培地に添加される金属または金属イオンは、培地から効率的に回収され得る
。他の実施形態において、回収後に培地中に残る金属または金属イオンは、培地のまたは
細菌遺伝子産物の下流プロセシングを実質的に妨げない。
構成的プロモーターのさらなる非限定的な例として、グラム陰性細菌またはグラム陰性
細菌を増殖するバクテリオファージに由来する構成的プロモーターが挙げられる。例えば
、Ｌｐｐ、ＯｍｐＡ、ｒＲＮＡ、およびリボソームタンパク質のプロモーター等の、高度
に発現されるグラム陰性遺伝子産物をコードする遺伝子のプロモーターが用いられてもよ
い。代替として、調節可能なプロモーターは、そのプロモーターの調節タンパク質を欠損
した株に用いられ得る。例えば、Ｐｌａｃ、Ｐｔａｃ、およびＰｔｒｃは、Ｌａｃｌを欠
損した株において構成的プロモーターとして用いられ得る。同様に、Ｐ２２ ＰＲおよび
ＰＬは、λＣ２リプレッサータンパク質を欠損した株に用いられ得、λＰＲおよびＰＬは
、λＣ１リプレッサータンパク質を欠損した株に用いられ得る。一実施形態において、構
成的プロモーターは、バクテリオファージに由来する。別の実施形態において、構成的プ
ロモーターは、サルモネラバクテリオファージに由来する。さらに別の実施形態において
、構成的プロモーターは、シアノファージに由来する。いくつかの実施形態において、構
成的プロモーターは、シネコシスティスプロモーターである。例えば、構成的プロモータ
ーは、ＰｐｓｂＡｌｌプロモーターまたはその改変体配列、Ｐｒｂｃプロモーターまたは
その改変体配列、Ｐｃｐｃプロモーターまたはその改変体配列、およびＰｒｎｐＢプロモ
ーターまたはその改変体配列であり得る。
Ｅ．宿主細胞
また、本明細書に開示される核酸分子またはベクターで形質転換される宿主細胞、およ
びその子孫も提供される。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、微生物細胞である
。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、自由に複製するベクターであってもよいが
、そうである必要はないベクター上に、核酸配列を担持する。他の実施形態において、核
酸は、宿主細胞のゲノムおよび／または宿主細胞の内在性プラスミドに組み込まれている
。形質転換された宿主細胞は、例えば、本明細書に開示される組換え栄養タンパク質の生
成に用途を見出す。
「微生物」は、古細菌、細菌、および真核生物ドメイン由来の原核生物および真核生物
の微生物種を含み、後者は、酵母および糸状菌、原虫類、藻類、またはより高等な原生生
物を含む。用語「微生物細胞」および「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、「微生物（ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」と同義に用いられる。
様々な宿主微生物が、本明細書に開示される核酸配列で形質転換され得、いくつかの実
施形態において、本明細書に開示される組換え栄養タンパク質を生成するために用いられ
得る。好適な宿主微生物は、独立栄養微生物および従属栄養微生物の両方である。いくつ
かの用途において、独立栄養微生物は、化石燃料における還元、および／または宿主微生
物に導入された組換え核酸配列によってコードされる栄養タンパク質を作製するために必
要な電気入力を可能にする。同様に、いくつかの用途において、これは、栄養タンパク質
を生成するコストおよび／もしくは環境影響を削減し、かつ／または、乳清、卵、および
大豆等の代替の栄養タンパク質を製造するコストおよび／もしくは環境影響と比較してコ
ストおよび／もしくは環境影響を削減する。例えば、本明細書に開示されるような宿主微
生物を使用して本明細書に開示される栄養タンパク質を作製するコストおよび／または環
境影響は、いくつかの実施形態において、牛乳を処理することによって食用に好適な形態
の乳清タンパク質を作製するコストおよび／または環境影響よりも低い。
従属栄養素の非限定的な例として、大腸菌、サルモネラネズミチフス菌、枯草菌、巨大
菌、コリネバクテリウム・グルタミクム、ストレプトマイセス・セリカラー、ストレプト
マイセス・リビダンス、ストレプトマイセス・ベネズエラエ、ロゼストレプトマイセス・
ロゼオスポラス、ストレプトマイセス・フラディアエ、ストレプトマイセス・グリセウス
、ストレプトマイセス・クラブリゲルス、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス、ス
トレプトマイセス・プラテンシス、サッカロポリスポラ・エリスラエア、コリネバクテリ
ウム・グルタミクム、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・ニデュランス、アスペ
ルギルス・オリゼー、アスペルギルス・テレウス、アスペルギルス・ソーヤ、ペニシリウ
ム・クリソゲナム、トリコデルマ・リーゼイ、クロストリジウム・アセトブチリカム、ク
ロストリジウム・ベイジェリンキ、クロストリジウム・サーモセラム、フュージバクター
・パウシボランス、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ボウラディ、ピ
キア・パストリス、およびピキア・スティピティスが挙げられる。
光独立栄養微生物は、真核性藻類、ならびに原核生物シアノバクテリア、緑色硫黄細菌
、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、および紅色非硫黄細菌を含む。
好極限性細菌も、好適な生物として企図される。そのような生物は、温度、放射線、圧
力、重力、真空、乾燥、塩分、ｐＨ、酸素分圧、および化学物質等の種々の環境パラメー
タに耐える。これらは、８０℃以上で増殖するピュロロブス・フマリイ等の超好熱菌、６
０～８０℃で増殖するシネココッカス・リビダス等の好熱菌、１５～６０℃で増殖する中
温菌、および１５℃未満で増殖するＰｓｙｃｈｒｏｂａｃｔｅｒ等の好冷菌、ならびにい
くつかの昆虫を含む。放射線耐性生物は、デイノコッカス・ラディオデュランスを含む。
圧力耐性生物は、１３０ＭＰａの圧力に耐える好圧生物を含む。重量耐性生物は、好圧菌
を含む。過重力（例えば、＞１ｇ）低重力（例えば、＜１ｇ）耐性生物も企図される。真
空耐性生物は、緩歩動物、昆虫、微生物、および種子を含む。乾燥耐性および耐無水生存
生物は、アルテミア・サリーナ等の乾生植物、線形動物、微生物、真菌、および地衣類を
含む。耐塩性生物は、好塩性生物（例えば、２～５Ｍ ＮａＣｌ）の好塩菌およびドナリ
エラ・サリーナを含む。ｐＨ耐性生物は、好アルカリ菌、例えば、ナトロノバクテリウム
、バチルス・ファーマスＯＦ４、スピルリナ種（例えば、ｐＨ＞９）、および好酸球、例
えば、シアニジウム・カルダリウム、フェロプラズマ種（例えば、低ｐＨ）を含む。Ｏ２
に耐えることができない嫌気性菌、例えばメタノコッカス・ヤンナスキイ等；いくらかの
Ｏ２に耐性を示す微好気性菌、例えばクロストリジウム、およびＯ２を必要とする好気性
菌もまた企図される。純粋なＣＯ２に耐性を示す気体耐性生物は、シアニジウム・カルダ
リウムを含み、金属耐性生物は、耐金属菌、例えば、フェロプラズマ・アシダルマヌス（
例えば、Ｃｕ、Ａｓ、Ｃｄ、Ｚｎ）、ラルストニア種ＣＨ３４を（例えば、Ｚｎ、Ｃｏ、
Ｃｄ、Ｈｇ、Ｐｂ）含む。Ｇｒｏｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ．Ｌｉｆｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｄ
ｇｅ：Ａｍａｚｉｎｇ Ｃｒｅａｔｕｒｅｓ Ｔｈｒｉｖｉｎｇ ｉｎ Ｅｘｔｒｅｍｅ
Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ（１９９８）ａｎｄ Ｓ
ｅｃｋｂａｃｈ，Ｊ．“Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｅ ｗｉｔｈ Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ Ｗｈｉｃｈ Ｔｈｒｉｖ
ｅ Ｕｎｄｅｒ Ｅｘｔｒｅｍｅ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．”Ｉｎ Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ
Ｂａｔａｌｌｉ Ｃｏｓｍｏｖｉｃｉ，Ｓｔｕａｒｔ Ｂｏｗｙｅｒ，ａｎｄ Ｄａｎ
Ｗｅｒｔｈｅｉｍｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｓｔｒｏｎｏｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ ｉｎ
ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｅ，ｐ．５１１．Ｍｉｌａｎ：Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｃｏｍｐｏ
ｓｉｔｏｒｉ（１９９７）。
混合栄養生物も、好適な生物である。混合栄養生物は、異なるエネルギー源および炭素
源の混合、例えば、光合成栄養および化学合成栄養、無機栄養および有機栄養、独立栄養
および従属栄養、ならびにそれらの組み合わせ、またはその組み合わせを利用することが
できる。混合栄養は、真核性または原核性であり得る。また、混合栄養は、絶対独立また
は任意独立であり得る。好適な混合栄養生物は、混合栄養藻類および混合栄養細菌を含む
。
藻類およびシアノバクテリアは、限定されないが、以下の属を含む：アカントセラス、
アカントコッカス、アカリオクロリス、アクナンテス、アクナンチジウム、アクチナスト
ラム、アクチノクロリス、アクティノサイクラス、アクチノタエニウム、アンフィクリシ
ス、アンフィジニウム、アンフィクリコス、アンフィプレウラ、アンフィプロラ、アンフ
ィスリクス、アンフォラ、アナベナ、アナベノプシス、アネウマスタス（Ａｎｅｕｍａｓ
ｔｕｓ）、アンキストロデスマス、アンキラ、アノモエオネイス、アパトコッカス、アフ
ァニゾメノン、アファノカプサ、アファノカエテ、アファノテーケ、アピオキスティス、
アピストネマ、アルスロデスムス、アルテロスピラ、アスコクロリス、アステリオネラ、
アステロコッカス、アウドウイネラ、アウラコセイラ、バシラリア、バルビアニア、バン
ブシナ、バンギア、バシクラミス、バトラコスペルマム、ビヌクレアリア、ビトリキア、
ブリディンジア、ボトルジオプシス、ボトリジウム、ボトリオコッカス、ボトリオスファ
エリア、ブラキオモナス、ブラキシラ、ブラキトリキア、ブレビスソニア、ブルボカエテ
、ブミレリア、ブミレリオプシス、カロネイス、カロトリクス、カンピロディスクス、キ
ャップソシフォン、カルテリア、カテナ、カビヌラ、セントリトラクタス、セントロネラ
、ケラチウム、キートセロス、カエトクロリス、カエトモルファ、カエトネラ、カエトネ
マ、カエトペルティス、カエトフォラ、カエトスファエリジウム、カマエシフォン、カラ
、カラシオクロリス、カラシオプシス、カラシウム、カラレス、キロモナス、クライノモ
ナス、クラミドブレファリス、クラミドカプサ、クラミドモナス、クラミドモノプシス、
クラミドミクサ、クラミドネフリス、クロラギエラ、クロランギオプシス、クロレラ、ク
ロロボトリス、クロロブラキス、クロロキトリウム、クロロコックム、クロログロエア、
クロログロエオプシス、クロロゴニウム、クロロロビオン、クロロモナス、クロロフィセ
マ（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｓｅｍａ）、クロロフィタ、クロロサッカス、クロロサルキナ、
コリシスティス、クロモフィトン、クロムリナ、クロオコッキディオプシス、クロオコッ
カス、クロオダクチロン、クロオモナス、クロオテセ、クリソアメーバ、クリサプシス、
クリシジアストラム、クリソカプサ、クリソカプセラ、クリソカエテ、クロソクロムリナ
、クリソコッカス、クリソクリナス、クリソレピドモナス、クリソリコス、クリソネブラ
、クリソフィタ、クリソピキス、クリソサッカス、クロソファエレラ、クリソステファノ
スファエラ，クラドフォラ、クラスチジウム、クロステリオプシス、クロステリウム、コ
ッコミクサ、コッコネイス、コエラステラ、コエラストラム、コエロスファエリウム、コ
エノクロリス、コエノコッカス、コエノシスティス、コラシウム、コレオカエテ、コロデ
ィクティオン、コムプソゴノプシス、コムプソポゴン、コンジュガトフィタ、コノカエテ
、コロナストラム、コスマリウム、コスミオネイス、コスモクラジウム、クラテリポルツ
ラ、クラチクラ、クリナリウム、クルシゲニア、クルシゲニエラ、クリプトアウラクス（
Ｃｒｙｐｔｏａｕｌａｘ）、クリプトモナス、クリプトフィタ、ステノフォラ、シアノジ
クチオン（Ｃｙａｎｏｄｉｃｔｙｏｎ）、シアノネフロン、シアノフォラ、シアノフィタ
、シアノテセ、シアノトモナス（Ｃｙａｎｏｔｈｏｍｏｎａｓ）、シクロネキシス、シク
ロステファノス、シクロテラ、クリンドロカプサ、クリンドロシスティス、シリンドロス
ペルマム、クリンドロテカ、キマトプレウラ、キンベラ、シムベロニズシア、シストジニ
ウム、ダクチロコッコプシス、デバルヤ（Ｄｅｂａｒｙａ）、デンチクラ、デルマトクリ
シス、デルモカルパ、デルモカルペラ、デスマトラクタム、デスミジウム、デスモコッカ
ス、デスモネマ、デスモシホン、ジアカントス、ジアクロネマ、ジアデスミス、ジアトマ
、ジアトメラ、ジセルラ、ジコスリックス、ジコトモコッカス、ジクラノカエテ、ジクト
ヨクロリス、ジクトヨコッカス、ジクチオスファエリウム、ジジモシスティス、ジジモゲ
ネス、ジジモスフェニア、ジラビフィラム、ジモルホコッカス、ディノブリオン、ディノ
コッカス、ジプロクロリス、ジプロネイス、ジプロスタウロン、ジストリオネラ、ドシジ
ウム、ドラバルナルディア、ドゥナリエラ、ジスモルホコッカス、エクバロシスティス、
エラカトスリクス、エレルベキア、エンシオネマ、エンテロモルファ、エントクラジア、
エントモネイス、エントフィサリス、エピクリシス、エピピキシス、エピテミア、エレモ
スファエラ、ユーアストロプシス、ユーアストラム、ユーカプシス、ユーココネイス、ユ
ードリナ、ユーグレナ、ユーグレノフィタ、ユーノティア、ユースティグマトフィタ、ユ
ートレプティア、ファラシア、フィシェレラ、フラギラリア、フラギラリフォルマ、フラ
ンセイア、フルストリア、クルシラ、ゲミネラ、ゲニクラリア、グラウコシスティス、グ
ラウコフィタ、グレノジニオプシス、グレノジニウム、グロエオカプサ、グロエオカエテ
、グロエオクリシス、グロエオコッカス、グロエオシスティス、グロエオデンドロン、グ
レオモナス、グロエオプラクス、グロエオテセ、グロエオティラ、グロエオトリキア、グ
ロイオジクチオン、ゴレンキニア、ゴレンキニオプシス、ゴモンチア、ゴンフォキンベラ
、ゴンフォネマ、ゴンフォスファエリア、ゴナトザイゴン、ゴングロシア、ゴングロシラ
、ゴニオクロリス、ゴニウム、ゴニオストマム、グラヌロクロリス、グラヌロシストプシ
ス、グロエンブラジア、ギムノジニウム、ギムノザイガ、ジャイロシグマ、ヘマトコッカ
ス、ハフニオモナス、ハラシア、ハンマトイデア、ハンナエア、ハンズスティア、ハパロ
シホン、ハプロタエニウム、ハプトフィタ、ハスレア、ヘミジニウム、ヘミトマ、ヘリバ
ウジエラ、ヘテロマスティクス、ヘテロスリクス、ヒベルジア、ヒルデンブランディア、
ヒレア、ホロペジウム、ホモエオスリクス、ホルマントネマ、ホルモチラ、ヒアロブラキ
オン、ヒアロカルジウム、ヒアロディスカス、ヒアロゴニウム、ヒアロテカ、ハイドリア
ナム、ヒドロコッカス、ヒドロコレウム、オオタマウミヒドラ、ヒドロディクティオン、
ヒドロセラ、ヒドルルス、ヒエラ、ヒメノモナス、イストモクロロン、ヨハネスバプティ
スチア、ジュラニイエラ、カライエビア、カサブレファリス、カトジニウム、ケフィリオ
ン、ケラトコッカス、キルクネリエラ、クレブソルミジウム、コルベシア、コリエラ、コ
マレキア、コルシコビエラ、クラスケラ、ラゲルヘイミア、ラギニオン、シラタマモ、レ
マネア、レポシンクリス、レプトシラ、ラボコッカス、ロボシスティス、ロボモナス、ル
チコラ、リングビア、マレオクロリス、マロモナス、マントニエラ、マルソニエラ、マル
チアナ、マスチゴコレウス、ガストグロイア、メロシラ、メリスモペディア、メソスティ
グマ、メソタエニウム、ミクラクチニウム、ミクラステリアス、ミクロカエテ、ミクロコ
レウス、ミクロシスティス、ミクログレナ、ミクロモナス、ミクロスポラ、ミクロタムニ
オン、ミスココッカス、モノクリシス、モノダス、モノマスティクス、モノラフィジウム
、ヒトエグサ、ヒザオリ、モウゲオチオプシス、ミオクロリス、マイロメシア、ミクソサ
ルシナ、ナエゲリエラ、ナンノクロリス、ナウトコッカス、ナビクラ、ネグレクテラ、ネ
イジウム、ネフロクラミス、ネフロシチウム、ネフロジエラ、ネフロセルミス、ネトリウ
ム、二テラ、ホシツリモ、ニッチア、ノドゥラリア、ノストック、オクロモナス、サヤミ
ドロ、オリゴカエトホラ、オニコネマ、オオカルジウム、オオシスティス、オペホラ、オ
フィオシチウム、オルトセイラ、オシラトリア、オキシネイス、パチクラデラ、パルメラ
、パルモジクチオン、パンドリナ、パンヌス、パラリア、パシェリナ、パウルシュルジア
、ペディアストラム、ペディネラ、ペディノモナス、ペディノペラ、ペラゴジクチオン、
ペニウム、ペラネマ、ペリジニオプシス、ペリジニウム、ペロニア、ペトロネイス、ファ
コタス、ファクス、ファエアスター、フェオデルマチウム、フェオフィタ、フェオスファ
エラ、フェオタムニオン、フォルミジウム、フィコペルティス、フィラリオクロリス、フ
ィロカルジウム、フィロミタス、ピンヌラリア、ピトホラ、プラコネイス、プランクトネ
マ、プランクトスファエリア、プラノチジウム、プレクトネマ、プレオドリナ、プレウラ
ストラム、プレウロカプサ、プレウロクラジア、プレウロジスカス、プレウロシグマ、プ
レウロシラ、プレウロタエニウム、ポシロモナス、ポドヘドラ、ポリブレファリデス、ポ
リカエトホラ、ポリエドリエラ、ポリエドリオプシス、ポリゴニオクロリス、ポリエピド
モナス、ポリタエニア、ポリトマ、ポリトメラ、ポルフィリディウム、ポステリオクロモ
ナス、プラシノクロリス、プラシノクラダス、プラシノフィタ、プラシオラ、プロクロル
フィタ、プロクロロトリックス、プロトデルマ、プロトシフォン、プロバソリエラ、プリ
ムネシウム、プサモジクチオン、プサモチジウム、シュードアナベナ、シュードエノクロ
ニウム、シュードカルテリア、シュードカテ、シュードカラシウム、シュードコッコミク
サ、シュードジクチオスファエリウム、シュードケフィリオン、シュードンコビルサ、シ
ュードクアドリグラ、シュードスファエロシスティス、シュードスタウラストラム、シュ
ードスタウロシラ、シュードテトラストラム、プテロモナス、パンクタストルアタ、ピラ
ミクラミス、ピラミモナス，ピロフィタ、クアドリクロリス、クアドリコッカス、クアド
リグラ、ラジオコッカス、ラジオフィラム、ラフィジオプシス、ラフィドセリス、ラフィ
ドネマ、ラフィドフィタ、ペイメリア、ラブドデルマ、ラブドモナス、リゾクロニウム、
ロドモナス、ロドフィタ、ロイコスフェニア、ロパロジア、リブラリア、ロゼンビンギエ
ラ、ロシチジウム、ロヤ、セネデスムス、シェルフェリア、シゾクラミデラ、シゾクラミ
ス、シゾメリス、シゾトリックス、スクロエデリア、スコリオネイス、スコチエラ、スコ
チエロプシス、スコウルフィエルジア、スキトネマ、セレナストラム、セレノクロリス、
セラホラ、セミオルビス、シデロセリス、ジデロシストプシス、ジモンセニア、シホノネ
マ、シロクラジウム、シロゴニウム、スケレトネマ、ソラストラム、スペルマトゾプシス
、スファエレロシスティス、スファエレロプシス、スファエロジニウム、ヨコワミドロ、
スファエロゾスマ、スピニフェロモナス、スパイロジャイラ、スピロタエニア、スピルリ
ナ、スポンジロモラム、スポンジロシウム、スポロテトラス、スプメラ、スタウラストラ
ム、スタエロデスマス、スタウロネイス、スタウロシラ、スタウロシレラ、ステノプテロ
ビア、ステファノコスティス、ステファノディスカス、ステファノポロス、ステファノス
ファエラ、スチココッカス、スチコグロエア、スチゲオクロニム、スチゴネマ、スチピト
コッカス、ストケシエラ、ストロムボモナス、スチロクリサリス、スチロジニウム、スチ
ロイキシス、スチロスファエリジウム、スリレラ、シキジオン、シンプロカ、シネココッ
カス、シネコシスティス、シネドラ、シノクロモナス、シヌラ、タベラリア、タブラリア
、テイリンギア、テムノガメタム、テトメモラス、テトラクロレラ、テトラシクラス、テ
トラデスマス、テトラエドリエラ、テトラエドロン、テトラセルミス、テトラスポラ、テ
トラストラム、タラシオシラ、タムニオカエテ、トラコクロリス、トレア、トリペラ、ト
リポスリクス、トラケロモナス、トラキディスカス、トレボウキシア、トレンテホリア、
トレウバリア、トリボネマ、トリコデスミウム、トリコディスカス、トロキスシア、トリ
ブリオネラ、ウロトリックス、ウログレナ、ウロネマ、ウロソレニア、ウロスポラ、ウバ
、バキュオラリア、バウケリア、ボルボックス、ボルブリナ、ウェステラ、ウォロスジン
スキア、キサンチジウム、キサントフィタ、キセノコッカス、ジグネマ、ジグネモプシス
、およびジゴニウム。
さらなるシアノバクテリアは、カマエシフォン、クロオコッカクス、シアノバクテリア
、シアノビウム、シアノテセ、ダクチロコッコプシス、グレオバクター、グロエオカプサ
、グロエオテセ、ミクロシスティス、プロクロロコッカス、プロクロロン、シネココッカ
ス、シネコシスティス、シアノシスティス、デルモカルペラ、スタニエリア、キセノコッ
カス、クロオコッキディオプシス、ミクソサルシナ、アルスロスピラ、ボルジア、クリナ
リウム、ゲイトレリネマ、レプトリングビヤ、リムノスリックス、リングビア、ミクロコ
レウス、オシラトリア、プランクトスリックス、プロキオロスリックス、ドアナベナ、ス
ピルリナ、スタリア、シンプロカ、トリコデスミウム、チコネマ、アナベナ、アナベノプ
シス、アファニゾメノン、シアノスピラ、シリンドロスペルモプシス、シリンドロスペル
マム、ノドゥラリア、ノストック、スキロネマ、カロトリクス、リブラリア、トリポスリ
クス、クロログロエオプシス、フィシェレラ、ゲイティエリア、リエンガリエラ、ノスト
クホプシス、スティゴネマ、およびサーモシネココッカス属のメンバーを含む。
緑色非硫黄細菌は、限定されないが以下の属を含む：クロロフレクスス、クロロネマ、
オシロクロリス、ヘリオトリックス、ヘルペトシフォン、およびロゼイフレクサス、およ
びサーモミクロビウム。
緑色硫黄細菌は、限定されないが以下の属を含む：クロロビウム、クラスロクロリス、
およびプロステコクロリス。
紅色硫黄細菌は、限定されないが以下の属を含む：アロクロマチウム、クロマチウム、
ハロクロマチウム、イソクロマチウム、マリクロマチウム、ロドブラム、サーモクロマチ
ウム、チオカプサ、チオロドコッカス、およびチオシスティス。
紅色非硫黄細菌は、限定されないが以下の属を含む：ファエオスピリルム、ロドバカ、
ロドバクター、ロドミクロビウム、ロドピラ、ロドシュードモナス、ロドサラシウム、ロ
ドスピリラム、ロドビブリオ、およびロゼオスピラ。
好気性化学合成無機栄養細菌は、限定されないが、硝化細菌、例えば、ニトロバクテラ
セエ種、ニトロバクター種、ニトロスピナ種、ニトロコッカス種、ニトロスピラ種、ニト
ロソモナス種、ニトロソコッカス種、ニトロソスピラ種、ニトロソロブス種、ニトロソビ
ブリオ種；無色硫黄細菌、例えばチオブラム種、チオバチルス種、チオミクロスピラ種、
チオスフェラ種、サーモトリックス種；絶対独立化学合成無機栄養水素細菌、例えばヒド
ロゲノバクター種、鉄およびマンガン酸化ならびに／または沈殿細菌、例えばシデロコッ
カス種、および磁性細菌、例えばアクアスピリラム種を含む。
古細菌は、限定されないが、メタン生成古細菌、例えばメタノバクテリウム種、メタノ
ブレビバクター種、メタノテルムス種、メタノコッカス種、メタノミクロビウム種、メタ
ノスピリルム種、メタノゲニウム種、メタノサルキナ種、メタノロブス種、メタノスリッ
クス種、メタノココイデス種、メタノプラヌス種；超好熱性Ｓ代謝群、例えば、サーモプ
ロテウス種、ピロディクティウム種、スルホロブス種、アシジアヌス種、および他の微生
物、例えば、枯草菌、サッカロマイセス・セレビシエ、ストレプトマイセス種、ラルスト
ニア種、ロドコッカス種、コリネバクテリア種、ブレビ宅テリア種、マイコバクテリア種
、ならびに油性酵母を含む。
さらに他の好適な生物は、Ｖｅｎｔｅｒら米国特許公開第２００７／０２６４６８８号
によって記載されるような合成細胞または合成ゲノムによって生成される細胞、およびＧ
ｌａｓｓら米国特許公開第２００７／０２６９８６２号に記載されるような細胞様システ
ムまたは合成細胞を含む。
さらに他の好適な生物は、大腸菌、アセトバクター・アセチ、枯草菌、酵母、および真
菌、例えば、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・サーモセラム、ペ
ニシリウム・クリソゲナム、ピキア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、スキ
ゾサッカロマイセス・ポンベ、シュードモナス‐フルオレッセンス、またはザイモモナス
・モビリスを含む。いくつかの実施形態において、これらの生物は、二酸化炭素を固定す
るために遺伝子操作され、他の実施形態において、これらは遺伝子操作されない。
いくつかの実施形態において、真核細胞、例えば、昆虫細胞または哺乳類細胞、例えば
、ヒト細胞が、宿主細胞として用いられる。そのような細胞のためのプロモーターおよび
エンハンサーを含むベクターおよび発現制御配列は周知である。この目的に有用な哺乳類
宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７、Ａ
ＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３、または懸濁培養における増殖のた
めにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖ
ｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ
ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ
ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１
９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２
３：２４３－２５１（１９８０））；サル腎細胞（ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；
アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ－７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）；ヒト子宮
頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣ
Ｌ ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）
；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ
８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲ
Ｉ細胞（Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８
３：４４－６８（１９８２））；ＭＲＣ ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅ
ｐ Ｇ２）である。
Ｆ．栄養タンパク質の生成
当業者は、本明細書に開示されるような組換え栄養タンパク質を生成する（および任意
選択的に分泌する）ように組換え細胞を培養するための、ならびに発現させた組換えタン
パク質の精製および／または単離のための多くの好適な方法を認識している。タンパク質
精製のために選択される方法は、該当するタンパク質の特性、細胞内におけるその位置お
よび形態、ベクター、宿主株のバックグラウンド、ならびに発現させたタンパク質の意図
する用途を含む多くの変数に依存する。培養条件も、所与の標的タンパク質の溶解性およ
び局在性に影響を及ぼし得る。本明細書に開示されるような組換え微生物細胞に発現され
る標的タンパク質を精製するために、限定されないが、イオン交換およびゲル濾過を含む
多くのアプローチを用いることができる。
いくつかの実施形態において、ペプチド融合タグを組換えタンパク質に付加することに
より、ペプチド融合タグを利用する様々な親和性精製法が可能になる。いくつかの実施形
態において、親和性方法の使用により、一段階でほぼ均一に標的タンパク質を精製するこ
とができる。精製は、例えば、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、トロンビン、またはＨＲ
Ｖ ３Ｃプロテアーゼによる融合タグの一部または全部の切断を含み得る。いくつかの実
施形態において、発現させた標的タンパク質の精製または活性測定の前に、標的タンパク
質の発現レベル、細胞局在性、および溶解性の予備分析が行われる。標的タンパク質は、
以下の分画のいずれかまたはすべてに見出され得る：可溶性または不溶性の細胞質分画、
周辺質、または培地。意図する用途に応じて、封入体、培地、または周辺質空間への選択
的局在化は、いくつかの実施形態において、比較的単純な手順による迅速な精製に有利で
あり得る。
大腸菌は、異種タンパク質の発現のための強力な宿主として広く認められているが、こ
の宿主における多くのタンパク質の過剰発現は、不溶性封入体の形態で凝集を起こしやす
いことも広く知られている。封入体の形成をレスキューするため、またはタンパク質自体
の力価を向上させるために最も一般的に用いられる方法の１つは、アミノ末端のマルトー
ス結合タンパク質（ＭＢＰ）［Ａｕｓｔｉｎ ＢＰ，Ｎａｌｌａｍｓｅｔｔｙ Ｓ，Ｗａ
ｕｇｈ ＤＳ．Ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇｇｅｄ ｍａｌｔｏｓｅ－ｂｉｎｄ
ｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ａ ｆｕｓｉｏｎ ｐａｒｔｎｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．
２００９；４９８：１５７－７２］、または低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）［
Ｓａｉｔｏｈ Ｈ，Ｕｗａｄａ Ｊ，Ａｚｕｓａ Ｋ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＳＵＭＯ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｔａｒｇｅｔ ｐ
ｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ
Ｂｉｏｌ．２００９；４９７：２１１－２１；Ｍａｌａｋｈｏｖ ＭＰ，Ｍａｔｔｅｒｎ
ＭＲ，Ｍａｌａｋｈｏｖａ ＯＡ，Ｄｒｉｎｋｅｒ Ｍ，Ｗｅｅｋｓ ＳＤ，Ｂｕｔｔ
ＴＲ．ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎｓ ａｎｄ ＳＵＭＯ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅ
ａｓｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓ．２００４；５（１－２）：７５－８６；Ｐａｎａｖａｓ Ｔ，Ｓａｎｄｅｒｓ Ｃ，
Ｂｕｔｔ ＴＲ．ＳＵＭＯ ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｅｎｈａｎ
ｃｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎ
ｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；４９７：３０３－１７］の融合物を該当するタンパク質に
含めることである。これらの２つのタンパク質は、著しく良好に発現され、大腸菌中で可
溶性形態であるため、該当するタンパク質も可溶性形態で効率的に生成される。該当する
タンパク質は、該当するタンパク質と融合タンパク質との間に部位特異的プロテアーゼ認
識配列（タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ等）を設計することにより切断
することができる［１］。
いくつかの実施形態において、組換えタンパク質は、最初は、正しくフォールディング
されていないか、または不溶性である。不溶性タンパク質のリフォールディングのための
様々な方法が周知である。ほとんどのプロトコルは、遠心分離により不溶性封入体を単離
した後、変性条件下で可溶化することを含む。次いで、タンパク質を非変性バッファーで
透析または希釈し、リフォールディングを行う。それぞれのタンパク質は特有のフォール
ディング特性を有するため、当業者は、任意の所与のタンパク質ごとに最適なリフォール
ディングプロトコルを実験的に決定することができる。最適なリフォールディング条件は
、例えば、タンパク質濃度、還元剤、酸化還元処理、二価カチオン等の変数を、マトリッ
クス法による小規模実験で検討することにより迅速に決定することができる。最適濃度が
分かったら、標的タンパク質の大規模な可溶化およびリフォールディングにそれらを適用
することができる。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質は、三次構造を含まない。いくつかの実
施形態において、栄養タンパク質中のアミノ酸の半分未満が三次構造に関与する。いくつ
かの実施形態において、栄養タンパク質は、二次構造を含まない。いくつかの実施形態に
おいて、栄養タンパク質中のアミノ酸の半分未満が二次構造に関与する。組換え栄養タン
パク質は、これらの構造特性のうちの１つ以上を含む状態においてそれらを発現する細胞
の培養物から単離されてもよい。いくつかの実施形態において、組換え栄養タンパク質の
三次構造は、タンパク質がそれを生成する培養物から単離された後に減少または消失され
る。いくつかの実施形態において、組換え栄養タンパク質の二次構造は、タンパク質がそ
れを生成する培養物から単離された後に減少または消失される。
いくつかの実施形態において、アルカリｐＨのＣＡＰＳバッファーをＮ－ラウリルサル
コシンと組み合わせて使用して封入体の可溶化を達成した後、ＤＴＴの存在下で希釈する
ことによりリフォールディングを促進する。標的タンパク質、発現条件、および意図する
用途に応じて、洗浄した封入体から可溶化したタンパク質は９０％超均一であり得、さら
なる精製を必要としない場合がある。Ｈｉｓ・Ｔａｇ（登録商標）融合タンパク質および
Ｈｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）固定化金属親和性クロマトグラフィー（Ｎｏｖｏｇｅｎ（
登録商標））を使用すると、完全な変性条件下（リフォールディング前）での精製が可能
である。さらに、６Ｍ尿素を用いて封入体から可溶化したＳ・Ｔａｇ（商標）、Ｔ７・Ｔ
ａｇ（登録商標）、およびＳｔｒｅｐ・Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ融合タンパク質は、適切
な樹脂上でクロマトグラフィーを行う前に２Ｍ尿素（Ｓ・ＴａｇおよびＴ７・Ｔａｇ）ま
たは１Ｍ尿素（Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ ＩＩ）に希釈することにより、部分変性条件下で精
製することができる。リフォールディングされた融合タンパク質は、Ｈｉｓ・Ｔａｇ、Ｓ
・Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ・Ｔａｇ ＩＩ、および他の適切な親和性タグ（例えば、ＧＳＴ・
Ｔａｇ（商標）、およびＴ７・Ｔａｇ）（Ｎｏｖｏｇｅｎ（登録商標））を用いて、天然
条件下で親和性精製することができる。
いくつかの実施形態において、組換え栄養タンパク質は、それを発現させるために用い
られる宿主細胞の内在性タンパク質である。すなわち、宿主細胞の細胞ゲノムは、組換え
栄養タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。いくつかの実施形態
において、調節配列が組換え核酸からの組換え栄養タンパク質の過剰発現を駆動するよう
に、栄養タンパク質の発現を増加させるのに十分な調節配列が、宿主細胞ゲノムに挿入さ
れ、内在性オープンリーディングフレームと作動可能に連結される。いくつかの実施形態
において、異種核酸配列は、栄養タンパク質の内在性オープンリーディングフレームに融
合され、組換え栄養タンパク質の細胞輸送を変更する（それをオルガネラまたは分泌経路
に誘導する等）異種アミノ酸配列を含むように栄養タンパク質の合成を引き起こす。いく
つかの実施形態において、内在性宿主細胞タンパク質をコードするオープンリーディング
フレームが、該オープンリーディングフレームと作動可能に連結された調節配列をさらに
含むプラスミド上で宿主細胞に導入される。いくつかの実施形態において、組換え宿主細
胞は、同様の条件下で増殖させた同様の宿主細胞によって生成される栄養タンパク質の量
よりも、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくと
も１０倍、または少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも
５０倍、または少なくとも１００倍多くの組換え栄養タンパク質を発現する。
いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、組換え生成系を使用するこ
となく、化学的に合成される。タンパク質合成は、当該技術分野で既知の技術を用いて、
液相系または固相系において実行することができる（例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．，
Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．（１９８９）。Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎ
ｇｌａｎｄ：ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｄ．（
１９８４）。Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ
ｅｄ．）．Ｒｏｃｋｆｏｒｄ：Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙを参照
のこと）。
Ｇ．植物における組換え栄養タンパク質の生成
本開示の栄養タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子は、核酸配列を含むトラ
ンスジェニック植物の生成を可能にする。したがって、本開示はまた、本開示の栄養タン
パク質をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む植物も提供する。植物は、形質
転換および再生を受けるいずれの植物であってもよく、限定されないが、アカシア、アル
ファルファ、アネット、リンゴ、アンズ、アーティチョーク、ルッコラ、アスパラガス、
アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコ
リー、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタロープメロン、ニンジン、キャッサバ
、カリフラワー、セロリ、白菜、サクランボ、コリアンダー、柑橘類、クレメンタイン、
コーヒー、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ダグラスファー、ナス、エンダイブ、キクヂ
シャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、森林樹、ウリ、ブドウ、グレープフルーツ、ハ
ニーデューメロン、ヒカマ、キウイフルーツ、レタス、リーク、レモン、ライム、テーダ
マツ、マンゴ、メロン、キノコ、木の実、オーツ麦、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞
植物、パパイヤ、パセリ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、ナシ、コショウ、カキ、パイナ
ップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジエ
ータパイン、赤チコリ、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、米、ライ麦、モロコシ、サ
ザンパイン、大豆、ホウレンソウ、スカッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワ
リ、スイートコーン、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、紅茶、タバコ、トマト
、芝生、つる植物、スイカ、コムギ、ヤムイモ、およびズッキーニを含む。好ましい実施
形態において、植物は、マメ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフ
ラワー、セロリ、白菜、トウモロコシ、ワタ、キュウリ、ナス、リーク、レタス、メロン
、エンドウ、コショウ、カボチャ、ラディッシュ、ホウレンソウ、大豆、スカッシュ、サ
トウキビ、スイートコーン、トマト、スイカ、およびコムギ植物である。いくつかの実施
形態において、植物は、トウモロコシ植物である。いくつかの実施形態において、植物は
、大豆植物である。いくつかの実施形態において、植物は、ワタ植物である。いくつかの
実施形態において、植物は、キャノーラ植物である。いくつかの実施形態において、植物
は、アラビドプシス、ベータ、グリシンヤトロファ、ミスカンサス、パニクム、ファラリ
ス、ポプルス、サッカルム、サリクス、シモンドシア、およびゼアから選択される属のメ
ンバーである。
植物細胞において活性な多数のプロモーターが、文献に記載されている。これらは、植
物ゲノムに存在するプロモーター、および他の源に由来するプロモーター（アグロバクテ
リウム・ツメファシエンスの腫瘍誘発プラスミド上に担持されるノパリンシンターゼ（Ｎ
ＯＳ）プロモーターおよびオクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）プロモーターを含む）、カリ
モウイルスプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルスを含む。例えば、米国
特許第５，８５８，７４２号および第５，３２２，９３８号（カリフラワーモザイクウイ
ルス（ＣａＭＶ３５Ｓ）に由来する構成的プロモーターの種類を開示する）、米国特許第
５，６４１，８７６号（コメアクチンプロモーターを開示する）、米国特許出願公開第２
００２／０１９２８１３Ａ１号（効果的な植物発現ベクターの設計に有用な５’、３’、
およびイントロンエレメントを開示する）、米国特許出願第０９／７５７，０８９号（ト
ウモロコシ葉緑体アルドラーゼプロモーターを開示する）、米国特許出願第０８／７０６
，９４６号（コメグルテリンプロモーターを開示する）、米国特許出願第０９／７５７，
０８９号（トウモロコシアルドラーゼ（ＦＤＡ）プロモーターを開示する）および米国特
許出願第６０／３１０，３７０号（トウモロコシニコチアナミンシンターゼプロモーター
を開示する）を参照のこと。植物細胞において機能するこれらのおよび多数の他のプロモ
ーターは、当業者に既知であり、トランスジェニック植物における栄養タンパク質の発現
を提供するための組換え核酸における使用に利用可能である。
いくつかの用途において、植物の緑色組織における選択的発現が望ましい。そのような
使用のための該当するプロモーターは、シロイヌナズナのリブロース－１，５－二リン酸
カルボキシラーゼ（Ｒｕｂｉｓｃｏ）の小サブユニット（Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ ｅｔ ａ
ｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０：８１－９３）、アルドラーゼ、
およびピルビン酸リン酸ジキナーゼ（ＰＰＤＫ）（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（
２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１（１）：４２－４８）等の遺伝
子に由来するものを含む。
さらに、プロモーターは、遺伝子発現の上昇に役立つように、少なくとも１つのエンハ
ンサー配列を含有するように改変されてもよい。そのようなエンハンサーは、当該技術分
野で既知である。そのような構築物を含むエンハンサー配列を含めることにより、栄養タ
ンパク質の発現が増強され得る。これらのエンハンサーは、真核細胞において機能するプ
ロモーターの転写開始点の５’に見出されることが多いが、しばしばコード配列の上流（
５’）または下流（３’）に挿入され得る。ある場合には、これらの５’増強エレメント
はイントロンである。エンハンサーとして特に有用なのは、コメアクチン１（米国特許第
５，６４１，８７６号を参照）およびコメアクチン２遺伝子の５’イントロン、トウモロ
コシアルコール脱水素酵素遺伝子のイントロン、トウモロコシ熱ショックタンパク質７０
遺伝子のイントロン（米国特許第５，５９３，８７４号）、およびトウモロコシｓｈｒｕ
ｎｋｅｎ １遺伝子である。
いくつかの用途には、種子組成の変更を実現するために植物の種子組織における発現が
望ましい。種子組成の変更に使用するための例示的なプロモーターは、ナピン（米国特許
第５，４２０，０３４号）、トウモロコシＬ３オレオシン（米国特許第６，４３３，２５
２号）、ゼインＺ２７（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉ
ｃ Ｒｅｓ．６（２）：１５７－１６６）、グロブリン １（Ｂｅｌａｎｇｅｒ ｅｔ
ａｌ（１９９１）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２９：８６３－８７２）、グルテリン １（Ｒｕ
ｓｓｅｌｌ（１９９７）上記参照）、およびペルオキシレドキシン抗酸化物質（Ｐｅｒ１
）（Ｓｔａｃｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１（６）
：１２０５－１２１６）等の種子遺伝子のプロモーターを含む。
本開示に従って調製される組換え核酸構築物は、典型的にはポリアデニル化シグナルお
よびポリアデニル化部位を含む３’エレメントも含む。周知の３’エレメントは、例えば
、米国特許第６，０９０，６２７号に開示されるｎｏｓ ３’、ｔｍｌ ３’、ｔｍｒ
３’、ｔｍｓ ３’、ｏｃｓ ３’、ｔｒ７ ３’等のアグロバクテリウム・ツメファシ
エンス遺伝子に由来するもの；パンコムギ熱ショックタンパク質１７（Ｈｓｐ１７ ３’
）、コムギユビキチン遺伝子、コムギフルクトース－１，６－ビホスファターゼ遺伝子、
米グルテリン遺伝子、米乳酸脱水素酵素遺伝子、および米β－チューブリン遺伝子等の植
物遺伝子由来の３’エレメント（これらはすべて米国公開特許出願第２００２／０１９２
８１３ Ａ１号に開示される）；ならびにエンドウ（ピスム・サティヴム）リブロースビ
スホスフェートカルボキシラーゼ遺伝子（ｒｂｓ ３’）、および宿主植物内の遺伝子に
由来する３’エレメントを含む。
構築物およびベクターは、遺伝子標的を、植物オルガネラに、特に、葉緑体、白色体、
または他の植物細胞小器官に標的化するための輸送ペプチドも含んでもよい。葉緑体輸送
ペプチドの使用についての記載は、米国特許第５，１８８，６４２号および第５，７２８
，９２５号を参照のこと。アラビドプシスＥＰＳＰＳ遺伝子の輸送ペプチド領域について
の記載は、Ｋｌｅｅ，Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ（ＭＧＧ（１９８７）２１０：４３７－４４２
）を参照のこと。
組換えＤＮＡで植物細胞を形質転換する数多くの方法が、当該技術分野で既知であり、
本開示において使用され得る。植物の形質転換によく用いられる２つのる方法は、アグロ
バクテリウム媒介形質転換および微粒子銃である。微粒子銃法は、米国特許第５，０１５
，５８０号（大豆）；第５，５５０，３１８号（トウモロコシ）；第５，５３８，８８０
号（トウモロコシ）；第５，９１４，４５１号（大豆）；第６，１６０，２０８号（トウ
モロコシ）；第６，３９９，８６１号（トウモロコシ）、および第６，１５３，８１２号
（コムギ）に例示されており、アグロバクテリウム媒介形質転換は、米国特許第５，１５
９，１３５号（ワタ）；第５，８２４，８７７号（大豆）；第５，５９１，６１６号（ト
ウモロコシ）；、および第６，３８４，３０１号（大豆）に記載されている。アグロバク
テリウム・ツメファシエンスに基づく植物形質転換系の場合、形質転換構築物上に存在す
る付加的なエレメントは、植物ゲノムへの組換えポリヌクレオチドの組込みを促進するた
めのＴ－ＤＮＡ左右境界配列を含む。
一般に、標的植物系統のゲノム中にランダムに、すなわち非特異的な位置に、組換えＤ
ＮＡを導入することが有用である。特別な場合、例えば、ゲノム中の既存の遺伝子を置換
するように、または植物ゲノム中の既存のプロモーターを用いるように、または遺伝子発
現に活性があることが分かっている所定の部位に組換えポリヌクレオチドを挿入するよう
に部位特異的組み込みを達成するために、組換えＤＮＡの挿入を標的とすることが有用で
あり得る。米国特許第４，９５９，３１７号に開示されるようなｃｒｅ－ｌｏｘおよび米
国特許第５，５２７，６９５号に開示されるようなＦＬＰ－ＦＲＴを含む、植物において
機能することが分かっているいくつかの部位特異的な組換え系が存在する。
形質転換方法は、一般的に、培地上の組織培養において、制御された環境で行われる。
「培地」は、インビトロで、すなわち、インタクトな生物の外で細胞を増殖させるために
使用される多数の栄養混合物を指す。レシピエント細胞標的は、限定されないが、分裂組
織細胞、カルス、未熟胚、および配偶子細胞、例えば、小胞子、花粉、精細胞、および卵
細胞を含む。稔性植物が再生され得るいずれの細胞も、レシピエント細胞として有用であ
ると考えられる。カルスは、限定されないが、未熟胚、苗の頂端分裂組織、ミクロスフェ
ア等を含む組織源から開始されてもよい。カルスとして増殖することができる細胞はまた
、遺伝子形質転換のためのレシピエント細胞でもある。本開示のトランスジェニック植物
を作製するための実際の形質転換方法および材料、例えば、種々の培地およびレシピエン
ト標的細胞、未熟胚細胞の形質転換、ならびにそれに続く稔性ランスジェニック植物の再
生は、米国特許第６，１９４，６３６号および第６，２３２，５２６号に開示されている
。
トランスジェニック植物の種子は、稔性トランスジェニック植物から採取することがで
き、本開示の組換え栄養タンパク質を産生する形質転換された植物の子孫世代を育成する
ために使用することができる。組換えＤＮＡを用いた植物の直接的な形質転換に加えて、
トランスジェニック植物は、組換えＤＮＡを有する第１の植物をＤＮＡを欠損した第２の
植物と交雑することにより調製することができる。例えば、形質転換に適した第１の植物
系統に組換えＤＮＡを導入してトランスジェニック植物を生成し、それを第２の植物系統
と交雑して組換えＤＮＡを第２の植物系統に遺伝子移入することができる。本開示の栄養
タンパク質をコードする組換えＤＮＡを有するトランスジェニック植物を、別の形質、例
えば、除草剤抵抗性もしくは害虫抵抗性、または油等の第２の栄養生成物の生成を付与す
る他の組換えＤＮＡを有するトランスジェニック植物系統と交雑し、両方の形質を付与す
る組換えＤＮＡを有する子孫植物を生成することができる。典型的には、そのような繁殖
において、形質を組み合わせるために、さらなる形質を寄与するトランスジェニック植物
は雄性系統であり、基本の形質を保持するトランスジェニック植物は雌性系統である。こ
の交雑の子孫は、ある植物は両方の親の形質のＤＮＡを保持し、ある植物は一方の親の形
質のＤＮＡを保持するように分離する：そのような植物は、親の組換えＤＮＡに関連する
マーカーによって、例えば、組換えＤＮＡに関する分析によるマーカー同定によって同定
することができるか、または、選択マーカーが組換え体に連結している場合には、除草剤
耐性マーカーとともに使用するための除草剤等の選択剤の適用により、もしくは強化され
た形質の選択により同定することができる。両方の親の形質のＤＮＡを保持する子孫植物
は、複数回、例えば、通常６～８世代、雌性親系統に戻し交雑して、他のトランジェニッ
ク親系統の組換えＤＮＡ以外は元の１つのトランスジェニック親系統と実質的に同じ遺伝
子型を有する子孫植物を生成することができる。
形質転換の実施において、典型的には、ＤＮＡが、いずれか１つの形質転換実験におい
て、わずかな割合を占める標的植物細胞に導入される。マーカー遺伝子は、トランスジェ
ニックＤＮＡ構築物をそれらのゲノムに受容することおよび組み込むことにより、安定に
形質転換された細胞を同定するための有効な系を提供するために用いられる。好ましいマ
ーカー遺伝子は、抗生物質または除草剤等の選択剤に対する抵抗性を付与する選択マーカ
ーを提供する。形質転換された植物が抵抗性であり得るいずれの除草剤も、選択マーカー
として有用な薬剤である。潜在的に形質転換された細胞が、選択剤に曝露される。生存細
胞の集団では、一般的に、抵抗性を付与する遺伝子が、細胞生存を許容する十分なレベル
で組み込まれ、発現される細胞である。外来性ＤＮＡの安定な組み込みを確認するために
、細胞をさらに検査してもよい。一般的に使用される選択マーカー遺伝子は、カナマイシ
ンおよびパロモマイシン（ｎｐｔＩＩ）、ハイグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）およびゲ
ンタマイシン（ａａｃ３およびａａｃＣ４）等の抗生物質に抵抗性を付与するか、または
グルフォシネート（ｂａｒまたはｐａｔ）およびグリフォセート（ａｒｏＡまたはＥＰＳ
ＰＳ）等の除草剤に抵抗性を付与するものを含む。そのような選択マーカーの例は、米国
特許第５，５５０，３１８号、第５，６３３，４３５号、第５，７８０，７０８号、およ
び第６，１１８，０４７号に例示されている。形質転換体を視覚的に同定する能力を提供
する選択マーカーも用いることができ、例えば、ルシフェラーゼもしくは緑色蛍光タンパ
ク質（ＧＦＰ）等の有色タンパク質または蛍光タンパク質を発現する遺伝子、あるいは種
々の発色基質が分かっているβグルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）を発現
する遺伝子を用いることができる。
選択剤への曝露を生き延びる植物細胞、またはスクリーニングアッセイで陽性と記録さ
れた植物細胞は、再生培地で培養し、植物へと成熟させることができる。形質転換植物細
胞から再生された発育中の小植物は、植物育成用混合物に移し、例えば、環境的に制御さ
れたチャンバー内で順化させることができる。植物は、初期の組織に応じて、形質転換体
が同定されてから約６週～１０ヶ月で再生する。植物は、当業者に既知の従来の植物育種
法を用いて授粉されてもよく、例えば自家授粉で生成された種子が、一般的にはトランス
ジェニックトウモロコシとともに用いられる。再生された形質転換植物またはその子孫種
子もしくは子孫植物を、組換えＤＮＡの発現について試験し、異種栄養タンパク質の存在
について選択することができる。
本開示の植物細胞に由来するトランスジェニック植物は、本開示の栄養タンパク質をコ
ードする異種核酸を含むトランスジェニック植物を作製し、異種核酸配列を含むトランス
ジェニック種子および半数体花粉を生成するように育成される。強化された特性を有する
そのような植物は、強化された特性について形質転換植物または子孫種子を選択すること
により同定される。本明細書において提供されるトランスジェニック種子から育成させた
トランスジェニック植物は、収量の増加に寄与するか、または、例えば、必須アミノ酸、
分枝鎖アミノ酸、もしくはＬｅｕのうちの少なくとも１つの含有量の増加等のタンパク質
の品質向上を含む高い植物価値を提供する他の形質に寄与する改善された農業的形質を示
す。
トランスジェニック植物は、栄養タンパク質の源として有用である。例えば、いくつか
の実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック植物は、
対照非トランスジェニック植物と比較して重量分率の大きな総タンパク質を含む。いくつ
かの実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック植物は
、対照非トランスジェニック植物と比較して重量分率の大きな必須アミノ酸を含む。いく
つかの実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック植物
は、対照非トランスジェニック植物と比較して重量分率の大きな分枝鎖アミノ酸を含む。
いくつかの実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック
植物は、対照非トランスジェニック植物と比較して重量分率の大きなＬｅｕを含む。いく
つかの実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック植物
は、ａ）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合の全アミノ酸残基に対する分
枝鎖アミノ酸残基、ｂ）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合の全アミノ酸
残基に対するＬｅｕ残基、およびｃ）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合
の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの
実施形態において、本開示の組換え栄養タンパク質を含むトランスジェニック植物は、ａ
）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合の全アミノ酸残基に対する分枝鎖ア
ミノ酸残基、ｂ）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合の全アミノ酸残基に
対するＬｅｕ残基、およびｃ）対照非トランスジェニック植物と比較して高い割合の全ア
ミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基を含む。
したがって、トランスジェニック植物は、高品質タンパク質の源として有用である。植
物は、採取し、さらに処理してまたは処理せずに、哺乳類の食事に用いることができる。
例えば、トランスジェニックコムギから作製されたる小麦粉、トランスジェニックトウモ
ロコシから作製されたコーンミール、またはトランスジェニックコメに由来する米または
米粉は、組換え栄養タンパク質を含まない植物から作製された同様の生成物と比較して、
タンパク質、必須アミノ酸、分枝鎖アミノ酸、およびＬｅｕのうちの少なくとも１つが濃
縮されている。いくつかの実施形態において、組換え栄養タンパク質は、植物性タンパク
質であるか、あるいは植物性タンパク質またはその誘導体もしくはムテインのポリペプチ
ド配列、例えば、必ずではないが、同じ種類の植物のタンパク質またはポリペプチド配列
等を含む。他の実施形態において、組換え栄養タンパク質は、植物性タンパク質またはそ
の誘導体もしくはムテインではない。
いくつかの実施形態において、組換え栄養タンパク質は、哺乳動物によって摂取される
前にトランスジェニック植物から回収または一部回収される。
Ｈ．組成物
本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タンパク質は、栄養組成物を形成するため
の少なくとも１つの第２の構成成分と組み合わせられてもよい。いくつかの実施形態にお
いて、組成物中のアミノ酸の唯一の源は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タ
ンパク質である。そのような実施形態において、上記組成のアミノ酸組成物は、本明細書
に開示される少なくとも１つの栄養タンパク質のアミノ酸組成物と同じである。いくつか
の実施形態において、組成物は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タンパク質
と、少なくとも１つの第２のタンパク質とを含む。いくつかの実施形態において、少なく
とも１つの第２のタンパク質は、本明細書に開示される第２の栄養タンパク質であり、他
の実施形態において、少なくとも１つの第２のタンパク質は、本明細書に開示される栄養
タンパク質ではない。いくつかの実施形態において、組成物は、１、２、３、４、５、６
、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個
、またはそれ以上の本明細書に開示される栄養タンパク質を含む。いくつかの実施形態に
おいて、組成物は０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の本明細書に開示される
栄養タンパク質ではないタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１
、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７
、１８、１９、２０個、またはそれ以上の栄養タンパク質を含み、組成物は、０、１、２
、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１
８、１９、２０個、またはそれ以上の本明細書に開示される栄養タンパク質ではないタン
パク質を含む。
いくつかの実施形態において、先行する段落に記載されるような栄養組成物は、少なく
とも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、および少なくとも１つの遊離アミ
ノ酸のうちの少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態において、栄養組成物は
、少なくとも１つのポリペプチドと、少なくとも１つのペプチドとを含む。いくつかの実
施形態において、栄養組成物は、少なくとも１つのポリペプチドと、少なくとも１つの遊
離アミノ酸とを含む。いくつかの実施形態において、栄養組成物は、少なくとも１つのペ
プチドと、少なくとも１つの遊離アミノ酸とを含む。いくつかの実施形態において、少な
くとも１つのポリペプチド、少なくとも１つのペプチド、および／または少なくとも１つ
の遊離アミノ酸は、１）分枝鎖アミノ酸、２）ロイシン、および３）必須アミノ酸から選
択されるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチド
、少なくとも１つのペプチド、および／または少なくとも１つの遊離アミノ酸は、１）分
枝鎖アミノ酸、２）ロイシン、および３）必須アミノ酸から選択されるアミノ酸からなる
。いくつかの実施形態において、栄養組成物は、少なくとも１つの修飾アミノ酸または非
標準アミノ酸を含む。修飾アミノ酸は、カルボキシ末端、アミノ末端、および／または側
鎖のうちの１つ以上に対する修飾を有するアミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、タンパク
質の翻訳後修飾によって形成されるもの、例えば、カルボキシル化グルタミン酸、ヒドロ
キシプロリン、またはハイプシンから選択されてもよい。他の非標準アミノ酸は、タンパ
ク質中に認められない。例として、ランチオニン、２－アミノイソ酪酸、デヒドロアラニ
ン、γアミノ酪酸、オルニチン、およびシトルリンが挙げられる。いくつかの実施形態に
おいて、栄養組成物は、１つ以上のＤ－アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、
栄養組成物は、１つ以上のＬ－アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、栄養組成
物は、１つ以上のＤ－アミノ酸と、１つ以上のＬ－アミノ酸との混合物を含む。
ポリペプチド、ペプチド、および遊離アミノ酸のうちの少なくとも１つを栄養組成物に
添加することにより、組成物中に存在する全アミノ酸に対する分枝鎖アミノ酸、ロイシン
、および必須アミノ酸のうちの少なくとも１つの割合を増加させることができる。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの炭水化物を含む。「炭水化
物」は、糖または糖のポリマーを指す。用語「糖類」、「多糖類」、「炭水化物」、およ
び「オリゴ糖類」は、同義に用いられ得る。ほとんどの炭水化物は、多くのヒドロキシル
基（通常、分子の各炭素原子上に１個）を有するアルデヒドまたはケトンである。炭水化
物は、一般に、分子式ＣｎＨ２ｎＯｎを有する。炭水化物は、単糖類、二糖類、三糖類、
オリゴ糖類、または多糖類であり得る。最も基本的な炭化水素は、単糖類、例えば、グル
コース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース
、およびフルクトースである。二糖類は、２つの結合した単糖類である。例示的な二糖類
として、スクロース、マルトース、セロビノース、およびラクトースが挙げられる。典型
的には、オリゴ糖類は、３個～６個の単糖類単位（例えば、ラフィノース、スタキオース
）を含み、多糖類は、６個以上の単糖類単位を含む。例示的な多糖類として、デンプン、
グリコーゲン、およびセルロースが挙げられる。炭水化物は、修飾された糖類単位、例え
ば、ヒドロキシル基が除去された２’－デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素で置
換された２’－フルオロリボース、またはＮ－アセチルグルコサミン、グルコースの窒素
含有形態（例えば、２’－フルオロリボース、デオキシリボース、およびヘキソース）を
含有してもよい。炭水化物は、多くの異なる形態、例えば、配座異性体、環式形態、非環
式形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、および異性体として存在し得る。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。本明細書で使
用される場合、「脂質」は、遊離脂肪酸を含む任意の形態の脂肪、油、トリグリセリド、
コレステロール、リン脂質、脂肪酸を含む。脂肪、油、および脂肪酸は、飽和、不飽和（
シスもしくはトランス）、または部分不飽和（シスもしくはトランス）であり得る。いく
つかの実施形態において、脂質は、ラウリン酸（１２：０）、ミリスチン酸（１４：０）
、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０
）、ヘプタデセン酸（１７：１）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）
、リノール酸（１８：２）、リノレン酸（１８：３）、オクタデカテトラエン酸（１８：
４）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、エイコサジエン酸（２０
：２）、エイコサテトラエン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）（ＥＰ
Ａ）、ドコサン酸（２２：０）、ドコセン酸（２２：１）、ドコサペンタエン酸（２２：
５）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）（ＤＨＡ）、およびテトラコサン酸（２４：０）
から選択される少なくとも１つの脂肪酸を含む。いくつかの実施形態において、組成物は
、少なくとも１つの修飾された脂質、例えば、調理によって修飾された脂質を含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの補助的なミネラルまたはミ
ネラル源を含む。ミネラルの例として、限定されないが、塩化物、ナトリウム、カルシウ
ム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリ
ウム、およびセレンが挙げられる。上記ミネラルのいずれかの好適な形態は、可溶性無機
塩、難溶性無機塩、不溶性無機塩、キレート化ミネラル、ミネラル錯体、非反応性ミネラ
ル（カルボニルミネラル等）、および還元ミネラル、ならびにそれらの組み合わせを含む
。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの補助ビタミンを含む。少な
くとも１つのビタミンは、脂溶性または水溶性のビタミンであってもよい。好適なビタミ
ンは、限定されないが、ビタミンＣ、ビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＢ１２、ビタミ
ンＫ、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＤ、ビタミンＢ６、葉酸、ピリドキシン、チ
アミン、パントテン酸、およびビオチンを含む。上記のいずれかの好適な形態は、ビタミ
ンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンと同じかまたは同様の活性を有する化合物、および
ビタミンの代謝物である。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの生物を含む。好適な例は当
該技術分野で周知であり、プロバイオティクス（例えば、乳酸桿菌またはビフィズス菌の
種）、スピルリナ、クロレラ、およびポルフィラを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１つの栄養補助食品を含む。好適
な例は当該技術分野で周知であり、薬草、植物、および特定のホルモンを含む。非限定的
な例として、イチョウ、朝鮮人参、およびメラトニンを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、賦形剤を含む。好適な賦形剤の非限定的な例
として、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、分散促進剤、崩壊剤、香味
剤、甘味剤、着色剤が挙げられる。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、緩衝剤である。好適な緩衝剤の非限定的な例
として、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸カルシウ
ム、および炭酸水素カルシウムが挙げられる。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、保存剤を含む。好適な保存剤の非限定的な例
として、抗酸化剤、例えば、αトコフェロールおよびアスコルビン酸塩、および抗菌剤、
例えば、パラベン、クロロブタノール、およびフェノールが挙げられる。
いくつかの実施形態において、組成物は、結合剤を賦形剤として含む。好適な結合剤の
非限定的な例として、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン
、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセル
ロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン、ポリビニルアルコール、Ｃ
１２－Ｃ１８脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖類、オリゴ糖
類、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの実施形態において、組成物は、滑沢剤を賦形剤として含む。好適な滑沢剤の
非限定的な例として、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン
酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス、モノステアリン酸ポリオキシエチレン、タルク、
ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸
マグネシウム、および軽鉱物油が挙げられる。
いくつかの実施形態において、組成物は、分散促進剤を賦形剤として含む。分散剤の非
限定的な例として、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアーガム、カオリ
ン、ベントナイト、精製木質セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモル
ファスシリケート、および高ＨＬＢ乳化剤界面活性剤としての微結晶性セルロースが挙げ
られる。
いくつかの実施形態において、組成物は、崩壊剤を賦形剤として含む。いくつかの実施
形態において、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤である。好適な非発泡性崩壊剤の非限定的な例
として、デンプン、例えば、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、それらのアル
ファ化デンプンおよび修飾デンプン、甘味剤、クレー、例えば、ベントナイト、微晶質セ
ルロース、アルギネート、デンプングリコール酸ナトリウム、寒天、ガム、例えば、グア
ー、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン、およびトラガカント等が挙げられる。いくつ
かの実施形態において、崩壊剤は、発泡性崩壊剤である。好適な発泡性崩壊剤の非限定的
な例として、クエン酸と組み合わせた重炭酸ナトリウム、および酒石酸と組み合わせた重
炭酸ナトリウムが挙げられる。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、香味剤を含む。外層内に組み込まれる香味剤
は、合成香味油および香味芳香剤；天然油；植物、葉、花、および果実からの抽出物；な
らびにそれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態において、香
味剤は、桂皮油、冬緑油、ペパーミント油、クローバー油、乾草油、アニス油、ユーカリ
油、バニラ油、柑橘油、例えば、レモン油、オレンジ油、ブドウ油、およびグレープフル
ーツ油等、ならびに果実エッセンス、例えば、リンゴ、モモ、ナシ、イチゴ、ラズベリー
、サクランボ、プラム、パイナップル、およびアンズから選択される。
いくつかの実施形態において、賦形剤は、甘味剤を含む。好適な甘味剤の非限定的な例
として、グルコース（コーンシロップ）、デキストロース、転化糖、フルクトース、およ
びそれらの混合物（担体として使用しない場合）；サッカリンおよびその種々の塩、例え
ばナトリウム塩等；ジペプチド甘味剤、例えば、アスパルテーム等；ジヒドロカルコン化
合物、グリシルリジン；ステビア（ステビオシド）；スクロースのクロロ誘導体、例えば
、スクラロース等；糖アルコール、例えば、ソルビトール、マンニトール、シリトール等
が挙げられる。また、水素添加デンプン加水分解物、および合成甘味剤３，６－ジヒドロ
－６－メチル－１，２，３－オキサチアジン－４－オン－２，２－ジオキシド、特に、カ
リウム塩（アセサルフェーム－Ｋ）、ならびにそれらのナトリウム塩およびカルシウム塩
も企図される。
いくつかの実施形態において、組成物は、着色剤を含む。好適な着色剤の非限定的な例
として、食品、医薬品、化粧品（ＦＤ＆Ｃ）用の着色剤、医薬品および化粧品用の着色剤
（Ｄ＆Ｃ）、ならびに外用薬品および化粧品用の着色剤（Ｅｘｔ．Ｄ＆Ｃ）を含む。着色
剤は、色素またはそれらの対応するレーキとして使用することができる。
製剤中の賦形剤または賦形剤の組み合わせの重量分率は、通常、組成物中のアミノ酸の
総重量の約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約
２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約２％以下、ま
たは約１％以下である。
本明細書に開示される栄養タンパク質および栄養組成物は、様々な形態に製剤化するこ
とができ、多数の異なる手段によって投与することができる。組成物は、所望により従来
許容されている担体、アジュバント、およびビヒクルを含有する製剤で経口的、経腸的、
または非経口的に投与することができる。本明細書において使用される用語「非経口的」
は、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内の注射および注入技術を含む。例示的な実施形
態において、栄養タンパク質または組成物は、経口投与される。
経口投与のための固体投薬形態は、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、トローチ
剤、ロゼンジ剤、散剤、および顆粒剤を含む。カプセル剤は、典型的には、栄養タンパク
質または組成物を含むコア材料と、コア材料を封入するシェル壁とを含む。いくつかの実
施形態において、コア材料は、固体、液体、およびエマルションのうちの少なくとも１つ
を含む。いくつかの実施形態において、シェル壁材量は、軟質ゼラチン、硬質ゼラチン、
およびポリマーのうちの少なくとも１つを含む。好適なポリマーは、限定されないが、セ
ルロースポリマー、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロー
ス、ヒドロキシメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、メチルセルロース、エチルセルロース、
酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、酢酸トリメリット酸セルロース、フタル酸ヒ
ドロキシプロピルメチルセルロース、コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、お
よびカルボキシメチルセルロースナトリウム；アクリル酸ポリマーおよびコポリマー、例
えば、アクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アンモニオメチルアクリレート、
エチルアクリレート、メチルメタクリレート、および／またはエチルメタクリレートから
形成されるもの（例えば、「Ｅｕｄｒａｇｉｔ」の商標名で販売されているコポリマー）
等；ビニルポリマーおよびコポリマー、例えば、ポリビニルポロリドン、ポリ酢酸ビニル
、ポリビニルアセテートフタレート、ビニルアセテートクロトン酸コポリマー、およびエ
チレン－ビニルアセテートコポリマー；ならびにシェラック（精製ラック）を含む。いく
つかの実施形態において、少なくとも１つのポリマーは、味覚マスキング剤として機能す
る。
錠剤、丸剤等は、圧縮、複数圧縮、多層化、および／またはコーティングされてもよい
。コーティングは、単数または複数であり得る。一実施形態において、コーティング材料
は、植物、真菌、および微生物のうちの少なくとも１つから抽出された糖類、多糖類、お
よび糖タンパク質のうちの少なくとも１つを含む。非限定的な例として、トウモロコシデ
ンプン、コムギデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、セルロース、ヘミセ
ルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチ
ン、マンナン、アラビアガム、ローカストビーンガム、メスキートガム、グアーガム、カ
ラヤガム、ガティガム、トラガントガム、フノリ、カラゲナン、寒天、アルギン酸塩、キ
トサン、またはジェランガムが挙げられる。いくつかの実施形態において、コーティング
材料は、タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、コーティング材料は、脂肪お
よび油のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、脂肪および油のう
ちの少なくとも１つは、高温で融解する。いくつかの実施形態において、脂肪および油の
うちの少なくとも１つは、硬化しているかまたは部分的に硬化している。いくつかの実施
形態において、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、植物に由来する。いくつかの実
施形態において、脂肪および油のうちの少なくとも１つは、グリセリド、遊離脂肪酸、お
よび脂肪酸エステルのうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、コー
ティング材料は、少なくとも１つの食用ワックスを含む。食用ワックスは、動物、昆虫、
または植物に由来し得る。非限定的な例として、蜜蝋、ラノリン、ヤマモモワックス、カ
ルナバワックス、および米ぬかワックスが挙げられる。錠剤および丸剤は、腸溶コーティ
ングを用いてさらに調製することができる。
代替として、本明細書に開示される栄養タンパク質および栄養組成物を具現化する散剤
または顆粒剤は、食品に組み込むことができる。いくつかの実施形態において、食品は、
経口投与のための飲料である。好適な飲料の非限定的な例として、果実飲料、人工香味料
入り飲料、人工甘味料入り飲料、炭酸飲料、スポーツ飲料、液体乳製品、シェイク、アル
コール飲料、カフェイン入り飲料、調整粉乳等が挙げられる。経口投与に他の好適な手段
は、水溶液および非水溶液、クリーム、ペースト、エマルション、懸濁液およびスラリー
を含み、これらの各々はまた、好適な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁剤、稀釈剤、甘味剤、
着色剤、および香味剤のうちの少なくとも１つを任意選択的に含有してもよい。
いくつかの実施形態において、食品は、固形食料である。固形食料の好適な例として、
限定されないが、フードバー、スナックバー、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッ
カー、ビスケット、クリームまたはペースト、アイスクリームバー、フローズンヨーグル
トバー等が挙げられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される栄養タンパク質および栄養組成物
は、治療食に組み込まれる。いくつかの実施形態において、治療食は、必須主要栄養素お
よび微量栄養素のいくつかまたは全部を任意選択的に含有する、すぐに使える食品である
。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される栄養タンパク質および栄養組成物
は、既存の食事に混ぜるように設計された栄養補助食品に組み込まれる。いくつかの実施
形態において、栄養補助食品は、必須主要栄養素および微量栄養素のいくつかまたは全部
を任意選択的に含有する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される栄養タン
パク質および栄養組成物は、既存の食品に混合されるか添加されて、その食品のタンパク
栄養を強化する。例として、主食（穀物、塩、砂糖、料理油、マーガリン）、飲料（コー
ヒー、紅茶、ソーダ、ビール、酒、スポーツドリンク）、軽食、甘い菓子、およびその他
の食品が挙げられる。
本明細書に開示される組成物は、例えば、筋肉量、強度および身体機能、熱発生、代謝
消費量、満腹感、ミトコンドリア生合成、体重または脂肪の損失、ならびに身体組成のう
ちの少なくとも１つを増加させるための方法に利用することができる。
Ｉ．使用方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される栄養タンパク質および栄養組成物
は、患者またはユーザ（時には、集合的に「対象」と称される）に投与される。本明細書
において使用される場合、「投与する」および「投与」は、ある人物が別の人物に、特定
の様式で、かつ／または特定の目的のために栄養タンパク質または栄養組成物を摂取する
ように指示する実施形態、同様に、ユーザが、第２の人物から受けたいずれの指示にも関
係なくまたは矛盾して、特定の様式で、かつ／または特定の目的のために栄養タンパク質
または栄養組成物を使用する状況を包含する。ある人物が別の人物に、特定の様式で、か
つ／または特定の目的のために、栄養タンパク質または栄養組成物を摂取するように指示
する実施形態の非限定的な例として、医師が一連の処置法および／または治療を患者に処
方する場合、訓練者がユーザ（運動選手等）に、特定の一連の処置法および／または治療
に従うように助言する場合、ならびに、製造業者、流通業者、マーケティング業者が、例
えば、製品の販売またはマーケティングに関連して提供される、パッケージまたは他の材
料上の広告または標示を通して、エンドユーザに使用の条件を推奨する場合が挙げられる
。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質または栄養組成物は、剤形で投与される
。いくつかの実施形態において、剤形は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タ
ンパク質の投与のために設計され、投与される栄養タンパク質の総量は、０．１ｇ～１ｇ
、１ｇ～５ｇ、２ｇ～１０ｇ、５ｇ～１５ｇ、１０ｇ～２０ｇ、１５ｇ～２５ｇ、２０ｇ
～４０ｇ、２５～５０ｇ、および３０～６０ｇから選択される。いくつかの実施形態にお
いて、剤形は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タンパク質の投与のために設
計され、投与される栄養タンパク質の総量は、約０．１ｇ、０．１ｇ～１ｇ、１ｇ、２ｇ
、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０
ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０
ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、および１００ｇから選択される。
いくつかの実施形態において、剤形は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養タ
ンパク質の投与のために設計され、投与される須アミノ酸の総量は０．１ｇ～１ｇ、１ｇ
～５ｇ、２ｇ～１０ｇ、５ｇ～１５ｇ、１０ｇ～２０ｇ、および１～３０ｇから選択され
る。いくつかの実施形態において、剤形は、本明細書に開示される少なくとも１つの栄養
タンパク質の投与のために設計され、投与される栄養タンパク質の総量は、約０．１ｇ、
０．１～１ｇ、１ｇ、２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５
ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５
ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、および１００ｇから選択される
。
いくつかの実施形態において、栄養タンパク質または栄養組成物は、１日０．１ｇ～１
ｇ、１日１ｇ～５ｇ、１日２ｇ～１０ｇ、１日５ｇ～１５ｇ、１日１０ｇ～２０ｇ、１日
１５ｇ～３０ｇ、１日２０ｇ～４０ｇ、１日２５ｇ～５０ｇ、１日４０ｇ～８０ｇ、１日
５０ｇ～１００ｇ、またはそれ以上の割合で摂取される。
対象による総タンパク質摂取量のいくつかの実施形態において、ある食事期間にわたる
対象による総タンパク質摂取量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％
、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なく
とも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０
％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少な
くとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％が、本開示によ
る少なくとも１つの栄養タンパク質で構成される。対象による総タンパク質摂取量のいく
つかの実施形態において、ある食事期間にわたる、対象による総タンパク質摂取量の５％
～１００％、対象による総タンパク質摂取量の５％～９０％、対象による総タンパク質摂
取量の５％～８０％、対象による総タンパク質摂取量の５％～７０％、対象による総タン
パク質摂取量の５％～６０％、対象による総タンパク質摂取量の５％～５０％、対象によ
る総タンパク質摂取量の５％～４０％、対象による総タンパク質摂取量の５％～３０％、
対象による総タンパク質摂取量の５％～２０％、対象による総タンパク質摂取量の５％～
１０％、対象による総タンパク質摂取量の１０％～１００％、対象による総タンパク質摂
取量の１０％～１００％、対象による総タンパク質摂取量の２０％～１００％、対象によ
る総タンパク質摂取量の３０％～１００％、対象による総タンパク質摂取量の４０％～１
００％、対象による総タンパク質摂取量の５０％～１００％、対象による総タンパク質摂
取量の６０％～１００％、対象による総タンパク質摂取量の７０％～１００％、対象によ
る総タンパク質摂取量の８０％～１００％、対象による総タンパク質摂取量の９０％～１
００％は、本開示による少なくとも１つの栄養タンパク質で構成される。いくつかの実施
形態において、少なくとも１つの本開示の栄養タンパク質は、ある食事期間にわたる対象
のカロリー摂取量の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも
２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、
少なくとも４５％、または少なくとも５０％を占める。
いくつかの実施形態において、本開示による少なくとも１つの栄養タンパク質は、本開
示の少なくとも２つの栄養タンパク質、本開示の少なくとも３つの栄養タンパク質、本開
示の少なくとも４つの栄養タンパク質、本開示の少なくとも５つの栄養タンパク質、本開
示の少なくとも６つの栄養タンパク質、本開示の少なくとも７つの栄養タンパク質、本開
示の少なくとも８つの栄養タンパク質、本開示の少なくとも９つの栄養タンパク質、本開
示の少なくとも１０個の栄養タンパク質、またはそれ以上を含む。
いくつかの実施形態において、食事期間は、１回の食事、２回の食事、３回の食事、少
なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少
なくとも６日、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４
週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少
なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、または少なくとも１年である。いくつかの実施形態
において、食事期間は、１日～１週間、１週間～４週間、１ヶ月～３ヶ月、３ヶ月～６ヶ
月、または６ヶ月～１年である。
臨床試験は、タンパク質が加齢または床上安静による筋力低下を防止するという証拠を
提供している。具体的には、研究により、タンパク質の補給が、長期床上安静中の時間当
たりの筋タンパク質合成速度（ＦＳＲ）を増加させ、長期床上安静中に脚質量および強度
を維持し、除脂肪体重を増加させ、歩行およびバランスの機能測定値を改善し、不動およ
び長期床上安静のためにサルコペニアのリスクがある個体に対する実行可能な治療介入と
しての役割を果たし得ることが示されている。（例えば、Ｐａｄｄｏｎ－Ｊｏｎｅｓ Ｄ
，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００４，８９：４
３５１－４３５８、Ｆｅｒｒａｎｄｏ，Ａ ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉ
ｔｉｏｎ ２００９ １－６、Ｋａｔｓａｎｏｓ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ．２００６，２９１：３８１－３８７を参照
のこと）。
運動選手における筋肉タンパク同化作用の増加に関する研究は、運動後に供給されるタ
ンパク質が、運動単独で達成されるより大きな程度まで筋肥大を促進することを示してい
る。また、運動後に供給されるタンパク質が、タンパク質分解を一切増加させることなく
タンパク質合成を支持し、正味の正のタンパク質バランスおよび筋肉量増加をもたらすこ
とも示されている。筋肉のタンパク質合成は、必須アミノ酸の補給に対して用量反応様式
で反応するが、すべてのタンパク質が筋肉増強において等しいわけではない。例えば、ア
ミノ酸ロイシンは、筋肉のタンパク質合成を刺激する上で重要な要因である。（例えば、
Ｂｏｒｓｃｈｅｉｍ Ｅ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ Ｍｅｔａｂ ２００２，２８３：Ｅ６４８－Ｅ６５７、Ｂｏｒｓｈｅｉｍ Ｅ ｅｔ
ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２００８，２７：１８９－９５、Ｅｓｍａｒｃｋ Ｂ ｅ
ｔ ａｌ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００１，５３５：３０１－３１１、Ｍｏｏｒｅ Ｄ
ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２００９，８９：１６１－８を参照のこと
）。
別の態様において、本開示は、対象において筋肉量、筋力、および機能的能力のうちの
少なくとも１つを維持するかまたは増加させる方法を提供する。いくつかの実施形態にお
いて、方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、また
は本開示の方法によって作製される栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形
態において、対象は、高齢者、医学的に重症である、およびタンパク質エネルギー栄養障
害に罹患している、のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、十分
な量の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製
される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施形
態において、本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によっ
て作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、対象において望ましいボディマス指数を維持するかまた
は達成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、十分な量の
本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される
栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態において、対象は、高齢者、医学
的に重症である、およびタンパク質エネルギー栄養障害に罹患している、のうちの少なく
とも１つである。いくつかの実施形態において、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本
開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、運動の遂行に
合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク
質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、経口、
経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
別の態様において、本開示は、タンパク質エネルギー栄養障害を有する対象にタンパク
質を提供する方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、十分な量
の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製され
る栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパ
ク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物は、経口
、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
癌患者および悪液質に罹患する他の患者において、必須アミノ酸補給の必要性が提案さ
れてきた。マウスにおける食生活に関する研究は、必須アミノ酸を用いた食事介入による
悪液性癌を有するマウスに対する生存上および機能上の利点を示している。癌以外にも、
必須アミノ酸の補給は、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不全、ＨＩＶ、および他の病態等の他
の疾患に罹患していて運動困難であるため筋肉の劣化に悩む患者において、筋機能改善お
よび筋肉増量等の利点を示している。
研究により、特定のアミノ酸が悪液質の管理に有利であることが示されている。食事中
のＢＣＡＡおよびＬｅｕ含有量が比較的多いと、翻訳増加をシグナル伝達すること、イン
スリン放出を促進すること、およびタンパク質分解を阻害することにより、総タンパク質
合成を促進して悪液質に好影響を与えると考えられる。よって、一般的にはＢＣＡＡおよ
び／または具体的にはＬｅｕを食事によって多く摂取することは、悪液質の影響の軽減ま
たは逆転に確実に寄与する。悪液質の根底にある原因に対処する上で窒素バランスが重要
であることから、食事によって多くのグルタミンおよび／またはアルギニンを摂取するこ
とは、悪液質の影響の軽減または逆転に確実に寄与すると考えられる。（例えば、Ｏｐ
ｄｅｎ Ｋａｍｐ Ｃ，Ｌａｎｇｅｎ Ｒ，Ｈａｅｇｅｎｓ Ａ，Ｓｃｈｏｌｓ Ａ．“
Ｍｕｓｃｌｅ ａｔｒｏｐｈｙ ｉｎ ｃａｃｈｅｘｉａ：ｃａｎ ｄｉｅｔａｒｙ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｔｉｐ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ？”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ
ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｃａｒｅ
２００９，１２：６１１－６１６、Ｐｏｏｎ ＲＴ－Ｐ，Ｙｕ Ｗ－Ｃ，Ｆａｎ Ｓ－
Ｔ，ｅｔ ａｌ．“Ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｏｒａｌ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａ
ｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ｃｈｅｍｏｅ
ｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ
：ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ．”Ａｌｉｍｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔ
ｈｅｒ ２００４；１９：７７９－７８８、Ｔａｙｅｋ ＪＡ，Ｂｉｓｔｒｉａｎ ＢＲ
，Ｈｅｈｉｒ ＤＪ，Ｍａｒｔｉｎ Ｒ，Ｍｏｌｄａｗｅｒ ＬＬ，Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ
ＧＬ．“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｌｂｕｍ
ｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｂｒａｎｃｈｅｄ ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉ
ｄ－ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｔｏｔａｌ ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ｉｎ
ｃａｎｃｅｒ ｃａｃｈｅｘｉａ．”Ｃａｎｃｅｒ．１９８６；５８：１４７－５７；
Ｘｉ Ｐ，Ｊｉａｎｇ Ｚ，Ｚｈｅｎｇ Ｃ，Ｌｉｎ Ｙ，Ｗｕ Ｇ “Ｒｅｇｕｌａｔ
ｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｇｌｕｔａｍｉｎｅ：ｉ
ｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈ．”Ｆｒ
ｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１Ｊａｎ １；１６：５７８－９７を参照のこと）。
したがって、対象において悪液質を治療する方法も、本明細書に提供される。いくつか
の実施形態において、悪液質を有する対象のための本開示の栄養タンパク質、本開示の栄
養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物の十分な量は、ヒトによっ
て経口摂取される本開示のタンパク質の量が代謝要求（しばしば上昇する）を満たすかま
たは超過する量である。１日当たり１．５ｇ／体重１ｋｇまたは総カロリー摂取量の１５
～２０％のタンパク質摂取量が、悪液質を有する人々にとって適切な標的であると考えら
れる。いくつかの実施形態において、対象によって摂取されるタンパク質のすべてが、本
開示による栄養タンパク質である。いくつかの実施形態において、本開示による栄養タン
パク質は、対象の総タンパク質摂取量を提供するために、タンパク質および／または遊離
アミノ酸の他の源と組み合わされる。いくつかの実施形態において、対象は、高齢者、医
学的に重症である、およびタンパク質エネルギー栄養障害に罹患している、のうちの少な
くとも１つである。いくつかの実施形態において、対象は、慢性閉塞性肺疾患、慢性心不
全、ＨＩＶ、癌、および他の病態等の、運動を困難にし、ひいては筋肉の劣化を引き起こ
す疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質、本
開示による栄養組成物、または本開示による方法によって作製される栄養組成物は、運動
の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施形態において、本開示による
栄養タンパク質、本開示による栄養組成物、または本開示による方法によって作製される
栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
サルコペニアは、加齢に関連した骨格筋の量（典型的には、２５歳以降は１年当たり０
．５～１％の損失）、質、および強度の退行性の損失である。サルコペニアは、脆弱症候
群の構成要素である。Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｓａｒｃ
ｏｐｅｎｉａ ｉｎ Ｏｌｄｅｒ Ｐｅｏｐｌｅ（ＥＷＧＳＯＰ）は、加齢に伴うサルコ
ペニアに関する実用的臨床定義およびコンセンサス診断基準を開発した。上記ワーキング
グループは、サルコペニアの診断のために、筋肉量の低下および筋機能の低下（強度また
は性能）の両方の存在を用いることを提案している。サルコペニアは、脂肪による筋線維
の置換、線維症の増加、筋肉代謝の変化、酸化ストレス、および神経筋接合部の変性等の
要因によって引き起こされる、筋組織の「質」の低下を伴う筋萎縮（筋肉のサイズの減少
）によって最初に特徴付けられる。これらの変化が合わさると、筋機能の進行性損失、お
よび最終的には脆弱性を引き起こす。脆弱性は、高齢の成人における健康および機能の破
局的衰退のリスク増加を具体化する、一般的な老年症候群である。脆弱性の原因は、サル
コペニア、骨粗鬆症、および筋力低下を含み得る。筋疲労（または、「強度の欠如」）と
しても知られる筋力低下は、骨格筋により力を発揮することができないことを意味する。
疾病の結果としての長期にわたる床上安静後等の衰弱は、しばしば筋萎縮および活性の減
少を伴う。また、サルコペニアの結果として、筋疲労が徐々に発生する。
本開示の栄養タンパク質は、サルコペニアもしくは脆弱性が対象に発症した場合、それ
を治療するのに有用であるか、またはリスク群のメンバーである対象におけるサルコペニ
アもしくは脆弱性の発症の予防に有用である。いくつかの実施形態において、対象によっ
て摂取されるタンパク質のすべてが、本開示による栄養タンパク質である。いくつかの実
施形態において、本開示による栄養タンパク質は、対象の総タンパク質摂取量を提供する
ために、タンパク質および／または遊離アミノ酸の他の源と組み合わされる。いくつかの
実施形態において、対象は、高齢者、医学的に重症である、およびタンパク質エネルギー
栄養障害に罹患している、のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において
、本開示による栄養タンパク質、本開示による栄養組成物、または本開示による方法によ
って作製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつか
の実施形態において、本開示による栄養タンパク質、本開示による栄養組成物、または本
開示による方法によって作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象
によって摂取される。
肥満は、高血圧、２型糖尿病、脂質異常症、冠動脈心疾患、脳卒中、癌（例えば、子宮
内膜、乳房、および結腸）、変形性関節症、睡眠時無呼吸、ならびに呼吸障害を含む共存
症の宿主に関連する多因子疾患である。＞３０ｋｇ／ｍ２のボディマス指数として定義さ
れる肥満の発生率は、米国において１５％（１９７６～１９８０）から３３％（２００３
～２００４）へと劇的に増加し、なおも増加し続けている。肥満に寄与する機構は複雑で
あり、行動的成分と、ホルモン、遺伝、および代謝プロセスとの相互作用に関与するが、
肥満は、主に、過剰なエネルギー摂取量および不十分な身体活動の２つの主因による生活
習慣に依存する状態であると見なされる。エネルギー摂取量に関して、総エネルギー摂取
量を制御しながら食事中のタンパク質の割合を適度に増加させることが、身体組成を改善
し、脂肪消失を促進し、体重減少後の体重維持を向上し得るという証拠が存在する。食事
性タンパク質の増加に関連する好ましい成果は、満腹感の増加に伴うエネルギー摂取量の
減少、エネルギー効率の低下および／または熱発生の増加、身体組成に及ぼす好ましい影
響（具体的には除脂肪筋肉量）、ならびに血糖管理の強化に主に起因すると考えられる。
食事性タンパク質は、等カロリーの炭水化物または脂肪の摂取量よりも食後のエネルギ
ー消費量を増加させる上で効果的である（例えば、Ｄａｕｎｃｅｙ Ｍ，Ｂｉｎｇｈａｍ
Ｓ．“Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ２４ ｈ ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒ
ｅ ｉｎ ｍａｎ ｏｎ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｔｒｉｅｎｔ
ｉｎｔａｋｅ．”Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ １９８３，５０：１－１３、Ｋａｒｓｔ Ｈ ｅ
ｔ ａｌ．“Ｄｉｅｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｍａｎ：
ｔｈｅｒｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅｓ ａｎｄ ｆａｔｓ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅｉｒ ｅｎｅ
ｒｇｙ ａｍｏｕｎｔ．”Ａｎｎ Ｎｕｔｒ Ｍｅｔａｂ．１９８４，２８：２４５－５
２、Ｔａｐｐｙ Ｌ ｅｔ ａｌ “Ｔｈｅｒｍｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｆｕｓ
ｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｉｎ
ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．”Ａｍ Ｊ Ｃ
ｌｉｎ Ｎｕｔｒ １９９３，５７（６）：９１２－６を参照のこと）。この特性は、他
の特性（満腹感誘導、除脂肪体重の維持）と並んで、タンパク質を体重管理を標的とする
食事の魅力的な構成成分にする。そのような食事によって引き起こされるエネルギー消費
量の増加は、タンパク質を消化および代謝するエネルギーコストが、他のカロリー源より
も高いという事実に一部起因し得る。タンパク質合成を含むタンパク質の代謝回転は、エ
ネルギー消費プロセスである。さらに、高タンパク食は、肝組織および褐色脂肪において
、エネルギー消費量の増加と確実に相関する脱共役タンパク質を上方制御し得る。異なる
タンパク質は、エネルギー消費量に特有の影響を及ぼし得るという理論が立てられてきた
。
研究は、タンパク質、具体的には、ＥＡＡおよび／またはＢＣＡＡ含有量の高いタンパ
ク質の経口摂取が、熱発生およびエネルギー消費量にはっきりと異なる影響を及ぼすこと
を示唆している（例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ｆａｔ－ｒｅｄｕｃｅｄ ｄｉｅｔｓ ｏｎ ２４ ｈ ｅｎｅｒｇｙ ｅｘｐｅｎｄ
ｉｔｕｒｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ａｎｉｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
，ｖｅｇｅｔａｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ．”Ａｍ
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０００，７２：１１３５－４１、Ａｃｈｅｓｏｎ Ｋ．ｅｔ
ａｌ．“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｏｉｃｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎ
ｅｓｉｓ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．”Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０１１
，９３：５２５－３４、Ａｌｆｅｎａｓ Ｒ．ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐ
ｒｏｔｅｉｎ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｎ ａｐｐｅｔｉｔｅ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ ｍｅ
ｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｗｅｉｇｈｔ ｓｕｂｊｅｃｔｓ”Ａｒｇ Ｂ
ｒａｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂｏｌ ２０１０，５４（１）：４５－５１、
Ｌｏｒｅｎｚｅｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｉｌｋ ｐｒｏ
ｔｅｉｎｓ ｏｎ ａｐｐｅｔｉｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｅｔ－ｉｎ
ｄｕｃｅｄ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ．”Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ ２０１２ ６６
（５）：６２２－７を参照のこと）。また、Ｌ－チロシンは、熱発生に関与するアミノ酸
として同定されている（例えば、Ｂｅｌｚａ Ａ．ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｂｅｔａ－ａ
ｄｒｅｎｅｒｇｉｃ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ ｐａｒｔｌｙ
ａｂｏｌｉｓｈｅｓ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｂｉｏａｃｔ
ｉｖｅ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．”Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２００９，５８
（８）：１１３７－４４を参照のこと）。さらなる研究により、ロイシンおよびアルギニ
ンの補給が、脂肪組織ではなく除脂肪体重への基質を誘導することによりエネルギー代謝
を変化させること示唆されている（Ｄｕｌｌｏｏ Ａ．“Ｔｈｅ ｓｅａｒｃｈ ｆｏｒ
ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｔｈａｔ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ
ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：ｆｒｏｍ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌｓ ｔｏ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｆｏｏｄ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ．”Ｏｂｅｓ
Ｒｅｖ ２０１１ １２：８６６－８３）。
総合すると、文献は、異なるタンパク質の種類は、熱発生にはっきりと異なる影響をも
たらすことを示唆している。ＥＡＡ、ＢＣＡＡ、ならびに／またはＴｙｒ、Ａｒｇ、およ
びＬｅｕのうちの少なくとも１つに富んだタンパク質またはペプチドは、熱発生に刺激作
用を及ぼすと考えられるため、また、熱発生の刺激は、体重管理に好影響をもたらすと考
えられるため、本開示は、一般に、熱発生を刺激するためおよび／または体重管理に好影
響をもたらすために有用な生成物および方法も提供する。
より具体的には、本開示は、対象において熱発生を増加させる方法を提供する。いくつ
かの実施形態において、方法は、対象に、十分な量の本開示の栄養タンパク質、本開示の
栄養組成物、または本開示の方法によって作製される栄養組成物を提供することを含む。
いくつかの実施形態において、対象は肥満である。いくつかの実施形態において、本開示
による栄養タンパク質、本開示による栄養組成物、または本開示による方法によって作製
される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対象によって摂取される。いくつかの実施形
態において、本開示による栄養タンパク質、本開示による栄養組成物、または本開示によ
る方法によって作製される栄養組成物は、経口、経腸、または非経口経路で対象によって
摂取される。
基本的レベルで、過体重状態の発生の理由は、エネルギー摂取量とエネルギー消費量と
の間の不均衡によるものである。いずれか特定の機会に（心的飽和）および食事の機会全
体にわたって（満腹感）食物を減らそうとする試みが、最近の研究の大きな焦点となって
いる。食事中の満足感および食後の満腹感の結果としてのカロリー摂取量の減少は、内部
および外部シグナルの複雑な相互作用によるものである。種々の栄養学的研究により、エ
ネルギー密度、含有量、舌触り、および味覚等の食物の特性における多様性が、心的飽和
反応および満腹感の両方に影響することが証明されている。
エネルギーを運搬する３つの主要栄養素として、脂肪、炭水化物、およびタンパク質が
存在する。１グラムのタンパク質または炭水化物は、４カロリーを提供し、１グラムの脂
肪は、９カロリーを提供する。タンパク質は、一般的に、炭水化物または脂肪よりも大き
く満腹感を増加させ、したがって、カロリー摂取量の減少を促進し得る。しかしながら、
満腹感を誘導する際にタンパク質の種類が重要であることを示す考慮すべき証拠が存在す
る（例えば、Ｗ．Ｌ．Ｈａｌｌ，ｅｔ ａｌ．“Ｃａｓｅｉｎ ａｎｄ ｗｈｅｙ ｅｘ
ｅｒｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｐｌａｓｍａ ａｍｉｎｏ ａｃ
ｉｄ ｐｒｏｆｉｌｅｓ，ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｈｏｒｍｏｎｅ ｓｅｃ
ｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｅｔｉｔｅ．”Ｂｒ Ｊ Ｎｕｔｒ．２００３Ｆｅｂ，８
９（２）：２３９－４８、Ｒ．Ａｂｏｕ－Ｓａｍｒａ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏ
ｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｎ ｓａｔｉａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｈｏｒｔ－ｔｅｒｍ ｓａｔｉｅｔｙ ｗｈｅｎ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ａｓ
ａ ｓｔａｒｔｅｒ．”Ｎｕｔｒ Ｊ．２０１１ Ｄｅｃ ２３，１０：１３９、Ｔ．
Ａｋｈａｖａｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｒｅｍｅａｌ ｃｏｎｓｕｍｐ
ｔｉｏｎ ｏｆ ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ
ｏｎ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ａｎｄ ｐｏｓｔｍｅａｌ ｇｌｙｃｅｍｉａ ａｎ
ｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ａｄｕｌｔｓ．”Ａｍ
Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｕｔｒ．２０１０Ａｐｒ，９１（４）：９６６－７５，Ｅｐｕｂ ２０
１０ Ｆｅｂ １７、ＭＡ Ｖｅｌｄｈｏｒｓｔ “Ｄｏｓｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓ
ａｔｉａｔｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｗｈｅｙ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ｃａｓｅ
ｉｎ ｏｒ ｓｏｙ”Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｅｈａｖ．２００９Ｍａｒ ２３，９６（４－
５）：６７５－８２を参照のこと）。証拠は、ロイシンに富んだタンパク質が、満腹感を
誘導するのに特に効果的であることを示している（例えば、Ｆｒｏｍｅｎｔｉｎ Ｇ ｅ
ｔ ａｌ “Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ａｎｄ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｆｏｏｄ ｉｎｔａｋｅ ｂ
ｙ ｄｉｅｔａｒｙ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｎｕｔｒ
Ｒｅｓ Ｒｅｖ ２０１２ ２５：２９－３９を参照のこと）。
いくつかの実施形態において、本開示の栄養タンパク質は、少なくとも１つの薬学的ま
たは生物学的な製剤と同時に対象によって摂取される。いくつかの実施形態において、栄
養タンパク質および少なくとも１つの薬学的または生物学的な製剤の有益な効果は、相加
効果を有し、一方、いくつかの実施形態において、栄養タンパク質および少なくとも１つ
の薬学的または生物学的な製剤の有益な効果は、相乗効果を有する。本開示の栄養タンパ
ク質とともに投与することができる薬学的または生物学的な製剤の例は、当該技術分野で
周知である。例えば、本開示の栄養タンパク質が、対象において筋肉量、筋力、および機
能的能力のうちの少なくとも１つを維持するまたは増加させるために使用される場合、栄
養タンパク質は、対象において筋肉量、筋力、および機能的能力のうちの少なくとも１つ
を維持するかまたは増加させることが示されている少なくとも１つの薬学的または生物学
的な製剤、例えば、タンパク質同化ステロイド等の治療投与計画と同時に対象によって摂
取されてもよい。本開示の栄養タンパク質が、対象において望ましいボディマス指数を維
持するまたは達成するために使用される場合、栄養タンパク質は、対象において望ましい
ボディマス指数を維持するまたは達成することが示されている少なくとも１つの薬学的ま
たは生物学的な製剤、例えば、オルリスタット、ロルカセリン、シブトラミン、リモナバ
ン、メトホルミン、エキセナチド、またはプラムリンチド等の治療投与計画と同時に対象
によって摂取されてもよい。本開示の栄養タンパク質が、対象において心的飽和反応およ
び満腹反応のうちの少なくとも１つを誘導するために使用される場合、栄養タンパク質は
、対象において心的飽和反応および満腹反応のうちの少なくとも１つを誘導することが示
されている少なくとも１つの薬学的または生物学的な製剤、例えば、リモナバン、エキセ
ナチド、またはプラムリンチド等の治療投与計画と同時に対象によって摂取されてもよい
。本開示の栄養タンパク質が、対象において悪液質、サルコペニア、および虚弱のうちの
少なくとも１つを治療するために使用される場合、栄養タンパク質は、悪液質、サルコペ
ニア、および虚弱のうちの少なくとも１つを治療することが示されている少なくとも１つ
の薬学的または生物学的な製剤、例えばオメガ３脂肪酸またはタンパク質同化ステロイド
等の治療投与計画と同時に対象によって摂取されてもよい。心的飽和および満腹感の誘導
における食事性タンパク質の役割のために、本明細書に開示される栄養タンパク質および
栄養組成物は、対象において心的飽和反応および満腹反応のうちの少なくとも１つを誘導
するために使用することができる。いくつかの実施形態において、方法は、対象に、十分
な量の本開示の栄養タンパク質、本開示の栄養組成物、または本開示の方法によって作製
される栄養組成物を提供することを含む。いくつかの実施形態において、対象は肥満であ
る。いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質、本開示による栄養組成
物、または本開示による方法によって作製される栄養組成物は、運動の遂行に合わせて対
象によって摂取される。いくつかの実施形態において、本開示による栄養タンパク質、本
開示による栄養組成物、または本開示による方法によって作製される栄養組成物は、経口
、経腸、または非経口経路で対象によって摂取される。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの本開示の栄養タンパク質または栄養組
成物を対象の食事に組み入れることは、食後の満腹感の誘導（空腹感を抑制することによ
ることを含む）、熱発生の誘導、血糖反応の低減、エネルギー消費量に対する好影響、除
脂肪体重に対する好影響、過食によって引き起こされる体重増加の減少、およびエネルギ
ー摂取量の減少から選択される少なくとも１つの影響を有する。いくつかの実施形態にお
いて、少なくとも１つの本開示の栄養タンパク質または栄養組成物を対象の食事に組み入
れることは、対象における体脂肪消失の増大、除脂肪組織消失の減少、脂質プロファイル
の改善、ならびに耐糖能およびインスリン感受性の向上から選択される少なくとも１つの
影響を有する。
以下の実施例は、本発明を使用する様式をより完全に説明する役割を果たす。これらの
実施例は、例示の目的で提示されるのであって、本発明の真の範囲を限定する役割を果た
すべきではない。
実施例１：ゼラチンよりも高い割合の必須アミノ酸、分枝鎖アミノ酸、およびロイシンを
含有するタンパク質の同定
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ
ａｔｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅとＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎ
ｆｏｒｍａｔｉｃｓとのコラボレーション）は、手作業で処理および検討されたタンパク
質のデータベースであり、タンパク質同定の出発点として使用した。５０個以上のアミノ
酸を有する食用種であるソラナム・リコペルシク、トウモロコシ、オリザ・サティバ亜種
ジャポニカ、グリシンマックス、オービス・アリエス、ピスム・サティヴム、ホウレンソ
ウ、オリザ・サティバ亜種インディカ、トリティクム・アエスティウム、スース・スクロ
ファ、モモ、カプシクム・アンヌウム、マルス・ドメスティカ、キハダマグロ、カプラ・
ヒルクス、シセル・アリエチヌム、タイセイヨウサケ、メレアグリス・ガロパボ、ソラナ
ム・ツベロスム、およびアガリクス・ビスポルスからのタンパク質試料をこの試験の標的
として採取した。こうして、８，４１５個の一連のタンパク質が評価のために提供された
。各タンパク質について、アミノ酸含有量、必須アミノ酸（「ＥＡＡ」）のパーセンテー
ジ、分枝鎖アミノ酸（「ＢＣＡＡ」）のパーセンテージ、ロイシン（「Ｌ」）のパーセン
テージ、およびタンパク質がすべての必須アミノ酸を含有するかどうかを算出した。また
、ＳｏｌｖＳｃｏｒｅも各タンパク質ごとに算出した。さらに、既知のアレルゲンに対し
て５０％を超える全体的相同性を有するものがあるかどうかを決定するために、既知のア
レルゲンのデータベースに対してタンパク質をスクリーニングした。全部で４６３個のタ
ンパク質が、２０以下のＳｏｌｖｅＳｃｏｒｅを有し、１９％以上のＥＡＡ、８％以上の
ＢＣＡＡ、および４％以上のＬｅｕを含有し、既知のアレルゲンに対する５０％未満の全
体的相同性（配列番号１～４６３）を有すると同定された。（同定されたタンパク質がゼ
ラチンよりも高い含有量のＥＡＡ、ＢＣＡＡ、およびＬｅｕを有することを確実にするた
めに、これらの値は、この実施例において該当する栄養タンパク質を同定するために用い
られた）。一連のタンパク質について、ｐＨ７での溶媒和スコア（「ＳｏｌｖＳｃｏｒｅ
」）、凝集スコアｐＨ７での（「ＡｇｇＳｃｏｒｅ」）、アレルゲン性（すなわち、本明
細書に記載されるような既知のアレルゲンに対する局所的相同性パーセント）、毒性（す
なわち、本明細書に記載されるような既知の毒素に対する相同性パーセント）、抗栄養性
（すなわち、本明細書に記載されるような既知のプロテアーゼ阻害剤に対する相同性パー
セント）、およびヒト相同性（すなわち、本明細書に記載されるような既知のヒトタンパ
ク質に対する相同性パーセント）を算出し、Ｃｙｓ残基（「Ｃ」）の合計数を決定した。
このようにして同定した２００個の代表的なタンパク質の特性を表３Ａおよび３Ｂに提示
する。
表３Ａ
Figure 0007303238000004
Figure 0007303238000005
Figure 0007303238000006

Figure 0007303238000007
表３Ｂ
Figure 0007303238000008

Figure 0007303238000009

Figure 0007303238000010

Figure 0007303238000011
実施例２：タンパク質の発現
本開示の栄養タンパク質をコードする遺伝子を、大腸菌における発現のためにコドン最
適化し、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＧｅｎｅＡｒｔまたはＤＮＡ２．０のいず
れかにより合成した。遺伝子は、天然タンパク質を発現するように、または精製を促進す
るために２つのアミノ末端タグのうちの１つを含有するように設計した：
ＭＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９５）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ（配列番号４９４）
ＮｃｏＩ－ＢａｍＨＩ制限酵素部位（第１のタグの場合）を用いて、またはＮｄｅＩ－
ＢａｍＨＩ制限酵素部位（第２のタグの場合）を用いて、これらの遺伝子構築物をｐＥＴ
１５ｂ プラスミドベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入した。すべての制限酵素は、Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。プラスミドを大腸菌Ｔ７ Ｅｘｐｒ
ｅｓｓ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に形質転換し、１００ｍｇ／ｌカル
ベニシリンを含有する溶原培地（ＬＢ）プレート上で選択した。単一のコロニーを取り出
し、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを用いてＬＢ中ＯＤ６００ｎｍ≒０．６まで増殖させ
、マスター細胞ストックとしての役割を果たすようにグリセロールストック（１０％グリ
セロールを含むＬＢ中（ｖ／ｖ））として－８０℃で保存した。
１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む２ｍｌ ＬＢ（１４ｍｍ×１００ｍｍ培養試験管
中）にグリセロールストックからのスタブを接種し、３７℃および２５０ｒｐｍで一晩増
殖させた。翌日、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む２ｍｌ ＬＢ（１４ｍｍ×１００
ｍｍ培養試験管中）に一晩培養物をＯＤ６００ｎｍ＝０．０５まで接種し、３０℃または
３７℃ならびに２５０ｒｐｍで増殖させた。ＯＤ６００ｎｍ≒０．８で、１ｍＭイソプロ
ピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて異種遺伝子の発現を開始
し、採取するまでさらに２時間（３７℃で増殖させる場合）または４時間（３０℃で増殖
させる場合）増殖させた。採取してから、ＯＤ６００ｎｍを測定し、１ｍｌアリコートを
遠心分離し、上清をデカントした。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析のために細胞をＯＤ６００ｎｍ
＝１．５０に再懸濁し、発現レベルを評価した。１０μｌの再懸濁した培養物を、１）Ｎ
ｏｖｅｘ（登録商標）ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）１２％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆ
ｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、または２）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）１６％ Ｔｒｉｃ
ｉｎｅゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかにローディングし、標準
的な製造者のプロトコルを用いて実行した。標準的な製造者のプロトコルを用いてＳｉｍ
ｐｌｙＢｌｕｅ（商標）ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を
使用してゲルを染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ（登録商標）Ｇｅｌ Ｄｏｃ
（商標）ＸＲ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して画像化した。過剰発現され
た異種タンパク質を、分子量マーカーおよび対照培養物と比較することにより同定した。
この方法を用いて、表４Ａおよび４Ｂに列挙したタンパク質の組換え発現が観察された
。
表４Ａ
Figure 0007303238000012
表４Ｂ
Figure 0007303238000013
実施例３：組換え栄養タンパク質の大量生成
本開示に記載されるような栄養タンパク質を大量に生成するための代表的なプロトコル
は次の通りである。
１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む５ｍｌ ＬＢ（５０ｍｌバッフル付きＰｙｒｅｘ
（登録商標）振盪フラスコ中）に、栄養タンパク質をコードする組換え遺伝子を含む組換
え大腸菌株のグリセロールストックからのスタブを接種し、後期対数増殖期まで３７℃お
よび２５０ｒｐｍで増殖させる（ＯＤ６００ｎｍ≒２）。２．５ｌ Ｕｌｔｒａ Ｙｉｅ
ｌｄ Ｆｌａｓｋ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）に、５０
０ｍｌの滅菌水および十分なＥｎＢａｓｅ ＥｎＰｒｅｓｓｏ（商標）錠剤（ＢｉｏＳｉ
ｌｔａ）を接種し、５００ｍｌの増殖培地を作製する。この培地に、１００ｍｇ／ｌ カ
ルベニシリン、０．００１％ Ｉｎｄｕｓｔｒｏｌ ２０４消泡剤、および０．６Ｕ／ｌ
ＥｎｚＩ’ｍ（ＢｉｏＳｉｌｔａ）を補充する。振盪フラスコにＯＤ６００ｎｍ＝０．
０５まで接種し、３０℃および２５０ｒｐｍで１６時間増殖させる。増殖培地にＥｎＰｒ
ｅｓｓｏ（商標）Ｂｏｏｓｔｅｒ錠剤（ＢｉｏＳｉｌｔａ）、１．２Ｕ／ｌ ＥｎｚＩ’
ｍ、および１ｍＭ ＩＰＴＧを補充して異種タンパク質の生成を誘導する。３０℃および
２５０ｒｐｍでさらに８～２４時間振盪させた後、遠心分離によりフラスコから採取し、
上清をデカントし、細胞湿重量を測定した。この段階では、約２０ｇＷＣＷ（細胞湿重量
のグラム）／培地１リットルが典型的に回収される。
各振盪フラスコによる発酵から採取された細胞を、２５ｍＬのＩＭＡＣ Ｅｑｕｉｌｉ
ｂｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（３０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、５０ｍＭ Ｐｈｏ
ｓｐｈａｔｅ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）に懸濁する。懸濁した細胞を、次いで
、氷上で超音波処理を行って溶解させる。溶解した細胞を６０分間遠心分離し、デカント
する。細胞片を破棄し、上清を０．２μｍ濾過する。次いで、フィルタにさらに１０ｍＬ
のＩＭＡＣ Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを流す。これらの濾過した
タンパク質溶液を、次いで、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精
製する。
ＩＭＡＣ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＩＭＡＣ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆ
ａｓｔ Ｆｌｏｗ）にニッケルを加えて平衡化する。３０ｍＬの各タンパク質溶液を５ｍ
Ｌ ＩＭＡＣカラムに充填し、さらなる平衡化溶液で洗浄し、未結合の不純物を除去する
。次いで、該当するタンパク質を１５ｍＬの０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍイミダゾール
（ｐＨ７．５）で溶出する。この段階で、精製タンパク質は、典型的にはＳＤＳ－ＰＡＧ
Ｅにより少なくとも９０％純粋であることが示される。約２０～６０ｍｇの各タンパク質
をＩＭＡＣ溶出画分から回収する。各ＩＭＡＣ溶出画分を配合液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
、ｐＨ７．５）に透析することによりバッファー交換を行う。バッファー交換後、すべて
の下流プロセシングのためにタンパク質溶液を回収する。
実施例４：栄養タンパク質の可溶性発現の予測
一連の２９２個の栄養タンパク質をコードするオープンリーディングフレームをクロー
ニングし、大腸菌に導入し、実施例２の方法を用いて組換えタンパク質の発現を評価した
。用いたシステムにおいて、１６３個のタンパク質が発現されたと同定され、１２９個は
発現されなかった。発現された１６３個のタンパク質のうち、１２５個を可溶性発現につ
いて調べた。７５個は可溶性に発現されたが、５０個は発現されなかったことが分かった
。
図１は、大腸菌発現スクリーンにおけるタンパク質発現の２次元ヒストグラムを示す。
ｉ図１は、発現されるタンパク質の相対的尤度（対数スケールで）を溶媒和スコア（Ｙ軸
）と凝集スコア（Ｘ軸）の関数として表している。ヒストグラム上の色の濃い印は、より
多い数のタンパク質が発現されたことを示し、薄い色の印は、より少ない数のタンパク質
が発現されたことを示す。図１は、良好に発現したタンパク質が、プロットの左上領域に
おいてクラスター化する傾向があり、溶媒和スコアはよりマイナスであり（≦－２０）、
凝集スコアはより低い（≦０．７５）ことを示している。よりマイナスでない溶媒和スコ
ア（≧－１５）および大きな凝集スコア（≧１）を有する良好に発現されたタンパク質の
例は、ほとんど存在しなかった。この結果は、－２０以下の溶媒和スコアおよび０．７５
以下の凝集スコアを有する栄養タンパク質が、このシステムにおいて発現される確率がよ
り高いことを示している。
図２は、大腸菌発現スクリーンにおける可溶性タンパク質の発現数の２次元ヒストグラ
ムを示す。図２は、溶媒和スコア（Ｙ軸）と凝集スコア（Ｘ軸）の関数として可溶性に発
現されるタンパク質の相対的確率（対数スケール上）を示す。この場合も同様に、ヒスト
グラム上の色の濃い印は、より多い数のタンパク質が発現されたことを示し、薄い色の印
は、より少ない数のタンパク質が発現されたことを示す。図２は、可溶性に発現したタン
パク質が、プロットの左上領域においてクラスター化する傾向があり、溶媒和スコアはよ
りマイナスであり（≦－２０）、凝集スコアはより低い（≦０．５）ことを示している。
よりマイナスでない溶媒和スコア（≧－１５）および大きな凝集スコアｓ（≧０．７５）
を有する可溶性に発現されたタンパク質の例は、ほとんど存在しなかった。この結果は、
－２０以下の溶媒和スコアおよび０．５以下の凝集スコアを有する栄養タンパク質が、こ
のシステムにおいて可溶性に発現される確率がより高いことを示している。
実施例５：溶解性スクリーニング
実施例２および３に記載されるように生成した９個の栄養タンパク質の溶解性を、遠心
濃縮後にタンパク質濃縮アッセイにより調べた。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ（Ｂｒａ
ｄｆｏｒｄ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプ
ロトコルに従って、２８０ｎｍの吸光度（適用される場合）で、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（
ｐＨ７．５）中の試料をタンパク質濃度について検査した。これらの測定値に基づいて、
１０ｍｇのタンパク質をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ ３ｋＤａ遠心濾過器（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ）に添加した。１０，０００Ｘｇで３０分間の遠心分離により試料を濃縮した。最
終的な濃縮された試料を、沈殿したタンパク質および色について調べ、次いで、上記のよ
うにタンパク質の濃度について検査した。その結果を表５に示す。
表５
Figure 0007303238000014
これらの栄養タンパク質の溶解性は、乳清（１２．５ｇ／Ｌ）および大豆（１０ｇ／Ｌ
）に関して典型的に見られる濃度よりも著しく高いことが分かった（Ｐｅｌｅｇｒｉｎｅ
，Ｄ．Ｈ．Ｇ．＆Ｇａｓｐａｒｅｔｔｏ，Ｃ．Ａ．，２００５．Ｗｈｅｙ ｐｒｏｔｅｉ
ｎｓ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
ａｎｄ ｐＨ．ＬＷＴ－Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ｐ．７７－８０、Ｌｅｅ，Ｋ．Ｈ．，Ｒｙｕ，Ｈ．Ｓ．＆ ａｎｄ Ｒｈｅｅ，Ｋ．Ｃ．
，２００３．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ｏｆ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｓｏｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’ Ｓｏｃｉｅｔ
ｙ，ｐｐ．８５－９０）。これは、本明細書に開示される栄養タンパク質の有用性を証明
するものである。例えば、栄養タンパク質の溶解性は、しばしばこの様式で送達されるタ
ンパク質を特徴づける「粉っぽさ」を回避しながら、できる限り少量の体積で高品質タン
パク質のコンプライアントな送達を向上し得る。これは、例えば、高齢者または他の対象
にタンパク質を送達するのに有用であり得る。
実施例６：安定性スクリーニング
栄養タンパク質の熱安定性は、タンパク質が有用な有効期間を有する可能性があるかど
うかの洞察を提供する。実施例６および７に記載されるように生成したタンパク質の試料
を、迅速な熱安定性スクリーニング法を用いて並行してスクリーニングした。この方法で
は、温度の上昇に伴ってタンパク質が変性するにつれて形成する凝集タンパク質に結合す
る疎水性色素（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ（登録商
標）Ｔｈｅｒｍａｌ ｓｈｉｆｔ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｓｓａｙ ｋｉｔ）の存在下
で、タンパク質を２つの代表的な配合物中で２５℃から９５℃に徐々に加熱した（Ｎｉｅ
ｓｅｎ，Ｆ．Ｈ．，Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｈ．＆Ｖａｄａｄｉ，Ｍ．，２００７．Ｔｈｅ
ｕｓｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｙ
ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｔｈａｔ ｐｒｏｍ
ｏｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｖ
ｏｌｕｍｅ ２，ｐｐ．２２１２－２２２１）。結合すると色素の蛍光が著しく増加する
ので、次いでそれをｒｔＰＣＲ機器により記録し、タンパク質の溶融曲線によって表す（
Ｌａｖｉｎｄｅｒ，Ｊ．Ｊ．，Ｈａｒｉ，Ｓ．Ｂ．，Ｓｕｉｌｌｉｖａｎ，Ｂ．Ｊ．＆Ｍ
ａｇｉｌｅｒｙ，Ｔ．Ｊ．，２００９．Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｔｈｅｒｍａ
ｌ Ｓｃａｎｎｉｎｇ：Ａ Ｇｅｎｅｒａｌ，Ｒａｐｉｄ Ｄｙｅ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｔ
ｈｅｒｍａｌ Ｓｈｉｆｔ Ｓｃｒｅｅｎ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒ
ｉｎｇ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃ
ｉｅｔｙ，ｐｐ．３７９４－３７９５．）。熱シフトが終了した後、試料を不溶性沈殿物
について調べ、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに分析した
。
タンパク質溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）をＰＢＳおよび２０ｍＭ ＨＥＰＥＳｐＨ７．
７バッファー）の両方において調製した（各々が、１Ｘ ＰｒｏｔｅｏＳｔａｔ ＴＳ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔを含有する）。色素の蛍光をモニタリングしながら
、リアルタイムＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）サーモサイクラーを用いて、各溶液の試料を０．５
℃／３０秒で ２５℃から９５℃に徐々に加熱した。この熱スキャンから、蛍光の増加が
観察された場合、最も強い勾配を有する温度から凝集体の温度を決定した（Ｔａｇｇ）。
アッセイを補完するために、熱シフトの前および後に試料を採取し、大きな可溶性凝集体
を検出することができるＳＥＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ－Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５
５／１５０）により分析した。本開示の３つの栄養タンパク質および乳清標準物質の結
果を表６に提示する。ＳＥＣによって検出された可溶性凝集体の存在は、観察された場合
は「有」、観察されなかった場合は「無」と記載され、乳清標準物質の「該当なし」の記
入は、不溶性沈殿物が生成されたためにＳＥＣ分析が行われなかったことを示す。栄養タ
ンパク質について、「－」はアッセイが行われなかったことを示す。
表６
Figure 0007303238000015
表６に示すように、タンパク質の多くは乳清よりも高いＨＥＰＥＳ Ｔａｇｇを有し、
９５℃（本アッセイの上限である）でいずれの凝集体も形成しないものもあるため、乳清
よりも安定であると予想される。
実施例７：消化率スクリーニング－消化半減期の決定
タンパク質の消化率をスクリーニングする目的は、潜在的に安全ではないアレルゲン性
タンパク質を除外すること、およびペプチドの生物学的利用能の予測因子として消化の相
対的完全性を決定することである。このスクリーニング方法は、模擬胃内消化および模擬
腸内消化といったタンパク質消化の両方の段階を含む、生理的に適切なインビトロ消化反
応を利用する（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ ２Ｓ ａｌｂｕ
ｍｉｎ（Ｂｅｒ ｅ １）ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ
Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｐ．３４１－３５２）。試料は、反応を通して採取することができ
、チップ電気泳動およびＬＣ－ＱＴＯＦ－ＭＳを用いてインタクトなタンパク質およびペ
プチド断片について分析することができる。アレルゲン性を有するタンパク質は、消化プ
ロテアーゼに耐性を示すためにアレルギー反応を引き起こすより高いリスクを有するタン
パク質またはタンパク質の大きな断片を同定することにより評価することができる（Ｇｏ
ｏｄｍａｎ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００８．Ａｌｌｅｒｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｓｓｅ
ｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｒｏｐｓ－ｗｈａ
ｔ ｍａｋｅｓ ｓｅｎｓｅ？．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ．７
３－８１）。消化率は、いかに効率的にタンパク質がペプチドに分解されるかを判定する
ことによって測定される（Ｄａｎｉｅｌ，Ｈ．，２００３．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｅ
ｐｔｉｄｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌ
ｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ６６，ｐｐ．３６１－３８４）。
本方法では、アッセイ条件およびプロテアーゼ濃度が生理的に適切である、タンパク質
のインビトロ消化のための自動化アッセイを用いた（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｆ．Ｊ．，Ｍａｃｋ
ｉｅ，Ａ．Ｒ．＆Ｃｌａｒｅ Ｍｉｌｌｓ，Ｅ．Ｎ．，２００５．Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐ
ｉｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｐｒｏｔｅｃｔ ｔｈｅ ｍｉｌｋ ａｌｌｅｒｇｅ
ｎ ａ－Ｌａｃｔａｌｂｕｍｉｎ ｆｒｏｍ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ ｄｕｒｉｎｇ
ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒ
ａｌ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．９８１０－９８１６、Ｍａｒｔｏ
ｓ，Ｇ．，Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ，Ｐ．，Ｍｏｌｉｎａ，Ｅ．＆Ｌｏｐｅｚ－Ｆａｎｄｉｎ
ｏ，Ｒ．，２０１０．Ｅｇｇ Ｗｈｉｔｅ Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
Ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｏｏｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ
．５６４０－５６４８、Ｍｏｒｅｎｏ，Ｊ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，２００５．Ｓｔａｂｉｌ
ｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ａｌｌｅｒｇｅｎ Ｂｒａｚｉｌ ｎｕｔ ２Ｓ
ａｌｂｕｍｉｎ（Ｂｅｒ ｅ １）ｔｏ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖ
ａｎｔ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．
ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，ｐｐ．３４１－３５２）。消化の第１段階は、模擬胃液（Ｓ
ＧＦ）中であり、ｐＨ１．５および（１：１０ ｗ／ｗ）のペプシン：基質の比率で配合
される。消化の第２段階は、模擬腸液（ＳＩＦ）中であり、ｐＨ６．５の胆汁酸塩ととも
に、（１：４：４００ ｗ／ｗ）トリプシン：キモトリプシン：基質の比率で配合される
。流動食の９０％が胃から小腸に通過するのに必要な時間の長さである１２０分間、模擬
胃液中でタンパク質を処理し（Ｋｏｎｇ，Ｆ．＆Ｓｉｎｇｈ，Ｒ．Ｐ．，２００８．Ｄｉ
ｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｆｏｏｄｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｏ
ｍａｃｈ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．６７－８０）、次
いで、模擬腸液で１２０分処理する。両方の反応全体にわたって試料の時点を採用し、分
析のために反応停止させる。ペプシンによって消化されやすいウシ血清アルブミンは、Ｓ
ＧＦ溶液の陽性対照であり、天然の状態でペプシンに耐性を示すがＳＩＦ中で消化される
βラクトグロブリンは、ＳＩＦ溶液の陽性対照である。電気泳動を用いてインタクトなタ
ンパク質および大きな断片を検出した。チップ電気泳動には、ＨＴ Ｌｏｗ ＭＷ Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを搭載したＣａｌｉｐｅｒ Ｌａｂｃｈｉｐ ＧＸＩＩ
を使用して、インタクトなタンパク質および４ｋＤａよりも大きなあらゆる消化断片のサ
イズおよび量をモニタリングした。観察されるインタクトなタンパク質の量を経時的にモ
ニタリングすることにより、ＳＧＦについて消化の半減期（τ１／２）を算出し、ＳＧＦ
による消化の後にインタクトなタンパク質が検出された場合、ＳＩＦにおける消化の半減
期を算出した。
この方法は、実施例２および３に記載されるように生成した本開示の１１個の栄養タン
パク質と、天然および組換え卵白アルブミン（それぞれ、ＯＶＡおよびｒＯＶＡ、配列番
号４９１）ならびにβラクトグロブリン（それぞれ、ＢＬＧおよびｒＢＬＧ、配列番号４
６４）タンパク質、そして乳清標準物質の消化半減期を分析するために用いられた。これ
らの実験の結果を表７に要約する。模擬腸液の「該当なし」の記入は、ＳＧＦによる消化
の後にインタクトなタンパク質が検出されなかったことを示す。
表７
Figure 0007303238000016
表７に示される結果は、本開示の１１個の栄養タンパク質はすべてＳＧＦによって完全
に消化され、２分以下のＳＧＦ半減期を有することを示す。比較すると、乳清は、ＳＧＦ
によって完全には消化されず、９９分のＳＧＦ半減期および４分のＳＩＦ半減期を有する
。この試験は、本開示の栄養タンパク質が、容易に消化される可能性が高く、経口摂取さ
れた時にアレルギー反応を誘発する可能性が低いことを示唆している。
また、表７の結果は、本開示に従って生成された組換えβラクトグロブリンおよび卵白
アルブミンは、両方とも、それらの天然に存在するカウンターパートよりも消化されやす
いことも示している。タンパク質が分解される速度は、消化管プロテアーゼの到達性を改
善または制限する特性を選択することにより制御することができる。この能力は、２つの
典型的なタンパク質特性であるグリコシル化およびジスルフィド架橋結合について実証す
ることができる。多くの天然に存在するタンパク質と同様に、天然に存在するＯＶＡおよ
びＢＬＧは、それらの宿主生物によってグリコシル化される。対称的に、宿主生物（この
場合は大腸菌）がグリコシル化しないため、本開示に従って生成される組換えタンパク質
はグリコシル化されない。本開示による組換え栄養タンパク質におけるグリコシル化の欠
如は、より消化されやすいタンパク質をもたらし得る。さらに、ＢＬＧは、消化を遅らせ
るかまたは妨げることが分かっている４つのジスルフィド結合を有する。これらのジスル
フィド結合が破壊されると、消化の速度が増加する（Ｒｅｄｄｙ，Ｉ．Ｍ．，Ｋｅｌｌａ
，Ｎ．Ｋ．Ｄ．＆Ｋｉｎｓｅｌｌａ，Ｊ．Ｅ．，１９８８．Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎ
ｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｏｆ ｂ－Ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｔｏ Ｐｅｐｔｉｃ ａｎｄ Ｃｈｙｍｏｔ
ｒｙｐｔｉｃ Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌｕ
ｍｅ ３６，ｐｐ．７３７－７４１）。本開示による組換え栄養タンパク質におけるジス
ルフィド結合形成の欠如または破壊は、より消化されやすいタンパク質をもたらし得る。
実施例８：消化率スクリーニング－消化生成物の分析
実施例２および３に記載されるように生成した２つの栄養タンパク質（配列番号７６２
および７６３）を、実施例７に記載されるようにＳＧＦおよびＳＩＦによる消化に供した
。両方のタンパク質はＳＧＦ中で完全に消化され、ＳＧＦ半減期を表８に示す。
表８
Figure 0007303238000017
ＳＧＦおよびＳＩＦによる消化の後に存在するペプチドを検出および同定するために、
ＳＧＦおよびＳＩＦ消化物の試料をＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＳＧ
Ｆ消化物の試料は、ＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳにより直接分析したが、ＳＩＦタンパ
ク質の消化には、ＬＣ／Ｑ－ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳによる検出および同定の前に、胆汁酸を
除去するためのＳＣＸによる精製が必要であった。クロマトグラムからペプチドを抽出し
、Ｂｉｏｃｏｎｆｉｒｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｇｌｉｅｎｔ）を使用して同定した。ペ
プチドの配列割当は、正確な質量マッチング（±１０ｐｐｍ）に基づいており、ＭＳ／Ｍ
Ｓ断片化によってさらに確認された。その結果を表９および１０に示す。
表９
Figure 0007303238000018
表１０
Figure 0007303238000019
表９および１０に見られるように、各タンパク質は、２～２２個のアミノ酸（配列番号
４８６）または２～１３個のアミノ酸（配列番号４９１）のサイズに及ぶ、複数のより小
さなペプチド断片に消化された。これらのペプチド断片のうちのいずれも、任意の既知の
アレルゲンと相同であるとは認められなかった。
本発明を、その特定の実施形態を参照して説明してきたが、当業者は、本発明の真の主
旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われてもよく、均等物が置き換えら
れてもよいことを理解されたい。また、特定の状態、材料、物質の組成、プロセス、単数
または複数のプロセスステップを、本発明の目的、主旨、および範囲に適応させるために
、多くの修正が行われてもよい。すべてのそのような修正は、特許請求の範囲内であるこ
とが意図される。

Claims (56)

  1. 配列番号４６６、４６７、４７１、４７５、４７９、４８０、４８１、および４８３～４８５からなる群から選択されるポリペプチド配列に少なくとも９０％相同なポリペプチド配列を含む組換タンパク質を含む栄養組成物であって、組換タンパク質がｐＨ７で少なくとも１２．５ｇ／Ｌの水溶解性を有し、かつ組換タンパク質が１０分未満の模擬胃内消化半減期を有する、栄養組成物。
  2. 経口、経腸、または非経口経路で摂取される、請求項１に記載の栄養組成物。
  3. 組換タンパク質が少なくとも１ｇの量で存在する、請求項１または２に記載の栄養組成物。
  4. 組換タンパク質が１ｇ～５ｇ、２ｇ～１０ｇ、５ｇ～１５ｇ、１０ｇ～２０ｇ、１５ｇ～２５ｇ、２０ｇ～４０ｇ、２５～５０ｇ、または３０～６０ｇから選択される量で存在する、請求項１～３のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  5. 組換タンパク質が１５ｇ～２５ｇ、２５～５０ｇ、または３０～６０ｇから選択される量で存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  6. 組換タンパク質が少なくとも２ｇ、３ｇ、４ｇ、５ｇ、６ｇ、７ｇ、８ｇ、９ｇ、１０ｇ、１５ｇ、２０ｇ、２５ｇ、３０ｇ、３５ｇ、４０ｇ、４５ｇ、５０ｇ、５５ｇ、６０ｇ、６５ｇ、７０ｇ、７５ｇ、８０ｇ、８５ｇ、９０ｇ、９５ｇ、または１００ｇの量で存在する、請求項１～５のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  7. 組換タンパク質が少なくとも１５ｇの量で存在する、請求項１～６のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  8. 組換タンパク質がｐＨ７で少なくとも５０ｇ／Ｌの水溶解性を有する、請求項１～７のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  9. 組換タンパク質が、
    ａ．少なくとも８％の全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割合、
    ｂ．少なくとも４％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、及び
    ｃ．少なくとも１９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合
    を含む、
    請求項１～８のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  10. 組換タンパク質の配列が各必須アミノ酸のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  11. 組換タンパク質が、
    ａ．少なくとも２４％の全アミノ酸残基に対する分枝鎖アミノ酸残基の割合、
    ｂ．少なくとも１１％の全アミノ酸残基に対するＬｅｕ残基の割合、及び
    ｃ．少なくとも４９％の全アミノ酸残基に対する必須アミノ酸残基の割合
    のうちの少なくとも１つを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  12. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸に対して少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  13. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質の少なくとも５０個のアミノ酸に対して少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  14. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質に対して少なくとも７０％の相同性を有する、請求項１～１３のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  15. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質に対して少なくとも９５％の相同性を有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  16. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質からなる、請求項１～１５のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  17. 組換タンパク質が、天然に存在する栄養タンパク質ではない、請求項１～１５のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  18. 組換タンパク質がアレルゲンではない、請求項１～１７のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  19. 組換タンパク質が、既知のアレルゲンに対して５０％未満の全体的配列相同性を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  20. 組換タンパク質が毒素ではない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  21. 組換タンパク質が、既知の毒素に対して５０％未満の全体的配列相同性を有する、請求項１～２０のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  22. 組換タンパク質が模擬胃液中で完全に消化される、請求項１～２１のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  23. 組換タンパク質が、ペプシン認識部位、トリプシン認識部位、およびキモトリプシン認識部位から選択される少なくとも１つのプロテアーゼ認識部位を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  24. 組換タンパク質がシステイン残基を含まない、請求項１～２３のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  25. 組換タンパク質がジスルフィド結合を含まない、請求項１～２４のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  26. 組換タンパク質がＮ結合型グリコシル化を含まない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  27. 組換タンパク質がＯ結合型グリコシル化を含まない、請求項１～２６のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  28. 組換タンパク質が凝集に耐性を示す、請求項１～２７のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  29. 組換タンパク質がｐＨ７でアニオン性である、請求項１～２８のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  30. 組換タンパク質が－２０以下の計算上の溶媒和スコアを有する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  31. 組換タンパク質が－３０以下の計算上の溶媒和スコアを有する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  32. 組換タンパク質が０．７５以下の計算上の凝集スコアを有する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  33. 組換タンパク質が０．５以下の計算上の凝集スコアを有する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  34. 組換タンパク質が０．３以下の計算上の凝集スコアを有する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  35. 組換タンパク質が親和性精製のためのポリペプチドタグをさらに含む、請求項１～３４のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  36. 親和性精製のためのポリペプチドタグがポリヒスチジンタグである、請求項３５に記載の栄養組成物。
  37. 少なくとも１つの第２の構成成分をさらに含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  38. 少なくとも１つの第２の構成成分が、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、遊離アミノ酸、炭水化物、脂質、ミネラルまたはミネラル源、ビタミン、栄養補助食品、有機物、医薬品、および賦形剤から選択される、請求項３７に記載の栄養組成物。
  39. 少なくとも１つの第２の構成成分がタンパク質である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  40. 少なくとも１つの第２の構成成分が、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、分枝鎖アミノ酸、非標準アミノ酸、および修飾アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  41. 少なくとも１つの第２の構成成分が必須アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である、請求項４０に記載の栄養組成物。
  42. 少なくとも１つの第２の構成成分が分枝鎖アミノ酸から選択される遊離アミノ酸である、請求項４０に記載の栄養組成物。
  43. 少なくとも１つの第２の構成成分がＬｅｕである、請求項４０に記載の栄養組成物。
  44. 少なくとも１つの第２の構成成分が脂質である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  45. 脂質が脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、および脂肪酸から選択される、請求項４４に記載の栄養組成物。
  46. 少なくとも１つの第２の構成成分がミネラルおよびビタミンから選択される、請求項３８に記載の栄養組成物。
  47. 少なくとも１つの第２の構成成分が栄養補助食品である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  48. 少なくとも１つの第２の構成成分が生物である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  49. 少なくとも１つの第２の構成成分が医薬品である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  50. 少なくとも１つの第２の構成成分が賦形剤である、請求項３８に記載の栄養組成物。
  51. 賦形剤が、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、分散促進剤、崩壊剤、香味剤、甘味剤、着色剤から選択される、請求項５０に記載の栄養組成物。
  52. 液体溶液、スラリー、懸濁液、ゲル、ペースト、粉末、または固体として製剤化される、請求項１～５１のいずれか１項に記載の栄養組成物。
  53. 請求項１～５１のいずれか１項に記載の栄養組成物を生産するための方法であって、異種微生物により前記組換タンパク質を産生することを含む、方法。
  54. 異種微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＰｉｃｈｉａ ｓｔｉｐｉｔｉｓからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
  55. 異種微生物が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
  56. 異種微生物がＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓである、請求項５５に記載の方法。
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