JP7239321B2 - 四価多重特異性抗体 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、四価多重特異性抗体、それらの生産および使用に関する。
発明の背景
2種類以上の抗原に結合する能力を有する二重特異性抗体または多重特異性抗体などの改変タンパク質は、当技術分野において公知である。そのような多重特異性結合タンパク質は、細胞融合、化学的コンジュゲーション、または組換えDNA技法を使って作製することができる。
近年、例えばIgG抗体フォーマットと一本鎖ドメインとの融合による四価二重特異性抗体などといった、多種多様な組換え多重特異性抗体フォーマットが開発されている（例えばColoma, M.J., et. al., Nature Biotech. 15（1997）159-163、WO 2001/077342、およびMorrison, S.L., Nature Biotech. 25（2007）1233-1234を参照されたい）。
多重特異性抗体の生産における障害の一つは、所望の機能的分子の他に、さまざまな望ましくない副生成物が形成されることである。ミスペアリングには、間違った重鎖同士のペアリング、および軽鎖と間違った重鎖対応物とのペアリング、または望ましくない軽鎖同士のペアリングが含まれる。
CH3ドメインに変異を導入して接触境界面を修飾することによって、2つの異なる抗体重鎖のペアリングを強制することを目指して、二重特異性抗体を生産する場合のミスペアリングした副生成物の問題を克服するための1つのアプローチは、「ノブ・イントゥ・ホール（knob-into-hole）技術」として知られている。一方の鎖では、「ホール」を作り出すために、嵩高いアミノ酸が短い側鎖を持つアミノ酸で置き換えられた。逆に、他方のCH3ドメインには、「ノブ」を作り出すために、大きな側鎖を持つアミノ酸が導入された。これら2つの重鎖（および2つの同一軽鎖、これらの軽鎖はどちらの重鎖にとっても適当である必要がある）を共発現させることにより、ホモ二量体形成（「ホール-ホール」または「ノブ-ノブ」）と対比して高収率のヘテロ二量体形成（「ノブ-ホール」）が観察された（Ridgway, J.B., et al., Protein Eng. 9（1996）617-621、およびWO 96/027011）。ファージディスプレイアプローチを使用して2つのCH3ドメインの相互作用面をリモデリングすることと、ヘテロ二量体を安定化するためにジスルフィド架橋を導入することとによって、ヘテロ二量体のパーセンテージをさらに増加させることができた（Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16（1998）677-681、Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270（1997）26-35）。ノブ・イントゥ・ホール技術の新しいアプローチは、例えばEP 1 870 459 A1に記載されている。このフォーマットは非常に魅力的だと思われるが、臨床に向けた進歩を物語るデータはまだない。この戦略の重要な制約の1つは、ミスペアリングした副生成物の形成を防止する目的で、ミスペアリングと不活性分子の形成を防止するために、2つの親抗体の軽鎖が同一であることを必要とする点である。したがってこの技法は、第1の抗原および第2の抗原に対する2つの抗体から出発して3種類または4種類の抗原に対する組換え三重特異性または四重特異性抗体を容易に開発する基礎としては、適当でない。というのも、これらの抗体の重鎖および/または同一軽鎖のいずれかをまず最適化する必要があり、次に、さらに第3の抗原および第4の抗原に対する抗原結合ペプチドを加える必要があるからである。
Fcドメインの対形成を促進するための他のアプローチが、ヘテロ二量体化ポリペプチドに関するWO 2013/02362に記載されている。WO 2013/12733は、ヘテロ二量体型Fc領域を含むポリペプチドに関する。WO 2012/131555は、改変ヘテロ二量体型免疫グロブリンに関する。EP 2647707は改変ヘテロ二量体型免疫グロブリンに関する。
二重特異性抗体の生産において、ミスペアリングした副産物という課題を回避するアプローチの一つは、軽鎖ポリペプチドとその正しい重鎖対応物とのペアリングを強制しようとするものである。「CrossMab技術」と呼ばれるこのアプローチは、重鎖と軽鎖の間のドメイン交差によって、特異性が異なる重鎖および軽鎖に異なるドメイン配置を作り出すことに基づいている。WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191は、ドメイン交差が施された二価二重特異性IgG抗体に関する。WO 2010/145792およびWO 2010/145792は、ドメイン交差が施された四価抗原結合タンパク質に関する。
軽鎖ミスペアリングを防止するために1つの結合部位にVH/VLの入れ替え/交換が施された、WO2009/080252に記載の多重特異性抗体（CrossMabVH-VL）（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191も参照されたい）は、第1の抗原に対する軽鎖と第2の抗原に対する間違った重鎖とのミスマッチによって生じる副産物を（そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較して）明らかに低減する。しかしそれらの調製も副生成物を完全には免れない。主要副生成物は、間違った軽鎖とドメイン交換が施された重鎖とのベンス・ジョーンズ型相互作用に基づく（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191、補足資料のFig. S1Iも参照されたい）。
WO2015/101588A1は血液脳関門シャトルモジュールに関する。WO2015/101588A1は、結合アームの1つにVH/VLドメイン交差が施され、CH1/CL境界面に変異を持つ、二価二重特異性抗体に言及している。WO2015/101588A1は、該変異の技術的効果には言及していない。
上述の二重特異性抗体の純度などを改善するために、上述の副生成物のさらなる低減が、今なお、必要とされている。抗体を治療用途に利用できるようにする抗体の特徴も、改善されうる。
一局面において、本発明は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体であって、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体に関する。
本発明の第1の局面による抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、ii）のアミノ酸置換を含む。
別の一局面において、本発明は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体であって、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体に関する。
本発明の第2の局面による抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、ii）のアミノ酸置換を含む。
本発明の一態様は、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が、互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸が、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が、互いに独立してEまたはDで置換され、かつCLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸が、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントが、CLドメイン中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されているものである、
多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、b）の追加Fabフラグメントがコア抗体の重鎖のC末端に融合されている、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、二重特異性である抗体に関する。
本発明の一態様は、2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら2つのCH3ドメインが、一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させることによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変された、2つのCH3ドメインを含む、多重特異性抗体に関する。
本発明の一態様は、2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインが、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるように各CH3ドメインに少なくとも1つのシステイン残基を導入することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、多重特異性抗体に関する。
本発明の別の一局面は、本発明の抗体をコードする核酸である。
本発明の別の一局面は、本発明の核酸を含む発現ベクターである。
本発明の別の一局面は、本発明の核酸を含む宿主細胞である。
本発明の別の一局面は、本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物または診断組成物である。
本発明の別の一局面は、本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートである。
本発明によれば、CH1ドメインおよびCLドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対の電荷を持つ荷電アミノ酸の置換を導入することによって、例えばベンス・ジョーンズ型生成物のような望ましくない副生成物と比較した所望の多重特異性抗体の比を改善することができる。さらにまた、本発明の抗体における凝集挙動が改善されて凝集体の分率が低くなり、それによって所望の抗体分子の総収量が改善される。
[本発明1001]
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、四価多重特異性抗体であって、
該追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体。
[本発明1002]
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、四価多重特異性抗体であって、
重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体。
[本発明1003]
i）のドメイン交差を含まない前記1つまたは2つのFabフラグメントが、ii）のアミノ酸置換を含む、本発明1001または1002の抗体。
[本発明1004]
ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸が、互いに独立してKおよびRで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、
本発明1001～1003のいずれかの抗体。
[本発明1005]
ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメインでは、123番目のアミノ酸がRで置換され、124番目のアミノ酸がKで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
本発明1001～1004のいずれかの抗体。
[本発明1006]
ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントが、CLドメイン中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されているものである、本発明1001～1005のいずれかの抗体。
[本発明1007]
i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントにおいて、CLドメインでは、123番目のアミノ酸がRで置換され、かつ124番目のアミノ酸がKで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、かつ
i）のドメイン交差を含むFabフラグメントにおいて、124番目のアミノ酸がEで置換されている、
本発明1001～1006のいずれかの抗体。
[本発明1008]
ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントが、カッパアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む、本発明1001～1007のいずれかの抗体。
[本発明1009]
b）の追加Fabフラグメントが、ペプチドコネクタを介してコア抗体の重鎖に融合されている、本発明1001～1008のいずれかの抗体。
[本発明1010]
多重特異性抗体が2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
・一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させること、または
・一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること
によって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、
本発明1001～1009のいずれかの抗体。
[本発明1011]
多重特異性抗体が2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインは、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるように各CH3ドメインに少なくとも1つのシステイン残基を導入することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、本発明1001～1010のいずれかの抗体。
[本発明1012]
本発明1001～1011のいずれかの抗体をコードする、単離された核酸。
[本発明1013]
本発明1012の核酸を含む、発現ベクター。
[本発明1014]
本発明1013の核酸を含む、宿主細胞。
[本発明1015]
本発明1001～1011のいずれかの多重特異性抗体を含む、薬学的組成物または診断組成物。
[本発明1016]
本発明1014の宿主細胞を、多重特異性抗体が生産されるように培養する工程を含む、多重特異性抗体を生産する方法。
[本発明1017]
四価多重特異性抗体の調製中の副生成物形成を低減するための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・本発明1001～1011のいずれかの四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
[本発明1018]
四価多重特異性抗体の凝集温度を上昇させるための方法であって、以下の工程を含む、方法:
・本発明1001～1011のいずれかの四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
図1:本発明の第1の局面による四価多重特異性抗体、すなわち同じ抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図1A:重鎖のそれぞれのC末端に、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介して融合されている、第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。該追加FabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む。コア抗体内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。 図1:本発明の第1の局面による四価多重特異性抗体、すなわち同じ抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図1B:重鎖のそれぞれのC末端に、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介して融合されている、第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。該追加FabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む。コア抗体内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。 図1:本発明の第1の局面による四価多重特異性抗体、すなわち同じ抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図1C:重鎖のそれぞれのC末端に、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介して融合されている、第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。ペプチドコネクタは、CH3と追加FabのVLドメインとを接続するか（図示されている）、あるいはCH3と追加FbのVHドメインとを接続する（図示されていない）ように配置することがきる。該追加Fabフラグメントは、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異による修飾を、CH1/CL境界面内に含む。コア抗体のFabフラグメントは、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む。 図1:本発明の第1の局面による四価多重特異性抗体、すなわち同じ抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図1D:重鎖のそれぞれのN末端に、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介して融合されている、第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。該追加Fabフラグメントは、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む。コア抗体内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。 図1:本発明の第1の局面による四価多重特異性抗体、すなわち同じ抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図1E:重鎖のそれぞれのN末端に、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介して融合されている、第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。該追加Fabフラグメントは、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異による修飾を、CH1/CL境界面内に含む。コア抗体のFabフラグメントは、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む。 図2:本発明の第2の局面による四価多重特異性抗体、すなわち異なる抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図2A:一方のFabフラグメントは第1の抗原に特異的に結合し、他方のFabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合する、2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。重鎖のそれぞれのC末端には、追加Fabフラグメントが融合されている。該追加Fabフラグメントは、それが融合されている重鎖と同じ抗原に特異的に結合する（この例の場合、第1の抗原に特異的に結合する重鎖に、第1の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されており、一方、第2の抗原に特異的に結合する重鎖には、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されている）。該追加Fabフラグメントが融合されている重鎖のFabフラグメントと該追加Fabフラグメントは、どちらも同じ修飾を含む。すなわち、この例の場合、第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含み、第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。 図2:本発明の第2の局面による四価多重特異性抗体、すなわち異なる抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図2B:一方のFabフラグメントは第1の抗原に特異的に結合し、他方のFabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合する、2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。重鎖のそれぞれのC末端には、追加Fabフラグメントが融合されている。該追加Fabフラグメントは、それが融合されている重鎖と同じ抗原に特異的に結合する（この例では、第1の抗原に特異的に結合する重鎖に、第1の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されており、一方、第2の抗原に特異的に結合する重鎖には、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されている）。該追加Fabフラグメントが融合されている重鎖のFabフラグメントと該追加Fabフラグメントは、どちらも同じ修飾を含む。すなわち、この例の場合、第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含み、第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。コア抗体は、重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾、例えばノブ・イントゥ・ホール変異、異なるCH3ドメインにおける反対電荷のアミノ酸による変異、および/または追加ジスルフィド架橋などを、CH3/CH3境界面に含む。 図2:本発明の第2の局面による四価多重特異性抗体、すなわち異なる抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図2C:一方のFabフラグメントは第1の抗原に特異的に結合し、他方のFabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合する、2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。重鎖のそれぞれのN末端には、追加Fabフラグメントが融合されている。該追加Fabフラグメントは、それが融合されている重鎖と同じ抗原に特異的に結合する（この例では、第1の抗原に特異的に結合する重鎖に、第1の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されており、一方、第2の抗原に特異的に結合する重鎖には、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されている）。該追加Fabフラグメントが融合されている重鎖のFabフラグメントと該追加Fabフラグメントは、どちらも同じ修飾を含む。すなわち、この例の場合、第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含み、第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。 図2:本発明の第2の局面による四価多重特異性抗体、すなわち異なる抗原に結合する2つのFabフラグメントを含むコア抗体を含む抗体、の例示的図解。図2D:一方のFabフラグメントは第1の抗原に特異的に結合し、他方のFabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合する、2つのFabフラグメントを持つコア抗体を含む、四価多重特異性抗体。重鎖のそれぞれのN末端には、追加Fabフラグメントが融合されている。該追加Fabフラグメントは、それが融合されている重鎖と同じ抗原に特異的に結合する（この例では、第1の抗原に特異的に結合する重鎖に 第1の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されており、一方、第2の抗原に特異的に結合する重鎖には、第2の抗原に特異的に結合する追加Fabフラグメントが融合されている）。該追加Fabフラグメントが融合されている重鎖のFabフラグメントと該追加Fabフラグメントは、どちらも同じ修飾を含む。すなわち、この例の場合、第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメントはVHドメインとVLドメインのドメイン交差を含み、第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント内では、CLドメインに正電荷を持つアミノ酸を導入し、かつCH1ドメインに負電荷を持つアミノ酸を導入する特異的変異によって、CH1/CL境界面が修飾されている。コア抗体は、重鎖のヘテロ二量体化を促進する修飾、例えばノブ・イントゥ・ホール変異、異なるCH3ドメインにおける反対電荷のアミノ酸による変異、および/または追加ジスルフィド架橋などを、CH3/CH3境界面に含む。 四価抗DR5-FAP抗体（実施例2）のドメイン配置およびアミノ酸置換。DR5TAA-0077対照抗体は、DR5に特異的に結合するコア抗体の結合アームに、VH/VLドメイン交差を含む。主要副生成物（中央）は、3つのFAP特異的軽鎖を含むので、非機能的結合部位を1つ持つ抗体である。本発明のDR5TAA-0083抗体を右側に示し、CH1/CL境界面におけるアミノ酸置換を明示している。 四価抗DR5-FAP抗体（実施例2）のドメイン配置およびアミノ酸置換。DR5TAA-0081対照抗体は、FAPに特異的に結合する追加Fabフラグメントの結合アームに、VH/VLドメイン交差を含む。主要副生成物（中央）は、3つのFAP特異的軽鎖を含むので、非機能的結合部位を1つ持つ抗体である。本発明のDR5TAA-0082抗体を右側に示し、CH1/CL境界面におけるアミノ酸置換を明示している。 実施例3に従ってBiacore（商標）で評価した四価抗DR5-FAP抗体の非依存的結合に関する例示的センサーグラム。 四価抗DR5-FAP抗体DR5TAA-0057（対照）/DR5TAA-0077（対照）/DR5TAA-0078（対照）の非依存的結合に関するセンサーグラム。 実施例4に従ってBiacore（商標）で評価した四価抗DR5-FAP抗体の同時結合に関する例示的なセンサーグラム。 四価抗DR5-FAP抗体DR5TAA-0057（対照）/DR5TAA-0077（対照）/DR5TAA-0078（対照）/DR5TAA-0081（対照）の同時結合に関するセンサーグラム。 四価抗DR5-FAP抗体DR5TAA-0082、DR5TAA-0083の同時結合のセンサーグラム。
発明の詳細な説明
1.定義
用語「1つの（a）」「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、一般に複数の指示対象を包含する。
本明細書において使用する用語「～または～のどちらか一方」は、同時には実現されえない択一的特徴を指す。したがって、「XまたはYのどちらか一方」と述べた場合、XだけまたはYだけが実現され、「XおよびY」は実現されえないことを意味する。
本明細書において「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、限定されるわけではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および抗体フラグメントなどのさまざまな抗体構造を、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り包含する。
「多重特異性抗体」は、2種類以上の異なるエピトープ（例えば2種類、3種類、4種類またはそれ以上の異なるエピトープ）に結合する。エピトープは同じ抗原上にあっても異なる抗原上にあってもよい。多重特異性抗体の例は2種類のエピトープに結合する「二重特異性抗体」である。
抗体が2種類以上の特異性を有する場合、認識されるエピトープは単一の抗原に関連していても、2種類以上の抗原に関連していてもよい。
本明細書において使用する「価」という用語は、ある抗体分子における指定された数の結合部位の存在を表す。例えば天然抗体は2つの結合部位を有し、二価である。したがって「三価」という用語は、ある抗体分子における3つの結合部位の存在を表す。本発明による抗体は少なくとも三価、すなわち少なくとも3つの抗原結合部位を含む。
「抗体特異性」とは、抗体による、抗原の特定エピトープの選択的認識を指す。例えば天然抗体は単一特異性である。本明細書において使用する「単一特異性抗体」という用語は、それぞれが同じ抗原の同じエピトープに結合する1つまたは複数の結合部位を有する抗体を表す。
エピトープは、抗原のうち、抗体によって結合される領域である。「エピトープ」という用語は、抗体への特異的結合能を有する任意のポリペプチド決定基を包含する。一定の態様においてエピトープ決定基は、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどといった、分子の化学的に活性な表面集団を包含し、一定の態様では、特異的三次元構造特徴、および/または特異的電荷特徴を有しうる。一定の態様において、ある抗体が、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物において、そのターゲット抗原を優先的に認識する場合、その抗体は抗原に特異的に結合するという。
本明細書において使用する「結合」および「特異的結合」という用語は、インビトロアッセイにおける、好ましくは精製野生型抗原を使ったプラズモン共鳴アッセイ（BIAcore、GE-Healthcare、スウェーデン・ウプサラ）における、抗原のエピトープへの抗体の結合を指す。
抗原への抗体の結合のアフィニティーは、ka（抗体/抗原複合体を形成する抗体の会合に関する速度定数）、kD（解離定数）、およびKD（kD/ka）を使って定義される。一態様において、～への結合、または～に特異的に結合するとは、10-8mol/l以下、一態様では10-8M～10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）を意味する。したがって、本発明の多重特異性抗体は、それが特異的である各抗原に、10-8mol/l以下の結合アフィニティー（KD）で、例えば10-8～10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、一態様では10-9～10-13mol/lの結合アフィニティー（KD）で、特異的に結合する。
本明細書において使用する「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖および/または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来すると共に、重鎖および/または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、フレームワークまたはCDRが、親免疫グロブリンの特異性とは異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むように修飾されている抗体を指す。好ましい一態様では、マウスCDRをヒト抗体のフレームワーク領域に移植することで、「ヒト化抗体」が調製される。例えばRiechmann, L., et al., Nature 332（1988）323-327、およびNeuberger, M.S., et al., Nature 314（1985）268-270を参照されたい。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、本発明の特性、とりわけC1q結合および/またはFc受容体（FcR）結合に関わる特性が生じるように、元の抗体の定常領域にさらなる修飾または改変が加えられた定常領域を持つものである。
本明細書において使用する用語「ヒト抗体」には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体が含まれるものとする。ヒト抗体は当分野の技術水準において周知である（van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5（2001）368-374）。ヒト抗体は、免疫化した時に、内在性免疫グロブリン生産を欠いた状態で、ヒト抗体の全レパートリーまたはその一部を生産する能力を有するトランスジェニック動物（例えばマウス）でも生産することができる。そのような生殖系列変異型マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの導入は、抗原チャレンジ時に、ヒト抗原の生産をもたらすであろう（例えばJakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90（1993）2551-2555、Jakobovits, A., et al., Nature 362（1993）255-258、Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7（1993）33-40を参照されたい）。ヒト抗体はファージディスプレイライブラリーでも生産することができる（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227（1992）381-388、Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222（1991）581-597）。ヒトモノクローナル抗体の調製にはColeらの技法およびBoernerらの技法も利用することができる（Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77（1985）、およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147（1991）86-95）。本発明のキメラ抗体およびヒト化抗体について既に述べたように、本明細書において使用する用語「ヒト抗体」も、本発明の特性、とりわけC1q結合および/またはFcR結合に関わる特性が生じるように、例えば「クラススイッチング」、すなわちFc部分の改変または変異（例えばIgG1からIgG4への改変もしくは変異および/またはIgG1/IgG4変異）などによって、定常領域に修飾が加えられた上述の抗体を含む。
本明細書において使用する用語「組換えヒト抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離される全てのヒト抗体、例えばNS0細胞またはCHO細胞などの宿主細胞から単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子に関してトランスジェニックである動物（例えばマウス）から単離された抗体、または宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使って発現された抗体などを包含するものとする。そのような組換えヒト抗体は、再編成された形態の可変領域および定常領域を有する。本発明の組換えヒト抗体は、インビボ体細胞超変異を起こしている。したがって、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のVH配列およびVL配列に由来しそれに関係するものの、インビボでは、ヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然には存在しないかもしれない。
本明細書において使用する用語「結合部位」または「抗原結合部位」は、抗体分子の領域（1つまたは複数）であって、リガンド（例えば抗原またはその抗原フラグメント）が実際に結合し、かつ抗体に由来する領域を表す。抗原結合部位は、抗体重鎖可変ドメイン（VH）および/もしくは抗体軽鎖可変ドメイン（VL）、またはVH/VLのペアを含む。
所望の抗原に特異的に結合する抗原結合部位は、a）その抗原に特異的に結合する公知の抗体に由来するか、またはb）例えば抗原タンパク質もしくは核酸またはそれらのフラグメントなどを用いるデノボ免疫化法によって、またはファージディスプレイによって得られる、新しい抗体または抗体フラグメントに由来しうる。
本発明の抗体の抗原結合部位は、抗原に対する結合部位のアフィニティーにさまざまな程度に寄与する6つの相補性決定領域（CDR）を含有することができる。3つの重鎖可変ドメインCDR（CDRH1、CDRH2およびCDRH3）と、3つの軽鎖可変ドメインCDR（CDRL1、CDRL2およびCDRL3）がある。CDRおよびフレームワーク領域（FR）の範囲は、これらの領域が配列間の可変性に従って画定されている編集されたアミノ酸配列データベースとの比較によって決定される。本発明の範囲には、より少ないCDRで構成される（すなわち結合特異性が3つ、4つまたは5つのCDRによって決定される）機能的抗原結合部位も包含される。例えば、CDR6個の完全なセットに満たなくても、結合には十分な場合がある。
抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、どの脊椎動物種からのものも、それぞれの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる2つの異なるタイプの一方に割り当てることができる。野生型軽鎖は、典型的には、2つの免疫グロブリンドメインを、すなわち通常は、抗原への結合にとって重要な1つの可変ドメイン（VL）と定常ドメイン（CL）とを含有する。
「重鎖」には、抗体のクラスまたはアイソタイプを定義づける異なるタイプがいくつか存在する。野生型重鎖は一連の免疫グロブリンドメインを含有し、通常は、抗原への結合にとって重要な1つの可変ドメイン（VH）と、いくつかの定常ドメイン（CH1、CH2、CH3など）を持つ。
「Fcドメイン」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。例えば天然抗体の場合、Fcドメインは、IgG、IgAおよびIgDアイソタイプでは、抗体の2つの重鎖の第2のおよび第3の定常ドメインに由来する2つの同一タンパク質フラグメントで構成され、IgMおよびIgEのFcドメインは、各ポリペプチド鎖に3つの重鎖定常ドメイン（CHドメイン2～4）を含有する。
「抗体フラグメント」とは、インタクト抗体のうち、そのインタクト抗体が結合する抗原に結合する部分を含む、インタクト抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例として、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2;ダイアボディ;線状抗体（linear antibody）;単鎖抗体分子（例えばscFv、scFab）;および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書にいう「Fabフラグメント」とは、軽鎖のVLドメインおよび定常ドメイン（CL）を含む軽鎖フラグメントと、重鎖のVHドメインおよび第1の定常ドメイン（CH1）とを含む抗体フラグメントを指す。
本明細書において使用する「可変ドメイン」または「可変領域」は、抗原への抗体の結合に直接関与する軽鎖と重鎖のペアのそれぞれを表す。軽鎖の可変ドメインは「VL」と略記され、軽鎖の可変ドメインは「VH」と略記される。ヒト軽鎖およびヒト重鎖の可変ドメインは同じ全体構造を有する。各可変ドメインは4つのフレームワーク（FR）領域を含み、その配列は広く保存されている。FRは3つの「超可変領域」（または「相補性決定領域」、CDR）によって接続されている。各鎖上のCDRは、上述のフレームワークアミノ酸によって分離されている。それゆえに、抗体の軽鎖および重鎖は、N末端からC末端に向かって、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。FRはβシートコンフォメーションをとり、CDRはβシート構造を接続するループを形成しうる。各鎖中のCDRはFRによってそれぞれの三次元構造に保持され、他方の鎖からのCDRと一緒に「抗原結合部位」を形成する。とりわけ重鎖のCDR3は抗原結合に最も寄与する領域である。CDR領域およびFR領域は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）の標準的定義に従って決定される。
本願において使用する用語「定常ドメイン」または「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメイン全体を表す。定常領域は抗原の結合に直接的には関与しないが、さまざまなエフェクター機能を呈する。
抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、クラスIgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMに分類され、これらのうちのいくつかはさらに、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、IgA1およびIgA2などのサブクラスに分類されうる。異なる抗体クラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。5つの抗体クラスの全てに見いだすことができる軽鎖定常領域（CL）はκ（カッパ）およびλ（ラムダ）と呼ばれる。本明細書において使用される「定常ドメイン」は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒト抗体の定常重鎖領域および/または定常軽鎖カッパまたはラムダ領域に由来するヒト型である。そのような定常ドメインおよび領域は当分野の技術水準において周知であり、例えばKabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載されている。
本明細書において使用する用語「完全長抗体」は、2本の抗体重鎖および2本の抗体軽鎖からなる抗体を表す。完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端に向かって、抗体重鎖可変ドメイン（VH）、抗体定常重鎖ドメイン1（CH1）、抗体ヒンジ領域（HR）、抗体重鎖定常ドメイン2（CH2）、および抗体重鎖定常ドメイン3（CH3）（VH-CH1-HR-CH2-CH3と略記される）、ならびに任意で、サブクラスIgEの抗体の場合は、抗体重鎖定常ドメイン4（CH4）からなるポリペプチドである。一態様において、完全長抗体の重鎖は、N末端からC末端に向かって、VH、CH1、HR、CH2およびCH3からなるポリペプチドである。完全長抗体の軽鎖は、N末端からC末端に向かって、抗体軽鎖可変ドメイン（VL）および抗体軽鎖定常ドメイン（CL）（VL-CLと略記される）からなるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（CL）はκ（カッパ）アイソタイプまたはλ（ラムダ）アイソタイプであることができる。抗体鎖は、CLドメインとCH1ドメインの間（すなわち軽鎖と重鎖の間）および完全長抗体重鎖のヒンジ領域間の鎖間ジスルフィド結合を介して、一つに連結される。典型的完全長抗体の例は、IgG（例えばIgG1およびIgG2）、IgM、IgA、IgD、およびIgEのような天然抗体である。
本発明の抗体は、単一の種、例えばヒトに由来するか、またはキメラ抗体もしくはヒト化抗体であることができる。本発明の抗体のコア抗体を形成する完全長抗体は、それぞれがVHとVLのペアによって形成された2つの抗原結合部位を含む。
本発明の抗体のコア抗体を形成する完全長抗体は、同じ抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含むか（第1の局面、図1A～D参照）または異なる抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含むか（第2の局面、図2A～D）の、どちらか一方であることができる。
コア抗体が、同じ抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含む場合、完全長抗体は、2つの同一Fabフラグメントを含む。（a）どちらのFabフラグメントも、（N末端からC末端に向かって）VH-CLドメイン配置の軽鎖とVL-CH1ドメイン配置を含む重鎖とをもたらす、同じ、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含むか（図1Bおよび図1D参照）、または（b）どちらのFabフラグメントもドメイン交差を含まず、したがって（N末端からC末端に向かって）VL-CLドメイン配置の軽鎖とVH-CH1ドメイン配置を含む重鎖とを含むか（図1Aおよび図1C参照）の、どちらか一方でありうる。
コア抗体が、異なる抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含む場合、完全長抗体は2つのFabフラグメントを含み、それらFabフラグメントのうちの厳密に1つが、（N末端からC末端に向かって）VH-CLドメイン配置の軽鎖とVL-CH1ドメイン配置を含む重鎖とをもたらす、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含む（図2A～D参照、抗原2に結合する結合アーム）。好ましい一態様において、他方のFabフラグメントはドメイン交差を含まず、したがって（N末端からC末端に向かって）VL-CLドメイン配置の軽鎖とVH-CH1ドメイン配置を含む重鎖とを含む。完全長抗体の「重鎖または軽鎖のC末端」とは、該重鎖または軽鎖のC末端にある最後のアミノ酸を表す。
本明細書にいうFabフラグメント内での「ドメイン交差」という用語は、抗体の天然ドメインアーキテクチャから逸脱した抗体結合アーム（すなわちFabフラグメント）において、少なくとも1つの重鎖ドメインが、対応するその軽鎖ドメインで置換されており、逆もまた同様であることを意味する。ドメイン交差には、3つの一般型、すなわち（i）VL-CH1構造の交差軽鎖とVH-CL構造を含む交差重鎖とをもたらす、CH1ドメインとCLドメインの交差、（ii）VH-CL構造の交差軽鎖とVL-CH1構造を含む交差重鎖とをもたらす、VHドメインとVLドメインの交差、および（iii）VH-CH1構造の交差軽鎖とVL-CL構造を含む交差重鎖とをもたらす、＜VL-CL＞ポリペプチドと＜VH-CH1＞ポリペプチドの交差（「Fab交差」）がある（前述のドメイン配置はいずれもN末端からC末端に向かって示されている）。
本発明において、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに入れ替わ」るとは、前述のドメイン交差戦略を指す。したがって、CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替わる」場合、それは（i）項で述べたドメイン交差、ならびにその結果生じる重鎖および軽鎖ドメインアーキテクチャを指す。同様に、VHとVLとが「互いに入れ替わる」場合、それは（ii）項で述べたドメイン交差を指し、CH1ドメインとCLドメインとが「互いに入れ替わる」と共に、VH1ドメインとVLドメインとが「互いに入れ替わる」場合、それは（iii）項で述べたドメイン交差を指す。ドメイン交差を含む二重特異性抗体は、例えばWO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191に開示されている。
本発明の抗体は、基本的に、（ii）項で述べたVHドメインとVLドメインの交差を含むFabフラグメントを含む。本発明の大まかな概念によれば、同じ抗原に特異的に結合するFabフラグメントは同じドメイン配置で構成される。したがって、VHドメインとVLドメインの交差を含むFabフラグメントが、本発明の抗体中に2つ以上存在する場合、それらのFabフラグメントは同じ抗原に特異的に結合する。本発明の抗体内で、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含むFabフラグメントとは異なる抗原に特異的に結合するFabフラグメントは、該ドメイン交差と同じドメイン交差を含まない。
本発明の抗体に含まれる「追加Fabフラグメント」とは、完全長抗体の重鎖のN末端またはC末端に（一態様ではペプチドコネクタを介して）融合されている、さらなるFabフラグメントを指す。
本発明の抗体は、完全長抗体の重鎖に融合された追加Fabフラグメントが、第2の抗原に特異的に結合するか（この場合、コア抗体は、同じ抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含む。図1A～D参照）、または重鎖に融合された追加Fabフラグメントが、それが配置された重鎖と同じ抗原に特異的に結合するか（この場合、コア抗体は異なる抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含む。図2A～D参照）の、どちらか一方になるような配置を持つ。
追加Fabフラグメントは、N末端重鎖部分（VHドメイン）またはそれらの軽鎖部分（VLドメイン）を介して、コア抗体の重鎖のC末端に融合されるか、C末端重鎖部分（CH1ドメイン）またはそれらの軽鎖部分（CLドメイン）を介して、コア抗体の重鎖のN末端に融合される。一態様において、追加Fabフラグメントは、コア抗体の重鎖のC末端またはN末端に、重鎖部分を介して融合される。
本発明において使用される用語「ペプチドコネクタ」は、アミノ酸配列を持つ（好ましくは合成起源の）ペプチドを表す。本発明の抗体内では、ペプチドコネクタは、追加Fabフラグメントをコア抗体の重鎖のC末端またはN末端に融合するために使用される。ペプチドコネクタは、一態様では長さが少なくとも5アミノ酸の、別の一態様では長さが5～100アミノ酸の、さらに別の一態様では10～50アミノ酸の、アミノ酸配列を持つペプチドである。一態様において、ペプチドコネクタは
（GxS）nまたは（GxS）nGm
であり、ここで、G＝グリシン、S＝セリン、かつ
x＝3、n＝3、4、5もしくは6、m＝0、1、2もしくは3であるか、または
x＝4、n＝2、3、4もしくは5、m＝0、1、2もしくは3である。
一態様では、x＝4かつn＝2または3であり、別の一態様ではx＝4、n＝2である。一態様において、ペプチドコネクタは（G4S）2である。
本明細書において使用する「三次構造」という用語は、本発明の抗体の幾何学的形状を指す。三次構造は、抗体ドメインを構成するポリペプチド鎖バックボーンを含むと共に、アミノ酸側鎖がいくつかの方法で相互作用し、結合している。
本明細書において使用する「アミノ酸」という用語は、カルボキシル基に対してα位にあるアミノ部分を有する有機分子を表す。アミノ酸の例には、アルギニン、グリシン、オルニチン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、およびプロリンがある。使用されるアミノ酸は、いずれの場合も任意で、L型である。「正荷電」または「負荷電」アミノ酸という用語は、pH7.4におけるアミノ酸側鎖の電荷を指す。アミノ酸は、共通する側鎖の性質に従って、次のようにグループ分けすることができる:
（1）疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
（2）中性親水性: Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
（3）酸性: Asp、Glu;
（4）塩基性: His、Lys、Arg;
（5）鎖の配向に影響を及ぼす残基: Gly、Pro;
（6）芳香族: Trp、Tyr、Phe。
（表）特有の性質を有するアミノ酸
Figure 0007239321000001
本明細書において使用する場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に記載のKabatナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatらに従う」という。具体的には、可変ドメインおよびカッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLについては、Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）のKabatナンバリングシステム（647～660頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatに従う」というが、これとは別に、定常重鎖ドメイン（CH1、ヒンジ、CH2およびCH3）については、Kabat EUインデックスナンバリングシステム（661～723頁参照）が使用され、本明細書ではこれを「ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う」という。
多重特異性抗体のポリペプチド鎖内のアミノ酸置換（または変異）は、抗体DNA中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはヌクレオチド合成によって調製される。しかしそのような修飾は、例えば上述のように、非常に限られた範囲でしか実行することができない。例えば修飾は、IgGアイソタイプおよび抗原結合などの上記抗体特徴を改変しないが、組換え生産の収量、タンパク質安定性をさらに改善するか、精製を容易にしうる。一定の態様では、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。
本発明の抗体は組換え手段によって生産される。抗体の組換え生産法は、当分野の技術水準において広く知られており、原核細胞および真核細胞におけるタンパク質発現と、それに続く抗体の単離、そして通常は薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞中で前述の抗体を発現させるために、各（修飾）軽鎖および重鎖をコードする核酸を標準的方法によって発現ベクター中に挿入する。発現は、CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母細胞、または大腸菌（E. coli）細胞のような適当な原核宿主細胞または真核宿主細胞中で実行され、抗体は細胞（上清または溶解後の細胞）から回収される。抗体を組換え生産するための一般的方法は当分野の技術水準において周知であり、例えばMakrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17（1999）183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8（1996）271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16（2000）151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48（1998）870-880の総説に記載されている。
本明細書において可換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAを包含する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、またはDNAポリメラーゼまたはRNAポリメラーゼによってもしくは合成反応によってポリマー中に組み込まれうる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびそれらの類似体を含みうる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成要素によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、ラベルへのコンジュゲーションなどといった、合成後に施される修飾を含みうる。他のタイプの修飾には、無修飾型のポリヌクレオチドの他に、例えば「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドの1つまたは複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合を持つもの（例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、荷電結合を持つもの（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、例えばタンパク質（例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ-L-リジンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えばアクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレーターを含有するもの（例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化性金属（oxidative metal）など）、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えばアルファアノマー核酸など）がある。さらに、糖中に通常は存在するヒドロキシル基はいずれも、例えばホスホネート基、リン酸基で置き換えるか、標準的な保護基で保護するか、追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製するために活性化するか、固形支持体または半固形支持体にコンジュゲートすることができる。5'および3'末端OHは、リン酸化するか、アミンまたは1～20炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは標準的保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、当技術分野において一般に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似体、例えば2'-O-メチル-、2'-O-アリル-、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体、およびメチルリボシドなどの塩基ヌクレオシド類似体（basic nucleoside analog）も含有することができる。1つまたは複数のホスホジエステル結合を、代替連結基で置き換えてもよい。これらの代替連結基には、リン酸基がP（O）S（「チオエート」）、P（S）S（「ジチオエート」）、（O）NR2（「アミデート」）、P（O）R、P（O）OR'、CO、またはCH2（「ホルムアセタール」）で置き換えられている態様があるが、それらに限定されるわけではなく、ここで、各RまたはR'は独立してHであるか、任意でエーテル（-O-）結合を含有してもよい置換もしくは無置換アルキル（1～20C）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジル（araldyl）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。上記の記載は、RNAおよびDNAを含めて、本明細書において言及するすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
「単離された」核酸とは、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、当該核酸分子を通常含有する細胞に含まれている核酸分子であるものの、染色体外に存在する核酸分子、またはその自然の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置にある核酸分子が含まれる。
本明細書において使用する「ベクター」という用語は、それが連結されたもう1つの核酸を増殖させる能力を有する核酸分子を指す。この用語は、自己複製性核酸構造としてのベクターおよび当該ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを包含する。この用語は、主に細胞へのDNAまたはRNAの挿入（例えば染色体組み込み）のために機能するベクター、主にDNAまたはRNAの複製のために機能するベクターの複製、およびDNAまたはRNAの転写および/または翻訳のために機能する発現ベクターを包含する。記載した機能を2つ以上提供するベクターも包含される。
「発現ベクター」は、それが機能的に連結された核酸の発現を指示する能力を有するベクターである。発現ベクターを適当な宿主細胞中に導入すると、発現ベクターは転写され、ポリペプチドに翻訳されうる。本発明の方法において宿主細胞を形質転換する場合は「発現ベクター」が使用される。したがって、本明細書に記載する宿主細胞の形質転換に関して「ベクター」という用語は、「発現ベクター」を意味する。「発現系」は通常、所望の発現産物を与えるように機能することができる発現ベクターを含む適切な宿主細胞を指す。
本明細書にいう「発現」は、核酸がmRNAに転写されるプロセスおよび/または転写されたmRNA（転写産物ともいう）が次にペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。転写産物およびコードされているポリペプチドを遺伝子産物と総称する。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、真核細胞における発現はmRNAのスプライシングを含みうる。
本明細書において使用する用語「形質転換」は、宿主細胞中にベクター/核酸を導入するプロセスを指す。強力な細胞壁障壁を持たない細胞を宿主細胞として使用するのであれば、トランスフェクションは例えばGraham and Van der Eh, Virology 52（1978）546以降に記載のリン酸カルシウム沈殿法などによって行われる。ただし、核注入による方法やプロトプラスト融合による方法など、DNAを細胞中に導入するための他の方法も使用しうる。原核細胞または強固な細胞壁構造を含む細胞を使用する場合、トランスフェクションの一方法は、例えば、Cohen, F.N, et al., PNAS 69（1972）7110以下参照に記載の塩化カルシウムを使ったカルシウム処理である。
本願において使用する用語「宿主細胞」は、本発明の抗体を作製するために改変することができる任意の種類の細胞系を表す。ただし、本用語はヒト体内のヒト細胞を除外する。
本明細書において使用する表現「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は可換的に使用され、このような名称はいずれも子孫を包含する。したがって「形質転換体」および「形質転換細胞」という単語は、初代対象細胞とそこから派生した培養物を、その継代数にかかわらず包含する。また、全ての子孫は、意図的な突然変異または偶然の突然変異により、そのDNAの内容が正確には同一でないこともありうると理解される。元の形質転換細胞中で選択の対象としたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫は包含される。別個の指定が意図される部分は、その文脈から明らかになるであろう。
NS0細胞における発現は、例えばBarnes, L.M., et al., Cytotechnology 32（2000）109-123、Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73（2001）261-270に記載されている。一過性発現は、例えばDurocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30（2002）E9に記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86（1989）3833-3837、Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89（1992）4285-4289、およびNorderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204（1997）77-87に記載されている。好ましい一過性発現系（HEK293）は、Schlaeger, E.-J.およびChristensen, K.により、Cytotechnology 30（1999）71-83に、そしてSchlaeger, E.-J., J. Immunol. Methods 194（1996）191-199に記載されている。
宿主細胞によって生産された抗体は、重鎖のC末端からの1つまたは複数（特に1つまたは2つ）のアミノ酸の翻訳後切断を起こしうる。それゆえに、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって宿主細胞が生産した抗体は、完全長重鎖を含む場合も、完全長重鎖の切断変異体（本明細書では切断変異体重鎖ともいう）を含む場合もありうる。これは、重鎖の最後の2つのC末端アミノ酸がグリシン（G446）およびリジン（K447）である場合（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）に当てはまりうる。
それゆえに、遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖のアミノ酸配列は、別段の表示がある場合を除き、本明細書では、C末端グリシン-リジンジペプチドなしで表示される。これに対し、そのC末端に融合された追加Fabフラグメントを含む重鎖のアミノ酸配列は、本明細書では、C末端グリシン-リジンジペプチドを含めて表示される。
本発明の一態様において、本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。本発明の一態様において、本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体は、追加のC末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）を含む。
本発明の組成物、例えば本明細書に記載する薬学的組成物は、本発明の抗体の集団を含む。抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体および切断型変異体重鎖を有する抗体を含みうる。一態様において、抗体の集団は、完全長重鎖を有する抗体と切断型変異体重鎖を有する抗体との混合物からなり、抗体のうちの少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％は、切断型変異体重鎖を有する。
本発明の一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物は、C末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が追加された本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体を含む。本発明の一態様において、本発明の抗体の集団を含む組成物は、C末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が追加された本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体を含む。
本発明の一態様において、そのような組成物は、本明細書に規定するCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体; C末端グリシン残基（G446、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が追加された本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体;およびC末端グリシン-リジンジペプチド（G446およびK447、ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）が追加された本明細書に規定する遊離のC末端を持つCH3ドメインを含む重鎖を含む抗体から構成される抗体の集団を含む。
細胞成分または他の夾雑物、例えば他の細胞核酸またはタンパク質を排除するために、アルカリ/SDS処理、CsClバンディング（banding）、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技法を含む標準的技法によって、抗体の精製（宿主細胞培養物から抗体を回収すること）が行われる。Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York（1987）を参照されたい。例えば微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインAアフィニティークロマトグラフィーまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えばカチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、チオフィリック吸着（例えばベータ-メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドによるもの）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えばフェニルセファロース、アザ-アレノフィリック樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸によるもの）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えばNi（II）アフィニティー材料およびCu（II）アフィニティー材料）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）といった、さまざまな方法が確立されており、タンパク質精製に広く使用されている（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75（1998）93-102）。
「薬学的組成物」という用語は、そこに含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にするような形態にあり、その組成物を投与される対象にとって許容できないほどに毒性のある追加の構成要素を含有しない調製物を指す。本発明の薬学的組成物は、当技術分野において公知のさまざまな方法によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および/または様式は、所望する結果に応じてさまざまであるだろう。一定の投与経路によって本発明の抗体を投与するには、抗体を、抗体の不活化を防止する材料でコーティングするか、抗体の不活化を防止する材料と同時投与することが必要になりうる。例えば抗体は、リポソームまたは希釈剤などの適当な担体に入れて、対象に投与することができる。薬学的に許容される希釈剤として食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。
「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物中の、活性成分以外の成分であり、これは対象にとって非毒性である。薬学的に許容される担体には、生理学的に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤などがある。好ましい一態様では、担体は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与、または表皮投与（例えば注射または注入による投与）に適している。
本発明の薬学的組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤などの佐剤も含有しうる。微生物の存在の防止は、上記滅菌手法によっても、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含めることによっても、確実にすることができる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物中に含めることも望ましいだろう。加えて、注射用医薬形態の長時間にわたる吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどといった、吸収を遅延させる薬剤を含めることによってもたらしうる。
本明細書にいう「処置」（および「処置する」または「処置すること」などといったその文法的変形）は、処置される個体の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のために行うこと、または臨床病理の経過中に行うことができる。処置の望ましい効果としては、疾患の発生または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の減縮、転移を防止すること、疾患の進行速度を減少させること、疾患状態の改善または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様では、疾患の発展を遅延させるか、または疾患の進行を遅らせるために、本発明の抗体が使用される。
本明細書において使用する「非経口投与」および「非経口的に投与される」という表現は、通常は注射による、経腸投与および外用以外の投与様式を意味し、例えば静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入を含むが、それらに限定されるわけではない。
選択した投与経路がなんであれ、適切な水和物型で使用しうる本発明の化合物および/または本発明の薬学的組成物は、当業者に公知の従来の方法によって、薬学的に許容される剤形に製剤化される。
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、特定の患者、組成物、および投与様式について、患者に対して有毒であることなく、所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分量が得られるように、変動させることができる。選択される投薬量レベルは、使用した本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定化合物の排泄率、処置の継続時間、使用する特定組成物と併用される他の薬物、化合物および/または材料、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全身健康、および過去の病歴などといった、医療分野において周知のさまざまな薬物動態因子に依存するであろう。
組成物は、滅菌状態になければならず、その組成物を注射器で送達できる程度には流動性でなければならない。担体は、水の他、一態様において、等張性食塩溶液である。
適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散系の場合は要求される粒度を維持することによって、また界面活性剤の使用によって、維持することができる。多くの場合、例えば糖類、マンニトールまたはソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムなどの等張化剤を組成物に含めることが好ましい。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通例含まれていて、適応症、用法、投薬量、投与、併用治療、禁忌および/または当該治療製品の使用上の注意に関する情報が記載されている説明書を指すために使用される。
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種分子、例えば限定するわけではないが細胞傷害性作用物質などにコンジュゲートされた抗体である。
本明細書において使用する「細胞傷害性作用物質」という用語は、細胞の機能を阻害もしく防止し、かつ/または細胞死もしくは細胞破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性作用物質には、放射性同位体（例えばAt211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位体）;化学療法剤または化学療法薬（例えばメトトレキサート、アドリアマイシン（adriamicin）、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他のインターカレーター剤）、成長阻害性作用物質;酵素およびそのフラグメント、例えば核酸分解酵素;抗生物質;毒素、例えば細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素または酵素活性毒素（それらのフラグメントおよび/または変異体を含む）;ならびに後述するさまざまな抗腫瘍性作用物質または抗がん性作用物質があるが、それらに限定されるわけではない。
本明細書において使用する「がん」という用語は、増殖性疾患、例えばリンパ腫、リンパ球性白血病、肺がん、非小細胞肺（NSCL）がん、気管支肺胞上皮（bronchioloalviolar）細胞肺がん、骨がん、膵がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚黒色腫または眼内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん（stomach cancer、gastric cancer）、大腸がん、乳がん、子宮がん、ファロピウス管癌、子宮内膜癌、子宮頸部癌、腟癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓または尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣腫（ependymona）、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫およびユーイング肉腫を指し、上記のがんのいずれかの難治性型、または上記のがんの1種または複数種の組み合わせを含む。
本明細書にいう「ヒトVEGF」は、例えばLeung, D.W., et al., Science 246（1989）1306-9; Keck, P.J., et al., Science 246（1989）1309-12およびConnolly, D.T., et al., J. Biol. Chem. 264（1989）20017-24に記載されている血管内皮成長因子（VEGF/VEGF-A）を指す。VEGFは、正常な血管新生および新血管形成ならびに腫瘍および眼内障害に関連する異常な血管新生および新血管形成の調節に関与する（Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18（1997）4-25; Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91（1993）153-159; Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26（1995）86-91; Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53（1993）4727-4735; Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73（1996）931-934; およびDvorak, H., et al., Am. J. Pathol. 146（1995）1029-1039）。VEGFは、いくつかの供給源から単離されているホモ二量体型糖タンパク質である。VEGFは、内皮細胞に対して高度に特異的なマイトジェン活性を示す。
本明細書にいうヒト「ANG-2」は、Maisonpierre, P.C., et al, Science 277（1997）55-60およびCheung, A.H., et al., Genomics 48（1998）389-91に記載されているヒトアンジオポエチン-2（ANG-2）（ANGPT2またはANG2とも略記される）を指す。アンジオポエチン-1およびアンジオポエチン-2は、血管内皮内に選択的に発現するチロシンキナーゼファミリーTieのリガンドとして発見された（Yancopoulos, G.D., et al., Nature 407（2000）242-48）。現在、アンジオポエチンファミリーには、4種類の決定的メンバーがある。アンジオポエチン-3およびアンジオポエチン-4（Ang-3およびAng-4）は、マウスおよびヒトにおける同じ遺伝子座の広く分岐した対応物に相当しうる（Kim, I., et al., FEBS Let, 443（1999）353-56; Kim, I., et al., J Biol Chem 274（1999）26523-28）。
プログラム細胞死タンパク質1とも呼ばれている用語「PD1」は、1992年に初めて記載された288アミノ酸のI型膜タンパク質である（Ishida et al, EMBO J., 11（1992）, 3887-3895）。PD-1は、T細胞調節因子の拡大CD28/CTLA-4ファミリーのメンバーであり、2種類のリガンド、すなわちPD-L1（B7-H1、CD274）およびPD-L2（B7-DC、CD273）を有する。このタンパク質の構造は、細胞外IgVドメインと、それに続く膜貫通領域および細胞内テールを含む。細胞内テールは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフおよび免疫受容体チロシンベーススイッチモチーフ中に位置する2つのリン酸化部位を含有するが、それは、PD-1がTCRシグナルを負に調節することを示唆している。これは、リガンド結合時の、PD-1の細胞質テールへのSHP-1ホスファターゼおよびSHP-2ホスファターゼの結合と合致する。PD-1はナイーブT細胞には発現しないが、T細胞受容体（TCR）媒介活性化に続いてアップレギュレートされ、活性化T細胞と疲弊T細胞の両方に観察される（Agata et al., Int. Immunology 8（1996）, 765-772）。これらの疲弊T細胞は機能障害表現型を有し、適切に応答することができない。PD-1は比較的広い発現パターンを有するが、その最も重要な役割は、おそらくT細胞上の共抑制受容体としての役割であるだろう（Chinai et al, Trends in Pharmacological Sciences 36（2015）, 587-595）。そこで、現在の治療アプローチは、T細胞応答を強化するために、PD-1とそのリガンドとの相互作用を遮断することに重点が置かれている。用語「プログラム死1」（Programmed Death 1）、「プログラム細胞死1」（Programmed Cell Death 1）、「タンパク質PD-1」、「PD-1」、「PD1」、「PDCD1」、「hPD-1」および「hPD-I」は可換的に使用することができ、ヒトPD-1の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、およびPD-1と共通するエピトープを少なくとも1つは有する類似体を包含する。ヒトPD1のアミノ酸配列はUniProt（www.uniprot.org）アクセッション番号Q15116に示されている。
「T細胞免疫グロブリン・ムチンドメイン含有分子3」の略号である用語「TIM3」は、HAVCR2、KIM-3、TIMD3、およびFLJ14428とも呼ばれており、マクロファージ活性化および炎症状態の重症度を調節するTヘルパー細胞1型特異的細胞表面タンパク質を指す。TIM3はがん、特にがん幹細胞とも関連する。TIM3のヌクレオチド配列およびタンパク質配列は多くの種について公知である。例えばヒトのアミノ酸配列はUniprotアクセッション番号Q8TDQ0に見いだすことができる。このヒトタンパク質は、およそアミノ酸22～202を含むIg様ドメインおよびムチンドメインを含む細胞外ドメイン（O結合型およびN結合型グリコシル化部位も含んでいる）、膜貫通ドメイン（アミノ酸203～223）、および細胞内（細胞質）ドメイン（アミノ酸224～301）を特徴とする。ヒトTIM3タンパク質の場合、細胞外ドメインはおよそアミノ酸22～202を含み、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸203～223を含み、細胞質ドメインはおよそアミノ酸224～301を含む。用語「Tim-3」は、ヒトTim-3の変異体、アイソフォーム、種ホモログ、ならびにTim-3と共通するエピトープを少なくとも1つは有する類似体を包含する。
本明細書において使用する用語「デス受容体5（DR5）」は、別段の表示がある場合を除き、霊長類（例えばヒト）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からの、任意のネイティブDR5を指す。この用語は、プロセシングされていない「完全長」DR5、および細胞におけるプロセシングがもたらす任意の形態のDR5を包含する。この用語は、DR5の天然変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も包含する。
本明細書において使用する用語「線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）」は、別段の表示がある場合を除き、霊長類（例えばヒト）および齧歯類（例えばマウスおよびラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源からの、任意のネイティブFAP20を指す。この用語は、プロセシングされていない「完全長」FAP、および細胞におけるプロセシングがもたらす任意の形態のFAPを包含する。この用語は、FAPの天然変異体、例えばスプライス変異体またはアレル変異体も包含する。好ましくは、本発明の抗FAP抗体はFAPの細胞外ドメインに結合する。
2.本発明の態様の詳細な説明
I.多重特異性抗体
1つの結合アームにドメインの入れ替え/交換が施された多重特異性抗体（CrossMabVH-VL）は、WO2009/080252およびSchaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191（これらの文献は参照により本明細書に組み入れられる）に詳述されている。これらは、第1の抗原に対する軽鎖と第2の抗原に対する間違った重鎖とのミスマッチによって生じる副産物を（そのようなドメイン交換を伴わないアプローチと比較して）明らかに低減する。しかしそれらの調製も副生成物を完全には免れない。主要副生成物はベンス・ジョーンズ型相互作用に基づく（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191、補足資料のFig. S1Iも参照されたい）。WO2015/101588A1は血液脳関門シャトルモジュールとして使用するための抗体に関し、CH1/CL境界面内に変異を含む結合アームの1つにVH/VLドメイン交差が施された二価二重特異性抗体に言及している。
本明細書では、VH/VLドメイン交差二重特異性抗体をさらに改良するためのアプローチであって、例えば、CH1ドメインおよびCLドメイン中の特定のアミノ酸位置に反対電荷による荷電アミノ酸の置換を導入することにより、副生成物のさらなる低減、および凝集挙動を低減することでそのような多重特異性抗体の収量を改善することによるアプローチを開示する。
したがって、本発明は、ある結合特異性を持つFabフラグメント内にVH/VLドメイン交差が施された四価多重特異性抗体に関する。この抗体内で、同じ特異性を持つ一組のFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に、（i）CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ（ii）CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）というアミノ酸置換を含み、一方、異なる結合特異性を持つ他方のFabフラグメントは、該アミノ酸置換を含まない。他方のFaフラグメントのCLドメインにおける特定アミノ酸による追加の置換も、さらに有益であるだろう。
第1の局面において、本発明は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体に関し、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合する前記1つもしくは2つのFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
この第1の局面による多重特異性抗体の模式図を図1A～Dに示す。この局面によれば、コア抗体は、同じ抗原（例えば第1の抗原）に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体である。この局面の一態様において、コア抗体は単一特異性抗体である。この局面の一態様において、コア抗体のFabフラグメントは、VHドメインとVLドメインのドメイン交差を含まない。
第2の局面において、本発明は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体に関し、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
この第2の局面による多重特異性抗体の模式図を図2A～Dに図示する。この局面によれば、コア抗体は、異なる抗原に結合する2つのFabフラグメント（例えば第1の抗原に特異的に結合する第1のFabフラグメント、および第2の抗原に特異的に結合する第2のFabフラグメント）を含む完全長抗体である。図2A～Dに示すとおり、第2の局面の多重特異性抗体内では、1つの追加Fabフラグメントを含む1つの重鎖は、同じ抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを保持している（すなわち、それらFabフラグメントのうちの一方はコア抗体のFabフラグメントであり、他方のFabフラグメントは当該重鎖に融合されている追加Fabフラグメントである）。この第2の局面の一態様において、コア抗体は二重特異性抗体である。
したがって本発明は、コア抗体への2つの追加Fabフラグメントの融合によって四価多重特異性抗体が形成される、多重特異性抗体のための一般的抗体ドメイン配置に基づく。コア抗体は、同じ抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含むか（第1の局面、図1A～D参照）、または異なる抗原結合特異性を持つ2つのFabフラグメントを含むか（第2の局面、図2A～D）の、どちらか一方であることができる、完全長抗体である。上述した両局面による多重特異性抗体は、以下に列挙するさらなる態様と組み合わせて、等しく応用することができる。
VHドメインとVLドメインのドメイン交差は、同じ（例えば第1の）抗原に特異的に結合するFabフラグメント中に存在する。これにより、先行技術から公知のCrossMab技術に従って、該Fabフラグメントの軽鎖ドメイン配置は、もう一つの（異なる、例えば第2の）抗原に特異的に結合するFabフラグメントのドメイン配置とは異なることになる。本発明の概念によれば、本発明の抗体は、VH/VLドメインの入れ替え/交換が施されたFabフラグメント中に追加のCH1/CLドメイン交換を含まない。すなわち、ドメイン交換が施されたFabは、VHドメインとCLドメインとを含むポリペプチド、およびVLドメインとCH1ドメインとを含むもう一つのポリペプチドという、2つのポリペプチドで構成される。加えて、同じ抗原に特異的に結合する一組のFabフラグメント（すなわち、ドメイン交差とは無関係に、例えば先に例示した「第1の」抗原または「第2の」抗原に結合するFabフラグメント、ただし、二組のFabフラグメントのどちらもが同じ置換を含むことはない）は、CH1/CL境界面内にアミノ酸置換を含み、これにより、この独特な重鎖および軽鎖ペアには反対電荷のアミノ酸が導入され、それが、正しい重鎖および軽鎖ペアの二量体化を促進する。本発明の抗体の好ましい一態様において、VH/VLドメイン交差を含まないFabフラグメントは、CH1/CL境界面にii）のアミノ酸置換を含む。
一方のFabフラグメントペアのCH1/CL境界面におけるアミノ酸置換
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、ii）のアミノ酸置換を含む。したがって一態様において、本発明の第1の局面は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体に関し、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
したがって、一態様において、本発明の第2の局面は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント、
を含む四価多重特異性抗体に関し、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が、互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されている。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されている。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されている。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されている（ナンバリングはすべてKabat EUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してKまたはRで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CLドメインでは、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている（ナンバリングはすべてKabatに従う）。
本発明の抗体の好ましい一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。抗体のCLドメイン内でのこの変異は、さらに、（本明細書において開示するとおり、対応するCH1ドメイン中の147番目および213番目における負荷電アミノ酸（すなわちEまたはD）による変異、ならびに任意で、例えば抗体の他方のCLドメインにおける任意の追加アミノ酸置換との組合せで）抗体分子の有利な安全性プロファイルも与えうる。該CLドメインのアミノ酸配列の分析では、見いだされるT細胞エピトープが、本明細書に記載する他の変異と比較して少ない。
本発明の抗体の好ましい一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）。
本発明の抗体の好ましい一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EU indexに従う）、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してKまたはRで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されている。
本発明の抗体の好ましい一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の好ましい一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の好ましい一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
本発明の抗体の好ましい一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されている。
第2のFabフラグメントペアのCH1/CL境界面における追加アミノ酸置換
本発明の抗体の一態様において、ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている。
したがって、本発明の抗体の一態様において、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
iii）ii）で定義したアミノ酸置換を含まない前記1つまたは2つのFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
好ましい一態様において、i）のVH/VLドメイン交差を含まないFabフラグメントは、ii）のアミノ酸置換を含み、i）のVH/VLドメイン交差を含むFabフラグメントは、iii）のアミノ酸置換を含む。
したがって、一態様において、本発明の第1の局面は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体に関し、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
iii）i）のドメイン交差を含むFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
したがって、一態様において、本発明の第2の局面は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つ（一態様では厳密に1つ）のコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つ（一態様では厳密に2つ）の追加Fabフラグメント、
を含む四価多重特異性抗体に関し、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わって（一態様では可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）だけが互いに入れ替わって）おり、
ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
iii）i）のドメイン交差を含むFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
iii）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、
iii）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、
iii）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている。
本発明の抗体の一態様では、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、
iv）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換を含む:
・124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はKで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はRで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はEで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はEで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントでは、CH1ドメインにおいて、147番目のアミノ酸はDで置換され、213番目のアミノ酸はDで置換されており、CLドメインにおいて、123番目のアミノ酸はRで置換され、124番目のアミノ酸はKで置換されており、i）のドメイン交差を含むFabフラグメントでは、CLドメイン中の124番目のアミノ酸がEで置換されている。
本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントは、カッパアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む。本発明の抗体の一態様において、ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントは、ラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む。
本発明の抗体の一態様において、追加Fabフラグメントは、コア抗体の重鎖のC末端に融合されている。
本発明の抗体の一態様において、追加Fabフラグメントはコア抗体の重鎖のN末端に融合されている。
Fc領域のヘテロ二量体化
本発明の一態様において、本発明の抗体は、先行技術において公知のさまざまなアプローチに従って（例えばCH3/CH3境界面内でのノブ・イントゥ・ホール修飾および/または追加システイン架橋の導入によって）ヘテロ二量体化が促進されるように改変された2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含む。
本発明の抗体の一局面において、多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）は、一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させること（ノブ・イントゥ・ホール技術の一般的アプローチに相当する）によって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている。
この局面の好ましい一態様において、元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、R、F、YおよびWから選択される。この局面の好ましい一態様において、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基は、A、S、TおよびVから選択される。この局面の好ましい一態様において、一方のCH3ドメインはT366W変異を含み、他方のCH3ドメインはT366S変異、L368A変異および407V変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一局面において、多重特異性抗体は、一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変された、2つのCH3ドメインを含む。
この局面の好ましい一態様において、正荷電アミノ酸は、K、RおよびHから選択される。この局面の好ましい一態様において、負荷電アミノ酸は、EまたはDから選択される。この局面の好ましい一態様において、一方のCH3ドメインはR409D変異およびK370E変異を含み、他方のCH3ドメインはD399K変異およびE357K変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一局面において、多重特異性抗体は、2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインは、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるように各CH3ドメインに少なくとも1つのシステイン残基を導入することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている。
この局面の好ましい一態様において、一方のCH3ドメインはE356C変異またはS354C変異を含み、他方のCH3ドメインはY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。この局面の好ましい一態様において、一方のCH3ドメインはS354C変異を含み、他方のCH3ドメインはY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
本発明の抗体の一態様において、多重特異性抗体は、ヘテロ二量体化が促進されるように改変された2つのCH3ドメインを含み、ここでは、一方のCH3ドメインがT366W変異を含み、他方のCH3ドメインがT366S変異、L368A変異および407V変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、前述のCH3ドメインのうちのどちらか一方はE356C変異またはS354C変異を含み、前述のCH3ドメインのうちの他方はY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。本発明の抗体の一態様において、多重特異性抗体は、ヘテロ二量体化が促進されるように改変された2つのCH3ドメインを含み、ここでは、一方のCH3ドメインがT366W変異を含み、他方のCH3ドメインがT366S変異、L368A変異および407V変異を含み（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、前述のCH3ドメインのうちのどちらか一方はS354C変異を含み、前述のCH3ドメインのうちの他方はY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）。
ペプチドコネクタ
本発明の抗体の一態様において、b）の前記1つまたは2つの追加Fabフラグメントは、ペプチドコネクタを介して、コア抗体の重鎖に融合される。
本発明の抗体の一態様において、ペプチドコネクタは少なくとも5アミノ酸の長さを有する。本発明の抗体の一態様において、ペプチドコネクタは5～100アミノ酸の長さを有する。本発明の抗体の一態様において、ペプチドコネクタは10～50アミノ酸の長さを有する。
本発明の抗体の一態様において、ペプチドコネクタはグリシン-セリンリンカーである。
本発明の抗体の一態様において、ペプチドコネクタは、
（GxS）nまたは（GxS）nGm
であり、ここで、G＝グリシン、S＝セリン、かつ
x＝3、n＝3、4、5もしくは6、m＝0、1、2もしくは3であるか、または
x＝4、n＝2、3、4もしくは5、m＝0、1、2もしくは3である。
一態様では、x＝4およびn＝2または3であり、別の一態様では、x＝4、n＝2である。一態様において、ペプチドコネクタは（G4S）2である。
抗体アイソタイプ
一態様において、本発明の抗体のコア抗体は完全長IgG抗体である。一態様において、本発明の抗体の定常ドメインは、ヒトIgG1またはIgG4サブクラスである。一態様において、CH3ドメインはヒトIgG1抗体に由来する。一態様において、多重特異性抗体はCH4ドメインを欠く。
抗体変異体
本発明の抗体の一態様において、
・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、VHドメインとVLドメインとが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、該ドメイン交差を含まない他方のFabフラグメントは、CLドメインおよびVLドメインを含む軽鎖と、CH1ドメインおよびVHドメインを含む重鎖とを含む。
本発明の抗体の一態様において、b）の追加Fabフラグメントはコア抗体の重鎖のC末端に融合される。
本発明の一態様において、多重特異性抗体は単離された抗体である。
本発明の抗体の一態様において、抗体は二重特異性、三重特異性または四重特異性である。本発明の抗体の一態様において、抗体は二重特異性である。
一定の態様では、ここに提供される抗体のアミノ酸配列変異体が考えられる。例えば、抗体の結合アフィニティーおよび/または他の生物学的性質を改善することが望ましい場合があるだろう。抗体のアミノ酸配列変異体は、その抗体をコードするヌクレオチド配列に適当な修飾を導入することによって調製するか、またはペプチド合成によって調製することができる。そのような修飾としては、例えば抗体のアミノ酸配列からの残基の欠失、および/または抗体のアミノ酸配列への残基の挿入、および/または抗体のアミノ酸配列内での残基の置換が挙げられる。最終コンストラクトが所望の特徴を有する限り、最終コンストラクトに到達するために、欠失、挿入、および置換をどのように組み合わせてもよい。
a）グリコシル化変異体
一定の態様において、ここに提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加または減少させるために改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、1つまたは複数のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、都合よく達成することができる。
抗体がFc領域を含む場合は、そこに付着する糖質を改変することができる。哺乳動物細胞によって生産されるネイティブ抗体は、典型的には、分岐したバイアンテナ型オリゴ糖を含み、それは一般的には、Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN結合によって付着する。例えばWright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15（1997）26-32を参照されたい。オリゴ糖は、さまざまな糖質、例えばマンノース、N-アセチルグルコサミン（GlcNAc）、ガラクトース、およびシアル酸、ならびにバイアンテナ型オリゴ糖構造の「ステム」中のGlcNAcに付着したフコースを含みうる。いくつかの態様では、一定の改善された性質を持つ抗体変異体を作出するために、本発明の抗体中のオリゴ糖に修飾を加えうる。
一態様では、Fc領域に（直接的または間接的に）付着したフコースを欠く糖質構造を有する抗体変異体が提供される。例えばそのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％でありうる。フコースの量は、例えばWO 2008/077546に記載されているようにMALDI-TOF質量分析によって測定されるAsn297における糖鎖内のフコースの平均量を、Asn297に付着しているすべての糖構造（例えば複合型、混成型および高マンノース型構造）の和と比較して算出することにより、決定される。Asn297とは、Fc領域の297番目（Fc領域残基のEUナンバリング）付近に位置するアスパラギン酸残基を指すが、抗体における軽微な配列変動ゆえに、Asn297は、297番目の上流側または下流側±3アミノ酸付近、すなわち294番目と300番目の間に位置する場合もありうる。そのようなフコシル化変異体は改善されたADCC機能を有しうる。例えばUS 2003/0157108、US 2004/0093621を参照されたい。「脱フコシル化」抗体変異体または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例として、US 2003/0157108、WO 2000/61739、WO 2001/29246、US 2003/0115614、US 2002/0164328、US 2004/0093621、US 2004/0132140、US 2004/0110704、US 2004/0110282、US 2004/0109865、WO 2003/085119、WO 2003/084570、WO 2005/035586、WO 2005/035778、WO 2005/053742、WO 2002/031140、Okazaki, A. et al, J. Mol. Biol. 336（2004）1239-1249、Yamane-Ohnuki, N. et al, Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622が挙げられる。脱フコシル化抗体を生産する能力を有する細胞株の例として、タンパク質フコシル化が欠損しているLec13 CHO細胞（Ripka, J. et al., Arch. Biochem. Biophys. 249（1986）533-545、US 2003/0157108、およびWO 2004/056312、特に実施例11）、およびアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞などのノックアウト細胞株（例えばYamane-Ohnuki, N. et al., Biotech. Bioeng. 87（2004）614-622、Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng. 94（2006）680-688、およびWO 2003/085107を参照されたい）が挙げられる。
例えば抗体のFc領域に付着したバイアンテナ型オリゴ糖がGlcNAcによってバイセクト化（bisect）されているバイセクト化（bisected）オリゴ糖を持つ抗体変異体が、さらに提供される。そのような抗体変異体は、低減したフコシル化および/または改善されたADCC機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えばWO 2003/011878、米国特許第6,602,684号、およびUS 2005/0123546に記載されている。Fc領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は改善されたCDC機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えばWO 1997/30087、WO 1998/58964、およびWO 1999/22764に記載されている。
b）Fc領域変異体
一定の態様では、ここに提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入することにより、Fc領域変異体を生成させることができる。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば置換）を含むヒトFc領域配列（例えばヒトIgG1、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域）を含みうる。
一定の態様において、本発明では、エフェクター機能の全部ではなく一部を保有する抗体変異体が考えられ、その抗体変異体は、これにより、インビボでの抗体の半減期が重要であるものの、一定のエフェクター機能（例えば補体およびADCC）は不必要または有害であるような応用にとって望ましい候補になる。CDCおよび/またはADCC活性の低減/枯渇を確認するために、インビトロおよび/またはインビボ細胞傷害性アッセイを行うことができる。例えば、抗体がFcγR結合を欠く（それゆえにおそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能は保持していることを保証するために、Fc受容体（FcR）結合アッセイを行うことができる。ADCCを媒介するための主要細胞であるNK細胞がFcγRIIIだけを発現するのに対し、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9（1991）457-492の464頁の表3に要約されている。関心対象の分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えばHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83（1986）7059-7063、およびHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82（1985）1499-1502を参照されたい）、米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166（1987）1351-1361参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を使用してもよい（例えばフローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー）およびCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マディソン）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（PBMC）およびナチュラルキラー（NK）細胞が挙げられる。これに代えて、またはこれに加えて、関心対象の分子のADCC活性は、インビボで、例えばClynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95（1998）652-656に開示されているような動物モデルにおいて、評価することもできる。抗体がC1qに結合することができず、したがってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合アッセイを行うこともできる。例えばWO 2006/029879およびWO 2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照されたい。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行うことができる（例えばGazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202（1996）163-171、Cragg, M.S. et al., Blood 101（2003）1045-1052、およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103（2004）2738-2743を参照されたい）。FcRn結合およびインビボクリアランス/半減期決定も、当技術分野において公知の方法を使って行うことができる（例えばPetkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18（2006）: 1759-1769を参照されたい）。
エフェクター機能が低減している抗体として、Fc領域残基238、265、269、270、297、327および329の1つまたは複数の置換を持つものが挙げられる（米国特許第6,737,056号）。そのようなFc突然変異体として、265、269、270、297および327番目のアミノ酸のうちの2つ以上に置換を持つFc突然変異体（残基265および297がアラニンに置換されているいわゆる「DANA」Fc突然変異体（米国特許第7,332,581号）を含む）が挙げられる。
FcRへの結合が改善または減縮されている一定の抗体変異体が記載されている（例えば米国特許第6,737,056号、WO 2004/056312、およびShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276（2001）6591-6604を参照されたい）。
一定の態様では、抗体変異体が、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換、例えばFc領域の298、333および/または334番目（残基のEUナンバリング）に置換を持つFc領域を含む。
いくつかの態様では、例えば米国特許第6,194,551号、WO 99/51642、およびIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164（2000）4178-4184に記載されているように、C1q結合および/または補体依存性細胞傷害（CDC）の改変（すなわち改善または減縮）をもたらす改変が、Fc領域に加えられる。
半減期が増加していて、胎児への母体免疫グロブリンの移行の原因となる新生児型Fc受容体（FcRn）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117（1976）587-593、およびKim, J.K. et al., J. Immunol. 24（1994）2429-2434）への結合が改善されている抗体が、US 2005/0014934に記載されている。これらの抗体は、FcRnへのFc領域の結合を改善する1つまたは複数の置換をFc領域中に持つFc領域を含む。そのようなFc変異体として、Fc領域残基:238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424または434のうちの1つまたは複数に置換を持つもの、例えばFc領域残基434の置換を持つものが挙げられる（米国特許第7,371,826号）。
Fc領域変異体の他の例については、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322（1988）738-740、US 5,648,260、US 5,624,821、およびWO 94/29351も参照されたい。
c）抗体誘導体
一定の態様において、ここに提供される抗体は、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、さらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（PEG）、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのどちらか一方）、およびデキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレン（propropylene）グリコールホモポリマー、ポリプロピレン（prolypropylene）オキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、およびそれらの混合物が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造上の利点を有しうる。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐型であっても非分岐型であってもよい。抗体に取り付けられるポリマーの数はさまざまであってよく、2つ以上のポリマーが取り付けられる場合、それらは同じ分子または異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数および/またはタイプは、例えば限定するわけではないが、改善しようとする抗体の特定の性質または機能、その抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうかなどといった、考慮事項に基づいて決定することができる。
もう一つの態様では、抗体と、放射線へのばく露によって選択的に加熱することができる非タンパク質部分とのコンジュゲートが提供される。一態様では、非タンパク質部分がカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102（2005）11600-11605）。放射線は任意の波長であってよく、例えば限定するわけではないが、通常の細胞は傷つけないが、非タンパク質部分を、抗体-非タンパク質部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が挙げられる。
イムノコンジュゲート
本発明の一態様では、本発明の多重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートが提供される。一態様において、そのようなイムノコンジュゲートは、細胞傷害性作用物質にカップリングされた多重特異性抗体を含む。
II.組換え法
抗体は、例えば米国特許第4,816,567号に記載されている組換え法および組成物を使って生産することができる。
一態様では、本発明の多重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および/またはVHを含むアミノ酸配列（例えば抗体の軽鎖および/または重鎖）をコードしうる。
さらにもう一つの態様では、そのような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
さらにもう一つの態様では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。さらにもう一つの態様では、そのようなベクター（例えばそのような発現ベクター）を含む宿主細胞が提供される。
そのような態様の一つにおいて、宿主細胞は、多重特異性抗体のコア抗体の軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、追加Fabフラグメントが融合された、多重特異性抗体のコア抗体の重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、任意で、追加Fabフラグメントが融合されていない多重特異性抗体のコア抗体の重鎖のアミノ酸配列を含む第3のベクター（多重特異性抗体が三価抗体である場合）、前記1つまたは2つの追加Fabフラグメントの軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第4のベクターを含む（例えばそれらのベクターで形質転換されている）。
そのような態様の一つにおいて、宿主細胞は、多重特異性抗体のコア抗体の第1の軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター、多重特異性抗体のコア抗体の第2の軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第2のベクター、多重特異性抗体のコア抗体の第1の重鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第3のベクター、および多重特異性抗体のコア抗体の第1の軽鎖のアミノ酸配列をコードする核酸を含む第4のベクターを含む（例えばそれらのベクターで形質転換されている）。
一態様において、宿主細胞は真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞またはリンパ系細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞）である。
一態様では、上述の宿主細胞を抗体が生産されるように培養する工程を含む、本発明の多重特異性抗体を生産する方法が提供される。
一態様では、上掲の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養する工程、および任意で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗体を回収する工程を含む、本発明の多重特異性抗体を作る方法が提供される。
本発明の抗体を組換え生産するために、抗体をコードする核酸、例えば上述のものを単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび/または発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手法を使って（例えば抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定しうる。
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に適した宿主細胞として、本明細書に記載する原核細胞または真核細胞が挙げられる。例えば抗体は、グリコシル化とFcエフェクター機能とが必要でない場合は特に、細菌中で生産しうる。細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現については、例えばUS 5,648,237、US 5,789,199、およびUS 5,840,523を参照されたい（大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2003）, pp.245-254も参照されたい）。発現後は、抗体を細菌細胞ペーストから可溶性画分に単離して、さらに精製することができる。
原核生物だけでなく、糸状菌や酵母などの真核微生物も、グリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的または完全にヒトのグリコシル化パターンを持つ抗体の生産をもたらす真菌株および酵母株を含めて、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22（2004）1409-1414、およびLi, H. et al., Nat. Biotech. 24（2006）210-215を参照されたい。
グリコシル化された抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物および脊椎動物）からも得られる。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞および昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用しうる（特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用しうる）バキュロウイルス株は、数多く同定されている。
植物細胞培養を宿主として利用することもできる。例えば米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号、および同第6,417,429号（トランスジェニック植物中で抗体を生産するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。
脊椎動物細胞も宿主として使用することができる。例えば、懸濁培養に適応した哺乳動物細胞株は役立ちうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株（COS-7）、ヒト胎児腎臓株（Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36（1977）59-74に記載の293または293細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（BHK）、マウスセルトリ細胞（Mather, J.P., Biol. Reprod. 23（1980）243-252に記載のTM4細胞）、サル腎臓細胞（CV1）、アフリカミドリザル腎臓細胞（VERO-76）、ヒト子宮頸癌細胞（HELA）、イヌ腎臓細胞（MDCK）、バッファローラット肝臓細胞（BRL3A）、ヒト肺細胞（W138）、ヒト肝臓細胞（Hep G2）、マウス乳房腫瘍（MMT060562）、例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383（1982）44-68に記載のTRI細胞、MRC5細胞、およびFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、DHFR- CHO細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77（1980）4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、ならびにY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生産に適した一定の哺乳動物宿主細胞株を概観するには、例えばYazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C.編, Humana Press,ニュージャージー州トトワ（2004）pp.255-268を参照されたい。
本発明の抗体は、改善された副生成物プロファイルおよび/または上昇した凝集温度を呈する。本発明の別の一局面は、多重特異性抗体の調製中の副生成物形成を低減しかつ/または多重特異性抗体の凝集温度を上昇させるための方法である。一態様において、該方法は、以下の工程を含む:
・四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程であって、該四価多重特異性抗体は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含み、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
前記工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
別の一態様において、該方法は、以下の工程を含む:
・四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程であって、該四価多重特異性抗体は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含み、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）多重特異性抗体の副生成物の形成を低減するために、
・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換を含む:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
前記工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
好ましい一態様において、本発明の多重特異性抗体の調製中の副生成物形成を低減しかつ/または本発明の多重特異性抗体の凝集温度を上昇させるための方法は、本明細書に開示する発明の四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程を含む。
III.薬学的組成物
一態様では、本発明の多重特異性抗体を含む組成物が提供される。一態様では、本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物または診断組成物が提供される。
一態様では、少なくとも1つの薬学的に許容される担体と組み合わされた本発明の多重特異性抗体を含む薬学的組成物が提供される。
本発明の抗体の薬学的組成物は、所望の純度を有するそのような抗体を、1つまたは複数の随意の薬学的に許容される担体（Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980））と混合することにより、凍結乾燥組成物または水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度において受容者にとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;保存剤（例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール）;低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;単糖、二糖、および他の糖質、例えばグルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えばEDTA;糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;および/または非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（PEG）などがあるが、それらに限定されるわけではない。例示的な、本明細書における薬学的に許容される担体として、さらに、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばrhuPH20（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が挙げられる。rhuPH20を含む一定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号および同第2006/0104968号に記載されている。一局面では、sHASEGPが、1つまたは複数の追加グリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
例示的な凍結乾燥抗体組成物は米国特許第6,267,958号に記載されている。水性抗体組成物としては米国特許第6,171,586号およびWO 2006/044908に記載されているものが挙げられ、後者の組成物はヒスチジン-酢酸緩衝液を含む。
本明細書における組成物は、処置される特定適応症の必要に応じて、2つ以上の活性成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含有しうる。そのような活性成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わせされて存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）に封入するか、またはマクロエマルションに封入することができる。そのような技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版, Osol, A.編（1980）に開示されている。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態にあるものが挙げられる。
インビボ投与に使用される組成物は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過などによって容易に達成しうる。
IV.治療方法および治療組成物
ここに提供される多重特異性抗体はいずれも、治療方法において使用することができる。
一局面では、医薬として使用するための、本発明の多重特異性抗体が提供される。さらなる局面では、がんの処置において使用するための本発明の多重特異性抗体が提供される。一定の態様では、処置方法において使用するための本発明の多重特異性抗体が提供される。一定の態様において、本発明は、有効量の本発明の多重特異性抗体を個体に投与する工程を含む、がんを有する個体の処置方法において使用するための、本発明の多重特異性抗体を提供する。そのような態様の一つにおいて、本方法はさらに、前記個体に有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与する工程を含む。
上記の態様のいずれにおいても、「個体」は、好ましくはヒトである。
さらにもう一つの局面において、本発明は、医薬の製造または調製における本発明の多重特異性抗体の使用を提供する。一態様において、医薬はがんを処置するための医薬である。さらにもう一つの態様において、医薬は、がんを有する個体に有効量の医薬を投与する工程を含むがんの処置方法において使用するための医薬である。そのような態様の一つにおいて、本方法はさらに、前記個体に、有効量の少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものを投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
さらなる一局面において、本発明は、がんを処置するための方法を提供する。一態様において、本方法は、がんを有する個体に有効量の本発明の多重特異性抗体を投与する工程を含む。そのような態様の一つにおいて、本方法はさらに、有効量の、後述する少なくとも1つの追加治療剤を、前記個体に投与する工程を含む。上記の態様のいずれにおいても「個体」はヒトでありうる。
さらにもう一つの局面において、本発明は、例えば上記の治療方法のいずれかにおいて使用するための、ここに提供される本発明の多重特異性抗体のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一態様において、薬学的組成物は、ここに提供される本発明の多重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。もう一つの態様において、薬学的組成物は、ここに提供される多重特異性抗体のいずれかと、少なくとも1つの追加治療剤、例えば後述するものとを含む。
本発明の抗体は、単独で、または他の作用物質と組み合わせて、治療に使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1つの追加治療剤と同時投与しうる。
上記の併用治療には、併用投与（この場合は2つ以上の治療剤が同じ組成物または別個の組成物に含まれている）、および個別投与（この場合、本発明の抗体の投与は、追加治療剤および/またはアジュバントの投与の前に、同時に、および/または後に、行うことができる）が包含される。本発明の抗体は放射線治療と併用することもできる。
本発明の抗体（および任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与、そして所望であれば局所処置のために、病巣内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与が挙げられる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の適切な経路で、例えば静脈内注射または皮下注射などの注射によって、行うことができる。限定するわけではないが、単回投与、またはさまざまな時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入を含む、さまざまな投薬スケジュールが、本明細書では考えられる。
本発明の抗体は、優良医療規範（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、調合され、投与されるであろう。この文脈において考慮すべき因子には、処置される特定障害、処置される特定哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング、および医療従事者に公知の他の因子が含まれる。抗体は、問題の障害を防止または処置するために現在使用されている1つまたは複数の作用物質と共に製剤化する必要はないが、任意でそのようにしてもよい。そのような他の作用物質の有効量は、組成物中に存在する抗体の量、障害または処置のタイプ、および上で述べた他の因子に依存する。これらは、一般に、本明細書における記載と同じ投薬量および投与経路で使用されるか、本明細書に記載する投薬量の約1～99％で、または実験的/臨床的に適当であると決定された任意の投薬量および任意の経路で使用される。
疾患の防止または処置に関して、本発明の抗体の適当な投薬量（単独で使用する場合、または1つもしくは複数の他の追加治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体を防止のために投与するか治療のために投与するか、治療歴、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の裁量に依存するであろう。抗体は、適宜、患者に1回で、または一連の処置で投与される。疾患のタイプおよび重症度に依存して、約1μg/kg～15mg/kg（例えば0.5mg/kg～10mg/kg）の抗体を、例えば1回または複数回の独立した投与によるかまたは持続注入によるかを問わず、患者に投与するための初回候補投薬量とすることができる。典型的な1日量は、上述の因子に依存して約1μg/kgから100mg/kgまで、またはそれ以上に及ぶだろう。数日またはそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、維持されるであろう。抗体の例示的投薬量の一つは約0.05mg/kg～約10mg/kgの範囲にあるだろう。したがって約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kgまたは10mg/kg（またはそれらの任意の組合せ）の1つまたは複数の用量を患者に投与することができる。そのような用量は（例えば患者が抗体の投与を約2回～約20回、例えば約6回受けることになるように）間欠的に、例えば毎週または3週ごとに投与することができる。高用量の初回負荷量を投与した後、それより低い用量を1回または複数回投与することができる。ただし他の投薬レジメンも役立ちうる。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易に監視される。
上記の組成物または治療方法はいずれも、本発明の多重特異性抗体の代わりに、または本発明の多重特異性抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを使って行いうると理解される。
V.製造品
本発明のもう一つの局面では、上述の障害の処置、防止および/または診断に有用な材料を含んでいる製造品が提供される。製造品は、容器、および容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含む。適切な容器として、例えば瓶、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど、さまざまな素材で形成されうる。容器は、組成物を単独で、または当該状態を処置、防止および/または診断するのに有効なもう一つの組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば容器は、静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであることができる）。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は本発明の抗体である。ラベルまたは添付文書は、当該組成物が、選択された状態を処置するために使用されることを示す。さらにまた、本製造品は、（a）本発明の抗体を含む組成物が入っている第1の容器と、（b）さらにもう一つの細胞傷害性作用物質または他の治療剤を含む組成物が入っている第2の容器とを含みうる。本発明のこの態様の製造品は、さらに、特定の状態を処置するために当該組成物を使用できることを示す添付文書を含みうる。これに代えて、またはこれに加えて、本製造品はさらに、薬学的に許容される緩衝液、例えば静菌性注射用水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第2の（または第3の）容器を含みうる。これは、商業的観点および使用者の観点から望ましい他の材料、例えば他の緩衝液、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジなどを、さらに含みうる。
上記の製造品はいずれも、本発明の多重特異性抗体の代わりに、または本発明の多重特異性抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含みうると理解される。
3.本発明の具体的態様
以下に、本発明の具体的態様を列挙する。
1. a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体であって、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸がK、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体。
2. a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む四価多重特異性抗体であって、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸が、K、RまたはHで置換され（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸が、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものである、
四価多重特異性抗体。
3.コア抗体が単一特異性抗体である、態様1の抗体。
4.コア抗体が二重特異性抗体である、態様1または2の抗体。
5. i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントが、ii）のアミノ酸置換を含む、態様1～4のいずれか1つの抗体。
6. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
態様1～5のいずれか1つの抗体。
7. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、
態様1～6のいずれか1つの抗体。
8. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
態様1～7のいずれか1つの抗体。
9. ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントが、CLドメイン中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されているものである、態様1～8のいずれか1つの抗体。
10. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントがカッパアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む、態様1～9のいずれか1つの抗体。
11. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントがラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む、態様1～9のいずれか1つの抗体。
12. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
ii）のアミノ酸置換を含む前記1つまたは2つのFabフラグメントは、カッパアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む、態様1～10のいずれか1つの抗体。
13. b）の追加Fabフラグメントがコア抗体の重鎖のC末端に融合されている、態様1～12のいずれか1つの抗体。
14.・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のいずれか一方は、VHドメインとVLドメインとが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、該ドメイン交差を含まない他方のFabフラグメントは、CLドメインおよびVLドメインを含む軽鎖とCH1ドメインおよびVHドメインを含む重鎖とを含む、態様1～13のいずれか1つの抗体。
15.二重特異性、三重特異性、または四重特異性である、態様1～14のいずれか1つの抗体。
16.二重特異性である、態様1～15のいずれか1つの抗体。
17. b）の追加Fabフラグメントがペプチドコネクタを介してコア抗体の重鎖に融合されている、態様1～16のいずれか1つの抗体。
18.ペプチドコネクタが少なくとも5アミノ酸の長さを有する、態様17の抗体。
19.ペプチドコネクタが、グリシン残基およびセリン残基の連続的配置からなるペプチドである、態様17または18の抗体。
20.多重特異性抗体が2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）が、一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させることによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、態様1～19のいずれか1つの抗体。
21.元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基がR、F、YおよびWから選択される、態様20の抗体。
22.元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基がA、S、TおよびVから選択される、態様20または21の抗体。
23.元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基がR、F、YおよびWから選択され、元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基がA、S、TおよびVから選択される、態様20～22のいずれか1つの抗体。
24.一方のCH3ドメインがT366W変異を含み、他方のCH3ドメインがT366S変異、L368A変異および407V変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様20～23のいずれか1つの抗体。
25.多重特異性抗体が2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインが、一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、態様1～19のいずれか1つの抗体。
26.正荷電アミノ酸がK、RおよびHから選択される、態様25の抗体。
27.負荷電アミノ酸がEまたはDから選択される、態様25または26の抗体。
28.正荷電アミノ酸がK、RおよびHから選択され、負荷電アミノ酸がEまたはDから選択される、態様25～27のいずれか1つの抗体。
29.一方のCH3ドメインがR409D変異およびK370E変異を含み、他方のCH3ドメインがD399K変異およびE357K変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様25～27のいずれか1つの抗体。
30.多重特異性抗体が2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインが、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるように各CH3ドメインに少なくとも1つのシステイン残基を導入することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、態様1～29のいずれか1つの抗体。
31.一方のCH3ドメインがE356C変異またはS354C変異を含み、他方のCH3ドメインがY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様30の抗体。
32.一方のCH3ドメインがS354C変異を含み、他方のCH3ドメインがY349C変異を含む（ナンバリングはKabatのEUインデックスに従う）、態様30または31の抗体。
33.態様1～32のいずれか1つの抗体をコードする単離された核酸。
34.態様33の核酸を含む発現ベクター。
35.態様33の核酸を含む宿主細胞。
36.態様34の発現ベクターを含む宿主細胞。
37.態様1～32のいずれか1つの抗体を含む組成物。
38.態様1～32のいずれか1つの抗体を含む薬学的組成物または診断組成物。
39.少なくとも1つの薬学的に許容される担体と組み合わされた態様1～32のいずれか1つの抗体を含む薬学的組成物。
40.態様1～32のいずれか1つの抗体を含むイムノコンジュゲート。
41.細胞傷害性作用物質にカップリングされた抗体を含む、態様40のイムノコンジュゲート。
42.医薬として使用するための、態様1～32のいずれか1つの抗体。
43.がんの処置において使用するための、態様1～32のいずれか1つの抗体。
44.医薬として使用するための態様40または41のイムノコンジュゲート。
45.がんの処置において使用するための、態様40または41のイムノコンジュゲート。
46.疾患を患っている患者の処置方法であって、そのような処置を必要としている患者に態様1～32のいずれか1つの多重特異性抗体を投与することによる方法。
47.疾患ががんである、態様46の方法。
48.疾患を患っている患者の処置方法であって、そのような処置を必要としている患者に態様40または41のイムノコンジュゲートを投与することによる方法。
49.疾患ががんである、態様48の方法。
50.態様35または36の宿主細胞を、多重特異性抗体が生産されるように培養する工程を含む、多重特異性抗体を生産する方法。
51.態様1～32のいずれか1つの抗体をコードする核酸を含む発現ベクターを含む宿主細胞を、多重特異性抗体が生産されるように培養する工程を含む、多重特異性抗体を生産する方法。
52.態様1～32のいずれか1つの抗体を調製するための方法であって、以下の工程を含む方法:
・前記抗体をコードする核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
・該宿主細胞を該抗体の合成が可能な条件下で培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該抗体を回収する工程。
53.a）ヒトDR5に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトFAPに特異的に結合し、
i）ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
54.ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様53の抗体。
55.a）ヒトDR5に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトFAPに特異的に結合し、
i）ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸はEまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
56.ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様55の抗体。
57.a）ヒトFAPに特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトDR5に特異的に結合し、
i）ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
58.ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様57の抗体。
59.a）ヒトFAPに特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトDR5に特異的に結合し、
i）ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトFAPに特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
60.ヒトDR5に特異的に結合するFabフラグメントがCLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様59の抗体。
61. a）抗体が、SEQ ID NO:33の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH DR5＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL DR5＞）を含み、かつ
b）抗体が、SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH FAP＞）およびSEQ ID NO:36の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL FAP＞）を含む、
ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する、態様53～60のいずれか1つの二重特異性抗体。
62. c）抗体が、SEQ ID NO:33の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH DR5＞）およびSEQ ID NO:34の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL DR5＞）を含み、かつ
d）抗体が、SEQ ID NO:35の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH FAP＞）およびSEQ ID NO:36の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL FAP＞）を含む、
ヒトDR5およびヒトFAPに特異的に結合する、態様54の二重特異性抗体。
63. a）ヒトPD1に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトTIM3に特異的に結合し、
i）ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
64.ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様63の抗体。
65. a）ヒトPD1に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトTIM3に特異的に結合し、
i）ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
66.ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様65の抗体。
67. a）ヒトTIM3に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトPD1に特異的に結合し、
i）ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
68.ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様67の抗体。
69. a）ヒトTIM3に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含む、ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する四価二重特異性抗体であって、前記追加FabフラグメントはヒトPD1に特異的に結合し、
i）ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントは、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）ヒトTIM3に特異的に結合するFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、K、RまたはH（好ましくはKまたはR）で置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）
を含む、
前記四価二重特異性抗体。
70.ヒトPD1に特異的に結合するFabフラグメントが、CLドメイン中に以下のアミノ酸置換:
・124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される
を含む、態様69の抗体。
71.a）抗体が、SEQ ID NO:46の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH PD1＞）およびSEQ ID NO:47の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL PD1＞）を含み、かつ
b）抗体が、SEQ ID NO:48の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TIM3＞）およびSEQ ID NO:49の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TIM3＞）を含む、
ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する、態様63～70のいずれか1つの二重特異性抗体。
72. a）抗体が、SEQ ID NO:46の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH PD1＞）およびSEQ ID NO:47の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL PD1＞）を含み、かつ
b）抗体が、SEQ ID NO:50の可変重鎖ドメイン（VH）（＜VH TIM3＞）およびSEQ ID NO:51の可変軽鎖ドメイン（VL）（＜VL TIM3＞）を含む、
ヒトPD1およびヒトTIM3に特異的に結合する、態様63～70のいずれか1つの二重特異性抗体。
73.多重特異性抗体（好ましい一態様では前記態様のいずれか1つの多重特異性抗体）の調製中の副生成物形成を低減しかつ/または多重特異性抗体（好ましい一態様では前記態様のいずれか1つの多重特異性抗体）の凝集温度を上昇させるための方法であって、以下の工程を含む方法:
・四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで、宿主細胞を形質転換する工程であって、該四価多重特異性抗体は、
a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含み、前記追加Fabフラグメントは第2の抗原に特異的に結合し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸は、K、RまたはHで置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む、
前記工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
74.多重特異性抗体（好ましい一態様では前記態様のいずれか1つの多重特異性抗体）の調製中の副生成物形成を低減しかつ/または多重特異性抗体（好ましい一態様では前記態様のいずれか1つの多重特異性抗体）の凝集温度を上昇させるための方法であって、以下の工程を含む方法:
・四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程であって、該四価多重特異性抗体は、
a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
を含み、重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わるように、ドメイン交差を含み、
ii）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
のどちらか一方は、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中に以下のアミノ酸置換:
・CLドメイン中の124番目のアミノ酸は、K、RまたはHで置換される（ナンバリングはKabatに従う）、および
・CH1ドメイン中の147番目または213番目のアミノ酸は、EまたはDで置換される（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）を含む、
前記工程、
・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
75.多重特異性抗体のii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、態様73または74の方法。
76.多重特異性抗体のii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸は、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、CLドメイン中の123番目および124番目のアミノ酸は、互いに独立してK、RまたはHで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、ii）のアミノ酸置換を含まないFabフラグメントにおいて、CLドメイン中の124番目のアミノ酸は、EまたはDで置換されている（ナンバリングはKabatに従う）、態様73または74の方法。
アミノ酸配列の説明
Figure 0007239321000002
Figure 0007239321000003
Figure 0007239321000004
本発明の理解を助けるために以下の実施例を提供するが、本発明の真の範囲は本願特許請求の範囲に記載される。記載する手順には、本発明の本旨から逸脱することなく、変更を加えることが可能であることが、理解される。
材料および一般的方法
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991）に提供されている。抗体鎖のアミノ酸は、上に定義するKabat（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD（1991））によるナンバリングシステムに従ってナンバリングされ、言及される。
組換えDNA技法
DNAの操作には、Sambrook, J. et al., Molecular Cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているように、標準的方法を使用した。分子生物学用試薬は製造者の説明書に従って使用した。
遺伝子合成
所望の遺伝子セグメントは、化学合成によって作製されたオリゴヌクレオチドから調製した。唯一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に挟まれた600～1800bp長の遺伝子セグメントを、PCR増幅を含むオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによってアセンブルし、次に、表示した制限部位、例えばKpnI/SacIまたはAscI/PacIによって、pPCRScript（Stratagene）系pGA4クローニングベクターにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのDNA配列はDNA配列決定によって確認した。遺伝子合成フラグメントは、Geneart（ドイツ・レーゲンスブルク）に、所与の仕様書に従って発注された。
DNA配列決定
DNA配列は、MediGenomix GmbH（ドイツ・マルティンストリート）またはSequiserve GmbH（ドイツ・ファターシュテッテン）において行われた両鎖シーケンスによって決定された。
DNAおよびタンパク質の配列解析ならびに配列データ管理
配列の生成、マッピング、解析、アノテーションおよび図解には、GCG（Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン）のソフトウェアパッケージ・バージョン10.2およびInfomaxのVector NTl Advanceスイート・バージョン8.0を使用した。
発現ベクター
記載する抗体の発現には、CMV-イントロンAプロモーターを持つcDNA編成またはCMV-イントロンAプロモーターを持たないcDNA編成に基づくか、CMVプロモーターを持つゲノム編成に基づく、一過性発現（例えばHEK293 EBNAまたはHEK293-Fにおける一過性発現）細胞用の発現プラスミドの変異体を応用した。
これらのベクターは、抗体発現カセットの他に、
・大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にする複製起点、および
・大腸菌においてアンピシリン耐性を付与するβ-ラクタマーゼ遺伝子
を含有していた。
抗体遺伝子の転写単位は、以下の要素で構成された:
・5'端のユニーク制限部位（1つまたは複数）
・ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
・次に、cDNA編成の場合はイントロンA配列、
・ヒト抗体遺伝子の5'-非翻訳領域、
・免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
・cDNAとしての、または免疫グロブリンエクソン-イントロン編成を持つゲノム編成としての、ヒト抗体鎖（野生型またはドメイン交換されたもの）
・ポリアデニル化シグナル配列を含む3'非翻訳領域、および
・3'端のユニーク制限部位（1つまたは複数）。
後述の抗体鎖を含む融合遺伝子は、PCRおよび/または遺伝子合成によって作製され、公知の組換え法および組換え技法により、例えば各ベクター中のユニーク制限部位を使った一致する核酸セグメントの接続によってアセンブルされた。サブクローニングされた核酸配列は、DNA配列決定によって検証した。一過性トランスフェクション用に、形質転換大腸菌培養物からのプラスミド調製によって、大量のプラスミドを調製した（Nucleobond AX、Macherey-Nagel）。
細胞培養技法
Current Protocols in Cell Biology（2000）, Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M.（eds.）, John Wiley & Sons, Inc.に記載されているように、標準的細胞培養技法を使用した。
多重特異性抗体は、後述するように、付着培養したHEK293-EBNA細胞または懸濁培養したHEK29-F細胞において、各発現プラスミドの一過性共トランスフェクションによって発現させた。
HEK293-EBNA系における一過性トランスフェクション
10％Ultra Low IgG FCS（ウシ胎児血清、Gibco（登録商標））、2mM L-グルタミン（Gibco（登録商標））、および250μg/mlジェネティシン（Gibco（登録商標））を補足したDMEM（ダルベッコ変法イーグル培地、Gibco（登録商標））中で培養した付着培養HEK293-EBNA細胞（エプスタイン・バーウイルス核抗原を発現するヒト胎児腎臓細胞株293; American type culture collection受託番号ATCC＃CRL-10852、ロット959218）における各発現プラスミド（例えば重鎖および修飾された重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾された軽鎖をコードするもの）の一過性共トランスフェクションによって、多重特異性抗体を発現させた。トランスフェクションには、FuGENE（商標）6 Transfection Reagent（Roche Molecular Biochemicals）を、FuGENE（商標）試薬（μl）対DNA（μg）の比率を4:1（3:1から6:1までの範囲）にして使用した。タンパク質は、（修飾型および野生型）軽鎖および重鎖コードプラスミドのモル比1:1（等モル）（それぞれ1:2から2:1までの範囲）を用いて、各プラスミドから発現させた。3日目に、4mMのL-グルタミン、グルコース［Sigma］およびNAA［Gibco（登録商標）］を細胞に供給した。トランスフェクション後の5～11日目に、多重特異性抗体を含有する細胞培養上清を、遠心分離によって収穫し、-20℃で保存した。例えばHEK293細胞などにおけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75（2001）197-203に記載されている。
HEK293-F系における一過性トランスフェクション
HEK293-F系（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用し、各プラスミド（例えば重鎖および修飾された重鎖、ならびに対応する軽鎖および修飾された軽鎖をコードするもの）の一過性トランスフェクションによって、多重特異性抗体を作製した。簡単に述べると、振とうフラスコまたは撹拌発酵槽において無血清FreeStyle（商標）293発現培地（Invitrogen）中で懸濁培養したHEK293-F細胞（Invitrogen）に、4つの発現プラスミドと293fectin（商標）またはfectin（Invitrogen）との混合物で、トランスフェクションを行った。2L振とうフラスコ（Corning）の場合、HEK293-F細胞を1.0E*6細胞/mLの密度で600mLに接種し、120rpm、8％CO2でインキュベートした。翌日、細胞に、約1.5E*6細胞/mLの細胞密度で、A）それぞれ重鎖または修飾された重鎖および対応する等モル比の軽鎖をコードするプラスミドDNA（1μg/mL）計600μgを含む20mLのOpti-MEM（Invitrogen）とB）20mlのOpti-MEM＋1.2mLの293fectinまたはfectin（2μl/mL）との混合物約42mLを使って、トランスフェクションを行った。発酵中は、グルコース消費量に応じて、グルコース溶液を加えた。分泌された抗体を含有する上清を5～10日後に収穫し、抗体を上清から直接精製するか、上清を凍結して保存した。
タンパク質量の決定
精製された抗体および誘導体のタンパク質濃度は、Pace, et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423に従い、アミノ酸配列に基づいて算出されるモル吸光係数を使用し、280nmにおける光学密度（OD）を決定することによって決定した。
上清中の抗体濃度の決定
プロテインAアガロースビーズ（Roche）を用いる免疫沈降によって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を見積もった。60μlのプロテインAアガロースビーズをTBS-NP40（50mM Tris、pH7.5、150mM NaCl、1％Nonidet-P40）中で3回洗浄した。次に、1～15mLの細胞培養上清を、前もってTBS-NP40中で平衡化したプロテインAアガロースビーズに適用した。室温で1時間インキュベートした後、ビーズを、Ultrafree-MCフィルターカラム（Amicon）上、0.5mLのTBS-NP40で1回、0.5mLの2×リン酸緩衝食塩水（2×PBS、Roche）で2回、および0.5mLの100mMクエン酸Na pH5.0で手短に4回、洗浄した。35μlのNuPAGE（登録商標）LDS Sample Buffer（Invitrogen）を加えることによって、結合している抗体を溶出させた。試料の半分を、それぞれNuPAGE（登録商標）試料還元剤と混和するか、還元しないでおき、70℃で10分加熱した。その結果、5～30μlを4-12％NuPAGE（登録商標）Bis-Tris SDS-PAGE（Invitrogen）（非還元SDS-PAGEにはMOPS緩衝液を使用し、還元SDS-PAGEにはNuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加物（Invitrogen）を含むMES緩衝液を使用した）に適用し、クーマシーブルーで染色した。
アフィニティーHPLCクロマトグラフィーによって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を定量的に測定した。簡単に述べると、Agilent HPLC 1100システムを使って、プロテインAに結合する抗体および誘導体を含有する細胞培養上清を、200mM KH2PO4、100mMクエン酸ナトリウム、pH7.4中のApplied Biosystems Poros A/20カラムに適用し、このマトリックスから200mM NaCl、100mMクエン酸、pH2.5で溶出させた。溶出したタンパク質をUV吸光度とピーク面積の積分によって定量した。精製標準IgG1抗体を標準とした。
あるいは、サンドイッチIgG-ELISAによって細胞培養上清中の抗体および誘導体の濃度を測定した。簡単に述べると、StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96ウェルマイクロタイタープレート（Roche）を、0.1μg/mLのビオチン化抗ヒトIgG捕捉分子F（ab'）2＜h-Fcγ＞BI（Dianova）100μL/ウェルにより、室温で1時間、あるいは4℃で終夜、コーティングした後、200μL/ウェルのPBS、0.05％Tween（PBST、Sigma）で、3回洗浄する。各抗体含有細胞培養上清のPBS（Sigma）における希釈系列100μL/ウェルをウェルに加え、マイクロタイタープレート振とう器上、室温で1～2時間インキュベートした。ウェルを200μL/ウェルのPBSTで3回洗浄し、結合している抗体を、0.1μg/mLのF（ab'）2＜hFcγ＞POD（Dianova）100μlを検出抗体として、マイクロタイタープレート振とう器上、室温で1～2時間検出した。結合していない検出抗体を200μL/ウェルのPBSTで3回洗い流し、100μL/ウェルのABTSを加えることによって、結合している検出抗体を検出した。吸光度の決定は405nmの測定波長（参照波長492nm）においてTecan Fluor Spectrometerで行った。
タンパク質精製
濾過した細胞培養上清から、標準的プロトコールを参照して、タンパク質を精製した。簡単に述べると、抗体をプロテインA Sepharoseカラム（GE healthcare）に適用し、PBSで洗浄した。抗体の溶出をpH2.8で達成した後、直ちに試料を中和した。凝集したタンパク質は、PBSにおける、または20mMヒスチジン、150mM NaCl pH6.0におけるサイズ排除クロマトグラフィー（Superdex 200、GE Healthcare）によって、単量体型抗体から分離した。単量体型抗体フラクションをプールし、（必要なら）例えばMILLIPORE Amicon Ultra（30MWCO）遠心分離濃縮器を使って濃縮し、凍結し、-20℃または-80℃で保存した。試料の一部を、例えばSDS-PAGE、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）または質量分析による、後続のタンパク質分析および分析的キャラクタリゼーション用に用意した。
SDS-PAGE
NuPAGE（登録商標）Pre-Castゲルシステム（Invitrogen）を製造者の説明書に従って使用した。具体的には、10％または4-12％NuPAGE（登録商標）Novex（登録商標）Bis-TRIS Pre-Castゲル（pH6.4）、およびNuPAGE（登録商標）MES（NuPAGE（登録商標）酸化防止ランニング緩衝液添加物を含む還元ゲル）またはMOPS（非還元ゲル）ランニング緩衝液を使用した。
分析用サイズ排除クロマトグラフィー
抗体の凝集状態およびオリゴマー状態を決定するためのサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）は、HPLCクロマトグラフィーによって行った。簡単に述べると、プロテインA精製抗体を、Agilent HPLC 1100システムで、300mM NaCl、50mM KH2PO4/K2HPO4、pH7.5中のTosoh TSKgel G3000SWカラムに適用するか、Dionex HPLCシステムで、2×PBS中のSuperdex 200カラム（GE Healthcare）に適用した。溶出したタンパク質をUV吸光度およびピーク面積の積分によって定量した。BioRad Gel Filtration Standard 151-1901を標準とした。
質量分析
この項では、VL-VH交換が施された複数の多重特異性抗体（VH/VL CrossMab）（およびCH1/CL交換が施された1つの対照（CH1/CL CrossMab））の、その正しいアセンブリに重点をおいたキャラクタリゼーションを説明する。予想一次構造を、脱グリコシル化インタクトCrossMabおよび脱グリコシル化/プラスミン消化CrossMabまたは脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
VH/VL CrossMab（CH1/CL CrossMab対照）を、1mg/mlのタンパク質濃度で、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、37℃において最大17時間、N-グリコシダーゼFによって脱グリコシル化した。プラスミン消化または制限LysC（Roche）消化は、100μgの脱グリコシル化VH/VL CrossMabを使って、Tris緩衝液pH8中、それぞれ室温で120時間、および37℃で40分行った。質量分析に先だって、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって、試料を脱塩した。総質量は、TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を装備したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-MSによって決定した。
表面プラズモン共鳴（SPR）（BIACORE）を用いる、各抗原への多重特異性抗体の結合および結合アフィニティーの決定
以下の手順に従ってVEGF結合を評価した:
ヒトVEGF-A-121への表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE（登録商標）T200計器（GE Healthcare）を使って調べた。10000（RU）前後の抗His抗体（1μg/mlの抗His抗体;注文コード:28995056; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N（10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare）をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
0.5μg/ml溶液を5μl/分の流量で30秒間注入することによってVEFG-A-121-Hisを捕捉した。会合は、1000nMから開始する1:3の段階希釈液で、さまざまな溶液濃度の表示の抗体を、30μl/分の流量で180秒間注入することによって測定した。解離相は600秒まで監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30μl/分のグリシンpH1.5溶液で60秒間洗浄することによって表面を再生した。抗His抗体表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（二重参照）。KDおよび他の速度論的パラメータの算出にはラングミュア1:1モデルを使用した。
以下の手順に従ってAng-2結合を評価した:
ヒトAng-2-RBD-Fcへの表示の抗体の結合を、表面プラズモン共鳴により、BIACORE（登録商標）T200計器（GE Healthcare）を使って調べた。8000（RU）前後のヤギ抗ヒトF（ab'）2（10μg/ml抗ヒトF（ab）'2;注文コード:28958325; GE Healthcare Bio-Sciences AB、スウェーデン）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使用することによって、SシリーズCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にpH5.0でカップリングした。固定化手順中は、HBS-N（10mM HEPES、150mM NaCl pH7.4、GE Healthcare）をランニング緩衝液として使用した。続く速度論的キャラクタリゼーションでは、試料緩衝液およびランニング緩衝液をpH7.4のPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）とした。フローセルを25℃に、また試料ブロックを12℃に設定し、速度論的キャラクタリゼーションに先だってランニング緩衝液で2回プライミングした。
5nM溶液を5μl/分の流量で25秒間注入することによって二重特異性抗体を捕捉した。会合は、100nMから開始する1:3の段階希釈液で、さまざまな溶液濃度のヒトAng2-RBD-Fcを、30μl/分の流量で120秒間注入することによって測定した。解離相は180秒まで監視し、試料溶液からランニング緩衝液に切り替えることによって誘発した。流速30μl/分のグリシンpH2.1溶液で60秒間洗浄することによって表面を再生した。ヤギ抗ヒトF（ab'）2表面から得られる応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。ブランク注入も差し引く（二重参照）。見掛けのKDの算出にはラングミュア1:1モデルを使用した。
Crossmabへの同時DR5およびFAP結合の評価
第1に、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、pH5.0において、600レゾナンスユニット（RU）前後のDR5（20μg/ml）を、CM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にカップリングした。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定し、ランニング緩衝液で2回プライミングした。第2に、二重特異性抗体の10μg/ml溶液を30μl/分の流速で30秒間注入した。第3に、hFAP（10μg/ml）を30μl/分の流速で30秒間注入した。hFAPの結合応答はhDR5に結合した二重特異性抗体の量に従属し、同時結合を示す。流速30μl/分のグリシンpH2溶液（GE Healthcare BR-1003-55）による70秒間の洗浄によって表面を再生した。同時結合は、事前にDR5が結合しているCrossmabへのhFAPの追加の特異的結合シグナルによって示される。
Crossmabへの非依存的DR5およびFAP結合の評価
GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、pH5.0において、3000レゾナンスユニット（RU）前後の捕捉システム（5μg/ml抗ヒトIgG（Fc）; GE Healthcare、BR-1008-39）をCM5チップ（GE Healthcare BR-1005-30）にカップリングした。試料緩衝液およびシステム緩衝液はPBS-T（0.05％Tween 20を含む10mMリン酸緩衝食塩水）pH7.4とした。フローセルを25℃に、試料ブロックを12℃に設定した。捕捉前に、フローセルをランニング緩衝液で2回プライミングした。
5μg/ml溶液を5μl/分の流速で60秒間注入することにより、二重特異性抗体を捕捉した。二重特異性抗体への各リガンドの非依存的結合は、逐次的にまたは同時に加えた各リガンド（流速10μl/分）の能動的結合能（active binding capacity）を決定することによって分析した:
1.ヒトDR5を5μg/mlの濃度で180秒間注入（抗原の単独結合を同定）、
2.ヒトFAPを5μg/mlの濃度で180秒間注入（抗原の単独結合を同定）、
3.濃度5μg/mlのヒトDR5および濃度5μg/mlのヒトFAPを180秒間注入（DR5とFAPの同時結合を同定）。
流速30μl/分の3M MgCl2溶液で60秒間洗浄することにより、表面を再生した。抗ヒトIgG表面から得られた応答を差し引くことによってバルク屈折率差を補正した。
結果として得られるアプローチ3の最終シグナルが、アプローチ1およびアプローチ2の個々の最終シグナルの和に等しければ、その二重特異性抗体は、両方の抗原に、相互に依存せずに結合することができる。
以下の手順に従ってPD1結合を評価した:
抗ヒトFc IgGを（Biacore）CM5センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定化した。次に、試料を捕捉し、hu PD1-ECDをそれらに結合させた。各分析サイクル後にセンサーチップ表面を再生した。最後に、データを1:1ラングミュア相互作用モデルに当てはめることによって平衡定数および速度定数を得た。
約10,000レスポンスユニット（RU）の20μg/ml抗ヒトIgG（GE Healthcare #BR-1008-39）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、Biacore T200中のCM5センサーチップのすべてのフローセルにカップリングした。試料緩衝液およびランニング緩衝液はHBS-EP＋（0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％ v/v Surfactant P20、pH 7.4）とした。フローセル温度を25℃に、試料コンパートメント温度を12℃に設定した。システムをランニング緩衝液でプライミングした。
さまざまな試料を10nMの濃度で15秒間注入し、フローセル2、3および4に連続的に結合させた。次に、一揃いのヒトPD1-ECD濃度（300nM、100nM、2×33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.2nMおよび2×0nM）を各試料上に300秒間注入した後、10/600秒の解離時間および3M MgCl2による30秒ずつ2回の再生工程を行い、そのうち最後の1回には、ランニング緩衝液による「注入後追加洗浄（extra wash after injection）」を含めた。最後に、二重参照データをBiacore T200評価ソフトウェアで1:1ラングミュア相互作用モデルに当てはめた。
以下の手順に従ってTIM3結合を評価した:
抗ヒトFab IgGを（Biacore）CM5センサーチップの表面にアミンカップリングによって固定化した。次に、試料を捕捉し、hu Tim3-ECDをそれらに結合させた。各分析サイクル後にセンサーチップ表面を再生した。最後に、データを1:1ラングミュア相互作用モデルに当てはめることによって平衡定数および速度定数を得た。
約10,000レスポンスユニット（RU）の20μg/ml抗ヒトFab IgG（GE Healthcare #28-9583-25）を、GE Healthcareが供給するアミンカップリングキットを使って、Biacore T200中のCM5センサーチップのすべてのフローセルにカップリングした。試料緩衝液およびランニング緩衝液はHBS-EP＋（0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05％ v/v Surfactant P20、pH 7.4）とした。フローセル温度を25℃に、試料コンパートメント温度を12℃に設定した。システムをランニング緩衝液でプライミングした。
さまざまな試料を10nMの濃度で30秒間注入し、フローセル2、3および4に連続的に結合させた。次に、一揃いのヒトTim3-ECD濃度（600nM、200nM、2×66.7nM、22.2nM、7.4nMおよび2×0nM）を各試料上に200秒間注入した後、10/600秒の解離時間およびグリシンHC1 pH2.1による30秒ずつ2回の再生工程を行い、そのうち最後の1回には、ランニング緩衝液による「注入後追加洗浄」を含めた。最後に、二重参照データをBiacore T200評価ソフトウェアで1:1ラングミュア相互作用モデルに当てはめた。
実施例1
1つの結合アームにVH/VLドメイン交差が施された、CH1/CL境界面中に荷電アミノ酸置換を持つ、二価多重特異性抗体の提供（概念実証）
多重特異性抗体のCH1/CL1境界面内で特異なアミノ酸を置換することの効果を証明する概念実証を行うために、2つの結合アームのうちの1つにVH/VLドメイン交差が施された例示的二価抗体を作製した。
CH1/CL境界面にアミノ酸置換を持たない抗体（対照）、ならびにCH1/CL境界面に単一の荷電アミノ酸置換を持つ抗体およびCH1/CL境界面に複数の荷電アミノ酸置換を持つ抗体を作製した。典型例として、非交差結合アームでヒトアンジオポエチン-2（ANG2）に結合しVH/VL交差結合アームでヒトVEGFに結合する多重特異性抗体を作製した。抗体の作製は、一般的方法の項で述べたように、古典的な分子生物学技法により、上述のようにHEK293細胞中で抗体を一過性に発現させることによって行った。
各抗体におけるアミノ酸置換を表1に示す。
（表１）概念実証のための二価多重特異性抗ANG2-VEGF抗体のアミノ酸置換
Figure 0007239321000005
これらの多重特異性抗体は、表2に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
（表２）概念実証のための二価多重特異性抗ANG2-VEGF抗体のアミノ酸配列
Figure 0007239321000006
すべてのコンストラクトに、第1のCH3ドメイン中の典型的ノブ（T366W）置換と第2のCH3ドメイン中の対応するホール置換（T366S、L368AおよびY407V）とによるノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術（ならびに2つの追加導入システイン残基S354C/Y349C）（上記の各対応重鎖（HC）配列に含まれている）を使用した。
発現した多重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、細胞培養上清から精製した。どの多重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。
得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またSDS-PAGEによる純度、単量体含量および安定性などの分析的特性について特徴づけた。
質量分析
予想一次構造を、脱グリコシル化インタクト抗体および脱グリコシル化/プラスミン消化あるいは脱グリコシル化/制限LysC消化抗体のエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
VH/VL CrossMabは、N-グリコシダーゼFにより、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、37℃で、最大17時間、1mg/mlのタンパク質濃度で脱グリコシル化した。プラスミンまたは制限LysC（Roche）消化は、100μgの脱グリコシル化抗体を使って、Tris緩衝液pH8中、それぞれ、室温で120時間、および37℃で40分間、行った。質量分析に先だって、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって、試料を脱塩した。総質量は、TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を装備したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-MSによって決定した。
VH/VLドメイン交差を施した二価多重特異性抗体の主要副生成物は、ベンス・ジョーンズ型相互作用に基づく（Schaefer, W. et al, PNAS, 108（2011）11187-1191、補足資料のFig. S1Iも参照されたい）。CH1/CL境界面に反対電荷を持つアミノ酸を導入することで、VH/VLドメイン交差多重特異性抗体の主要副生成物を著しく低減できることが、二価多重特異性抗体の分析によって明らかになった。MS分析の結果を表3に示す。
（表３）質量分析によって決定された、概念実証用の二価多重特異性抗ANG2-VEGF抗体を発現させた時に形成される主要副生成物（ベンス・ジョーンズ型）の分率
Figure 0007239321000007
MSの結果が示すとおり、CH1/CL境界面における反対電荷を持つアミノ酸の導入は、これらの置換を持たない「野生型」VH/VL交換二価対照抗体と比較すると、副生成物形成を強く低減する。示されているとおり、本発明のアミノ酸置換、すなわちCLドメインにおける124番目のアミノ酸の置換と、対応するCH1ドメインにおける147番目または213番目における置換との組合せ（抗体Ang2VEGF-0396およびAng2VEGF-0397参照）は、アミノ酸残基が1つしか相違しない抗体分子（すなわち、CLドメインにおいてアミノ酸124の代わりにアミノ酸123を交換;抗体Ang2VEGF-0394およびAng2VEGF-0395参照）と比較すると、より優れた副生成物の低減をもたらす。CLドメイン中の124番目におけるアミノ酸置換を含む複数のアミノ酸置換を含む抗体は、ベンス・ジョーンズ型副生成物を示さないか、ベンス・ジョーンズ型副生成物が検出不可能であり、主要副生成物の形成を完全に抑制できることが示された。
どの抗体も良好な収量で生産することができた。表示の多重特異性抗体の例示的生産収量をプロテインA精製後に評価した。結果を表4に示す。
（表４）表示した抗体の生産収量［mg/L上清］
Figure 0007239321000008
一般的方法の項で述べたように抗原結合を評価した。結果を表5に示す。
（表５）ANG2およびVEGFに対する表示した抗体のアフィニティー
Figure 0007239321000009
試験した抗体はいずれも、両方のターゲット、すなわちAng2およびVEGFに特異的に結合し、ナノモル濃度域の抗原アフィニティーを呈する。荷電アミノ酸残基の導入は抗原結合を損なわない。
抗体コンストラクトの安定性を評価するために、熱安定性および凝集開始温度を以下の手順に従って評価した。
表示した抗体の試料を、20mMヒスチジン/ヒスチジン塩酸塩（histidine chloride）、140mM NaCl、pH6.0中に、1mg/mLの濃度で調製し、10μLマイクロキュベットアレイに移し、試料を0.1℃/分の速度で25℃から90℃まで加熱しつつ、266nmレーザーで励起した時の静的光散乱データおよび蛍光データを、Optim1000計器（Avacta Inc.）で記録した。
凝集開始温度（Tagg）は散乱光強度が増加し始める温度と定義される。融解温度（Tm）は蛍光強度対波長のグラフにおける変曲点と定義される。
結果を表6に示す。
（表６）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）および融解温度（Tm）
Figure 0007239321000010
この概念実証実験からの結果は、CH1/CL境界面における単一のアミノ酸置換には、VH/VLドメイン交差が施された多重特異性抗体の副生成物形成を強く低減する効力があることを証明している。複数のアミノ酸置換の導入には、VH/VLドメイン交差が施された多重特異性抗体の主要ベンス・ジョーンズ型副生成物の形成を完全に抑制する効力があった。しかもアミノ酸置換を含む抗体コンストラクトはすべて、良好な収量で生産することができ、ナノモル濃度域でそれぞれの抗原に結合することができた。
実施例2:
1つの結合アームにVH/VLドメイン交差が施された、CH1/CL境界面中に荷電アミノ酸置換を持つ、四価多重特異性抗体の提供
DR5およびFAPに特異的に結合する四価二重特異性抗体を、実施例1の抗体について述べたように作製し、発現させ、精製した。この実施例の四価抗体は、DR5に特異的に結合する単一特異性コア抗体を含む。FAPに特異的に結合する2つのFabフラグメントは、図1Aおよび図1Bに示すように、コア抗体の重鎖のC末端に融合されている。CH1/CL境界面にアミノ酸置換を持たない抗体（対照）およびCH1/CL境界面に複数の荷電アミノ酸置換を持つ抗体を作製した。
これらの抗体のドメイン配置およびCH1/CL境界面におけるアミノ酸置換を表7に示す。
（表７）四価多重特異性抗DR5-FAP抗体のCH1/CL境界面におけるアミノ酸置換
Figure 0007239321000011
これらの四価多重特異性抗体は、表8に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って発現させた。
（表８）四価多重特異性抗DR5-FAP抗体のアミノ酸配列
Figure 0007239321000012
発現した多重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって、細胞培養上清から精製した。
プロテインAアフィニティークロマトグラフィー後に、凝集体含量および生産収量を評価した。
（表９）表示した四価多重特異性抗DR5-FAP抗体のプロテインA精製後の凝集物含量および生産収量［mg/L上清;計算値］。LMW含量は、100と単量体含量および凝集体含量の和との差である。
Figure 0007239321000013
それぞれの野生型VH/VLドメイン交差対照抗体と比較すると、本発明の抗体では、凝集体形成が低減した。
追加精製工程において、試料を分取用SECによってさらに処理した。この工程の結果を表10に要約する。
（表１０）分取用SEC精製の要約。収量ならびにCE-SDSによる純度および分析用SECによる単量体含量を示した。
Figure 0007239321000014
（表１１）表示した抗体の凝集開始温度（Tagg）
Figure 0007239321000015
発現したDR5FAP Crossmabはすべて安定であり、類似する凝集開始温度を持っていた（DR5TAA-0081を除く）。
抗体の予想一次構造を実施例1で述べたようにMSによって分析した。
対応する野生型VH/VLドメイン交差四価抗DR5-FAP抗体を生産する際に検出されうる主要副生成物は、3つのFAP軽鎖を含み、DR5軽鎖を1つしか含まない、半機能的抗体である。図解のために、野生型抗体DR5TAA-0077およびDR5TAA-0081について所望の分子とそれぞれの主要副生成物を図3Aおよび図3Bに示す（それぞれ左側と中央の像）。
本発明の四価抗体のMS分析により、VH/VLドメイン交差四価抗DR5-FAP抗体のCH1/CL境界面に荷電アミノ酸残基を導入すれば、主要副生成物の分率を著しく低減できることが明らかになった。
（表１２）質量分析によって決定された、四価多重特異性抗DR5-FAP抗体を発現させた時に形成される主要副生成物（3つのFAP軽鎖と1つのDR5軽鎖を持つ抗体）および副産物の分率*
Figure 0007239321000016
*異なる分子のイオン化効率は特定の未決定の因子によって相違しうるので、定量は量的推定を意味することに注意されたい。ここでは、DR5FAPの分子サイズと定量されたその副産物の分子サイズとが似ているので、異なるDR5FAP分子の完全性を比較するために、定量を使用することができる。
上記の表は、導入された電荷が、荷電残基を持たない変異体と比較して、軽鎖のミスペアリングを低減することを示している。選択した荷電残基に依存して、軽鎖のミスペアリングを検出限界まで低減することができる。この表は、使用した荷電残基、すなわちFAP定常軽鎖中のQ124E、DR5定常軽（CL）鎖中のE123R/Q124K、DR5のCH1中のK147E、K213Eによって、あらゆる副生成物を回避できることを、明らかに示している。非交差ドメイン中に2つの電荷交換を置き、交差ドメイン中に単一の追加電荷を置くことは有益である。
実施例3:
Crossmabへの非依存的DR5およびFAP結合の評価
さまざまなドメイン交換が施されさまざまな荷電残基が追加導入されたDR5TAA CrossMAbへのDR5およびFAPの非依存的結合を示す。そのために、＜Fc＞捕捉IgGをチップ表面に固定化して、さまざまなDR5TAA CrossMAbを捕捉する。この実験では、ターゲットDR5およびFAPを、個別に、または同時に、捕捉されたCrossMAbに加えた。
（表１３）さまざまな四価DR5FAP CrossMAbへのFAPおよびDR5の非依存的結合および同時結合の要約。この表は、各結合イベントおよび複合結合イベントに関するRUならびに測定されたシグナル強度と予想シグナル強度との間の比を示している。
Figure 0007239321000017
この実験の結果（表）は、DR5とFAPの実験的に測定されたシグナル強度の比が、理論的に予想される最大ターゲット占有率に非常に近い（すべて90％超）ことを示している。これは、さまざまなドメイン交換および荷電残基を持つDR5TAA CrossMAbが、適用された分子設計とは無関係に、同時結合する能力を有することを示している。
実施例4:
Crossmabへの同時DR5およびFAP結合の評価
チップ表面にDR5を固定化し、第1の結合工程ではDR5TAA CrossMAbを加える。第2の工程では、リガンドFAPを加える。DR5TAA試料のSPR分析により、DR5TAA CrossMAbの変異体はすべて、ドメイン交換の位置とは無関係に、また導入された荷電アミノ酸とは無関係に、両方のターゲットに同時結合する能力を有することが明らかになった。この実験の結果（SPR センサーグラム）を図5A、BおよびCに示した。これらの結果は、すべてのCrossMAbの明らかな同時DR5およびFAP結合を示している。
実施例5:
2つの結合アームにVH/VLドメイン交換/入れ替えが施され（2＋2CrossMAbVh-VL）、CH1/CL境界面に単一の荷電アミノ酸置換を持つ、PD1およびTIM3に結合する多重特異性抗体の作製および発現
一例として、ヒトPD1およびヒトTIM3に結合する多重特異性抗体を、一般的方法の項で述べたように、古典的な分子生物学技法によって作製し、上述のようにExpi293F細胞の293F中で一過性に発現させた。電荷を持たない多重特異性2＋2CrossMAbVH-VL抗体はWO 2010/145792にも記載されている。表14に示すアミノ酸配列をコードする核酸を含有する発現プラスミドを使って多重特異性抗体を発現させた。
（表１４）VH/VLドメイン交換/入れ替えが施された軽鎖（LC）および重鎖（HC）のアミノ酸配列（2＋2CrossMAbVh-VL）
Figure 0007239321000018
さらなる例として、表14と同じコンストラクト/IgGバックボーンを使用し、ただし、i）PD1結合アームにはSEQ ID NO:46のヒト化可変ドメイン（VH 抗PD1）およびSEQ ID NO:47（VL 抗PD1）を、またTIM3結合アームにはSEQ ID NO:48（VH 抗TIM3）およびSEQ ID NO:49（VL 抗TIM3）のヒト化可変ドメインを使って、ならびにii）PD1結合アームにはSEQ ID NO:46（VH 抗PD1）およびSEQ ID NO:47（VL 抗PD1）のヒト化可変ドメインを、またTIM3結合アームにはSEQ ID NO:50（VH 抗TIM3）およびSEQ ID NO:51（VL 抗TIM3）のヒト化可変ドメインを使って、四価二重特異性PD1TIM3抗体を発現させた。
実施例6:
PD1およびTIM3に結合する多重特異性抗体の精製およびキャラクタリゼーション
上で発現させた多重特異性抗体を、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーとサイズ排除クロマトグラフィーとの併用によって上清から精製した。どの多重特異性抗体も、良好な収量で生産することができ、安定である。得られた生成物を、質量分析によってその実体について特徴づけ、またSDS-PAGEによる純度、単量体含量および安定性などの分析的特性について特徴づけた。
質量分析
予想一次構造を、脱グリコシル化インタクトCrossMabおよび脱グリコシル化/プラスミン消化あるいは脱グリコシル化/制限LysC消化CrossMabのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI-MS）によって分析した。
VH/VL CrossMabは、N-グリコシダーゼFにより、リン酸緩衝液またはTris緩衝液中、37℃で、最大17時間、1mg/mlのタンパク質濃度で脱グリコシル化した。プラスミンまたは制限LysC（Roche）消化は、100μgの脱グリコシル化VH/VL CrossMabを使って、Tris緩衝液pH8中、それぞれ、室温で120時間、および37℃で40分間、行った。質量分析に先だって、Sephadex G25カラム（GE Healthcare）でのHPLCによって、試料を脱塩した。総質量は、TriVersa NanoMateイオン源（Advion）を装備したmaXis 4G UHR-QTOF MSシステム（Bruker Daltonik）でのESI-MSによって決定した。
多重特異性抗体の安定性
抗体コンストラクトの安定性を評価するために、熱安定性および凝集開始温度を以下の手順に従って評価した。表示した抗体の試料を、20mMヒスチジン/ヒスチジン塩酸塩（histidine chloride）、140mM NaCl、pH6.0中に、1mg/mLの濃度で調製し、10μLマイクロキュベットアレイに移し、試料を0.1℃/分の速度で25℃から90℃まで加熱しつつ、266nmレーザーで励起した時の静的光散乱データおよび蛍光データを、Optim1000計器（Avacta Inc.）で記録した。
凝集開始温度（Tagg）は散乱光強度が増加し始める温度と定義される。融解温度（Tm）は蛍光強度対波長のグラフにおける変曲点と定義される。
実施例7:
2＋2抗PD1-TIM3多重特異性抗体のキャラクタリゼーション
結合Elisa
hu PD1用ELISA
Nunc maxisorpストレプトアビジン被覆プレート（MicroCoat #11974998001）を、25μl/ウェルの、濃度500ng/mlのビオチン化PD1-ECD-AviHisでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、一連の濃度の抗PD1抗体試料25μlを加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH＋L-POD（JIR、JIR109-036-098）を1:5000希釈で加え、振とう機上、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、25μl/ウェルのTMB基質（Roche、11835033001）を加え、OD2～3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
hu Tim3用ELISA
Nunc maxisorpストレプトアビジン被覆プレート（MicroCoat #11974998001）を、25μl/ウェルの、濃度60ng/mlのビオチン化Tim3-ECD-AviHisでコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、一連の濃度の抗PD1抗体試料25μlを加え、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトH＋L-POD（JIR、JIR109-036-098）を1:5000希釈で加え、振とう機上、室温で1時間インキュベートした。洗浄（PBST緩衝液で3×90μl/ウェル）後に、25μl/ウェルのTMB基質（Roche、11835033001）を加え、OD2～3までインキュベートした。測定は370/492nmで行った。
ELISAの結果をEC50値［nM］として表15に列挙する。
（表１５）抗PD1-TIM3二重特異性抗体の生化学的結合および細胞結合（ELISA）
Figure 0007239321000019
Tim3に関して二価である抗体（キメラTIM3-0018、2＋2PD1TIM3-0359、キメラTIM3-0028、2＋2PD1TIM3-0358）では、強い結合（avid binding）（すなわち両アームによる結合）を検出することができる。PD1結合については、アビディティ効果は検出されなかった。EC50値は二価フォーマットおよび四価フォーマットで同等である。
結合Biacore
PD1およびTIM3に結合する多重特異性抗体の抗原結合特性
多重特異性抗体の、それぞれのターゲット抗原、すなわちPD1およびTIM3に対する結合を、Biacore（登録商標）によって評価した。
結果を表16に示す。
（表１６）PD1/Tim3二重特異性抗体のアフィニティー
Figure 0007239321000020
試験した抗体はすべて両方のターゲット、すなわちPD1およびTIM3に特異的に結合する。

Claims (7)

  1. a）第1の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
    b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
    を含む、ヒトIgG1またはIgG4サブクラスの四価多重特異性抗体の調製中の副生成物形成を低減するための方法であって、
    該追加Fabフラグメントが第2の抗原に特異的に結合し、
    i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
    ・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
    のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、かつ
    ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
    ・CLドメイン中の124番目および123番目のアミノ酸がKまたはRで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
    ・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものであり、かつ
    iii）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されているものであり（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
    iv）多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
    ・一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させること、または
    ・一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること
    によって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されており、
    該多重特異性抗体の副生成物形成を低減するために、該多重特異性抗体が、該定常軽鎖ドメイン（CL）および該定常重鎖ドメイン1（CH1）中に該アミノ酸置換を含み、
    該方法が、以下の工程を含む、方法:
    ・該四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    ・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
    ・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
  2. a）それぞれ第1の抗原および第2の抗原に特異的に結合する2つのFabフラグメントを含む完全長抗体によって形成される、1つのコア抗体、および
    b）どちらもコア抗体の重鎖のC末端またはN末端のどちらか一方に融合されている、2つの追加Fabフラグメント
    を含む、ヒトIgG1またはIgG4サブクラスの四価多重特異性抗体の調製中の副生成物形成を低減するための方法であって、
    重鎖に融合されている追加Fabフラグメントは、該重鎖上に配置されたコア抗体のFabフラグメントと同じ抗原結合特異性を呈し、
    i）・第1の抗原に特異的に結合するFabフラグメント、または
    ・第2の抗原に特異的に結合するFabフラグメント
    のどちらか一方はドメイン交差を含んでいて、可変重鎖ドメイン（VH）と可変軽鎖ドメイン（VL）とが互いに入れ替わっており、かつ
    ii）i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントは、定常軽鎖ドメイン（CL）および定常重鎖ドメイン1（CH1）中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、
    ・CLドメイン中の124番目および123番目のアミノ酸がKまたはRで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
    ・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸がEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）ものであり、かつ
    iii）ii）に定義したアミノ酸置換を含まないFabフラグメントは、CLドメイン中にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、124番目のアミノ酸がEまたはDで置換されているものであり（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
    iv）多重特異性抗体は2つの定常重鎖ドメイン3（CH3）を含み、それら定常重鎖ドメイン3（CH3）が、
    ・一方のCH3ドメイン中に生成させた突起が他方のCH3ドメイン中に生成させたくぼみ内に配置されうるように、少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで一方のCH3ドメイン中に突起を生成させ、かつ少なくとも1つの元のアミノ酸残基を元のアミノ酸残基より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置換することで他方のCH3ドメイン中にくぼみを生成させること、または
    ・一方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を正荷電アミノ酸で置換し、かつ他方のCH3ドメイン中の少なくとも1つの元のアミノ酸残基を負荷電アミノ酸で置換すること
    によって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されており、
    該方法が、以下の工程を含む、方法:
    ・該四価多重特異性抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むベクターで宿主細胞を形質転換する工程、
    ・該多重特異性抗体の合成が可能な条件下で該宿主細胞を培養する工程、および
    ・該宿主細胞培養から該多重特異性抗体を回収する工程。
  3. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントにおいて、
    ・CLドメインでは、123番目のアミノ酸がRで置換され、かつ124番目のアミノ酸がKで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつ
    ・CH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が互いに独立してEまたはDで置換されている（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、
    請求項1または2に記載の方法。
  4. i）のドメイン交差を含まないFabフラグメントにおいて、CLドメインでは、123番目のアミノ酸がRで置換され、かつ124番目のアミノ酸がKで置換されており（ナンバリングはKabatに従う）、かつCH1ドメイン中の147番目および213番目のアミノ酸が、互いに独立してEまたはDで置換されており（ナンバリングはKabat EUインデックスに従う）、かつ
    i）のドメイン交差を含むFabフラグメントにおいて、124番目のアミノ酸がEで置換されている、
    請求項1～3のいずれか一項に記載の方法。
  5. ii）のアミノ酸置換を含むFabフラグメントが、カッパアイソタイプの軽鎖定常ドメインCLを含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の方法。
  6. b）の追加Fabフラグメントが、ペプチドコネクタを介してコア抗体の重鎖に融合されている、請求項1～5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 多重特異性抗体が2つのCH3ドメインを含み、それら2つのCH3ドメインは、CH3ドメイン間にジスルフィド結合が形成されるように各CH3ドメインに少なくとも1つのシステイン残基を導入することによって、ヘテロ二量体化が促進されるように改変されている、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
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