BR102020009493A2

BR102020009493A2 - Composto proteico constituído pela biomassa de um organismo geneticamente modificado expressando proteínas fibrilares associado a outras fontes nutricionais provenientes de resíduos agroindustriais

Info

Publication number: BR102020009493A2
Application number: BR102020009493-9A
Authority: BR
Inventors: Bernardo De Leão Rosenmann
Original assignee: Bernardo De Leão Rosenmann
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2021-11-23
Also published as: WO2021226690A1

Abstract

composto proteico constituído pela biomassa de um organismo geneticamente modificado expressando proteínas fibrilares associado a outras fontes nutricionais provenientes de resíduos agroindustriais. a presente invenção trata-se da elaboração de um composto proteico associado a outras fontes nutricionais e aplicável na ração de cães e gatos. estão compreendidas as etapas de (a) criação de uma cepa de saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada para expressar de forma heteróloga proteínas fibrilares animais; cultivo da biomassa mutada para obtenção da biomassa microbiana expressando tais proteínas no meio reacional e obtenção do concentrado proteico contendo a biomassa e proteínas expressadas; e (b) formulação com outros compostos nutritivos essenciais para cães e gatos provenientes de resíduos agroindustriais e destinação para etapas de pós-processamento do produto.

Description

COMPOSTO PROTEICO CONSTITUÍDO PELA BIOMASSA DE UM ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO EXPRESSANDO PROTEÍNAS FIBRILARES ASSOCIADO A OUTRAS FONTES NUTRICIONAIS PROVENIENTES DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS

Campo da invenção

[001] A presente invenção dedica-se ao setor de nutrição de cães e gatos.

Fundamentos da invenção

[002] A domesticação de animais acompanha a história humana, uma vez que cães eram uma ferramenta para garantir a segurança de residências ou auxiliar em caças, e gatos apresentavam um papel importante no controle de roedores. A alimentação destes ocorria de acordo com a nutrição humana e na base das dietas, entre outras fontes de nutrientes, encontrava-se a carne.

[003] Atualmente, com a tendência à industrialização e com cães e gatos assumindo um papel majoritário como animais de estimação, instaura-se um mercado que demanda rações fabricadas e de alta qualidade. Ainda assim, permanece como fonte proteica predominante a carne bovina, de frango, suína, de peixes ou oriunda de outros animais também consumíveis por humanos.

[004] As demandas de fontes energéticas para cães e gatos se diferenciam de acordo com as necessidades nutricionais de cada grupo. De acordo com a Escola de Medicina Veterinária da Universidade de Cornell, gatos são animais que dependem da inserção de carne em suas dietas devido aos aminoácidos essenciais nela presentes (principalmente carnitina e taurina). Já cães assumem uma alimentação mais flexível em termo de proteínas, podendo assimilar outras fontes como vegetais, cereais e leguminosas. Apesar de adotarem uma dieta maleável, para cães a proteína animal ainda é considerada um meio completo de obtenção dos aminoácidos essenciais não produzidos pelo animal (BEITZ et al., 2006).

[005] Tomando como base o consumo diário intermediário de animais de cães e gatos de médio porte, a faixa de concentração ideal de proteínas é de 23 a 25 g/dia em rações secas ou 6,4 a 8 g/dia em rações úmidas. Considerando as porções de ração recomendadas e o número de animais para cada 1000 habitantes, o consumo de carne por rações animais pode equivaler a parcelas significativas do total de produção nacional. Em países com elevado número de cães e gatos, como os Estados Unidos, este valor chega a 31,52%. Em outros países, como os do Reino Unido, 39,21% da produção de carne é destinada para rações de animais de estimação, já na Itália esse valor é de 31,45% (LEENSTRA, VELLINGA & BESSEI; 2018).

[006] Associado ao vasto consumo de carne animal está o impacto ambiental causado principalmente pelas culturas de aves, suínos e bovinos. A emissão de gases causadores do efeito estufa, degradação de áreas nativas para pastagem, e consumo de água representam uma ameaça para o meio ambiente. Em uma analogia à pegada de carbono - análise das consequências geradas pelo consumo humano de diversos produtos - estudos são feitos para determinar a “ecological paw print” (EPP) provocada pelo perfil de alimentação animal.

[007] No Japão, por exemplo, a população de cães e gatos domésticos tem o potencial consumidor de 3,6 a 15,6% de toda a comida produzida no país em um ano, podendo chegar à emissão de 2,5 a 10,7 milhões de gases do efeito estufa nesse mesmo período (SU & MARTENS, 2018).

[008] Assim, há uma crescente tendência para o desenvolvimento de produtos baseados em fontes proteicas alternativas, visando tanto o bem-estar de cães e gatos quanto a mitigação do impacto ambiental causado pelo perfil de consumo de proteínas animais. Uma possibilidade é o uso de biomassa microbiana, podendo ser de leveduras, fungos filamentosos ou bactérias, como produto de alto teor proteico para ser usado como parte integrante de rações para animais de estimação.

[009] Como referência, cita-se a patente US3939284A, na qual é proposto um método de obtenção de células de levedura, entre elas Candida utilis, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces fragilis para serem misturadas a fontes de proteínas vegetais e animais, como concentrado proteico de peixe, rejeitos de abatedouros e farinha de ossos. Apesar de apresentar a associação de biomassa de levedura como componente (de 5 a 50%), como muitas formulações, ainda depende de partes animais para suprir as necessidade nutricionais em termos de proteína. Além disso, conta com aditivos flavorizantes para aumentar a atratividade do produto, o qual é destinado exclusivamente à alimentação humana, sem prospectar a aplicação como ração animal.

[0010] Dentre as inúmeras possibilidades de microrganismos GRAS (geralmente reconhecido como seguro) para serem usados como biomassa proteica em alimentação, um destaque é feito para leveduras, como a Saccharomyces cerevisiae.

[0011] Além de aproximadamente 50% de sua composição ser de proteínas, leveduras também podem ser fonte de vitamina B - envolvida nos sistemas nervoso e circulatório - além de selênio - mineral antioxidante auxiliar na atividade pancreática e endócrina. Outra vantagem de sua admissão como um composto de rações de animais de estimação é sua alta digestibilidade (entre 60 e 80%), fazendo com que os macro e micronutrientes presentes na estrutura celular sejam aproveitados por cães e gatos.

[0012] A adição de leveduras em rações também é realizada pelo potencial que estes organismos têm de aumentar a aceitabilidade do produto por melhorarem a palatabilidade de formulações. Esse efeito é observado principalmente em cães com a adição de extrato de levedura, nos casos em que há um pré-tratamento térmico da mistura antes de finalizada (LIMA et al., 2016).

[0013] Como referência, cita-se a patente CN102008026B, na qual a formulação proposta sugere a utilização de biomassa de leveduras ou bactérias do gênero Bacillus como uma fonte de microproteínas. Associada a partes animais como órgãos e peles, farinha ou grãos proteicos inteiros e compostos lipídicos animais e vegetais, além de vitaminas e outros minerais, a biomassa microbiana representa uma fonte adicional de aminoácidos e polipeptídeos. Apesar de inserir leveduras como um componente nutricional na ração, não somente como um aditivo, a invenção ainda é dependente de partes animais como fontes de proteínas e lipídeos, fato que ainda corrobora para a manutenção do consumo elevado de carne por cães e gatos.

[0014] Como referência cita-se a patente CA2735659C, na qual é descrita a formulação de uma ração para animais de estimação composta majoritariamente por uma matriz vegetal, chegando a até 70% da massa total. O método, apesar de dispensar fontes animais em sua composição e inserir elementos pré e probióticos, a biomassa de levedura aparece apenas como um coadjuvante. São utilizadas bactérias e leveduras dos gêneros Bacillus, Bacteroides, Bifidobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Saccharomyces, Candida ou Streptococcus exclusivamente para a formação de uma camada de cobertura da ração com propriedades probióticas, sem aproveitar o potencial destes microrganismos como fonte proteica. A patente segue uma grande tendência de utilização de células microbianas apenas como um aditivo, subutilizando um material com alta concentração proteica e fonte de outros macro e micronutrientes.

[0015] A tendência de alimentação de cães e gatos alternativa à carne deu lugar a um nicho de opções de rações à base de proteínas vegetais. Apesar de uma alternativa ambientalmente mais amigável, não supre a totalidade de necessidades nutricionais. Fontes proteicas provenientes de grãos e cereais apresentam uma deficiência em aminoácidos essenciais que animais de estimação necessitam e não conseguem produzir por conta própria (DONADELLI, JONES & BEYER, 2019).

[0016] As proteínas animais destinadas ao mercado pet podem ser provenientes de órgãos ou outros co-produtos da indústria frigorífica, mas a maior utilização se dá em forma de peças de músculos. Estes tecidos são formados por proteínas fibrilares responsáveis por permitir a formação de estruturas de contração e relaxamento, além de serem ricas em aminoácidos essenciais para a manutenção de funções metabólicas em cães e gatos.

[0017] Proteínas animais miofibrilares como α-actina, troponina e tropomiosina são fontes de aminoácidos como lisina e metionina, os quais são parte integrante do sistema hormonal, atuam como compostos para estruturas enzimáticas, estão envolvidos no transporte de oxigênio e principalmente na atividade muscular de animais (MALVA et al., 2018). Assim, justifica-se a manutenção de uma dieta a base de carne para animais de estimação, reiterando a necessidade de descobrir novas formas de produzir estas proteínas sem reforçar as criações de animais os impactos ambientais por elas gerados.

[0018] Sabe-se que leveduras, por serem seres eucarióticos, são capazes de expressar proteínas heterólogas de mamíferos com os mais diversos propósitos. Um dos exemplos mais concretos desta tecnologia são as inúmeras cepas de Saccharomyces cerevisiae que produzem polipetídeos de outros organismos. A grande disseminação da aplicação da espécie para esta finalidade está pautada em sua capacidade de suportar as condições de cultivo industrial, além de admitir as sequências genéticas inseridas conforme a necessidade de fabricação (GOMES et al., 2018).

[0019] Como referência cita-se a patente RU0002515913, na qual propõe-se um método de transformação da cepa VKPM Y-3928 de Saccharomyces cerevisiae em um vetor com o promotor GAL1 visando a expressão de proteínas de fusão humanas recombinantes. A invenção mostra a viabilidade da expressão de proteínas de mamíferos por leveduras desta espécie.

[0020] Como referência cita-se a patente US8753866B2, na qual é descrita a produção de proteínas secretadas em células eucarióticas microbianas. A técnica refere-se à síntese em Saccharomyces cerevisiae de qualquer proteína secretada, como uma enzima terapêutica ou industrial tais como lipases, celulases, ou proteases. A sequências codificantes das proteínas sintetizadas pela levedura podem ser de origem microbiana, como fungos do gênero Trichoderma ou Aspergillus, ou de células de insetos ou mamíferos. Este método, apesar de incluir a expressão de proteínas de mamíferos, segue a grande tendência de aplicação da técnica de mutação de leveduras para síntese de polipeptídeos heterólogos, visando somente a produção de enzimas.

[0021] Como referência cita-se a patente CN108203697A, na qual é descrita a modificação genética de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae para expressar proteínas de células NK (natural killer) de peixes para serem administradas em culturas animais aquáticas e reduzir o uso de medicamentos nas mesmas. A invenção consiste em extrair o material genético de células de peixe, replicá-lo por PCR com primers específicos para a região desejada, inserir os fragmentos replicados em Escherichia coli TOP10 com enzimas de restrição para obter um plasmídeo recombinante, selecionar as bactérias transformadas e inserir o plasmídeo em células de Saccharomyces cerevisiae. A patente conta com uma tecnologia de transformação de leveduras muito bem consolidada, utilizando a bactéria Escherichia coli TOP10 como intermediária para replicação dos plasmídeos contendo o gene de interesse antes de inserir na S. cerevisiae. Apesar disso, segue a linha de muitas tecnologias semelhantes utilizando a mesma levedura, focando a aplicação do produto expressado como um recurso terapêutico em animais, não explorando a possibilidade de sintetizar proteínas para fins alimentares, além de destinar a levedura como administração direta ao animal, sem etapas de processamento ou purificação do produto.

[0022] Como referência cita-se a patente MX2015017899A, a qual descreve o uso do gene da quimosina bovina otimizado com uma sequência sintética para a produção de proteína recombinante, expressando em Pichia pastoris. A invenção parte de uma sequência de aminoácidos com alto nível de similaridade à codificada por bois, mas com mudanças pontuais para que seja assimilada pela levedura usada como hospedeira. Com o código genético aprimorado para a síntese de quimosina bovina, ocorre a inserção do plasmídeo pPICZa encarregado de transformar as células de Pichia pastoris. Esta tecnologia mostra a aceitabilidade que espécies de leveduras têm com genes de mamíferos, mas como tantos outros processos similares foca na expressão de uma enzima, não como um vetor de tradução de outras proteínas com função de suprimento proteico.

[0023] Como referência cita-se a patente CN106399135A, na qual é detalhada o cultivo da cepa C20140911 de Saccharomyces cerevisiae que detém um alto potencial produtivo de proteínas. A biomassa é cultivada em meio líquido, e os produtos de fermentação ficam dispersos no ambiente reacional. A grande vantagem desta invenção reside na alta síntese de proteínas e aminoácidos quando comparada com uma cepa não mutada. Apesar de demonstrar uma eficácia competitiva, a expressão de peptídeos e polipeptídeos proposta por esta invenção segue um rumo comum e muito bem definido em outras tecnologias semelhantes, uma vez que o enfoque é na síntese de aminoácidos aplicáveis em ração de porcos. O uso de misturas resultantes de metabolismo de leveduras análogos à esta em alimentação de animais já é uma técnica amplamente difundida e descrita.

[0024] Como referência cita-se a patente US6737262B1, a qual se trata do método de obtenção de uma ração animal contendo polipeptídeos expressos em um organismo geneticamente modificado. A tecnologia proposta é baseada na modificação de levedura para a expressão de uma série de aminoácidos essenciais à nutrição animal. Também são associados grãos detentores de uma pluralidade de aminoácidos à mistura produzida por via microbiana. Apesar da patente prever o uso de um organismo geneticamente modificado, sendo este uma célula de levedura, limita a aplicação da técnica para expressar aminoácidos. Além disso, não prevê uma mistura da biomassa com os grãos selecionados, deixando de explorar suas propriedades nutricionais existentes, focando apenas em seu uso como um vetor de expressão de peptídeos.

[0025] Leveduras da espécie Saccharomyces cerevisiae têm muito bem consolidada sua aplicação como um sistema de tradução para proteínas de emprego industrial, as quais são utilizáveis de forma terapêutica ou como alimento ou suplementos alimentares animais e humanos. Um potencial recentemente explorado deste microrganismo é o de expressar miostatina de mamíferos, uma proteína capaz de modular peso e composição muscular de animais. A S. cerevisiae foi capaz de ser modificada com um cassete de expressão contendo genes estrangeiros responsáveis pela síntese do peptídeo de interesse, que foi utilizada como vacina oral em ratos, apresentando eficácia como proteína heteróloga ao gerar resposta imune (ZHANG et al., 2012).

[0026] Células de Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris tiveram seu potencial analisado para a expressão de α-tropomiosiona, uma proteína muscular fibrilar, analisando sua similaridade com a produzida por mamíferos. O estudo mostra que a estabilidade, compatibilidade de sequência de aminoácidos, bem como a funcionalidade da proteína dependem do número de cópias do plasmídeo, força do promotor e composição do meio reacional (ALEGRIA et al., 2003). Apesar de demonstrar a eficácia na expressão de uma proteína fibrilar de mamíferos, a aplicação da mesma reserva-se a estudos comparativos, não explora a possibilidade de associar esta com outras proteínas similares, tampouco destina seu emprego à alimentação animal, mostrando que esta é uma rota não traçada.

[0027] Como referência cita-se a patente US10485259B2, na qual são expressas em células de levedura (Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris) uma série de proteínas compreendidas na composição de ovos. A invenção demonstra a possibilidade de construir um vetor que permita a tradução de uma ou mais sequências, demonstrando que um organismo eucariótico pode desempenhar o papel de expressar simultaneamente mais de um polipeptídeo de interesse. Ainda assim, não explora a expressão de proteínas fibrilares de mamíferos em leveduras.

[0028] A alimentação de cães e gatos depende de uma série de componentes para suprir suas necessidade metabólicas e de crescimento. Uma vez que o consumo de carne está intimamente relacionado com grandes impactos ambientais pela agropecuária, encontrase como solução a expressão de tais proteínas por uma via microbiológica. Em contrapartida, ainda existem elementos da ração animal que podem ser substituídos por fontes nutricionais oriundas de sobras ou rejeitos dos processos agroindustriais.

[0029] De acordo com a FDA, agência federal do departamento de saúde americano, está previsto que os alimentos destinados à nutrição animal devem seguir os mesmos parâmetros que para humanos, sendo ingredientes seguros para ingestão, produzidos em condições sanitárias, livres de substâncias prejudiciais e devidamente identificados em rótulos. Portanto, partes remanescentes de processamento de grãos, subprodutos de atividades agroindustriais, restos de frutas e verduras em devida condição de armazenamento e conservação, ou biomassa de outros processos fermentativos podem ser algumas das opções empregadas na formulação de rações para cães e gatos.

[0030] Dentre as maiores vantagens do uso destes materiais estão a constituição dos resíduos ser quase completamente orgânica, seu preço ser reduzido quando comparado com os mesmos insumos in natura, serem boas fontes de fibra bruta e terem compatibilidade com o organismo dos animais.

[0031] Sabendo que resíduos de cultivo rural e da cadeia produtiva alimentar correspondem à porção majoritária da produção agrícola anual, podendo chegar a até 30%, e que grande parte destes refugos ainda contêm nutrientes disponíveis e admitidos por animais de estimação, viabiliza-se um composto contendo elementos desta origem associados à uma biomassa reconhecida como segura expressando proteínas fibrilares animais.

[0032] Dentre os subprodutos agroindustriais mais usuais para a alimentação animal estão aqueles que são fontes ricas em compostos energéticos, como farelo de arroz ou soja e cascas, bagaços, folhas ou sementes de frutas, verduras e raízes. Estão incluídos como fontes proteicas as cascas de mandioca e resíduos de cereais, bem como farinhas e tortas de filtração do processamento de oleaginosas. Por fim, podem ser incorporados sobras da moagem de cereais e do refino de óleos como origem de fibra bruta (AIJLA et al., 2012).

[0033] A seleção de resíduos a serem utilizados na formulação de rações para cães e gatos dependem de características nutricionais como proteína e fibra bruta, além da taxa de digestibilidade de matéria orgânica. Ademais de reduzir o custo de insumos e mitigar o impacto ambiental ao reaproveitar rejeitos, uma composição alimentar com esta base ainda tem o potencial de trazer benefícios substanciais aos animais de estimação.

[0034] Um exemplo de aplicação é o de grãos secos de destiladores com solúveis (DDGS) em rações de cães e gatos. Por ser um resíduo rico em fibras insolúveis seu uso em monogástricos geralmente é feito em menores quantidades. Porém, o DDGS ainda possui maiores concentrações de proteínas, gorduras vitaminas e minerais se comparado ao milho antes de processado. É um composto facilmente incorporado em misturas para refeições animais, não afeta o processo industrial e tem potencial de aumentar a palatabilidade de alimentação de pets (RISOLIA et al., 2019).

[0035] Como referência cita-se a patente KR100733906B1, na qual é proposto um método de nutrição natural para pets. A invenção consiste em uma mistura à base de ovo, farinhas de frutas e vegetais, lipídeos de origem animal ou vegetal e outro componente que pode ser farinha de pão, algas em pó, queijo em pó ou farinha de arroz integral. Por fim, são adicionados restos de carne em forma de pó para então ser empacotado e armazenado. Apesar de utilizar fontes nutricionais de rejeitos, a invenção ainda é dependente de produtos de origem animal para suprir o teor de proteínas demandada pela alimentação de cães e gatos.

[0036] Como referência cita-se a patente US6338866B, em que é produzida uma ração para pets a partir dos resíduos de algas e fungos contendo ácidos graxos. A tecnologia prevê a reutilização de biomassa gerada como subproduto em processos produtivos de ácidos graxos, misturando-a com ingredientes para gerar uma formulação com aroma suave aceitável por pets e humanos. Esta invenção demonstra a possibilidade do reuso de biomassa proveniente de outros processos com aceitabilidade pelos animais de estimação, mas parte unicamente desta fonte nutricional. Não associando-a com outros produtos pode ocorrer uma deficiência de nutrientes essenciais.

[0037] Diante do anteriormente exposto, sabe-se que é expressivo o consumo alimentar de cães e gatos em nível mundial, mas que ainda depende fortemente de uma das maiores indústrias poluidoras, a da carne animal. Sabendo que, juntamente com as inferências em ecossistemas causadas pela criação de gados e granjas, um dos grandes problemas da agroindústria é a geração de resíduos não aproveitados.

[0038] Partindo da capacidade de leveduras admitirem genes heterólogos de mamíferos e com sua maquinaria celular serem capazes de expressar uma gama de proteínas animais, além de que são microrganismos seguros com aplicação industrial amplamente descrita, viabiliza-se a criação de uma cepa mutante capaz de expressar proteínas fibrilares ricas em aminoácidos essenciais para a alimentação de cães e gatos sem depender de nenhum produto de origem animal.

[0039] Associando esta biomassa mutada a outras fontes biodisponíveis em rejeitos agroindustriais, cria-se uma formulação com aceitabilidade, altamente nutritiva, bioquimicamente segura e que é capaz de surgir de uma via proteica alternativa à carne e de subprodutos ou restos transformados em componentes alimentares compatíveis com as necessidade de animais domésticos.
Breve descrição dos desenhos
A Figura 1 apresenta um fluxograma simplificado do processo, englobando as etapas de cultivo da biomassa de levedura mutada, de formulação com resíduos agroindustriais e de eventuais etapas de pós processamento para obtenção do produto.

Descrição da invenção

[0040] A presente invenção trata-se da elaboração de um composto proteico associado a outras fontes nutricionais e aplicável na ração de cães e gatos. A técnica compreende as etapas descritas na Figura 1 de (a) criação de uma cepa de levedura geneticamente modificada para expressar proteínas fibrilares animais heterólogas; cultivo da biomassa mutada para obtenção da biomassa microbiana expressando tais proteínas no meio reacional e obtenção do concentrado proteico contendo biomassa e proteínas expressadas; e (b) formulação com outros compostos nutritivos essenciais para cães e gatos provenientes de resíduos agroindustriais e destinação para etapas de pósprocessamento do produto.

[0041] A etapa (a) de criação de uma cepa de levedura geneticamente modificada prevê a utilização preferencial de Saccharomyces cerevisiae, podendo ser associada ou realocada por variantes da mesma ou de outra espécie como do gênero Pichia, preferencialmente Pichia pastoris. Visando a obtenção de um microorganismo capaz de expressar as proteínas fibrilares animais, esta invenção descreve a construção de uma cepa de levedura capaz de produzir em seu citosol proteínas animais, de modo que é realizada a expressão heteróloga de alguns dos principais polipeptídeos envolvidos na formação de fibras musculares animais (como actina, troponina e tropomiosina).

[0042] As sequências elegidas referentes às regiões codificantes de actina, troponina e tropomiosina são, respectivamente, as identificadas como SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, SEQ ID NO: 4, 5 ou 6, e SEQ ID NO: 7, 8 ou 9, representando as três proteínas para espécies de bovinos (Bos taurus), frangos (Gallus gallus) ou suínos (Sus scrofa) - cujas espécies de origem foram escolhidas pela sua aplicação na alimentação como fonte de proteína. As proteínas identificadas nas SEQ ID NO: 10, 11 ou 12, SEQ ID NO: 13, 14 ou 15, e SEQ ID NO: 16, 17 ou 18 podem ser expressas de forma simultânea no mesmo microorganismo ou de forma individual de modo que, durante o processo fermentativo, há a opção de um co-cultivo de leveduras da mesma espécie, porém expressando diferentes proteínas recombinantes. Diante da técnica desenvolvida, possibilita-se a expressão de outras proteínas musculares a fim de obter um produto ainda mais rico em proteínas.

[0043] Para a modificação genética da levedura, é utilizado como instrumento da inserção gênica a capacidade nativa da levedura de realizar a recombinação homóloga como um mecanismo de reparo a quebra da fita dupla de DNA. Sendo assim, a partir de uma metodologia de edição gênica sítio dirigida, deve-se induzir uma quebra no cromossomo da levedura e disponibilizar no citosol desta fragmentos de DNA contendo o gene a ser inserido - com um promotor compatível a espécie hospedeira - balizado pelas regiões de homologia do local de quebra, que permitem, portanto, a recombinação homóloga com esse fragmento heterólogo e, por conseguinte, a inserção do gene - no caso, da proteína fibrilar escolhida - no local pré-determinado pela quebra do cromossomo da levedura. A metodologia de edição gênica escolhida deve, portanto, ser capaz de direcionar o local da quebra no cromossomo e, por consequência, direcionar o local da inserção gênica na levedura.

[0044] Além da inserção gênica no cromossomo da levedura, é possível também expressar as proteínas fibrilares por meio de plasmídeos contendo promotores e origens de replicação compatíveis com a espécie escolhida. Sendo os genes para as três proteínas fibrilares expressas em um único plasmídeo em forma de operon ou compartimentalizadas a partir do uso de três plasmídeos individuais e suas combinações. Os plasmídeos contendo apenas um gene para uma proteína podem também ser inseridos em três diferentes clones, permitindo o co-cultivo das diferentes leveduras expressando cada uma alguma proteína fibrilar das aqui já citadas anteriormente.

[0045] As sequências SEQ ID NO: 1, 2 ou 3, SEQ ID NO: 4, 5 ou 6, e SEQ ID NO: 7, 8 ou 9 podem ser organizadas em forma de operon, o qual é formado por um promotor constitutivo livre de regulação, seguido de cada gene contendo uma sequência de ligação ao ribossomo (RBS) compatível com leveduras da espécie S. cerevisiae, e a região codificante de cada gene. Outra estratégia prevê que os genes podem ser expressos de forma distinta, sendo cada um controlado por um promotor específico compatível com as leveduras utilizadas. Em quaisquer das situações, os genes podem ser integrados no cromossomo do microrganismo, visando a estabilidade do DNA recombinante e a garantia de que este permanecerá íntegro nas progênies oriundas da divisão celular em meio reacional, ou expressos pela manutenção do plasmídeo na levedura selecionada.

[0046] Para a integração dos genes no cromossomo, foi utilizada a metodologia de inserção gênica sítio dirigida no cromossomo de Saccharomyces cerevisiae descrita por Jessop-Fabre et al. (2016), na qual os elementos particulares dessa invenção - genes codificantes para proteínas fibrilares animais associados a um promotor compatível a espécie de levedura - foram inseridos em regiões específicas do cromossomo fazendo proveito da recombinação homóloga nativa e dos instrumentos disponíveis na metodologia selecionada.

[0047] A modificação da cepa de Saccharomyces cerevisiae contou, portanto, com as etapas de construção dos vetores contendo, cada um: um gene ou mais para a expressão de uma ou mais proteínas fibrilares animais; um promotor compatível com a cepa de levedura escolhida para expressão antecedendo a região codificante do gene; a região de homologia do cromossomo da levedura balizando a sequência gênica e outros elementos essenciais para a funcionalização do vetor de acordo com a metodologia escolhida - como regiões de compatibilização com o microrganismo escolhido para a propagação do plasmídeo antes da transformação em levedura. Após a construção dos vetores - podendo eles possuir um ou mais genes para as diferentes proteínas fibrilares -, é preciso realizar a transformação e multiplicação dos plasmídeos em algum organismo compatível, sendo utilizado preferencialmente a bactéria Escherichia coli. Os plasmídeos utilizados para a clonagem dos genes da actina, troponina e tropomiosina são provenientes da metodologia descrita por Jessop-Fabre et al., podendo ser associados ou substituídos por outros plasmídeos com uso já difundido na espécie aqui citada que também são capazes de carregar a informação genética até a levedura de interesse e fazer com que as proteínas sejam expressas.

[0048] Após a propagação dos vetores preferencialmente em E. coli, os vetores contendo os genes com o promotor a serem inseridos e a região de homologia que direciona a inserção no cromossomo devem ser purificados e linearizados para a remoção de todos os outros elementos antes presentes no vetor a fim de permitir a sua multiplicação pelo sistema bacteriano. As células de S. cerevisiae são, então, submetidas a crescimento em meio contendo extrato de levedura, peptona e dextrose a uma temperatura de 28 a 40°C, até atingir cerca de 2x107 células/mL, para então serem lavadas com água deionizada. A transformação dos fragmentos de DNA linearizados é realizada, então, pela incubação das células de levedura com acetato de lítio de 20 a 40 minutos entre 30 e 50 °C juntamente com os fragmentos de DNA heterólogos a serem inseridos e os vetores contendo os elementos guia correspondentes a região de homologia prédeterminada para o funcionamento da metodologia descrita por Jessop-Fabre et al., (2016). Antes da inserção dos fragmentos gênicos, contudo, para o funcionamento da metodologia escolhida é preciso transformar na levedura um plasmídeo que permita a expressão da nuclease essencial ao funcionamento da edição gênica sítio dirigida aqui selecionada para executar a inserção dos genes no cromossomo da levedura.

[0049] Posteriormente, as células são incubadas por de 2 a 3 horas em meio contendo extrato de levedura, peptona e dextrose constituindo a fase de recuperação, para então serem plaqueadas em meio sólido com a mesma composição acrescida de ágar e antibióticos específicos (G418 e Noursetromicina). O plaqueamento é uma etapa fundamental para a seleção adequada de clones positivos para a presença dos plasmídeos essenciais para o funcionamento do sistema de edição gênica descrita pela metodologia de Jessop-Fabre et al., 2016. A confirmação da integração do DNA plasmidial no cromossomo se dá por seleção por reação de PCR e sequenciamento utilizando oligonucleotídeos específicos para a região integrada. Os clones bem sucedidos selecionados podem, individualmente, expressar todos os genes das proteínas fibrilares aqui descritas ou pode-se selecionar mais de um clone onde cada um expressa uma ou mais das proteínas fibrilares aqui citadas.

[0050] Na fase subsequente à etapa (a), após a seleção dos clones desejados, objetivando o cultivo da biomassa mutada para obtenção das proteínas no meio reacional, é inicialmente realizado um pré-inóculo com o clone ou com os clones selecionados em meio contendo extrato de levedura, peptona e dextrose, podendo ser suplementado com outros macro e micronutrientes demandados pelo microrganismo. A etapa para incremento do número de células que serão inoculadas em reator ocorre de 24 a 72 horas com temperatura de 25 a 45 °C com agitação de 90 a 230 rpm até atingir de 1,0±0,5x105 a 1,0±0,5x109 UFC/mL. Se houver a seleção de mais de um clone, podese realizar o co-cultivo ou o cultivo individual de cada OGM.

[0051] Em seguida, os pré-inóculos são adicionados ao reator no qual deverá ocorrer a produção da biomassa da levedura expressando as proteínas fibrilares. Junto ao inóculo - adicionado na proporção 15 a 30% (v/v) - são incorporados os elementos do meio de cultivo compostos por uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e uma fonte de micronutrientes - preferencialmente, sendo a fonte de carbono glicose e a de nitrogênio, uréia ou aminoácidos livres. O processo fermentativo ocorre de 28°C a 45°C por até 144h sob agitação constante de 120 a 450 rpm em meio líquido sob condições controladas em biorreator. São monitorados também a aeração do meio, mantida entre 0,3 e 1,5 vvm, o pH de 4 a 8, e a produção de espuma, controlados, respectivamente, pelo aumento ou redução da injeção de ar filtrado, de ácido ou base e de antiespumante.

[0052] Após o processo fermentativo, está compreendida a etapa de obtenção do concentrado proteico contendo a biomassa de levedura juntamente com as proteínas animais fibrilares sintetizadas pelo metabolismo celular. O caldo fermentado pode admitir uma etapa de separação sólido-líquido com o intuito de reter a biomassa microbiana, sendo nesse caso a operação unitária preferivelmente realizada por uma centrífuga de disco ou decanter ou por um filtro do tipo tambor rotativo. Como os polipeptídeos de interesse são intracelulares, é possível adicionar uma etapa de lise celular para tornálos mais biodisponíveis ao consumo animal. A lise pode ocorrer antes ou após a filtração da biomassa, admitindo incorporação dos elementos presentes no caldo fermentado ou optando por uma ressuspensão das células separadas para então rompê-las.

[0053] A lise celular de leveduras é compatível com uma série de métodos físicoquímicos, mecânicos ou enzimáticos. Podem ser optadas etapas de rompimento por homogeneização a alta pressão, agitação em moinho de bolas ou ultrassom, desde que controlados os choques mecânicos ou cavitação para que não degradem as proteínas de interesse. Também são opções viáveis e menos custosas como choque osmótico, congelamento e descongelamento ou aquecimento, uma vez que não dependem de equipamentos específicos e têm como base a oscilação de temperatura ou concentração de sais no meio intracelular. Ademais, métodos químicos são uma alternativa com o uso de álcalis, ácidos, solventes ou detergentes capazes de degradar a parede celular e liberar seu conteúdo interno. Por fim, análogo aos métodos físico-químicos quanto à praticidade e isenção de equipamentos adicionais, estão os métodos enzimáticos. Enzimas como β-1,3-glucanases associadas a um controle de pH para atividade enzimática ótima mostram-se efetivas para a ruptura de células de levedura.

[0054] Após a separação ou não da biomassa do caldo fermentado e a ruptura celular ou não, é obtido um produto final que pode ser líquido como uma emulsão ou pastoso a fim de ser incorporado na ração de animais. A vantagem do uso do caldo fermentado é a manutenção dos micro e macro nutrientes excretados pela levedura durante a fermentação que podem enriquecer a composição nutricional do produto final. Além disso, a dispensabilidade de um downstream custoso se apresenta como uma vantagem tecnológica pela economia no processo e pela não geração de resíduos durante o processo produtivo.

[0055] Sendo assim, há três opções possíveis de processamento para o produto obtido nesta etapa: (i) o caldo fermentado contendo a biomassa de levedura expressando as proteínas fibrilares animais pode ser usado diretamente sem nenhuma etapa de downstream para a formulações com outros elementos nutricionais provenientes de resíduos agroindustriais; (ii) o caldo fermentado contendo a biomassa de levedura expressando as proteínas fibrilares animais pode ser filtrado ou centrifugado objetivandose obter a biomassa com um conteúdo líquido menor para ser usada na formulação com outros elementos nutricionais provenientes de resíduos agroindustriais - dispensando, portanto, o caldo fermentado e mantendo a biomassa expressando as proteínas fibrilares; e (iii) o caldo fermentado contendo a biomassa de levedura ou a biomassa de levedura filtrada ou centrifugada pode passar por uma etapa de lise celular para então ser utilizada na formulação com outros elementos nutricionais provenientes de resíduos agroindustriais

[0056] A etapa subsequente diz respeito à formulação com outros compostos nutritivos essenciais para cães e gatos provenientes de resíduos agroindustriais. Tomando como base uma composição adequada para tais animais e integralmente proveniente da produção de biomassa geneticamente modificada expressando proteínas fibrilares associada à resíduos agroindustriais nutricionalmente adequados, definem-se alguns compostos como fonte de proteínas, carboidratos, fibras brutas, lipídeos, vitaminas e minerais, tendo em vista que os teores destes macronutrientes nos resíduos podem ser variáveis pois dependem intimamente do seu estado de processamento e conservação.

[0057] Os elementos proteicos, e também fonte de aminoácidos essenciais, serão provenientes da fermentação e lise da cepa de Saccharomyces cerevisiae mutada sintetizando os polipeptídeos fibrilares animais. Ainda podem ser acrescidos farelos como o de colza, semente de algodão, ervilha, soja ou outras leguminosas por serem ricos em proteínas e rejeitos provenientes do processamento de grãos. Seguindo as determinações da FDA (Food and Drug Administration) pautadas pela AAFCO (Association of American Feed Control Officials), os teores de proteína em rações para cães não devem ser menores que 18% para manutenção corporal de um animal adulto, e um mínimo de 22% para garantir condições de crescimento e reprodução. Para gatos, esse teor para as mesmas finalidades são de 26 e 30%.

[0058] A fibra bruta pode ser proveniente de grãos de destilaria, polpa cítrica, farelos como o de amendoim, cascas de leguminosas ou grãos, tortas de filtração de extração de óleos, cascas de frutas e verduras, entre outros. Além de auxiliarem no funcionamento gastrointestinal e serem parte integrante da formação do bolo fecal quanto mais solúveis, as fibras ainda cumprem um papel importante na formulação ao encorparem a mistura da ração.

[0059] Fontes de carboidratos, por sua vez, podem ser de resíduos ricos em açúcares como o melaço, de cereais processados tais como cevada, arroz e trigo; e de polpa de frutas ou de partes remanescentes de tubérculos e outras raízes. A variação da taxa de carboidratos na ração dependerá de qual objetivo deseja suprir. Rações ditas de baixo carboidrato poderão conter menores níveis do que aquelas direcionadas à crescimento, de alta demanda energética ou destinada a fases iniciais de desenvolvimento dos animais de estimação. Lipídeos, por sua vez, podem ser acrescidos em forma de óleos de sementes ou leguminosas, presentes na lecitina, ou de outras origens, como da torta de filtração de caroços.

[0060] A variação de teores dos principais macronutrientes em dietas de cães e gatos variam de acordo com o estágio de desenvolvimento do animal, bem como a finalidade da dieta, podendo ser de alta taxa de carboidrato, proteína ou gordura. Tomando como base uma dieta com enfoque em manutenção corporal de um animal adulto, os valores de fontes energéticas pode variar como disposto na Tabela 1 abaixo. Assim, conhecendo a composição de resíduos agroindustriais é possível modular uma formulação de ração que se adeque para o fim de alimentação animal.

[0061] Aminoácidos essenciais, vitaminas, macro e microminerais que eventualmente não forem suficientes quando provenientes dos ingredientes propostos na formulação da ração, podem ser acrescidos de outras formas, de modo que sejam supridas as necessidades nutricionais e metabólicas de animais de estimação.

[0062] Além de serem ingredientes do composto proposto como ração para cães e gatos, os resíduos agroindustriais poderão ser adicionados de forma cumprir funções de aditivos sensoriais ou para alterar as condições físico-químicas da mistura. São considerados possíveis rejeitos utilizados como aditivos de ração o dreche, DDGS (grãos secos por destilação) ou farelo de amendoim para aumentar a palatabilidade, glicerina como um retentor de umidade em rações secas ou extrusadas, lecitina como um agente espessante, e melaço como um aglutinante.

[0063] Alimentos para animais de estimação são disponibilizados em variações comerciais de forma e umidade. Rações sólidas contém de 6 a 10% de umidade, enlatadas de 60 a 90% e semi-sólidas de 25 a 35%. Seguindo a etapa de formulação, a mistura obtida segue para a fase de pós processamento do produto, que pode incluir operações de extrusão, peletização, coating, secagem, entre outros. A forma final do produto dependerá da palatabilidade e concentrações de nutrientes almejadas, da facilidade de digestão pelo animal, do tempo de vida para a qual é destinada, da inserção ou não de aditivos ou preservantes, do tempo de prateleira desejado e do custo da ração finalizada.

Exemplos de concretizações da invenção

[0064] EXEMPLO 1: Criação dos vetores de clonagem

[0065] Utilizando a metodologia de recombinação homóloga nativa de leveduras proposta por Jessop-Fabre et al. (2016), inicia-se o processo de transformação da cepa s288c de Saccharomyces cerevisiae com a construção de vetores contendo os genes de proteínas fibrilares animais. Para a construção de tais vetores, se faz necessária a montagem contendo o gene responsável pela expressão das proteínas de interesse, acompanhado de um promotor compatível com a maquinaria celular da levedura no upstream da fita codificante, e flanqueado por sequências coincidentes com a região de homologia alvo escolhidas com base no conhecimento da estrutura dos cromossomos da levedura.

[0066] Para a expressão da proteína de SEQ ID NO: 10 o vetor construído constou com o gene de SEQ ID NO: 1, antecedido pelo promotor natural de leveduras identificado na SEQ ID NO: 19 e delimitado por regiões de homologia compatíveis com a de SEQ ID NO: 22. De forma análoga, um segundo vetor foi elaborado contendo os elementos necessários para a expressão da proteína de SEQ ID NO: 13, como o gene de SEQ ID NO: 4, precedido pelo mesmo promotor de SEQ ID NO: 19 por sua maior compatibilidade com a maquinaria de transcrição e tradução da Saccharomyces cerevisiae s288c. Para a região de homologia na qual o gene foi inserido, foi escolhida a de SEQ ID NO: 21, portanto no vetor construído constavam sequências capazes de serem ligadas com esta região no processo de reparo descrito no Exemplo 2. Por fim, para a expressão heteróloga da proteína de SEQ ID NO: 16 pela Saccharomyces cerevisiae s288c o terceiro vetor construído constou com o promotor de SEQ ID NO: 19, seguido do gene de SEQ ID NO: 7. Como a região de homologia ao cromossomo da levedura selecionada para a inserção deste gene de interesse foi a de SEQ ID NO: 20, o vetor foi finalizado com a presença nas extremidades do fragmento de sequências capazes de serem conciliadas com a região escolhida.

[0067] Para a obtenção em maiores quantidades dos plasmídeos construídos foi realizada a clonagem dos três vetores em três diferentes colônias de Escherichia coli TOP10 cultivada em meio LB suplementado com 100 μg/mL de ampicilina para seleção dos transformantes, uma vez que todos os vetores criados também continham gene para resistência ao antibiótico como forma de marcador de seleção. Após o cultivo em célula bacteriana, os plasmídeos foram extraídos e purificados para a etapa seguinte da metodologia proposta.

[0068] Sabendo que os cromossomos da levedura são lineares, e que a expressão das proteínas fibrilares de interesse só se dá se devidamente incorporadas à esta estrutura, foi necessário um corte nos plasmídeos construídos após a replicação e purificação. Com a enzima de restrição NotI, os plasmídeos foram linearizados de forma a transformaremse em fragmentos contendo o promotor, o gene de interesse e que esta estrutura estivesse delimitada em ambas as extremidades pelas regiões de homologia previamente selecionadas e descritas.

[0069] EXEMPLO 2: Clonagem das sequências selecionadas em Saccharomyces cerevisiae e linearização no cromossomo

[0070] A metodologia proposta por Jessop-Fabre et al. (2016) consiste em realizar uma mutação sítio dirigida portanto prevê que, para que ocorra a inserção correta dos genes de interesse nas regiões de homologia desejadas, a técnica depende de uma endonuclease para realizar os cortes nos cromossomos da levedura e de um RNA guia (gRNA) para cada região de homologia escolhida, fazendo com que a endonuclease seja direcionada para a exata região de homologia em que se deseja incorporar os insertos. Portanto, juntamente com as sequências previamente linearizadas são inseridos os plasmídeos contendo o gene para a tradução em gRNA e um plasmídeo contendo a sequência para síntese da endonuclease usada para abrir as fitas dos cromossomos.

[0071] Para a inserção destes plasmídeos também clonados em colônias distintas de E. coli TOP 10, replicados e purificados, juntamente com os fragmentos dos genes de interesse previamente construídos e linearizados, a Saccharomyces cerevisiae s288c foi inicialmente cultivada em meio extrato de levedura peptona dextrose com 20g/L dextrose por aproximadamente 48 horas a 30 °C até atingir 107 células/mL - quantificada em câmara de contagem - e posteriormente lavada com água deionizada estéril.

[0072] Em seguida foi submetida a acetato de lítio por 20 minutos a 40 °C juntamente com os elementos a serem inseridos nas células. A proporção usada na transformação foi de 1 μg de fragmentos linearizados de DNA com 1 μg do plasmídeo de gRNA auxiliares. As células foram, então, incubadas por 2 horas em meio extrato de levedura peptona dextrose com 20g/L dextrose para recuperação. Por fim, a seleção dos clones foi realizada pelo plaqueamento em meio sólido com o mesmo meio acrescido de ágar e antibióticos específicos (G418 e Noursetromicina), sendo a confirmação dos genes inseridos e de suas localizações no cromossomo da levedura realizada por PCR e identificação de banda em gel de eletroforese.

[0073] A determinação da inserção dos genes por PCR foi realizada para confirmar a viabilidade da cepa devidamente mutada com os genes de SEQ ID NO: 1, 4 e 7, competente para a expressão das respectivas sequências de aminoácidos identificadas como SEQ ID NO: 10, 13 e 16.

[0074] EXEMPLO 3: Cultivo da levedura geneticamente modificada para obtenção do concentrado proteico contendo a biomassa expressando as proteínas fibrilares animais

[0075] Após a seleção do clone de Saccharomyces cerevisiae s288c expressando constitutivamente os genes para as proteínas fibrilares animais de interesse, realiza-se um pré-inóculo em meio extrato de levedura peptona dextrose com 20g/L dextrose líquido a fim de atingir a concentração inicial no bioreator de produção de 5 g/L de biomassa. O inóculo é cultivado por 72 horas a 37 °C com agitação constante de 120 rpm até atingir uma concentração de células de 1x107 UFC.mL-1.

[0076] Após o cultivo do pré-inóculo de forma a acrescer a quantidade de células viáveis para o crescimento da levedura expressando as proteínas fibrilares animais de interesse, o processo tem continuidade com a etapa de cultivo da biomassa mutada em biorreator. Em meio líquido contendo glicose e aminoácidos livres em concentrações de 20 e 8 g/L, respectivamente, é acrescido o inóculo previamente cultivado atingindo uma concentração inicial de 5 g/L de biomassa no biorreator. O processo fermentativo para produção da biomassa, então, se propaga por 72 horas a 35 ºC com pH 5, mantido à rotação constante de 320 rpm. A aeração foi mantida em 0,5 vvm e acrescida para 1,2 vvm após 12 horas. Ao final da fermentação, obteve-se uma concentração final de biomassa de 30 g/L.

[0077] Para obter o concentrado proteico derivado da biomassa de levedura expressando proteínas fibrilares, optou-se por não realizar nenhuma etapa de separação do caldo fermentado. Utilizou-se, portanto, a biomassa juntamente com o seu caldo fermentado a fim de manter os compostos presentes no caldo fermentado para a formulação do composto proteico final, tendo como vantagem a diminuição de uma operação unitária potencialmente custosa ao processo e manutenção dos inúmeros micronutrientes presentes no caldo fermentado pela levedura durante o crescimento da biomassa.

[0078] Para aumentar, contudo, a biodisponibilidade das proteínas fibrilares expressas pela levedura, optou-se por realizar a lise celular da biomassa, uma vez que as proteínas animais não são excretadas. Para a lise celular, o método utilizado foi o enzimático pela adição das seguintes enzimas no caldo fermentado e pela manutenção adequada das condições exigidas pela reação: β-1,3 Glucanases e quitinases em pH 6, 5 a 35 °C. Optou-se por não utilizar nenhum composto químico na etapa de lise a fim de não deixar nenhum resíduo potencialmente tóxico no concentrado proteico derivado da levedura, agora lisado, que será posteriormente utilizado na formulação com outras fontes nutricionais derivadas de resíduos agroindustriais para utilização na ração de cães e gatos.

[0079] EXEMPLO 4: Formulação de um composto rico em proteínas destinado a ração de cães

[0080] Para uma formulação à base de resíduos agroindustriais associados com a biomassa de Saccharomyces cerevisiae mutada, visando a nutrição de cães e admitindo sua utilização como um ingrediente para outras rações, uma composição adequada depende de fontes de macronutrientes admissíveis por estes animais. A base de uma composição adequada pode conter 70% de levedura expressando proteínas fibrilares, associada à 10% de farinha de palmiste como fonte proteica, acrescida de 10% de melaço de cana-de-açúcar capaz de oferecer açúcares redutores, 15% de óleo de soja para suprir a demanda de lipídeos, e 2% de grãos secos de destilaria conferindo as fibras e sendo admitido como agente de aumento de palatabilidade.

[0081] Essa composição resulta em um composto nutritivo com taxas de elementos em base seca de 36% de proteína bruta, 16% de gorduras, 3,7% de fibras brutas e energia digestível de 90%. Tal formulação adequa-se às demandas de macronutrientes por cães e ainda admite acréscimo de aditivos ou suplementos de vitaminas, minerais e aminoácidos, ou serve como um ingrediente para outras formulações destinadas a este grupo de animais.

[0082] EXEMPLO 5: Formulação de um composto rico em proteínas destinado a ração de gatos

[0083] Para uma formulação à base de resíduos agroindustriais associados com a biomassa de Saccharomyces cerevisiae mutada, visando a nutrição de gatos e admitindo sua utilização como um ingrediente para outras rações, uma composição adequada depende de fontes de macronutrientes admissíveis por estes animais. A base de uma composição adequada pode conter 80% de levedura expressando proteínas fibrilares, acrescida de 10% de partes remanescentes de batata capaz de oferecer açúcares redutores, 10% de óleo de soja para suprir a demanda de lipídeos, e 1% de rejeitos da moagem de milho conferindo as fibras.

[0084] Essa composição resulta em um composto nutritivo com taxas de elementos em base seca de 38% de proteína bruta, 11,4% de gorduras, 3,9% de fibras brutas e energia digestível de 94%. Tal formulação adequa-se às demandas de macronutrientes por gatos e ainda admite acréscimo de aditivos ou suplementos de vitaminas, minerais e aminoácidos, ou serve como um ingrediente para outras formulações destinadas a este grupo de animais.

[0085] EXEMPLO 6: Ração seca

[0086] Visando a obtenção de uma ração seca com granulometria adequada, passível de ser compactada e com teor de umidade entre 6 e 10%, a composição resultante da biomassa de levedura mutada acrescida de resíduos agroindustriais como fonte nutricional segue da etapa de mistura para uma extrusora com a milimetragem de grãos desejada, operando entre 60 a 100 ºC eliminando patógenos como Enterococcus spp. ou Salmonella spp. sem causar danos aos ingredientes da formulação. Com a mistura contendo de 20 a 30% após a extrusão, os grãos de ração formulada e modelada são secos por ar aquecido em convecção operando de 100 a 130 ºC obtendo um produto final com umidade entre 6 e 10%.

[0087] EXEMPLO 7: Ração úmida

[0088] Visando a obtenção de uma ração úmida com 60 a 90% de água em sua composição e destinada à comercialização em latas ou sachês, a composição resultante da biomassa de levedura mutada acrescida de resíduos agroindustriais como fonte nutricional segue da etapa de mistura para uma para uma extrusora operando entre 60 a 100 ºC eliminando patógenos como Enterococcus spp. ou Salmonella spp. sem causar danos aos ingredientes da formulação. A massa extrusada com 20 a 30% de umidade é cortada em pedaços com o tamanho de interesse e misturada com uma geleia ou pasta para atingir a umidade final desejada de 60 a 90% antes de ser empacotada ou enlatada.
Definições
SEQ ID NO: 1 - Sequência codificante para a cadeia de actina alfa 1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 2 - Sequência codificante para a cadeia de actina alfa 1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 3 - Sequência codificante para a cadeia de actina alfa 1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 4 - Sequência codificante para cadeia da tropomiosina alfa 1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 5 - Sequência codificante para cadeia da tropomiosina alfa 1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 6 - Sequência codificante para cadeia da tropomiosina alfa 1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 7 - Sequência codificante para cadeia da troponina T1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 8 - Sequência codificante para cadeia da troponina T1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 9 - Sequência codificante para cadeia da troponina T1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 10 - Sequência de aminoácidos de actina alfa 1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 11 - Sequência de aminoácidos de actina alfa 1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 12 - Sequência de aminoácidos de actina alfa 1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 13 - Sequência de aminoácidos de tropomiosina alfa 1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 14 - Sequência de aminoácidos de tropomiosina alfa 1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 15 - Sequência de aminoácidos de tropomiosina alfa 1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 16 - Sequência de aminoácidos de troponina T1 de Bos taurus
SEQ ID NO: 17 - Sequência de aminoácidos de troponina T1 de Gallus gallus
SEQ ID NO: 18 - Sequência de aminoácidos de troponina T1 de Sus scrofa
SEQ ID NO: 19 - Sequência do promotor TEF1 (fator de alongamento da tradução) nativo de Saccharomyces cerevisiae s288c
SEQ ID NO: 20 - Região de homologia do cromossomo X de Saccharomyces cerevisiae s288c localizada entre os pares de base 194944 e 195980
SEQ ID NO: 21 - Região de homologia do cromossomo XI de Saccharomyces cerevisiae s288c localizada entre os pares de base 93378 e 94567
SEQ ID NO: 22 - Região de homologia do cromossomo XI de Saccharomyces cerevisiae s288c localizada entre os pares de base 91575 e 92913

Claims

COMPOSTO PROTEICO CONSTITUÍDO PELA BIOMASSA DE UM ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO EXPRESSANDO PROTEÍNAS FIBRILARES ASSOCIADO A OUTRAS FONTES NUTRICIONAIS PROVENIENTES DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS caracterizado por (a) uma biomassa de levedura geneticamente modificada expressando proteínas fibrilares constitutivas da musculatura animal e (b) resíduos agroindustriais como fonte de outros elementos nutricionais essenciais para a ração de cães e gatos.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cepa de levedura geneticamente modificada ser dos gêneros Saccharomyces ou Pichia, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as proteínas fibrilares animais expressadas compreenderem actina, troponina e tropomiosina.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a mutação da levedura envolver a inserção de genes para a expressão de proteínas fibrilares de espécies utilizadas em alimentação humana ou animal em sua forma in natura, englobando bovinos (Bos taurus), aves (Gallus gallus) e suínos (Sus scrofa).
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os resíduos agroindustriais incorporados na formulação serem integrados em quantidades suficientes para suprirem a demanda de macronutrientes de cães e gatos.
COMPOSTO PROTEICO CONSTITUÍDO PELA BIOMASSA DE UM ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO EXPRESSANDO PROTEÍNAS FIBRILARES ASSOCIADO A OUTRAS FONTES NUTRICIONAIS PROVENIENTES DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS caracterizado por a criação e cultivo de uma levedura - dos gêneros Saccharomyces ou Pichia, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris - geneticamente modificada para a expressão de proteínas fibrilares animais utilizada como parte integrante de uma formulação para rações de cães e gatos.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a alteração na levedura geneticamente modificada ser a inserção de genes para a expressão de proteínas fibrilares constitutivas da musculatura animal compreendidas pelas proteínas actina, troponina e tropomiosina, cujas sequências codificantes são compreendidas pelas sequências SEQ ID NO: 1 a 9 e as sequências de aminoácidos pelas SEQ ID NO: 10 a 18.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a modificação na levedura para a expressão heteróloga das proteínas fibrilares animais compreender a associação dos genes com um promotor compatível com a levedura hospedeira e a expressão compreender o uso de plasmídeos inseridos na levedura ou a inserção dos genes em regiões específicas do cromossomo da levedura a partir de uma metodologia de edição gênica que utilize do mecanismo nativo de recombinação homóloga da levedura.
COMPOSTO PROTEICO CONSTITUÍDO PELA BIOMASSA DE UM ORGANISMO GENETICAMENTE MODIFICADO EXPRESSANDO PROTEÍNAS FIBRILARES ASSOCIADO A OUTRAS FONTES NUTRICIONAIS PROVENIENTES DE RESÍDUOS AGROINDUSTRIAIS caracterizado por as etapas de (a) criação de uma cepa de levedura geneticamente modificada para viabilizar a expressão heteróloga de proteínas fibrilares animais e seu cultivo para obtenção da biomassa microbiana expressando tais proteínas no meio reacional resultando em um composto proteico; e (b) formulação com outros compostos nutritivos essenciais provenientes de resíduos agroindustriais com etapas de pós-processamento do produto destinado para alimentação de cães e gatos.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a biomassa de levedura geneticamente modificada ser dos gêneros Saccharomyces ou Pichia, preferencialmente Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris, para a expressão de proteínas fibrilares animais como fonte alternativa de proteína em rações de cães e gatos.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a biomassa da levedura ser modificada para expressar proteínas fibrilares animais constitutivas da musculatura animal compreendidas pelas proteínas actina, troponina e tropomiosina, cujas sequências codificantes são compreendidas pelas sequências SEQ ID NO: 1 a 9 e as sequências de aminoácidos pelas SEQ ID NO: 10 a 18.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a etapa de formulação da biomassa de levedura geneticamente modificada com resíduos agroindustriais como fonte de nutrientes essenciais na ração de cães e gatos compreender bagaços, cascas, farelos, tortas de filtração, biomassas microbianas ou vegetais passíveis de reutilização, óleos ou outros resíduos que não contenham traços de origem animal.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a aplicação da biomassa de levedura modificada na formulação para rações de cães e gatos ser compreendida por seu uso associada ou não com o caldo fermentado, englobando etapas de lise celular, de separação sólido-líquido ou de purificação das proteínas expressadas de maneira prévia à formulação.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por a formulação ter prevista na composição resíduos agroindustriais desempenhando funções nutricionais como fonte de macronutrientes como proteínas, carboidratos, fibras alimentares e lipídeos, micronutrientes, aminoácidos e vitaminas.
COMPOSTO PROTEICO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por permitir a suplementação com outros aditivos que não contenham traços de origem animal - como aminoácidos essenciais, minerais, vitaminas e espessantes - com fim de aprimorar as condições físico-químicas do produto final e permitir etapas adicionais de pós-processamento do produto - como secagem, extrusão e outros - de acordo com a necessidade das características do produto final almejadas.